专利名称：与主要组织相容性复合体i类重链表达负调节有关的人巨细胞病毒基因区域的鉴定的制作方法
技术领域：
本发明涉及感染后不会负调节细胞MHC I类重链表达的重组突变体人巨细胞病毒(HCMV)。
背景技术：
人巨细胞病毒(HCMV)是一种β疱疹病毒，它会在免疫减弱和免疫抑制的成人，以及在子宫中或在围产期被感染的婴儿中引起严重的临床疾病(Alford和Britt，1990)。230-kb的HCMV双链DNA基因组已测序(Chee等，1990)，它至少具有200个可读框架(ORF)。出于本申请的目的，可读框架定义为某基因的一部分，它编码一串氨基酸因而可能编码某种蛋白质。某些HCMV蛋白因其与其它病毒(尤其是单纯疱疹病毒)或细胞蛋白的同源性，其功能是已知或可预测的。但是，大多数HCMV ORF所编码蛋白的功能是未知的。
为了研究HCMV基因的功能，可构建HCMV缺失突变体以评价其体外生长特性(Jones等，1991；Jones和Muzithras，1992)。出于本申请的目的，缺失突变体定义为缺失了部分野生型病毒基因组的人巨细胞病毒突变体。该方法涉及用一个原核细胞报道基因(通常为β-葡糖苷酸酶，但也可使用鸟苷磷酸核糖转移酶)定点置换诱变选定的HCMV基因。以此方式，重组病毒只有在被置换的病毒基因是非必需基因时才能被分离。
有研究者证明，HCMV感染会导致细胞MHC I类重链的负调节(Browne等，1990；Beersma等，1993；Yamashita等，1993)。出于本申请的目的，负调节定义为MHC I类重链的合成、稳定性或表面表达的下降。对其它DNA病毒也报道过此类现象，例如腺病毒，鼠巨细胞病毒和单纯疱疹病毒(Anderson等，1985；Burget和Kvist，1985；del Val等，1989；Campbell等，1992；Campbell和Slater，1994；York等，1994)。在腺病毒和单纯疱疹病毒系统中，体外复制非必需的病毒基因的产物足以引起MHC I类重链的负调节(Anderson等，1985；Burget和Kvist，1985)。还未鉴定出与鼠巨细胞病毒负调节有关的基因。
发明概述本发明提供了重组突变体人巨细胞病毒，它不会在感染后负调节细胞MHCI类重链的表达。在含有可读框架IRS-1-US11的重组巨细胞(HCMV)突变体基因组区域内制造了基因序列的缺失。同样缺失了可读框架US2-US11的两个此类突变体RV798和RV799都失去了负调节MHC I类重链的能力。
本发明还提供了一种在感染了巨细胞病毒的细胞中调控主要组织相容性复合体(MHC)I类表达的负调节的方法，该方法使用了重组突变体人巨细胞病毒。
本发明还提供了使用了重组突变体人巨细胞病毒的疫苗，以及通过施用免疫原性量的重组突变体人巨细胞病毒来预防或降低个体对急性巨细胞病毒易感性的方法。含可读框架IRS-1-US11的重组巨细胞病毒(HCMV)突变体基因组区域中基因序列缺失的活减毒HCMV疫苗能够引起优于含此基因区域的疫苗的免疫应答，因为前者不引起I类的负调节。所以，缺失了此区域的病毒是有利的免疫原。
本发明还提供了基因治疗载体，其中，涉及MHC I类重链负调节的HCMV基因可整合入腺病毒载体或类似的以病毒为基础的基因治疗载体中，以尽可能减弱免疫应答。这将允许使用重组的腺病毒或类似的以病毒为基础的用于基因治疗的基因治疗载体。
参照以下附图将能够更充分地理解本发明。
图1显示的是利用免疫荧光流式细胞计数法进行的在HCMV感染细胞中细胞表面MHC I类的检测。用所示病毒以感染倍数5PFU/细胞感染人包皮成纤维(HFF)细胞72小时。此时，将细胞与1％的仲甲醛混合，并先用HLA-A、B、C(W6/32)特异的第一抗体或对照的鼠IgG(同种型匹配的)、然后用第二抗体FITC结合的山羊抗鼠IgG染色。使用Immuno Program，Coulter MDADS1，根据前向角光散射比log积分的90°光散射计算阳性细胞(总共5×103个)百分比和平均荧光强度(MFI)。
图2显示在HCMV野生型AD169株感染的细胞中MHC I类重链的表达。图2A是Western印迹分析。HFF细胞不经感染(U)或用5PFU/细胞的感染倍数感染。在感染后24、48和72小时，收获总细胞蛋白，通过15％ SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳印迹到硝酸纤维素膜上，使用ECL化学发光检测试剂盒(Amersham)，用TP25.99鼠单克隆抗体(MHC I类重链上一非构象型表位特异性)检测。在不加或加有(+PFA)膦酰基甲酸条件下，对HFF细胞不进行感染或如上进行感染，在感染后晚期(69-73小时)放射性标记4小时(图2B)或在感染后指定的时刻标记2小时(图2C)。放射性标记后立刻收获蛋白质，然后用TP25.99鼠单克隆抗体免疫沉淀I类重链。
图3显示重组病毒基因组的结构。图3A，第一行是HCMV野生型基因组的总体结构图。单一区序列用线表示，重复区序列用阴影框表示。L和S部分内的相关Hind III片段(Oram等，1982)用字母指示表示。第二行是野生型的S部分内Hind III片段Q、X和V区域的放大。重要的可读框架及其取向(Chee等，1990)用空心框表示。IRs重复序列的位置用阴影矩形表示。给出了HindIII(H)和XhoI(X)限制性核酸内切酶位点位置。图3B-I显示所示HCMV突变体的基因组结构。各图中，第一行都是AD169野生型基因组的结构，第二行代表用于制造重组病毒的线性化质粒的相关序列。斜线表示病毒侧翼序列的边界，这些序列可能与生成所需突变的同源重组有关。缺失区用第一行下的阴影框表示。图3J显示RV799的衍生化与结构。第一、二行与图3B-I的相同，第三行表示从RV134亲代(第二行)制造RV799所用线性化质粒的相关序列。
图4A-C显示被HCMV突变体感染的细胞内重链表达的分析。以所示病毒感染(感染倍数5PFU/细胞)或不感染(U)HFF细胞，然后在感染后晚期(69-73小时)放射性标记4小时。放射性标记后立刻收获蛋白质。图4A是TP25.99鼠单克隆抗体免疫沉淀的I类重链的放射显影图。图4B是证实近乎相当的放射性标记效率的全部放射性标记蛋白的放射显影图。图4C是证实通过病毒复制循环后相当的进展情况的放射显影图。UL80蛋白是用抗装配蛋白兔多克隆抗血清免疫沉淀的。
图5A-C显示被RV789、RV799、RV134或AD169野生型感染细胞的I类重链免疫沉淀。HFF细胞用所示病毒感染(感染倍数5PFU/细胞)或不感染(U)HFF细胞，然后在感染后晚期(71-73小时)放射性标记2小时。放射性标记后立刻收获蛋白质。图5A是用TP25.99鼠单克隆抗体免疫沉淀的I类重链放射显影图。如图4B和4C所述，证实了相当的放射性标记效率(图5B)和通过病毒复制的进展情况(图5C)。
图6是显示RV798感染细胞中合成的I类重链的内切糖苷酶H敏感性的放射显影图。用RV798感染(感染倍数5PFU/细胞)或不感染(U)HFF细胞，然后在感染后早期(6-8小时)或感染后晚期(80-82小时)放射性标记2小时。为了用于比较，未感染的细胞放射性标记2小时。蛋白质在放射性标记后立刻收获(脉冲)或在完全未标记的培养基中追踪2小时后收获(追踪)。用TP25.99鼠单克隆抗体免疫沉淀I类重链。免疫沉淀的蛋白质加(+)或不加(-)1.5mU的内切糖苷酶H孵育6小时，然后进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳及荧光显影。
图7A-C显示被RV798、RV7181、RV7177或AD169野生型感染细胞的I类重链免疫沉淀。用所示病毒感染(感染倍数5PFU/细胞)或不感染(U)HFF细胞，然后在感染后晚期(65-67小时)放射性标记2小时。在放射性标记后立刻收获蛋白质。图7A是用TP25.99鼠单克隆抗体免疫沉淀的I类重链的放射显影图。如图4B-C所述，证实了相当的放射性标记效率(图7C)和通过病毒复制的进展情况(图5C)。
图8A-D是利用了免疫荧光术的显示被感染细胞内US11基因产物(gpUS11)位置的照片。用AD169野生型或RV699(US11基因缺失)感染(感染倍数5PFU/细胞)或不感染(U)HFF细胞。8小时后，将未感染和感染的细胞与4％的仲甲醛混合。然后用0.2％ Triton X-100透化某些细胞。第一抗体是针对US11融合蛋白产生的兔多克隆抗血清(Jones和Muzithras，1991)。用Zeiss显微镜目测荧光度。
图9A-D显示细胞经HCMV突变体感染后早期其中重链表达的分析。用所示病毒感染(感染倍数5PFU/细胞)或不感染(U)HFF细胞，然后在感染后6-10小时放射性标记4小时。放射性标记后立即收获蛋白质。图9A是用TP25.99鼠单克隆抗体免疫沉淀的I类重链的放射显影图。图9B是一张放射显影图，其中为了证实近乎相当的感染情况，用鼠单克隆抗体9221免疫沉淀72-kDa IE1极早期蛋白。图9C是用鼠单克隆抗体Ber-T9进行的细胞运铁蛋白受体免疫沉淀的放射显影图，为的是证实该糖蛋白近乎相当的表达。图9D是为了证实近乎相当的放射性标记效率的全部放射性标记蛋白的放射显影图。
图10提供了用野生型和突变型HCMV感染的HFF细胞的MHC I类重链表达数据的归纳。第一行是HCMV野生型基因组的总体结构，第二行是野生型S部分的Hind III-Q和-X区域的放大。ORF用无阴影矩形指示；与US4和US5重叠的未标明ORF是US4.5。各种HCMV突变体中的缺失用阴影矩形表示。RV670缺失IRS1-US9和US11；RV35缺失US6-US11；RV67缺失US10-US11；RV80缺失US8-US9；RV725缺失US7；RV69缺失US6；RV47缺失US2-US3；RV5122缺失US1；RV46缺失IRS1；RV798缺失US2-US11；RV7181缺失IRS1-US9；RV7177缺失IRS1-US6；RV7186缺失IRS1-US11。通过免疫沉淀实验(使用重链构象非依赖性单克隆抗体，TP25.99)得出MHC I类重链的负调节结果，实验中，HCMV感染的HFF细胞在感染后晚期放射性标记。最后一行显示含有足以进行MHC I类重链负调节的基因的两个亚区的位置。亚区A含有ORF US2至US5(碱基193119-195607)，亚区B含有ORF US10至US11(碱基199083-200360)。
图11A-B是表达HCMV US11基因细胞系的Western印迹。用US11表达质粒稳定转化未感染的人U373-MG星形细胞瘤细胞，分别用TP25.99单克隆抗体和US11多克隆抗血清通过Western印迹分析细胞的MHC I类重链表达(图11A)和US11表达(图11B)。
优选实施例的说明构建表达某标记基因(β-葡糖苷酸酶)(该基因取代了一组病毒基因)的重组HCMV突变体RV670。以此突变体感染人成纤维细胞后，主要组织相容性复合体(MHC)I类重链的表达并不象野生型HCMV感染此类细胞时那样被降低。
与野生型HCMV不同，本发明的病毒并不负调节细胞的MHC I类重链蛋白的表达。在本发明中利用了HCMV基因组中含有重链表达负调节必需基因的一段7kb区域。
本领域熟练技术人员应该知道，需要有效的抗原加工和呈递以激活和扩增有效的用于细胞介导的免疫应答的细胞毒性T淋巴细胞前体。有效的病毒抗原呈递要求在感染全过程中MHC I类蛋白的持续表达。用RV670感染细胞能够产生I类重链的持续表达。
本领域熟练技术人员应该知道，病毒(RV670)或具有类似基因缺失的其它人巨细胞病毒可被用于生产有效的活疫苗，因为I类重链在RV670感染细胞中仍象在非感染细胞中一样得以表达，并由此产生为了引发细胞毒性T细胞应答的病毒抗原呈递。
在本发明中，流式细胞计数和免疫荧光实验证实，在HCMV野生型8169株感染的HFF细胞中，I类重链的细胞表面表达在感染后晚期严重降低。放射性标记-免疫沉淀实验显示，从感染后很早(3小时)开始，新合成MHC I类重链的负调节发生于感染的全过程(图2C)。这种降低据报道是在转译后水平I类重链在HCMV感染细胞中的周转速度高于其在非感染细胞中(Beersma等，1993)。这种I类重链的不稳定性因病毒肽将不能有效呈递而降低了细胞介导的对HCMV感染的免疫应答。因此，就在确立持久的或潜在的HCMV感染中躲避宿主的免疫系统而言，I类重链表达的降低是十分重要的(Gooding，1992)。
我们筛选出HCMV突变体库，代表了18个ORF，它们就其在组织培养中的病毒复制以引起MHC I类重链负调节的能力而言是非必需的。HCMV基因组S部分中一段7kb区域(含有ORF US2-US11，碱基193119-200360)清楚地显示出含有这种表型所必需的基因(数据归纳于图10)。在此区域内，有两个亚区，每个都含有足以进行重链负调节的基因。
亚区A具有ORF US2-US5(碱基193119-195607)。US2和US3被认为编码膜糖蛋白(Chee等，1990)。US3是差异剪接基因，在病毒复制循环的全过程中表达，编码着一种具有转录反式激活功能的蛋白质(Tenney和Colberg-Poley，1991；Colberg-Poley等，1992；Tenney等，1993；Weston，1988)。此亚区内还有几个较小的ORF(位于ORF US3和US5之间)，但它们的表达特征或功能未有报道。据Gretch和Stinski报道，有一段1.0kb的从HCMV基因组该区域转录的早期mRNA，但未对其精细作图。迄今还不知道这些基因中那些与重链的负调节有关。
亚区B也足以引起MHC I类重链的负调节，它含有US10和US11基因(图10)，碱基199083-200360。但是，根据使用表达野生型US10基因产物水平的HCMV突变体RV67得到的数据，US10的表达不足以引起重链表达的负调节(图2B)。遗传数据暗示，US11基因产物是必需的。我们证明，在不含其它MCNV蛋白时，US11的表达足以在稳定转化的非感染细胞中引起MHC I类重链的负调节(图11)。以上两个ORF的RNA和蛋白质表达都开始于早期且贯穿感染的全过程(Jones和Muzithras，1991)；US10和US11分别编码22kDa(gpUS10)和32kDa(gpUS11)糖蛋白；两种糖蛋白都具有N连接的糖残基，它们完全是内切糖苷酶H敏感性的。这些糖蛋白存在于内质网或高尔基体内侧中。与此结论相一致的是免疫荧光数据显示在细胞表面未测得gpUS11，但其可在HCMV感染细胞的细胞质中测得(图8)。HCMV gpUS11(以及gpUS10)的特征与腺病毒2型E3区域编码的25kDa糖蛋白(E3-19K)相似。Ad E3-19K不是病毒复制所必需的。已证明，其特征为含有内切糖苷酶H敏感性的N连接糖残基，存在于内质网中，以及与I类重链结合，因而能够防止其向细胞表面9的运送(Anderson等，1985；Burgert和Kvist，1985)。与Ad E3-19K相反，没有发现gpUS11(或gpUS10)与I类重链之间的直接关联(即通过共免疫沉淀)(未给出数据)。
鉴定US2-US11基因区域作为HCMV基因组的MHC I类重链负调节必需区有几方面的意义。如上所述，在感染全过程中基因组此区域的表达起着干扰有效的细胞介导的免疫应答的作用。供激活和扩增细胞毒性T淋巴细胞(CTL)前体群的抗原呈递需要有MHC I类分子的表面表达(Schwartz，1985)。此外，它们也是已激活的CTL识别目标所必需的(Zinkernagel和Doherty，1980)。在MCMV中，针对主要极早期蛋白的CTL能够避免此病毒的致命感染(Jonjic等，1988)。但是据报道，在HCMV感染个体中，针对同源HCMV极早期蛋白IE1的CTL极少(Gilbert等，1993)。最近的研究表明，以干扰素-γ处理过的HCMV感染的细胞呈递IE肽比未处理过的细胞更有效(Gilbert等，1993)。干扰素μ引起MHC I类蛋白表面表达的增加。因此，提高HCMV感染的细胞中I类重链的表达在有效产生IE特异的CTL或针对其它重要的HCMV抗原的CTL方面可能是重要的。US2-US11基因区域缺失的HCMV突变体具有此效果，因为以此突变体感染细胞时I类重链并不被负调节。所以，在开发诱导有效抗HCMV免疫应答的活HCMV疫苗中，病毒基因组此区域的缺失是重要的。
几年前，有报道称HCMV UL18 ORF编码一种类似MHC I类重链的蛋白质(Beck和Barrell，1988)。HCMV感染细胞中重链的负调节被假设为是由于UL18基因产物对β2-微球蛋白的竞争，该竞争有效地防止了正常情况下I类重链与β2-微球蛋白的结合(Browne等，1990)。UL18缺失的HCMV突变体仍保持其负调节重链表达的能力，此假设因而被否认(Browne等，1992)。仍有可能，UL18基因的产物只是多个HCMV基因中的一个，其表达足以导致此表型。但是，本发明的数据显示，只有US2-US11区域内的基因才足以负调节I类重链。
有两种互不相关的机制都能引起MHC I类表达的负调节，强调了这种表型对在宿主中有效感染和抗性的重要性。一种机制可能是另一种机制的支持体系，但也可认为每一体系都有其细胞类型特异性。在HFF细胞体系中，两种机制都有效。但是，在U373-MG细胞中，重链表达的负调节更多地依赖于亚区A。此时，在与亚区B基因产物相互作用的细胞蛋白质其质及量方面可能存在差异。在单纯疱疹病毒体系中也存在类似情况。据最近的报道，88个氨基酸的US12基因产物足以在内质网中与I类重链螯合(York等，1994)。但是，在单纯性疱疹病毒感染的鼠细胞中，重链的表达不受影响，但ICP47蛋白在那些细胞中有表达，在HSV感染的人成纤维细胞体系中鼠的重链表达被负调节(York等，1994)。
可制备一种含有本发明重组HCMV突变体的药物组合物，此突变体中的基因组缺失了足以在被感染细胞中负调节MHC I类表达的基因序列。在药物组合物中可使用稳定剂或其它合适的载体。
正如前述的，缺失了MHC I类表达负调节基因序列的本发明重组HCMV突变体可用于预防巨细胞病毒感染的疫苗中。该疫苗在药学上认可的载体中含有有效量的重组HCMV突变体。疫苗中可加也可不加佐剂。
个体施用以免疫原性量的本发明重组HCMV突变体可对个体进行针对巨细胞病毒免疫，此突变体中缺失了能够负调节MHC I类表达的基因序列。
个体施用以免疫原性量的本发明重组HCMV突变体可防止或降低个体对急性巨细胞病毒的易感性，此突变体中缺失了能够负调节MHC I类表达的基因序列。
有一种可控制巨细胞感染细胞中MHC I类表达负调节的方法，其步骤包括鉴定能够负调节主要组织相容性复合体的基因序列，然后从巨细胞病毒基因组中删除鉴定出的基因序列。
如前所述，与MHC I类重链负调节有关的基因序列可与腺病毒或其它类似的以病毒为基础的基因治疗载体结合，以尽可能减弱免疫应答，从而允许这些载体用于基因治疗。有一种以病毒为基础的基因治疗载体含有可读框架US11的基因序列。另一以病毒为基础的基因治疗载体含有亚区A和B的基因序列(分别含可读框架US2-US5和US10-US11)。
实施例1病毒与细胞向American Type Culture Collection获取HCMV AD169株，按本领域熟练技术人员所熟知的标准实验方案进行繁殖。人包皮成纤维(HFF)细胞是在此实验室中分离的，且使用20传代数以内的细胞(Jones和Muzithras，1991)。HFF细胞被培养在含10％胎牛血清和25mM HEPES的Dulbeccos改良的Eagle培养基(DMEM)中。
DNA序列本发明使用的是HCMVAD169株DNA序列(基因库编号X17403)的Chee等(1990)的编号体系。
质粒利用现有方法构建用于制造HCMV突变体的质粒(Jone等，1991；Muzithras；1992)。一般，在β-葡糖苷酸酶报道基因两侧环绕以两段1.5kb的HCMV序列，两序列位于要从病毒中删除的基因的两侧。每一次，在转染前，用于原核骨架内剪切的限制性酶将质粒DNA线性化。衍生自pHind-G、pHind-X、或pXba-P的HCMVAD169株基因组DNA片段，分别含有HindIII-G DNA片段(碱基176844至195837)、-X DNA片段(碱基195837至200856)和Xbal-P DNA片段(碱基200391至206314)(Oram等，1982；Jones等，1991)。pUS7/US3含有衍生自pHind-G和pHind-X的1.7kb的Pstl-Pstl HCMV片段(pIBI30载体中的碱基196447至194741，[International Biotechnologies，Inc.])。
为了以β-葡糖苷酸酶置换HCMV ORF US11至IRS1(即RV7186；图3)，构建pBgdUS11/IRS1。在序列上，该质粒含有1.8kb的Pstl-Xbal片段(碱基202207至200391，含有US13、US12和US11启动子序列，来自pXba-P)、β-葡糖苷酸酶、含有早期和晚期聚腺苷酸化信号的288b SV40片段(取自pRcCMV[Invitrogen])和1.7kb的Ncol-Ncol片段(碱基189763至188062，含有J1I至IRL1序列，来自pHind-G)。
为了以β-葡糖苷酸酶置换HCMV ORF US11至US12(即RV798；图3)，构建pBgdUS11/US12。在序列上，该质粒含有1.8kb的Pstl-Xbal片段(碱基202207至200391，含有US13、US12和US11启动子序列，来自pXba-P)、β-葡糖苷酸酶、含有US10聚腺苷酸化信号的255b片段(碱基199276至199021，来自pHind-X)和1.3kb的Nhel-Apal片段(碱基193360至192063，含有C末端的US2至IRS1序列，来自pHind-G)。
为了以β-葡糖苷酸酶置换HCMV ORF US11至US6(即RV35；图3)，构建pBgdUS11/US6。在序列上，该质粒含有1.8kb的Pstl-Xbal片段(碱基202207至200391，含有US13、US12和US11启动子序列，来自pXba-P)、β-葡糖苷酸酶和1.5kb的Hpal-Sstll片段(碱基195589至194062，含有C末端的US6至US3序列，来自pHind-G)。以β-葡糖苷酸酶置换HCMV ORF US11至US10，或单个US11(即分别为RV67和RV699；图3)前已说明(Jones等，1991)。
为了以β-葡糖苷酸酶置换HCMV ORF US9至IRS1(即RV7181；图3)，构建pBgdUS9/IRS1。在序列上，该质粒含有1.1kb的SalI-ApaI片段(碱基200171至199021)、351b SV40早期启动子(来自pRcCMV)、β-葡糖苷酸酶、228b SV40聚腺苷酸化信号片段和1.7kb的NcoI-NcoI片段(碱基189763至188062，含有J1I至IRLI序列，来自pHind-G)。
为了以β-葡糖苷酸酶置换HCMV ORF US6至IRS1(即RV7177；图3)，构建pBgdUS6/IRS1。在序列上，该质粒含有1.7kb的NcoI-NcoI片段(碱基188062至189763，含有IRL1、J1I和IRS1启动子序列，来自pHind-G)、β-葡糖苷酸酶、含有US10聚腺苷酸化信号的255b片段(碱基199276至199021，来自pHind-X)和1.8kb的BsmI-SauI片段(碱基196222至198030，含有C末端的US9序列，来自pHind-X)。
为了以β-葡糖苷酸酶置换HCMV ORF US3和US2(即RV47；图3)，构建pBgdUS3/US2。在序列上，该质粒含有1.7kb的PstI-PstI片段(碱基196447至194741)，含有HSV-1gH启动子的180b Smal-HaeIII片段(McKnight，1980)、β-葡糖苷酸酶、255b的US10聚腺苷酸化信号片段和1.3kb的Nhel-Apal片段(碱基193360至192063，含有C末端的US2至IRS1序列，来自pHind-G)。
为了以β-葡糖苷酸酶置换HCMV ORF US1(即RV5122；图3)，构建pBgdUS1。在序列上，该质粒含有1.8kb的AatII-SstI片段(碱基190884至192648，含有IRS1和US1的C末端序列，来自pHind-G)、180b的含HSV-1gH启动子的SmaI-HaeIII片段(McKnight，1980)、β-葡糖苷酸酶、255b的US10聚腺苷酸化信号片段和1.6kb的Sphl-Sphl片段(碱基192934至194544，含有US2和C末端的US3序列，来自pHind-G)。
为了以β-葡糖苷酸酶置换HCMV ORF IRS1(即RV46；图3)，构建pBgdIRS1。在序列上，该质粒含有1.7kb的NcoI-NcoI片段(碱基188062至189763，含有IRL1、J1I和IRS1的启动子序列，来自pHind-G)、β-葡糖苷酸酶、255b的US10聚腺苷酸化信号片段(碱基199276至199021，来自pHind-X)和1.2kb的NarI-XhoI片段(碱基191830至193003，含C末端IRS1和US1序列，来自pHind-G)。为了删除HCMV ORF US11至US2但不插入报道基因(即RV799；图3)，构建pdUS11/US2。在序列上，该质粒含有1.8kb的PstI-XbaI片段(碱基202207至200391，含有US13、US12和US11启动子序列，来自pXba-P)、β-葡糖苷酸酶、65b的含有US10聚腺苷酸信号的NruI-ApaI片段(碱基199086至199021，来自pHind-X)和1.3kb的NheI-ApaI片段(碱基193360至192033，含有C末端的US2至IRS1序列，来自pHind-G)。
重组突变体HCMV的分离如现有技术所述进行重组突变体HCMV的产生与分离(Jones等，1991；Jones和Muzithras，1992)。转染当天裂解HFF细胞使其具有70％至80％的汇合性。以胰蛋白酶处理细胞，在DMEM/10％FCS/25mM HEPES中悬溶成5.6×106细胞/ml。利用改良的硫酸钙协同沉淀技术进行DNA转染。将1.5μg感染型HCMV DNA和2.5μg线性质粒DNA混合于氯化钙溶液(300μ1，含10mM TrispH7.0/250mM氯化钙)中，冰上冷却。为了引发协同沉淀，将DNA从冰上移开，温和搅拌的同时滴加300μl2X的HeBS pH6.95(室温下；1X HeBS为19.2mMHEPES，137mM NaCl，5mM KCl，0.8mM磷酸钠，0.1％葡萄糖)。1.5分钟后，将沉淀置于冰上(为了防止进一步形成沉淀)。将沉淀与3×106细胞(悬浮液)混合，置于82mm的组织培养板中。在37℃ 6小时后，去除培养基，在1XHeBS中以20％的DMSO休克细胞2分钟。细胞以PBS洗涤两次，加入生长培养基。每4-7天换一次培养基。14天后，可观察到病毒噬斑，在细胞上铺一层含0.5％琼脂糖的含150μg/ml X-gluc(5-溴4-氯3-碘葡糖苷酸；Biosynth)的DMEM。加入上层几天后，选取蓝色噬斑(即β葡糖苷酸酶阳性突变体病毒噬斑)。重组病毒噬斑纯化三次。HCMV突变体RV799是β葡糖苷酸酶阴性的，所以对以上方法进行改良后进行分离。此时，以β葡糖苷酸酶阳性的HCMV突变体RV134作为亲代病毒(Jones等，1991)。这样，在转染中用HCMV突变体RV134代替野生型AD169株DNA。随机挑选初级转染板上出现的初级噬斑，在HFF细胞上再铺平板。10天后，去除培养基，如上所述在被感染细胞上铺以含X-gluc琼脂糖。此种情况下，4天后选取白色噬斑(β葡糖苷酸酶阴性突变病毒噬斑)，并纯化噬菌斑。根据现有技术所述，通过DNA印迹杂交分析法验证每一种HCMV突变体的正确基因组结构。
抗体与HCMV US11蛋白和HCMV UL80蛋白反应的兔多克隆抗体同现有描述(Jones等，1991；1994)。人MHC I类蛋白重链上一构象依赖性表位特异性的鼠单克隆抗体W6/32和人运铁蛋白受体特异性的Ber-T9是购置的。向Dr.S.Ferrone获取人MHC I类蛋白重链上一构象非依赖性表位特异性的鼠单克隆抗体TP25.99(D’Urso等，1991)(Department of Microbiology，New York MedicalCollege，Valhalla，NY)。HCMV IE1蛋白特异性的鼠单克隆抗体9221是向Dupont购置的。
被感染细胞蛋白质的放射性标记和免疫沉淀根据标准方案进行脉冲-追踪放射性标记(Sambrook等，1989)。HCMV感染的HFF细胞(感染倍数5PFU/细胞)在感染后的所示时段，在无甲硫氨酸/半胱氨酸的Dulbecco’s改良Eagle培养基(DMEM)中，以200μCi[35S]甲硫氨酸和[35S]半胱氨酸(NEN-DuPont)/ml脉冲标记。去除放射性培养基，细胞在完全DMEM中洗涤两次，在完全DMEM中进行所示时间的追踪。用三重去垢剂裂解缓冲液(Sambrook等，1989)抽提蛋白质。保留澄清后的蛋白质提取物(4℃以15000×g离心5分钟后的上清液)用于根据标准法的免疫沉淀(Sambrook等，1989)。使用蛋白A琼脂糖(Pharmacia)沉淀出与抗体结合的蛋白质。为了人运铁蛋白受体的免疫沉淀，在蛋白A琼脂糖之前加入兔抗鼠IgG(Pierce)。在2-巯基乙醇存在下煮沸经洗涤的沉淀物，在变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳。固定凝胶，并浸在1M的水杨酸钠(Sambrook等，1989)中，然后干燥并放射自显影。
免疫荧光术根据标准方案进行免疫荧光测试(Harlow，1989)。全部步骤在60mm的组织培养板中进行。简而言之，感染或未感染的细胞用仲甲醛固定，用0.2％TritonX-100(有指示)透化。加入3％牛血清白蛋白磷酸盐缓冲液溶液后，细胞在4℃静止过夜。顺次用以下抗血清处理细胞，每种均在室温下处理30分钟10％HCMV阴性人血清(为了封闭Fc受体)；所示第一抗体；和FITC结合的抗鼠或抗兔IgG(适当选用)。
实施例2HCMV野生型感染的人成纤维细胞中的I类负调节我们试图确定MHC I类重链负调节在本发明的人包皮成纤维(HFF)细胞培养体系中的时间和特性。根据流式细胞计数，使用构象依赖性I类单克隆抗体W6/32时，在感染后晚期(即72小时)，被HCMVAD169株野生型感染的HFF细胞在I类重链于细胞表面表达方面显著降低(图1)。在使用构象非依赖性I类单克隆抗体TP25.99的Western测试中证明，在感染后晚期，I类蛋白质的稳态水平也降低(图2)。由于病毒肽是在细胞表面被感染后组装的I类复合体呈递的，所以我们试图通过代谢放射性标记的蛋白质免疫沉淀来评价感染后各时刻合成的I类蛋白质状态。如图2B所示，不论有无病毒DNA合成抑制剂膦酰基甲酸盐，都可检测到I类重链表达的减少。这表明，病毒极早期或早期基因功能足以减少重链。此外，还证明了感染后很早就出现重链负调节3小时(图2C)。由于此效果是使用构象非依赖性抗体观察到的，这种减少反映了新合成重链的总体水平。
无MHC I类负调节功能的HCMV突变体的筛选代表了18个非必需ORF(UL33、UL81、IRS1、US1-US13、US27-US28和TRS1)的几种前文构建的HCMV缺失突变体通过流式细胞计数和免疫沉淀分析就重链表达进行筛选。只有RV670，缺失了HCMV基因组(Jones和Muzithras，1992)S部分内一段9kb区域的突变体不保留野生型的负调节表型(图4A)。该突变体缺失了至少11个ORF，从IRS1至US11(US10除外)，其中包括据说编码糖蛋白的US6族基因(US6-US11)(Chee等，1990)。为了证实这一观察结果，对另外分别获得的两个突变体进行了测试，一个与RV670具有相同的缺失，另一个新突变体RV7186缺失了完整的IRS1至US11区域(图3)。表型均与RV670相同，而且稳定表达I类重链。先前，我们构建了US6族ORF缺失HCMV突变体，包括单个缺失或成组缺失(Jones和Muzithras，1992)，以及类似的邻近IRS1-US3区域内的缺失突变体。根据利用构象非依赖性抗体的免疫沉淀，全部这些突变体均被证明保留了在HFF细胞内，在感染后晚期负调节I类重链的能力(图4A)。对照实验显示，根据pp65蛋白(图4B)和UL80蛋白(图4C)的表达判断，不同的感染细胞培养物间放射性标记相当，而且直至晚期的感染进展相当。这些数据显示(i)一个以上病毒基因足以减少I类重链；或(ii)US3至US6之间的基因(在RV670和RY7186中缺失但保留于其它突变体中)是表型所必需的。
MHC I类重链负调节所必需的HCMV基因组的一7kb区域的鉴定为了进一步确定含有与MHC I类重链负调节有关基因的区域的位置，构建了缺失IRS1-US11基因区内多个基因的其它HCMV置换突变体(图3)。其中之一，RV798缺失了US2-US11的基因。以RV798感染HFF细胞，并在感染后晚期进行测试，MHC没有象在野生型AD169株感染的细胞中那样被负调节(图4A)；实际上，观察到轻微的刺激作用。对与RV798相同的几种非依赖性缺失突变体进行了类似的检测全都丧失了负调节I类重链的能力。为了进一步证实7kb的HCMV US2-US11区域含有重链负调节所需的基因，构建了突变体RV799，其中具有与RV798相同的US2-US11缺失，但是以一种不同的方法产生的。通过插入β葡糖苷酸酶标记基因代替US2-US11由野生型AD169株制得RV798。相反，RV799的亲代是RV134(β葡糖苷酸酶阳性突变体，因为具有插入在US9-US10基因间区域的β葡糖苷酸酶表达盒(Jones等，1991))。为了构建RV799，设计了一种质粒，它在与RV134重组后同时缺失了US2-US11和β葡糖苷酸酶表达盒(图3)。根据β葡糖苷酸酶底物存在下的白色噬斑分离出合适的RV799 HCMV突变体，因为它是β葡糖苷酸酶阴性的。RV799而不是其RV134亲代，与RV798的表型相同(图5)。这样，由于RV789和RV799是使用保留了I类重链负调节能力的亲代以不同方法构建的，这就证实了表型必需基因位于7kb的US2-US11区域内(碱基193119至200360)。
为了测定适当的I类重链细胞表面表达是否发生在RV798或RV799感染后的晚期，进行了免疫荧光测试。使用构象依赖性单克隆抗体(W6/32)或构象非依赖性单克隆抗体(TP25.99)，在未感染和RV798和RV799感染的HFF细胞中都检测到了MHC I类重链的细胞表面表达，但野生型AD169感染的HFF细胞除外。I类重链在非感染细胞中适当成熟而产生内切糖苷酶H抗性分子。相反，AD169感染细胞中合成的I类重链据报道是完全内切糖苷酶H敏感性的(Beersma等，1993)。如图6所示，RV798感染细胞内合成的I类重链不论在感染后早晚还是晚期，都转化为成熟的内切糖苷酶抗性形式，转化率与非感染细胞中合成的相近。总之，这些数据表明，MHC I类的合成、加工和表面表达在以这些HCMV突变体感染的细胞中均未受到破坏。此外，此结果显示，含US2-US11基因的7kb区域包含了一个或多个HCMV负调节重链所需的基因。
在US2-US11基因区域中的两个亚区含有涉及I类重链负调节的基因在RV35中缺失的HCMV基因组区域来自US6-US11，而在RV798中缺失的区域来自US2-US11(图3)。在RV35感染的HFF细胞中，MHC I类重链被负调节，但是在RV798感染的细胞中没有被负调节(图4A)。该数据表明，在重链负调节中所涉及的一个或多个基因位于从ORF US2至US5的2kb亚区(亚区A；碱基193119-195607)中。为了确定该2kb亚区是否是I类重链负调节所需要的，检查HCMV置换突变体RV7181和RV7177。在这些突变体中分别缺失HCMV ORF IRS1-US9和IRS1-US6；因此，在两个突变体中都不存在亚区A。在感染后晚期时受感染HFF细胞的试验表明，两种突变体都保留了有效地负调节I类重链基因表达的能力(图7)。因此，当亚区A中的基因存在于HCMV基因组中时，便足以减少MHC表达(如RV35)，尽管它们的存在并不是该表型所必需的。此外，累积的数据表明，在所鉴别的7kb的US2-US11区域(即在RV798中缺失的区域)中，没有一个HCMV基因是在受感染的HFF细胞中有效地负调节重链所绝对需要的，这暗示来自US2-US11基因区域的其他部分的基因也足以在感染晚期表现出该表型。
表明US11基因产物涉及MHC I类重链负调节的证据在用突变体RV7181(缺失IRS1-US9(图3))感染的HFF细胞中，MHC I类重链表达被负调节，这与RV798感染的HFF细胞相反(图7)。该数据暗示由US10和US11基因(碱基199083-200360)构成的第二个亚区(亚区B)涉及减少重链表达。然而，从HCMV基因组结构中表达US10不足以进行重链负调节。HCMV突变体RV670以类似于野生型的稳态水平表达US10而且缺失了7kb的US2-US11基因区域中所有其他ORF，但是它不能在受感染的HFF细胞中造成MHC I类重链的负调节(图2B和4A)。
US11编码32千道尔顿的糖蛋白(gpUS11)，该糖蛋白含有N-连接的(而不是O-连接的)碳水化合物，该碳水化合物对内切糖苷酶H完全敏感，这表明糖处于高甘露糖形式。在感染过程中都检测到gpUS11，从感染后非常早的时候(即3小时)开始并持续到晚期。然而，gpUS11在受感染细胞中的水平在感染后约8小时时最高。为了确定它在受感染细胞中的位置，在野生型AD169株感染细胞的免疫荧光分析中使用兔多克隆抗血清(Jones and Muzithras，1991)。将未感染和RV699感染的HFF细胞用作阴性对照。RV699是与AD169同型的HCMV突变体，不同点是缺失了US11 ORF(Jone等，1991)。在感染后8小时被固定和透化的细胞中，在AD169感染的HFF细胞中观察到使核界限模糊的细胞质荧光，但是在两个阴性对照细胞中都没有观察到(图8)。一般，在核周围区域中的特异性荧光更强。在未透化细胞中没有检测到特异性的荧光(图8)。荧光数据和内切糖苷酶H敏感性数据表明，gpUS11不是细胞表面糖蛋白。根据翻译的DNA序列，预计gpUS11在靠近其N-末端和C末端处有疏水性结构域(Weston andBarrell，1986)，它们分别是假定的信号序列和跨膜结构域。因此该gpUS11与胞质内的膜(可能是内质网)关联。
在感染后早期HCMV突变体对MHC I类重链表达的负调节已表明，在野生型AD169株感染的细胞中MHC I类的表达在感染后非常早时间便开始(图2C)。为了确定突变体中某些是否不能早期负调节，用在感染后6-10小时放射标记的受感染HFF细胞的抽提物进行免疫沉淀试验。在用每个突变体感染后早期，HFF中I类重链的水平都被降低，除了RV798(该突变体缺失整个7kb的US2-US11区域)之外(图9A)。对照试验显示，不同突变体感染的细胞被同样地感染和放射标记(图9B和D)。另一种细胞糖蛋白即运铁蛋白受体的表达无差别地受各种突变体的影响(图9C)。因此，在感染后早期重链负调节所需的基因与感染后晚期减少重链所需的基因是相同的。此外，来自两个已鉴别的在感染后晚期负调节重链表达中所涉及的亚区中基因的表达，足以在感染后非常早的时候降低表达。
实施例3重组HCMV(RV798)疫苗制备用以前所描述的方法(Elek and Stern，1974)制备HCMV疫苗。HCMV突变体RV798在MRC-5人二倍体肺成纤维细胞(CCL171，美国典型培养物保藏中心)或人包皮成纤维细胞(MRHF[Bio Whittaker])上生长。用等于1的感染倍数，在含5％牛血清和5％胎牛血清的Dulbecco′s改良Eagle培养基中感染细胞。24小时后，除去培养基，用Hank′s平衡盐溶液或Dulbecco′s磷酸盐缓冲液洗涤3次。加入无血清的新鲜DMEM培养基；在出现晚期病毒细胞病变效应后(约为感染后7天)，孵育受感染的细胞4天。在预清除的离心步骤(在18℃ 6000×g离心20分钟)之后，再在18℃于15,500×g下离心1小时使无细胞的病毒沉淀。沉淀后的病毒再悬浮于含有25％山梨糖醇的Dulbecco′s磷酸盐缓冲液中，以等份形式储藏于-70℃。RV798疫苗贮存物的效价用标准程序在人包皮成纤维细胞上确定(Wentwork and French，1970)。按以前所描述的方法(Elek and Stern，1974；Gehrz等，1980；Starr等，1981)，通过将约103-107噬斑形成单位的接种量皮下注射入上臂的三角肌区域而施用疫苗。
实施例4gpUS11足以负调节MHC I类重链为了确定在其他病毒基因产物不存在的情况下US11基因产物是否能够造成重链负调节，将包括碱基200391-199683在内的US11编码区域(碱基200360-199716[Chee等，1990])和某些非编码的侧翼序列克隆人真核表达质粒，处于组成型HCMV主要极早期启动子-增强子的转录调控之下。人U373-MG星形细胞瘤细胞(HTB17，美国典型培养物保藏中心)用该质粒转染(Sambrook等，1989)，并且在0.375mg/ml嘌呤霉素存在下选择稳定转化的细胞，因为该质粒还编码原核的嘌呤霉素抗性基因。挑出克隆并扩大成细胞系。那些表达gpUS11的克隆用Western印迹法鉴别；不同的细胞系表达不同数量的US11。在这些细胞中MHC I类重链表达按类似方式进行。如图11中所示，US11的表达与I类重链的表达呈反相关。这些数据证明，HCMV US11的表达足以在其他表达基因不存在的情况下负调节MHC I类重链的表达。
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权利要求
1.一种重组巨细胞病毒(HCMV)突变体，包括一基因组，该基因组缺失了一段能够负调节主要组织相容性复合体(MHC)I类表达的基因序列，该缺失基因序列具有一段包含可读框架IRS1-US11的区域。
2.根据权利要求1所述的重组HCMV突变体，其中缺失的基因序列区域包含可读框架IRS1-US9和US11。
3.根据权利要求1所述的重组HCMV突变体，其中缺失的基因序列区域包含可读框架US2-US11。
4.根据权利要求1所述的重组HCMV突变体，其中缺失的基因序列区域包含可读框架US11。
5.根据权利要求1所述的重组HCMV突变体，其中缺失的基因序列区域包含亚区A和亚区B，其中亚区A包含可读框架US2-US5，亚区B包含可读框架US10-US11。
6.根据权利要求5所述的重组HCMV突变体，其中缺失的基因序列区域的亚区B包含可读框架US11。
7.一种在巨细胞病毒感染细胞中调控主要组织相容性复合体I类表达的负调节的方法，该方法包括下列步骤(a)鉴定巨细胞病毒基因组区域内的一段基因序列，该序列含有能够负调节MHC I类表达的可读框架IRS1-US11；(b)从巨细胞病毒基因组中删除鉴定出的基因序列。
8.根据权利要求7所述的方法，其中鉴定出的基因序列来自含可读框架IRS1-US9和US11的巨细胞病毒基因组区域。
9.根据权利要求7所述的方法，其中鉴定出的基因序列来自含可读框架US2-US11的巨细胞病毒基因组区域。
10.根据权利要求7所述的方法，其中鉴定出的基因序列来自含可读框架US11的巨细胞病毒基因组区域。
11.根据权利要求7所述的方法，其中鉴定出的基因序列来自含亚区A和亚区B的巨细胞病毒基因组区域，其中亚区A包含可读框架US2-US5，亚区B含可读框架US10-US11。
12.根据权利要求11所述的方法，其中鉴定出的来自亚区B的基因序列含可读框架US11。
13.一种药物组合物，包括重组巨细胞病毒(HCMV)突变体，该突变体具有一段缺失了能够负调节主要组织相容性复合体(MHC)I类的表达的基因序列的基因组，被缺失序列具有含可读框架IRS1-US11区域。
14.根据权利要求13所述的药物组合物，其中重组HCMV突变体的缺失基因序列区含可读框架IRS1-US9和US11。
15.根据权利要求13所述的药物组合物，其中重组HCMV突变体的缺失基因序列区含可读框架US2-US11。
16.根据权利要求13所述的药物组合物，其中重组HCMV突变体的缺失基因序列区含可读框架US11。
17.根据权利要求13所述的药物组合物，其中重组HCMV突变体的缺失基因序列区含亚区A和亚区B，其中亚区A包含可读框架US2-US5，亚区B含可读框架US10-US11。
18.根据权利要求17所述的药物组合物，其中重组HCMV突变体的缺失基因序列的亚区B含可读框架US11。
19.用于预防巨细胞病毒感染的疫苗组合物，包括在药学上认可的载体中包含有效量的重组巨细胞病毒(HCMV)突变体，该突变体具有缺失了能够负调节主要组织相容性复合体I类的表达的基因序列的基因组，被缺失的基因序列包含可读框架IRS1-US11区域。
20.根据权利要求19所述的疫苗组合物，还含有佐剂。
21.根据权利要求19所述的疫苗组合物，其中重组HCMV突变体的缺失基因序列区含可读框架IRS1-US9和US11。
22.根据权利要求19所述的疫苗组合物，其中重组HCMV突变体的缺失基因序列区含可读框架US2-US11。
23.根据权利要求19所述的疫苗组合物，其中重组HCMV突变体的缺失基因序列区含可读框架US11。
24.根据权利要求19所述的疫苗组合物，其中重组HCMV突变体的缺失基因序列区含亚区A和亚区B，其中亚区A包含可读框架US2-US5，亚区B含可读框架US10-US11。
25.根据权利要求19所述的疫苗组合物，其中重组HCMV突变体的缺失基因序列的亚区B含可读框架US11。
26.一种免疫个体以抵抗巨细胞病毒的方法，包括对个体施用免疫有效量的重组巨细胞病毒(HCMV)突变体，该突变体具有一段缺失了能够负调节主要组织相容性复合体(MHC)I类的表达的基因序列的基因组，被缺失序列具有含可读框架IRS1-US11区域。
27.根据权利要求26所述的方法，其中重组HCMV突变体的缺失基因序列区含可读框架IRS1-US9和US11。
28.根据权利要求26所述的方法，其中重组HCMV突变体的缺失基因序列区含可读框架US2-US11。
29.根据权利要求28所述的方法，其中重组HCMV突变体的缺失基因序列区含可读框架US11。
30.根据权利要求26所述的方法，其中重组HCMV突变体的缺失基因序列区含亚区A和亚区B，其中亚区A包含可读框架US2-US5，亚区B含可读框架US10-US11。
31.根据权利要求30所述的方法，其特征在于，其中重组HCMV突变体的缺失基因序列的亚区B含可读框架US11。
32.一种预防或降低个体对急性巨细胞病毒易感性的方法，包括对个体施用免疫原性量的重组巨细胞病毒(HCMV)突变体，该突变体具有一段缺失了能够负调节主要组织相容性复合体(MHC)I类的表达的基因序列的基因组，被缺失序列具有含可读框架IRS1-US11区域。
33.根据权利要求32所述的方法，其中重组HCMV突变体的缺失基因序列区含可读框架IRS1-US9和US11。
34.根据权利要求32所述的方法，其中重组HCMV突变体的缺失基因序列区含可读框架US2-US11。
35.根据权利要求32所述的方法，其中重组HCMV突变体的缺失基因序列区含可读框架US11。
36.根据权利要求32所述的方法，其中重组HCMV突变体的缺失基因序列区含亚区A和亚区B，其中亚区A包含可读框架US2-USS，亚区B含可读框架US10-US11。
37.根据权利要求36所述的方法，其中重组HCMV突变体的缺失基因序列的亚区B含可读框架US11。
38.一种以病毒为基础的基因治疗载体，包含来自人巨细胞病毒基因组可读框架US11的基因序列。
39.一种以病毒为基础的基因治疗载体，包含来自人巨细胞病毒基因组亚区A和亚区B的基因序列，其中的亚区A含可读框架US2-US5，亚区B含可读框架US10-US11。
40.一种以病毒为基础的基因治疗载体，包含来自人巨细胞病毒基因组亚区A的基因序列，其中的亚区A含可读框架US2-US5。
全文摘要
以人巨细胞病毒(HCMV)感染人成纤维细胞引起MHC I类细胞表面表达的负调节。本发明涉及一种突变体，具有HCMV的S部分内的一段9kb缺失(包括可读框架IRS1-US9和US11)，该突变体不能负调节I类重链。通过检测HCMV基因组此区域内缺失较小的突变体的表型，一段含有至少9个可读框架的7kb区域被证明含有降低重链表达所需的基因。此外，本发明还测定了7kb区域的两个亚区(A和B)，均具有足以引起重链负调节的基因。在亚区B中，涉及US11基因产物。它编码一种内切糖苷酶敏感性糖蛋白，该糖蛋白是胞质内的，与抑制I类重链细胞表面表达的腺病毒2型E3-19K糖蛋白类似。
文档编号C12N15/34GK1154718SQ95194425
公开日1997年7月16日 申请日期1995年7月28日 优先权日1995年7月28日
发明者T·R·琼斯, A·E·坎贝尔 申请人:美国氰胺公司, A·E·坎贝尔