专利名称：生产核酸的拷贝的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种产生至少是部分核酸链的拷贝的方法。
在遗传工程领域，经常有这样的情况样品中仅存在非常少量的核酸，而以研究或诊断测试为目的，则需要大量的全序列或部分序列核酸。也就是说，可能需要知道某种特定的核酸是否存在于样品中(比如确定一个人是否被一种特定的病毒感染，可以是DNA，也可以是RNA，或者确定在他们的核酸中存在或不存在有特定的序列)。如果存在于样品中的话，由于核酸的量是低于可检测限度的，所以需要对样品做扩增反应，这样即可产生更多量的核酸(如果存在的话)。然后，可通过检测来确定核酸的存在与否。如果检测结果为阳性的，则证明核酸存在于原始样品中。相反地，若结果为阴性的，那么可以证明核酸不存在于原始样品中。
本发明涉及不同的技术，用这些技术，可以使存在于或潜在存在于样品中的核酸得到扩增，产生大量核酸。
根据本发明的第一个方面，提供了一种方法，用该方法可以产生至少是部分核酸链(“靶链”)的拷贝，靶链是存在于或潜在存在于样品中的，本方法包含下列步骤(i)提供了一种固相支持系统，其上固着有大量的单链寡核苷酸，这些平链寡核苷酸能同靶链杂交。(ii)(a)清洗支持系统以除去未杂交物质。(iii)产生靶1链的拷贝，该链掺入了固相的寡核苷酸及包含同至少是部分靶链互补的核苷酸序列，也就是说生成的靶1链拷贝中至少有一部分是以靶链为模板而生成的，并且，如果需要，可以是靶1序列拷贝的全部。(iv)使同靶1链拷贝相杂交的靶链变性，然后可选择使至少是部分的靶链同支持系统上的尚未转变为靶1链拷贝的寡核苷酸再杂交。(v)同时，(a)用固定于固相支持物上的靶1链拷贝作为模板来生成(从杂交干靶1链上的引物来生成)靶2链拷贝，该链包括了感兴趣的核酸序列，并且(b)用靶链为模板，如果他们已经同固定的寡核苷酸杂交了的话，再次产生至少是部分的靶1链拷贝，并且(如果需要)，可完成靶1链的形成，并且(vi)按所需要的次数重复步骤(iv)和(v)，在每次重复步骤(iv)和(v)时，用靶2链拷贝来进一步生成靶1链拷贝。
如前所述，本发明的方法对于含有或不含感兴趣的核酸的样品均有效。如果核酸不存在，那么上面列出的步骤(iii)-(vi)将不会导致靶1链拷贝和靶2链拷贝的产生。此外，不能生成靶2链拷贝提供了有价值的信息，因为在实行的检测步骤中，将确定靶2链拷贝的存在，若结果为阴性，则证明靶链不存在于原样品中。
清洗步骤(ii)(a)使得未杂交物质从支持系统上被移去，这样使得用于步骤(iii)中的靶链样品将是无污染的。因而，在原样品中存在的污染物将不会参与本发明方法的其后的反应。
在步骤(iv)中，靶链可同支持物上的未延伸寡核苷酸再杂交。或者在步骤(v)之前，可将原始的靶链从固相支持系统上移去。
按以下所述操作也是可取的在整个的从步骤(iii)-(vi)的顺序操作中，在每次杂交反应后和/或在每次链合成反应后和/或连接反应后，洗涤固相支持系统和/或移去反应试剂。这样，比如，在步骤v(b)中引入的过量的引物就可在(至少是部分的另外的)靶1链拷贝产生前被去除。
寡核苷酸优选地共价同固相支持物相联。优选地，固相支持系统是是一种颗粒组成的系统并且寡核苷酸是固定于颗粒之上的。颗粒组成的支持系统的应用是其自声权利的一个重要特征。并且因此根据本发明的另一个方面，本发明提供了一种方法，用该方法可以产生至少是部分的核酸链(靶链)的拷贝，其中靶链是存在于或潜在存在于样品中，本方法包括以下步骤(i)提供了一种颗粒组成的固相支持系统，其上固定有大量的单链寡核苷酸，这些寡核苷酸可同靶链杂交。(ii)提供了单链形式的靶链并且可使靶链同支持物上的寡核苷酸链杂交，寡核苷酸链的数目要远远大于靶链的数量。(iii)产生靶1链拷贝，其掺入了固定的寡核苷酸及包含同至少是部分靶链互补的核酸序列，也就是说生成的靶1链拷贝至少有一部分是以靶链为模板而生成的，并且，如果需要，可以完成靶1序列拷贝的形成。(iv)变性同靶1链拷贝相杂交的链并且可任选将至少是部分的先前的靶链同支持物上的尚未转化为靶1链拷贝的寡核苷酸再杂交。(v)同时，(a)用固定于固相支持物上的靶1链拷贝作为模板来生成靶2链(从同靶1链拷贝杂交的引物上生成)，该链包括感兴趣的核酸序列，并且，(b)用靶链作为模板，如果靶链已同固定的寡核苷酸杂交，来进一步生成至少是部分的靶1链拷贝，并且(如果需要)可完成靶1链拷贝，而且(vi)按所需次数重复步骤(iv)和(v)，在步骤(iv)和(v)的每次重复中，用靶2链拷贝来进一步生成靶1链拷贝。
本发明的第二个方面的一个优选的特性是，步骤(ii)之后，在执行步骤(iii)之前，可以洗涤颗粒固相支持物以移去未杂交的物质。
优选的颗粒是非多孔型硅石，并且优选大小在50到200微米间的颗粒(更优选的是大小在100到200微米间)。这些颗粒可以含有交联的硅氧烷基质，其中含有能同寡核苷酸反应的反应基团(比如环氧基团)，这样，通过硅氧烷基质就可将寡核苷酸固定于支持物上。合适的颗粒在WO-A-93/13220(Tepnd)中有叙述。
更优选的是这些固相支持物上应被装入一个柱中，这样液体就可以容易地加入或移出。这样的柱子的应用可以使得反应物(比如杂交缓冲液，核苷酸)能被容易地加入到反应体系中。再者，在任意一步完成后，可以简便地对柱进行洗涤以移去过剩的反应物等，以便留下洁净的样品用来进行下一步反应。
在WO-A-93/13220中揭示了一种合适的柱子的制备法。
在上面的方案中，靶1链拷贝可通过许多途径产生。首先，支持物上的寡核苷酸的定向可以使其作为引物(用杂交于其上的靶链或靶2链拷贝作为模板)在步骤(v)(b)中延伸从而直接产生靶1链拷贝。其次，定向的寡核苷酸也可能不能按前项所述的方式延伸。在这种情况下，需要加入游离的引物，这些引物同已经与固定的寡核苷酸杂交的靶链或靶2链拷贝进行杂交，然后向寡核苷酸方向延伸，结果最后同寡核苷酸会合并共同完成靶1链拷贝的制备。
本发明方法的一个特征是，在步骤(ii)中，固相支持系统上的寡核苷酸的数量要大大多于将与之杂交的靶链的量。此处所说的大大多于指的是支持物上的寡核苷酸的总量要比径步聚(ii)中引入的靶链的量多10倍，更优选的是多至少100倍，并且多至少1000倍则更佳。
步骤(v)(a)导致了靶2链拷贝的生成，该链包括有感兴趣的核酸序列，在步骤(v)的最后(包括除了用固定于支持物上的寡核苷酸外还用液相的引物)，靶2链拷贝同靶1链拷贝杂交，在先执行步骤(v)之后，靶2链拷贝数较未延伸的寡核苷酸要低。因此，在第一次重复步骤(iv)时，靶2链拷贝(已经经变性从靶1链拷贝上解离下来)将趋向于同未延伸的寡核苷酸杂交，而同靶1链拷贝进行再杂交的趋势则较前者小。这样，在重复步骤(v)(b)时，靶2链拷贝同寡核苷酸的杂交将导致产生更多的靶1链拷贝，同时在步骤(v)(a)中更多的靶2链拷贝也将产生(通过先前生成的靶1链拷贝产生)。
步骤(iv)和(v)可按需要不断重复。至少在此过程的前几个循环中，每次生产步骤(v)都将生成更多量的靶2链拷贝，同时，当然也将会使未经延伸的寡核苷酸的量减少。这样的早期阶段将会使靶2链拷贝的数目呈几何增长。在每次重复后续步骤(iv)后，靶2链拷贝同靶1链拷贝进行再杂交的可能性均将增长，这样的结合不会导致产生更多的靶1链拷贝或靶2链拷贝。假若步骤(iv)和(v)重复得足够地多，那么将有这样一点，在此点所有的或基本上所有的支持物上的原始的寡核苷酸都被延伸并产生了靶1链拷贝。若反应的进行能够达到此点，则是理想的。
步骤(f)的产物包括其上固着有双链核酸的固相支持系统。更确切地说，双链包括一条链是靶1链拷贝，该链掺入有固定于支持物上的原始寡核苷酸，另一条链是与靶1链拷贝杂交的靶2链拷贝，该链掺入有感兴趣的原始靶链的顺序的拷贝。原始顺序被复制的真实程度将依赖于诸如(i)在步骤(ii)中同寡核苷酸杂交的靶链的区域，和(ii)有步骤e(i)中同引物相杂交的靶1链拷贝的区域。
步骤(f)的产物可用于多种用途。首先，靶2链拷贝可从固定的靶1链拷贝上经变性解离下来。经收集，就可得到增量的感兴趣的序列(增量是指同原始靶链的量相比)。一旦靶2链拷贝经变性并被从系统中移去，就可得到一固相支持系统，该系统可至少再用一次，以产生更多量的感兴趣的序列，这一流程包括(vii)将引物同位点上的靶1链拷贝杂交，这样，引物延伸后的产物是以靶1链拷贝为模板并包含有感兴趣的序列。(viii)以靶1链拷贝作为模板延伸引物，并且(ix)产物链经变性从靶1链拷贝上解离并收集产物链。
步骤(vii)-(ix)优选重复至少一次，优选地是重复多次。每次重复步骤(vii)-(ix)产生的产物链的量基本相同。因此，以这种累加为基础，重复步骤(vii)-(ix)导致的产物链的量的增加是线性的。为了最大限度地得到产物链，很明显希望所有的或基本上所有的原始寡核苷酸均转化为靶1链拷贝。
步骤(vi)或步骤(viii)中得到的产物的另一种用途是可用限性内切酶酶切双链，使之从支持物上脱落，这种双链产物可以克隆入一种载体或用作其它任意的用途。
应该清楚，本发明方法所产生的核酸能通过常规方法检测，比如用酶标的可同核酸杂交的寡核苷酸检测。
本发明的方法可通过多种途径实施。
在第一种实施方案中，固定于固相支持系统上的寡核苷酸的方向是，当靶链杂交于其上并运用合适的酶系统时，寡核苷酸本身可延伸产生靶1链拷贝。这通常意味着寡核苷酸是通过它们的5′末端同固相支持系统相连，从而使延伸过程从5′向3′延伸。
在这个实施方案中，用于步骤(v)(a)中，生成靶2链拷贝的引物为液相引物，该引物可同靶1链拷贝的远离支持物的一端的位点杂交，并向支持物端延伸以生成靶2链拷贝。应当理解在生成靶2链拷贝时，通过延伸固定的寡核苷酸可产生更多的靶1链拷贝(固定于支持物上)。
在最简单的实施方法中，本发明的第一个实施方案用了一种固相支持系统，其上掺入有一种固定的寡核苷酸(用于同二条核酸链的一条靶链杂交)。在对本发明的第一个实施方案的改进方案中，固相支持系统上包含有二种不同的固定的寡核苷酸，一种寡核苷酸可同双链核酸中的一条链杂交，而第二种寡核苷酸可同双链核酸的另一条链杂交。应当理解伴随这种改进，就可以生成两类的靶2链拷贝，这二类拷贝是互补的并且(当杂交在一起时)可以生成至少是部分的原始双链序列。
在本发明的第二个实施方案中，固定于固相支持系统上的寡核苷酸的方向是，当靶链同其杂交后，需引物再同靶链杂交并且(用合适的酶系)向着寡核苷酸延伸引物。在此种情况下，要完成靶1链拷贝的制备，需将引物延伸产物同寡核苷酸相连。本发明的这一实施方案通常意味着寡核苷酸足以其3′末端同固相支持系统相联，引物(杂交于靶链上)的延伸是按5′到3′的方向向着支持物端进行延伸的。
对于本发明中的第二种实施方案，固相支持系统可以包括一种类型的固定的寡核苷酸或包括二种类型的固定的寡核苷酸，以产生互补的靶2链拷贝。
也可以将本发明实施方案1和实施方案2相结合以便使固相支持系统掺入有二种固定的寡核苷酸(同本发明的实施方案3相一致)，即(i)第一种本身可延伸以产生靶1链拷贝(正如本发明实施例1)的寡核苷酸，和(ii)第二种需要同引物延伸得到的产物连接的寡核苷酸(为了生成靶1链拷贝)，该引物是同靶链杂交的。
正如上面所述，固相支持系统可以掺入二种不同的固定的寡核苷酸，一种可同双链核酸的一条链杂交，而另一种则可同双链核酸的另一条链杂交。就本发明自身权利而言，这是一个重要的特性，因而根据本发明的第三个方面，提供了一种方法，用该方法可生成至少是部分的核酸链的拷贝，这些核酸存在于或潜在存在于样品中，该方法包括以下步骤(i)提供了一种固相支持系统，其上固定有大量的二种不同的单链寡核苷酸0和0′，此二种寡核苷酸可以分别同双链核酸的二条互补链中的一条杂交，也就是说互补双链提供了靶1链和靶1′链，(ii)提供了单链形式的靶1和靶1′链并且使靶链同支持物上的寡核苷酸杂交，寡核苷酸的数量基本超过靶链的数量，(iii)生成靶1和1′链的拷贝，每个拷贝均掺入有寡核苷酸0或0′中的一种，以及包含有同至少是部分靶1或靶1′链互补的一段核酸序列，即靶1或1′链的拷贝的合成至少在部分上是以各自的靶链为模板而分别进行的，从而产生了至少是部分的靶1或靶2链的拷贝。并且，如果需要，可生成全部的靶1和/或靶2的序列的拷贝，(iv)变性同靶1链拷贝相杂交的链并且可任选使至少是一部分前述的链同支持物上的有未转化为靶1链的寡核苷酸再杂交，(v)同时(a)以固定于固相支持物上的靶1链拷贝为模板来生成靶2链拷贝(通过延伸同靶1链拷贝相杂交的引物实现)，后者含有感兴趣的核酸序列，并且(b)如果该靶链已杂交于固定的寡核苷酸上的话，则用该靶链作为模板来进一步产生至少含部分靶1链的拷贝，并且(如果需要)可生成全部的靶1链拷贝，并且(vi)按所需次数重复步骤(iv)和(v)，以靶2链拷贝为模板，每次重复步骤(iv)和(v)都将进一步生成靶1链的拷贝。
本发明将用与附图有关的实施例进一步说明，其中
图1描述了装置的一个实施方案，本发明的方法可通过此种装置实施；图2简要描述了本发明实施方案1中的各步的过程；图3简要描述了本发明实施方案1中的一个另外的流程；图4简要描述了本发明实施方案2的流程；图5简要描述了本发明第二种实施方案中的一个另外的流程；图6简要描述了本发明的第三种实施方案的一个的流程；图7简要描述了本发明第三种实施方案的一个另外的流程；图8和图9图示实施例1的结果；并且图10和图11图示实施例2的结果。
首先参看图1，图中所示的装置包括一个可流动通过的柱子1，柱中间是一个横放的隔板，隔板上有颗粒支持物PA，隔板下是颗粒支持物PB。PA和PB分别含有固定于其上的寡核苷酸3和4，详情见下。隔板2可允许液体流过但颗粒PA和PY不能通过。但是也可以不要隔板2而将支持物PA和PB混合在一起，这样亦可行。
同柱2相连的是进流装置，如图所示。可加入杂交缓冲液，酶，核苷酸及清洗液。此外同柱2相连的还有贮存器5，从柱中流出的产物可注入其中并且也可将其中的产物再重新上柱。提供的加热器6是在需要时加热柱1的。最后，图示的多个阀门的使用是用来将试剂加入或移出柱中。将液体加入或移出柱子可用注射器实现，比如正排量(positivedisplacement)注射器。
支持物PA和PB可以是如WO-A-93/13220中所述那样。这样，支持物是固相二氧化硅，其外表有硅氧烷基质，寡核苷酸3和4可(分别)结合于该基质上。寡核苷酸同支持物结合的方式在WO-A-93/13200中有记述。
支持物PA和PB仅在结合的寡核苷酸上有区别。考虑到DNA分子包含互补可杂交的链A和链B。固定于支持物PA上的寡核苷酸可同链A(当从链B上变性解离)杂交，同时，支持物PB上的寡核苷酸可以同链B杂交。
现在来参看图2，该图显示了本发明的第一个实施例的运用，可用来生产令人感兴趣的双链序列的拷贝，双链序列分别含有X、Y序列。柱子包括两类颗粒，图2中称为P1和P2。为了图解，链X和Y在其末端区假定含有任意的碱基序列。
所包括的步骤如下1.含靶序列的DNA或者是柱外变性后然后加入柱中，或者是双链DNA先加入柱中再原位变性。这二种情况中，DNA的变性是通过升高温度或同化学物质接触实现，这在本领域内是已知的。任意一种情况下，变性DNA在柱中同支持物混合。然后将柱子降温，以使得靶物同颗粒上的寡核苷酸是可进行杂交。杂交反应在一很精确的温度下发生，该温度对于支持物上的核酸顺序同靶物顺序的结合是特异的(称为反应的Tm(熔解温度))。Tm由靶序列中碱基的组成比率决定。含高的AT比值的DNA在均低的温度下熔解，而含高的GC比值的DNA的熔解温度则较高(在任意给定盐浓度下)。
如图所示，序列X(靶)的3′末端具有序列AAAA。(通过5′末端)固定于颗粒P1上的寡核苷酸含有序列TTTT，即该序列可同序列X的3′末端杂交，因而该链可被捕获(步骤(b))。
Z链(靶)，如图所示，在其3′末端有序列GGGG。(通过5′末端)固定于颗粒P2上的寡核苷酸有序列CCCC，其可同Y链3′末端区杂交，因此此链也可被捕获(步骤(b))。2.在清洗柱子移去杂质(包括非靶物质、DNA、蛋白质，这些物质均有抑制作用)，脂类及盐后，柱子继续使用一种缓冲液清洗，该缓冲液对于方案中下一步的进行是有益的。然后加入聚合酶及核苷酸来延伸柱上结合的寡核苷酸，这些寡核苷酸可作为引物，因而可从引物复制被捕获的链(步骤(c))从而生成固定于支持物上的靶1链拷贝。3.一旦反应完成，可清洗柱子以除去不想要的(未用的)试剂。4.其后，可将靶链从固定的靶1链拷贝上经变性解离(步骤(d))并且可同未经延伸的寡核苷酸再杂交，因为未经延伸的寡核苷酸的数量要远远大于原始的双链分子的最初的量。5.在下一步(步骤(f))中，如图所示，具有序列TTTT和CCCC的游离引物(溶相)被加入并同共价联结颗粒P1和P2的那些链杂交。通过清洗步骤将过量的游离引物洗出柱子。6.现在加入酶和核苷酸(步骤(g))，以便使对于每个P1和P2颗粒，两个延伸反应都同时发生，即(i)延伸那些同核酸链杂交，并被共价固定于支持物上的寡核苷酸(比如P1上的)TTTT(这一反应的方向是远离支持物P1和P2的)以生成靶1链拷贝，并且(ii)延伸那些同共价固定于支持物上的链相杂交的游离引物(比如对于P1是CCCC)(这一么应发生的方向是朝向支持物P1和P2)，这样生成靶2链拷贝。
步骤(i)可使在颗粒P1上合成共价固定于支持物上的序列Z，另外该步可使在颗粒P2上合成共价固定于支持物上的序列X。步骤(ii)可导致颗粒P1上的序列X及颗粒P2上的序列Z的合成。这是以几何级数复制靶DNA的开始。7.然后可以清洗柱以移去不需要的试剂。8.步骤(d)-(g)可按照所需次数重复。
在支持物上有大量过量的原始的固定寡核苷酸。因而，本过程起初的循环将按下进行(只考虑颗粒P1)。假定在步骤(g)结束时，颗粒P1有二条共价固定的链Z及二条同链Z杂交的链X。在第一次重复步骤(d)-(n)时，随之的结果将是4条链X和链Z。在下一次重复后将每链有8条，等等。然而这种指数增长将受到固定于支持物上的寡核苷酸数目的限制。这样，步骤(g)中合成的杂交链的量将渐渐增至这样的水平在随后的变性和再杂交步骤中(步骤(d)和(e))，一些链X将同未延伸的寡核苷酸杂交。而另外一些将同链Z杂交，而链Z是通过延伸固定的引物得到的。最后，所有固定引物都将被延伸并且颗粒P1上的双链核酸将会饱和。(该结论对于P2同样有效)。
双链核酸可以从支持物上切下来(用合适的限性酶)。另一办法是将步骤(g)中得到的靶2链拷贝产物经变性从支持物上解离下来。然后重复下列步骤，用其来产生按线性增长的靶2链拷贝。(i)将引物CCCC和TTTT同固定的靶1链拷贝杂交，(ii)延伸引物，并且(iii)变性并收集延伸产物(即靶2链拷贝)。
现在来谈图3，该图显示了图2所示方案的一个改进方案。图3中的方案以一双链核酸开始，其中其X链有任意序列，正如图示。在5′端为A，3′端为B，而另一条链则有任意末端序列C、D(A同C互补，B同D互补)。在A和B之间，部分的X链为序列L，同Y链上的序列M互补。
提供两类颗粒P1和P2。颗粒P1上带有大量的序列为M的寡核苷酸，后者通过5″末端固定于(颗粒支持物P1)上。颗粒P2上带有大量的序列为L的寡核苷酸，后者通过5′末端固定于(颗粒支持物P2)上。
图3中的方案同图2中的一样，也包括方案的各个步骤，因此不再赘述。但下列几点需要指出在图2的方法中，两个固定的寡核苷酸(TTTT和CCCC)使得合成出的靶1链拷贝有互补的碱基序列。这是由于一条寡核苷酸(CCCC)同序列X的末端相对应，而另一寡核苷酸(TTTT)同序列Z链的另一末端相对应。
与之相比，在图3的方法中，链X是通过其中间区L同颗粒P1上的寡核苷酸M相杂交并且链Z是通过其中间区M同颗粒P2上的寡核苷酸L相杂交。在下面的延伸步骤中(步骤(c))，颗粒P1上产生的靶1链拷贝有如下序列5′M……………………………C3′同时颗粒P2上产生的则有如下序列5′L……………………………B3′这样，这二种靶1链拷贝是不互补的。
在步骤(e)中，颗粒P1上靶2链拷贝产物的序列为3′L……………………………A5′这代表了部分的原始链X的拷贝，同样，颗粒P2产生的靶2链拷贝产物的序列为3′M……………………………D5′也只代表了部分的原台链Z的拷贝。
现在来说明图4，图4显示了本发明的第二种实施方案。
本方法以双链DNA开始，DNA含二链X、Y。在柱中用了二种颗粒P3和P4。
第一种颗粒P3上，寡核苷酸GGGG(通过其3′末端)固定于P3上，其可同链X的5′末端杂交。
寡核苷酸AAAA(也通过其3′末端)固定于另一种颗粒P4上，其将与链Z的5′末端区杂交。
变性靶DNA并同颗粒P3和P4杂交后，清洗颗粒去除污染物(同前)。杂交反应捕获感兴趣的序列。
加入两种游离产物(CCCC和TTTT)并同颗粒结合的DNA杂交。引物(TTTT)将同链X3′末端区杂交。另一引物(CCCC)将同链Z的3′末端杂交(步骤c)。
然后清洗颗粒来除去多余的试剂。
向柱中加入酶的核苷酸(也有这样的可能，即此步中同时加入引物)并且进行延伸反应，延伸反应将引物向支持物的方向延伸，但不连接到固定的寡核苷酸上(步骤d)。“**”在步骤(d)产物中代表延伸产物不同固定的寡核苷酸连接。
加入DNA连接酶使延伸(引物所得的)产物同固定的寡核苷酸连接，这样就产生了固定于支持物上的靶1链拷贝(步骤e)。
在变性和再杂交后(步骤f)，再加入二种引物TTTT和CCCC。引物TTTT，同P4颗粒上的靶1链拷贝的3′末端杂交，并且也同颗粒P3上的已杂交的核酸杂交。同样，引物CCCC也同固定于颗粒P3上的靶1链拷贝3′末端杂交，并且亦同颗粒P4上的已杂交的核酸杂交。
清洗柱子以除去过剩试剂。加入聚合酶及核苷酸并进行延伸反应(步骤g和h)。引物照图所示延伸(产生靶2链拷贝)，然后(在清洗柱后)来进行连接反应，来完成在支持物P3和P4上的靶1链拷贝的制备。
步骤(f)-(i)可按所需次数重复以生成大量的靶1拷贝链和靶2拷贝链。后者最终被作为产物收集而前者(固定于其支持物上)可用来按前述的办法生产更多的靶2链拷贝。
现在来谈图5，该图显示了图4中方案的一个改进方案。
同图3中相同，图5中方案也以同样的双链DNA开始。此外，图5中的方法用二种类型的颗粒，称为颗粒P3，序列为M的寡核苷酸通过其3′末端固定于P3上，颗粒P4，序列为L的寡核苷酸通过其3′末端转化于P4上。
图5中的方法的各步反应次序同图4中的一样。图5中的方法的产物包括固定有靶1链拷贝序列的支持物3′M…………………………D5′和3′L…………………………A5′这些支持物可用来产生更多的这些序列5′L…………………………B3′和5′M…………………………C3′这些序列存在于原双链核酸中。
现在来说明图6，该图叙述了一种方法，该方法同本发明的第三种实施方案一致，是图2和图4中方法的结合。在图6的方法中，第一种类型的颗粒通过3′末端(参看图2中的P1颗粒)P5捕获序列X(原始双链核酸中的X序列)。第二种类型的颗粒P6则通过5′末端(参看图4中的颗粒P4)来捕获序列Y。
总的反应流程在图6中描述。颗粒P5上进行的反应顺序同颗粒P1上进行的很相似。P6上进行的各反应步骤则同颗粒P4上进行的一致。尽管颗粒P5和P6在一个柱中，但P6上发生的直接反应对P5无影响。
图6的方法中产生的支持物可用来产生增量的X和Y序列，X和Y序列是存在于原始核酸中的。
图6中的方法可以经改进而按图7所示进行操作，它也是从图3中所示的核酸类型开始。在图7中，颗粒P5上具有序列为M的并通过5′末端固定于P5上的寡核苷酸(参见图3中的P1颗粒)，同样，P6颗粒上具有序列为L的并通过其3′末端固定于P6上的寡核苷酸(参看图5中的P4颗粒)。图7中的反应的顺序同图5或图6中的相同。在这些步骤中，颗粒P5的功能同图3中的颗粒P1相同，而颗粒P6的功能同图5中的颗粒P4的目同。
图7中的方法产生的支持物可用来生成增量的下列序列3′M…………………………C5′和3′L…………………………A5′这些序列存在于原始核酸样品中。
参考下面非限定性的实施例，该发明通过实施例来阐述。实施例1在本实施例中，“缓冲液”指包括10mM Tris-HCl pH8.3，50mM KCl和1.5mM MgCl2的组合物。
24聚体寡核苷酸序列如下(I)(I)5′GGC GTC ATC ATG GTC ATA GCT GTT 3′将(I)通过其5′末端固定于颗粒支持物上(大小为105μm)，该颗粒以M-相的名子在3M有售，固定是用WO-A-93/13220(Tepnel)中描述的方法通过硅氧烷基质的实现的。每克颗粒支持物中含50μmol的过量的序列(I)。
在5个流过柱(flow through)装置中每个装入2mg的支持物，柱子内径为2mm。支持物通过相距10mm的二块过滤器板(frits)保持其位置。
向每个柱中加入25fmol的溶于缓冲液中的48聚体寡核苷酸，其序列(II)为(II)5′AGC GGA TAA CAA TTT CAC ACA GGA AAC AGC TATGAC CAT GAT TAC GCC 3′然后将柱子在95℃保温10分钟。将温度减至72℃。这一流程将使序列(II)同固定的序列(I)杂交。
用缓冲液清洗柱子，并将温度降至57℃，再向柱中加入缓冲液，其中含有4种dNTP，每种0.2mM，以及1.25单位的聚合酶(栖热水生菌)。
将柱子保温于57℃2分钟以与之杂交的48聚体寡核苷酸作模板延伸固定的24聚体寡核苷酸(序列(I))。
然后将柱子的温度增至95℃，保温2分钟使48聚体序列(II)同延伸序列(I)变性解离。
将柱温冷却至72℃，向其中加入缓冲液，该缓冲液含有4种dNTP，每种0.2mM，以及1.25单位聚合酶(栖热水生菌)和25pmol的生物素化的24聚体寡核苷酸，其序列(ii)为(III)5′AGC GGA TAA CAA TTT CAC ACA GGA 3′在72℃下保温2分钟以使序列II同未经延伸的序列(I)杂交，并使序列(III)同已延伸的序列(I)杂交。然后将柱子冷却至57℃，保温2分钟以延伸序列(I)和(III)。
收集一个柱子中的支持物作下面叙述的检测步骤之用。
剩下的柱子用上面详述的方案再作以下的循环95℃变性(2分钟)，加入序列(II)并在72℃再杂交(2分钟)，57℃延伸(2分钟)(尽管可用更短的时间)。在4个、9个、19个和29个循环后，收集支持物。(因此这些样品分别经过了5次、10次、20次和30次的延伸反应)。
空白的实验按下面所述进行。(a)一个柱子中含有其上固定有序列(I)的支持物及缓冲液。该柱用上面所述的方案来进行循环，但不向其中补加核酸或反应试剂。
所有收集到的样品均用于下面的检测方案。
收集的颗粒同链霉亲和素-碱性磷酸酶复合物反应。过量的复合物经洗涤移去，然后用商业出售的碱性磷酸酶检测系统(Ampak exDako)来处理颗粒。处理能使样品随时间而显色并可在490nm下观测。结果见图8，该图为吸收值对扩增温育时间作图。图9是吸收值变化率对样品经历的延伸循环数作用。
从这些数据可清楚地看出扩增是指数扩增。实施例2除了序列(I)、(II)和(III)用下列序列(Ia)，(Iia)和(IIIa)分别代替之外，实施例1中的方案被重复应用。(Ia)5′ AGC GGA TAA CAA TTT CAC ACA GGA 3′(IIa)5′ GGC GTA ATC ATG GTC ATA GCT GTT TCC TGT GTGAAA TTG TTA TCC GCT 3′(IIIa)5′GGC GTA ATC ATG GTC ATA GCT GTT 3′此外，对照实验照下面的进行(b)用非互补(同序列(I))的生物素化的24聚体寡核苷酸作探针检测一个含有已延伸的序列(I)的柱，该探针序列为5′CGC CAT TCA GGC TGC CGA ACT GTT 3′(c)一个柱子，其上含有固定有已延伸的序列(I)的支持物，保温于4℃中作为循环为0的对照。
结果分别作图，即图10和图11。可再次看出扩增是按指数进行的。
应该理解序列(II)和(Iia)是互补的。因为这样就可通过用固定有序列(I)的颗粒同固定有序列(Ia)的颗粒的组合来实现序列(II)和(IIa)的扩增。
权利要求
1.一种生成至少是部分存在或潜在存在于样品中的核酸链(靶链)拷贝的方法，该方法包括以下步骤(i)提供一种固相支持系统，其上固定有大量的能同靶链杂交的单链寡核苷酸。(ii)提供了靶链的单链形式并将其同支持物上的寡核苷酸杂交，寡核苷酸的数量要大大超出靶链的数量，(ii)(a)清洗支持系统以除去未杂交的物质，(iii)生成靶1链的拷贝，该拷贝掺入有固定的寡核苷酸及包含同至少是部分靶链互补的核苷酸序列，也就是说生成的靶1链拷贝至少有一部分是以靶链为模板而生成的，并且，如果需要，可完成靶1链拷贝序列形成。(iv)变性同靶1链拷贝杂交的核酸链并且可选择使至少是部分的前述链同支持物上的未转变成靶1链拷贝的寡核苷酸再杂交。(v)同时，(a)用固定于固相支持物上的靶1链拷贝为模板来合成(从杂交于靶1链拷贝的引物上合成)靶2链拷贝，靶2链拷贝含有感兴趣的核酸序列，且(b)若靶链已同固定的寡核苷酸杂交，则可用其作为模板来合成更多的至少是部分的靶1链拷贝，并且(若需要)完成靶1链的形成，并且(vi)按所需次数重复步骤(iv)和(v)，每次重复步骤(iv)和(v)均用靶2链拷贝来生成更多的靶1链拷贝。
2.权利要求1的方法，其中的固相支持系统是一种颗粒系统，寡核苷酸被固定于颗粒上，
3.生成至少是部分核酸链(靶链)的拷贝的方法，靶链存在或潜在存在于样品中，本方法包括步骤(i)提供一种颗粒固相支持系统，其上固定有大量的能同靶链杂交的单链寡核苷酸，(ii)提供了靶链的单链形式并且使靶链同固定于支持物上的寡核苷酸杂交，寡核苷酸的数量要大大超过靶链的数量，(iii)生成靶1链拷贝，该拷贝包括固定的寡核苷酸及同至少是部分靶链互补的核酸序列，即生成的靶1链拷贝至少有一部分是以靶链为模板而合成的，并且，如果需要，可完成靶1链拷贝序列的形成，(iv)变性同靶1链拷贝杂交的核酸链并且可选择使至少部分的前述的链同支持物上的尚未转变成靶1链拷贝的寡核苷酸再杂交，(v)同时，(a)用固定于固相支持物上的靶1链拷贝为模板来生成(从杂交于靶1链拷贝的引物上合成)靶2链拷贝，靶2链拷贝含有感兴趣的核酸序列，且(b)若靶链已同固定的寡核苷酸杂交，则可用其作为模板来进一步合成更多的至少是部分的靶1链拷贝，并且(若需要)完成靶1链拷贝的形成，并且(vi)按所需次数重复步骤(iv)和(v)，每次重复步骤(iv)和(v)均用靶2链拷贝来生成更多的靶1链拷贝。
4.权利要求3的方法，其中在步骤(ii)后，在执行步骤(iii)前清洗支持系统以移去未杂交的物质。
5.权利要求2到4的任一项的方法，其中颗粒是非多孔性二氧化硅
6.权利要求2到5任一项的方法，其中颗粒的大小在50到200微米。
7.权利要求2到6任一项的方法，其中寡核苷酸是通过硅氧烷基质固定于支持物上的。
8.权利要求2到7的任一项的方法，其中颗粒是在柱子中，液体可方便地加入或移出柱子。
9.权利要求1到8的任一项的方法，其中所有的或基本上所有的固定于支持物上的原始寡核苷酸都转变成靶1链拷贝。
10.权利要求1到9的任一项的方法，其中支持物上的寡核苷酸的方向使得它们可以用靶链作为模板进行延伸或者是用杂交于其上的靶2链拷贝作为模板进行延伸，以产生靶1链拷贝。
11.权利要求2的方法，其中固相支持系统上包含两种不同的固定的寡核苷酸，其方向如权利要求10中所述，一种的方向是使其能同双链核酸的一条链杂交，另一种的方向是使其同双链核酸的另一条链杂交。
12.权利要求1到9的任一项的方法，其中靶1链拷贝是这样产生的，使引物同已经与固定的寡核苷酸杂交的靶拷贝或靶2链拷贝杂交，然后在步骤(v)(b)中向着寡核苷酸方向延伸引物，最后通过与寡核苷酸的连接来完成靶1链拷贝的制备。
13.权利要求11的方法，其中固相支持物上包含两种不同的固定的寡核苷酸，其方向和权利要求12中所述，一种的方向是使其能同双链核酸的一条链杂交，另一种的方向是使其能同核酸的另一条链杂交。
14.权利要求1到13的任一项的方法，其中固相支持系统包含两种固定的寡核苷酸，包括(i)第一种可通过延伸其自身来生成靶1链拷贝的寡核苷酸，(ii)第二种(为了生成靶1链拷贝)需要同引物延伸生成的产物连接的寡核苷酸，引物同靶链杂交。
15.产生至少是部分存在于或潜在存在于样品中的核酸链拷贝的方法，该方法包括下列步骤(i)提供了一种固相支持系统，其上固定有大量的两种单链寡核苷酸0和0′中的每一种，每种寡核苷酸可同双链核酸互补链中的一条杂交，互补的核酸二条链称为靶1链和靶1′链，(ii)提供单链形式的靶1和靶1′链并使之同支持物上的寡核苷酸杂交，寡核苷酸的数量要基本超过靶链的数量，(iii)生成靶1和1′链拷贝，每个拷贝均包含各自的寡核苷酸0或0′且核酸序列至少有一部分同靶1或靶1′链分别互补，即生成的靶1和靶1′链拷贝至少有一部分是以各自的靶链作为模板而合成的，并且，若需要，完成靶1序列和/或靶1′序列的拷贝的形成，(iv)变性同靶1和靶1′链拷贝杂交的靶1和靶1′链并且可任选将至少是部分的靶1和靶1′链同支持物上的尚未转化成靶1链或靶1′链拷贝的寡核苷酸再杂交，(v)同时(a)用固定于固相支持物上的靶1和靶1′链拷贝作为模板来分别生成(从与靶1和靶1′链拷贝杂交的引物上生成)靶2和靶2′链拷贝并且(b)如果靶1和靶1′链拷贝已同固定的寡核苷酸杂交，则可以将其作为模板来进一步生成更多的至少是部分的靶1和靶1′链拷贝，并且(如果需要)可完成靶1链拷贝的形成，并且(vi)按所需次数重复步骤(iv)和(v)，每次重复步骤(iv)和(v)均用靶2和靶2′链拷贝来生成更多的靶1和靶1′链拷贝。
16.此前任意一项权利要求的方法还包括以下步骤(vii)将引物同靶1链拷贝在特定位点杂交以使用靶1链拷贝作为模板来延伸引物得到的产物含有感兴趣的序列，(viii)用靶1链拷贝作为模板延伸引物，并且(ix)将产物链从靶1链拷贝上变性解离。收集产物链。
17.生产至少是部分核酸链(“靶链”)拷贝的方法，把链存在于或潜在存在于样品中，该方法包括的步骤有(i)提供了一种固相支持系统，其上固定有大量的单链寡核苷酸，寡核苷酸能同靶链杂交，(ii)提供了靶链的单链形式，并使之同支持物上的寡核苷酸杂交，寡核苷酸的数量大大超过靶链的数量，(iii)产生靶1链拷贝，其包括固定的寡核苷酸以及含有至少有一部分同靶链互补的核酸序列，即生成的靶1链拷贝其序列至少有一部分是以靶链作为模板而生成的，并且，如果需要，可完成靶1序列拷贝的形成，(iv)将同靶1链拷贝杂交的链变性并且可任选将至少是部分的前述链同支持物上的尚未转化成靶1链拷贝的寡核苷酸再杂交，(v)同时(a)用固定于固相支持物上的靶1链拷贝作为模板来生成(从同靶1链拷贝杂交的引物上)靶2链拷贝，靶2链拷贝中含有感兴趣的核酸序列，并且(b)若靶链已同固定的寡核苷酸杂交，则可以其作为模板来进一步合成更多的至少是部分靶1链的拷贝，并且(如果需要)可完成靶1链拷贝的形成，且(vi)按所需次数重复步骤(iv)和(v)，每次重复均可用靶2链拷贝来进一步生成更多的靶1链拷贝。(vii)将引物同靶1链拷贝在特定位点杂交以使用靶1链拷贝为模板延伸的延伸产物包含有感兴趣的序列(viii)用靶1链拷贝作为模板来延伸引物，并且(ix)将产物链从靶1链拷贝上变性解离并收集该产物链。
全文摘要
公开了一种方法，该方法用固定在固相支持物上的寡核苷酸来扩增核酸。靶核酸链(样品中待分析)同寡核苷酸杂交并且用靶链作为模板来生产靶链拷贝(包含固定的寡核苷酸)。将靶链从靶链拷贝上变性解离并同未延伸的寡核苷酸再杂交。在下一步中，从与靶链杂交的寡核苷酸上合成出新的靶(1)链拷贝，并且用前面生成的靶(1)链拷贝可同时合成出靶(2)链拷贝。按所需的次数不断重复下列步骤变性，再杂交，生成靶(1)和靶(2)链拷贝，就可以得到理想的扩增度。
文档编号C12Q1/68GK1152946SQ9519420
公开日1997年6月25日 申请日期1995年5月30日 优先权日1994年5月28日
发明者S·J·明特 申请人:特普尼尔医学有限公司