专利名称：防治大豆胞囊线虫病的菌株及其制剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及微生物领域，更确切地说，涉及用于防治植物根部病害，特别是用于防治大豆胞囊线虫病的菌株及其制剂。
大豆是我国的重要栽培作物之一，其经济价值较高。近年来由于种植面积不断扩大，重迎茬耕作问题突出，因而导致大豆病虫害发病面积增加，危害日益严重。在诸多病虫害中，以大豆胞囊线虫(Hetero derag1ycines)病的危害最大，其发病面积约占大豆种植面积的70％以上，一般损失达10-40％，严重的甚至可造成大豆绝产。对于大豆根部的病害，目前多数是采用呋喃丹、多福合剂与乙基硫磷等化学农药以及各种化学种衣剂。这类药物虽然在大豆生长前期有一定防效，但是由于这类化学农药的大量使用，导致环境的严重污染。另外，由于药物在土壤中长期积累，降低了土壤肥力，而且易使病菌及害虫产生抗药性，降低了药物对病虫害的防治效果。鉴于化学农药的诸多弊病，使得利用生物方法来防治植物寄生线虫病日益受到关注。在生物防治的过程中，最关键的问题是要找到并分离出对特定的病虫害有足够杀灭能力的微生物菌株及用该菌株配制出适于使用的制剂。迄今为止，用淡紫拟青霉(Paccilomyceslilacinus)来防治根结线虫(Meloidogyne spp.)国外已做过不少试验，例如，菲律宾已有商品制剂(商品名BIOCON)投放市场，此制剂通过浸泡马铃薯块茎来防治其根结线虫病的效果很好。然而这种制剂对于防治大豆胞囊线虫病的效果却很不理想，所以迄今为止尚未发现有利用深紫拟青霉制剂来防治大豆胞囊线虫病的报导。这是因为，对于大多数植物而言，其生活环境十分复杂，菌剂与植物本身、病害虫、土壤等各方面的条件互相影响。以往的生防菌剂多是作用方式和作用位点单一，因而防治效果有限，尤其是对用于植物根部病害的生防菌剂，由于土壤抑菌作用[即土壤抑制真菌孢子(也包括细菌、放线菌的繁殖体)萌发]的普遍存在，严重影响了菌剂实际应用于大田中的病害虫防治。特别是对大面积种植的大豆来说，至今仍未发现一种能有效地防治大豆胞囊线虫病的生物防治方法。
本发明的目的是要提供一种适用于防治大豆胞囊线虫病的菌株及其制剂。
本发明人经过多年对各种有关菌株的筛选分离工作，90年在黑龙江省华楠县孟家岗的大豆连作四年的田块土壤中，测得每100g土中平均含有胞囊数67.5个。共检测了128个胞囊，完全寄生的占9.5％。其中发现了一个胞囊很特别，胞囊内的物质全部被消解掉，而真菌孢子充满了整个体腔，将孢子转移到PDA平板上培养繁殖，经鉴定为淡紫拟青霉的特异菌株。另外对50余种土样一万多个胞囊测定的结果，发现虽有一些寄生菌属于淡紫拟青霉，但均未发现象上述菌株能在大豆胞囊线虫雌虫体内产生大量孢子的现象，只是在胞囊内产生菌丝，寄生或缠绕在卵上。因而本发明人确定，上述分离出的特异菌株是一种新菌株。将得到的菌株转入含多菌灵(从0.1ppm至50ppm，逐渐增大浓度)的PDA培养基中，结果筛选出一种可耐50ppm多菌灵的生防菌株。多次转代后，该菌株的产孢能力会有所下降，但可通过紫外诱导的方法使其复壮，即在20w紫外灯下15-20cm处，隔日辐照一次，每次约15min，一般辐照3-4次后即可挑选菌落中的回复部分，进行单孢分离，即可实现菌株复壮。该菌株在PDA培养基上培养时，菌落正面呈暗紫红色，背面为黑褐色。培养两周后，其菌落直径即达到79±4mm，产生大量分生孢子，其大小为(2.4±1.1)×(2.2±0.3)μm。该种菌可耐50ppm的多菌灵，可寄生于大豆胞囊线虫的卵中及雌虫体内并能消解利用其中的物质，最终使其分生孢子充满整个雌虫体腔并导致雌虫死亡，从而使大豆胞囊线虫由于无法繁殖而很快被消灭。而所测定的淡紫拟青霉中的其他菌株均未发现上述效果。于是，本发明人将这一特异的新菌株送往北京中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏，其保藏日期为1995年10月23日，保藏号为CGMCC0241，其名称为淡紫拟青霉CGMCC0241。另外，如果将本发明的淡紫拟青霉CGMCC0241采用液体发酵的三级发酵工艺，并加入复合添加剂制成该菌株的制剂，则更方便于在大面积的大豆种植田上用于大豆胞囊线虫病的防治。
从而，本发明提供了一种用于防治大豆胞囊线虫病的菌株，其特征在于，它是淡紫拟青霉CGMCC0241。
另外，本发明还提供了一种用于防治大豆胞囊线虫病的菌株液体制剂，它是采用真菌菌株接种，通过液体三级发酵工艺而制成，其特征在于，用于接种的菌株为淡紫拟青霉CGMCC0241；液体发酵的温度一般控制在24-30℃，优选为26-28℃；PH值一般控制在5-8，优选PH6-7；所说三级发酵最终结束时间的掌握条件是镜检观察到的菌株液生孢子浓度达到5×108个/ml以上，优选是达到7×108个/ml以上，并且菌丝干重达到2％(W/V)以上。
上述三级发酵工艺是指从试管原种开始，经过三角摇瓶、种子罐、发酵罐的三级发酵，接种量一般为5-10％，这些是现有技术，但对本发明的淡紫拟青霉来说，在发酵过程中的温度、PH值和发酵时间皆应限定在上述范围内。发酵时间一般与培养基的组成、发酵温度、发酵罐的体积、通气条件等有关。通常摇瓶和种子罐的发酵时间各为1.5-2.5天，发酵罐的发酵时间为2-4天，总发酵时间约为一周。
上述的液体发酵所用的培养基设有严格限制，它可以采用现有技术中一般的真菌培养基，但本发明人通过研究后发现，根据大豆营养需求及我国大豆主产区土壤矿质元素的分布规律，应适当添加一定比例(从数个ppm至数百个ppm)的微量元素(如硼、钼等)。在培养基中加入一定氯化钠和钙盐(0.1-2％)，可明显地增加产孢率和抑制杂菌生长。
因此，本发明采用的培养基成分如下培养基成分 含量蔗糖 2-5％(W/V，下同)NaCl0.2-2％KNO30.1-0.8％K2HPO40.02-0.2％CaCO3和/或CaCl20.1-0.8％FeSO4·7H2O 50-300ppmZnSO450-300ppmMgSO4·7H2O 200-1000ppmCuSO42-10ppmNaMoO4·2H2O 2-10ppmH3BO45-30ppm水 余量(补足100％)在上述成分中，一些元素(氯和钙)具有抑制有害细菌生长的效果。同时，适量钙盐可在一定程度上提高植株耐病性。另外，由于我国大豆种植地区的土壤中缺少钼和硼，因此适当补充这两种微量元素十分重要。其他各种成分都是有利于淡紫拟青霉的繁殖或有利于大豆生长的成分。
在菌株液体发酵的基础上，控制发酵液PH值，并复合多种添加剂研制成具有多种作用方式，多位点的新型生防菌剂-大豆保根菌剂。首先，为利于真菌的生长繁殖，将发酵液PH值调至微酸性条件(PH6.0-6.5)。几丁质成分一方面在分解后可释放出杀线物质，同时又可以刺激加强生防菌对线虫的侵染，而且还能够给微生物、植株提供丰富的营养，克服土壤对真菌菌剂的抑制作用，增强植株耐病性。在发酵生产结束后，选择加入0.2-0.5％(W/V)富含几丁质、胶原蛋白的物质(主要为虾、蟹等动物的甲壳)。另外，一些植物具有良好的杀线虫效果，选择在发酵液中加入2-5％(W/V)的蒜汁和/或大麻汁。另外，在菌液中加入0.1-0.3％(w/v)的甲基纤维素，以增加菌液粘稠度和均匀度，同时使菌剂更牢固地包衣在大豆种子上。
上述的三类添加剂，既可单独使用其中的任一类，也可以使用其中的任两类或者三类结合使用。
另外，本发明菌株液体制剂的另一种优选方案的特征在于，其中所说的菌株发酵液经减压浓缩，然后再加入上述各种添加剂中的一种或多种进行复配而制成。其中所述的添加剂包括富含几丁质、胶原蛋白的物质；蒜汁和/或大麻汁；甲基纤维素。该方案的优点是便于贮存和运输。
另外，本发明菌株液体制剂的另一种优选方案的特征在于，其中所说的菌株发酵液经过过滤，将固、液组分分别处理、包装，制成待播种时混合施用的制剂。该方案的优点也是便于贮存和运输。
另外，本发明还提供了一种用于防治大豆胞囊线虫病的固体菌珠制剂，其特征在于，它是由上述液体菌珠制剂与固体填充物按(0.5-1.3)∶1(w/w)混合、阴干和粉碎而制成。
上述的固体填充物最好是由硅藻土70重量％和草炭30重量％混合而成。
本发明的液体菌株制剂的使用方法如下按播种每亩所用的大豆种子量(约5-6kg大豆)加100ml的液体菌剂混合，包衣种子，待晾干后即可进行正常播种。此外根据不同的耕作条件及生产规模，还可以采用其他后处理工艺，例如将液体菌剂浓缩后复配，或将发酵液过滤，将固、液组分分别处理包装，待播种时再混合施用。
本发明的固体菌株制剂的使用方法是将该制剂的粉碎细粒或其成形颗粒剂与大豆种子混合均匀后再进行正常的播种。
与现有技术的化学农约或类似生物农约相比，本发明的用于防治大豆胞囊线虫病的液体或固体菌株制剂具有如下优点1、可以寄生于线虫的胞囊、雌虫体内及卵中，抑制其发育和繁殖，从而显著地减少土壤中线虫种群数量；2、淡紫拟青霉在液体发酵过程中产生的代谢物可抑杀胞囊线虫的2龄幼虫；3、能有效地克服土壤的抑菌作用，可以长期地保持淡紫拟青霉的杀线虫的能力；4、可定殖于大豆植株的根际，拮抗线虫及根腐菌的浸染；5、可调节根际微环境(包括酶活性及微生物群落)，有利于大豆生长；6、增加大豆须根量，并增加根瘤数量和体积；7、促进大豆生长，增加大豆耐病性；8、制剂中的有机添加物分解后能释放出抑杀线虫及病菌的物质，即通过多个位点、多种方式作用于线虫生活史的各个阶段，从而能长期地保持杀线虫和抑制病菌的能力。
下面通过具体实施例来进一步解释本发明。
实施例1
采用试管培养的淡紫拟青霉CGMCC 0241原种，再按三角摇瓶→种子罐→发酵罐的三级发酵工艺培养，接种量为7％，采用的培养基组合物成分如下培养基成分 含量蔗糖 3％(W/V，下同)NaCl 1％KNO30.3％K2HPO40.1％CaCO30.3％FeSO4·7H2O100ppmZnSO4100ppmMgSO4·7H2O500ppmCuSO45ppmNaMoO4·2H2O 5ppmH3BO410ppm水 余量(补足100％)控制发酵温度在26-28℃；PH6.5±0.5一、二级发酵时间各定为2天，三级发酵结束时间定为发酵液中液生孢子浓度达到6×108个/ml，整个发酵时间为7天。发酵结束后测得的菌丝干重为2％(W/V)。调节菌液PH值为6.0，往该发酵液中加入0.25％(W/V)的蟹壳粉、3％(W/V)的蒜汁和0.2％(W/V)的甲基纤维素，混合均匀后按每100ml制剂与3kg大豆种子(一亩的用量)混合拌种，共试验100亩地。另外，为了对比起见，在同一地区划出10亩地未使用本发明的制剂。结果表明，在使用本发明制剂的100亩大豆中，胞囊线虫病明显减轻，较对照减少65％，对根腐病防效40％以上，大豆的平均亩产要比未使用本发明制剂的平均亩产高出约20％。
权利要求
1.一种用于防治大豆胞囊线虫病的菌株，其特征在于，它是淡紫拟青霉CGMCC0241。
2.一种用于防治大豆胞囊线虫病的菌株液体制剂，它是采用真菌菌株接种，通过液体三级发酵工艺而制成，其特征在于，用于接种的菌株为淡紫拟青霉CGMCC0241；液体发酵的温度一般控制为24-30℃；PH值为5-8；所说三级发酵最终结束时间的掌握条件是镜检观察到的菌株液生孢子浓度达到5×108个/ml以上，并且菌丝干重达到2％(W/V)以上。
3.如权利要求2所述的菌株液体制剂，其特征在于，在制备该制剂时的发酵过程中使用的培养基组合物的成分如下培养基成分 含量蔗糖 2-5％(W/V，下同)NaCl 0.2-2％KNO30.1-0.8％K2HPO40.02-0.2％CaCO3和/或CaCl20.1-0.8％FeSO4·7H2O 50-300ppmZnSO450-300ppmMgSO4·7H2O 200-1000ppmCuSO42-10ppmNaMoO4·2H2O 2-10ppmH3BO45-30ppm水 余量(补足100％)
4.如权利要求2所述的菌株液体制剂，其特征在于，在该制剂中还含有0.2-0.5％(W/V)富含几丁质、胶原蛋白的物质。
5.如权利要求2所述的菌株液体制剂，其特征在于，在该制剂中还含有2-5％(W/V)的蒜汁和/或大麻汁。
6.如权利要求2所述的菌株液体制剂，其特征在于，在该制剂中还含有0.1-0.3％(w/v)的甲基纤维素。
7.如权利要求2所述的菌株液体制剂，其特征在于，在该制剂中还含有0.2-0.5％(W/V)富含几丁质、胶原蛋白的物质；2-5％(W/V)的蒜汁和/或大麻汁及0.1-0.3％(w/v)的甲基纤维素。
8.如权利要求2所述菌株液体制剂，其特征在于，其中所说的菌株发酵液经减压浓缩，然后再加入权利要求7中所述添加剂的一种或多种进行复配而制成。
9.如权利要求2所述菌株液体制剂，其特征在于，其中所说的菌株发酵液经过过滤，将固、液组分分别处理、包装，制成待播种时混合施用的制剂。
10.一种用于防治大豆胞囊线虫病的固体菌株制剂，其特征在于，它是由液体菌剂与固体填充物按(0.5-1.3)∶1(W/W)混合，阴干和粉碎而制成。
全文摘要
一种用于防治大豆胞囊线虫病的菌株，其名称为淡紫拟青霉CGMCC0241。一种用于防治大豆胞囊线虫病的菌株液体制剂，它是用上述菌株接种，经过三级发酵并加入复合添加剂而制成。发酵过程温度为24-30℃；pH值为5-8；最终发酵结束时间的条件为镜检观察到的液生孢子数在5×10
文档编号C12N1/14GK1138096SQ9512111
公开日1996年12月18日 申请日期1995年12月29日 优先权日1995年12月29日
发明者刘杏忠, 张新德, 谢云清, 孙漫红 申请人:中国农业科学院生物防治研究所, 黑龙江省农垦科学院农作物开发研究所