专利名称：从细菌中提取异源不溶性蛋白质的制作方法
背景技术：
以含有编码哺乳动物蛋白质的DNA序列的载体转化细菌是常用的方法。用细菌表达哺乳动物蛋白质，可得到高产量的这种蛋白质，它包含在细菌的包涵体内。为了得到并纯化这种蛋白质，必须从细菌中提取出含有蛋白质的包涵体。
在过去，分离包涵体的方法是通过离心发酵液体培养基(fermentation broth)，除去上清，将细菌沉淀物重悬在缓冲液中，然后用机械方法，如均质化处理或超声处理，或者，用溶菌酶加去圬剂处理，使细菌细胞裂解。再将含有裂解细菌细胞的混合物离心，得到上清液和包涵体沉淀。包涵体沉淀物，是对细菌细胞体裂解和离心处理后得到的含有包涵体的沉淀。但是，这种处理方法包括离心含有活细菌发酵液体培养基的第一步操作。在大批量的离心过程中，活细菌常常会以气溶胶的形式被离心发散到周围的空气中。
美国专利4,958,007通过在发酵液体培养基中加入甲苯或酸来首先使细菌灭活而解决了这个问题。然后将此培养基离心，除去上清液，将细菌沉淀物重悬在缓冲液中，并调整此悬液的pH，使最终pH为6-9。换句话说，就是将被酸化的发酵液体培养基的pH，调整到6-9。然后通过均质化处理使细菌细胞裂解，从细胞中释放出包涵体。这种方法避免了在离心过程中活细菌发散到空气中；但是，如果使用甲苯灭活细菌，这种方法必须在防爆炸的房间内操作，因为甲苯是易燃性的，它的气雾会引起爆炸。而且，如果用酸灭活细菌，细菌沉淀物重悬于缓冲液中，再将悬液的pH调整至最终pH为6-9，这样，会使原来可溶性的细菌蛋白质变成不溶性的，结果导致包涵体沉淀中含有不可接受的高浓度宿主细菌蛋白质。
因此，有必要对提取不溶性重组蛋白质的方法进行改进，改进的方法应该在离心之前就杀灭全部或绝大部分细菌，绝大部分宿主细菌蛋白质应保留在溶液中，占绝对优势的不溶性蛋白质应该是细菌表达的异源性蛋白质。发明概述本发明通过当细菌尚存在于发酵液体培养基中时，裂解这种表达异源性蛋白质的细菌，随后可任选地用酸处理灭活细菌，来满足上述改进要求。然后可以在不发散活菌的状态下进行离心。这种对细菌的裂解处理，显著地降低了活菌的数量，并且可以在密闭系统中进行操作，使含有活菌的液体培养基的发散降到最小程度，或者完全消除。用本发明方法获得的包涵体含有更高纯度的异源性蛋白质，也就是说与按用现有的技术提取得到的包涵体相比较，这种包涵体含有更低浓度的不溶性细菌蛋白质。
本发明提供了三种从表达异源性蛋白质的细菌中提取含有异源性蛋白质的包涵体的方法。
第一个实施方案包括如下步骤(a)在发酵液体培养基中发酵表达异源不溶性蛋白质的细菌；(b)裂解包含在发酵液体培养基中的细菌；(c)离心该发酵液体培养基，得到包涵体沉淀和上清液；(d)除去上清液，得到包涵体沉淀。
本发明的第二个实施方案包括如下步骤(a)在发酵液体培养基中发酵表达异源不溶性蛋白质的细菌；(b)裂解包含在发酵液体培养基中的细菌；(c)在0-15℃的温度下冷却或保持该发酵液体培养基；(d)向已均质化处理的发酵液体培养基加入酸，使其pH达到大约2.0；(e)在0-15℃的温度下温育被酸化的发酵液体培养基，以便杀灭所有残存的未被裂解的细菌；(f)离心该发酵液体培养基，得到包涵体沉淀和上清液；(g)从包涵体沉淀物中除去上清液；(h)将此包涵体沉淀悬浮在缓冲液中，得到悬浮液；(i)将pH调整液加入到该悬浮液中，使悬浮液的pH达到6-9；(j)裂解在步骤(i)的悬浮液中包含的悬浮固体；(k)离心该悬浮液，得到含有异源性蛋白质的包涵体沉淀和上清液；(l)除去上清液，得到被分离出的含有异源性蛋白质的包涵体。
本发明的第三个实施方案包括如下步骤(a)在发酵液体培养基中发酵表达异源不溶性蛋白质的细菌；(b)裂解包含在发酵液体培养基中的细菌；(c)在0-15℃的温度下冷却或保持该发酵液体培养基；(d)将硝酸加入到该发酵液体培养基中，使其pH达到约2.0；(e)在大约0-15℃的温度下培育这种酸化的发酵液体培养基，以便杀灭细菌；(f)使该液体培养基的pH上升到大约8.5；(g)对此液体培养基作裂解处理；(h)离心已裂解的液体培养基，得到包涵体沉淀和上清液；(i)除去上清液，得到分离的含有异源性蛋白质的包涵体。附图的简要说明该图显示，用本发明的方法得到的，和不是用本发明的方法得到的包涵体的十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)图。发明详述在此引用的所有美国专利(U.S.Patents)作为一个整体在此引入作为参考。
本发明提供了几种方法，用于提取不溶性的非细菌蛋白质，特别是提取通过基因转化的细菌，如大肠杆菌(E.Coli)产生的哺乳动物蛋白质。在细菌中表达的非细菌蛋白质被称为异源性蛋白质。在此所用的术语“转化的细菌”表示该细菌是经基因工程转化能产生异源性蛋白质的细菌。这种基因工程转化通常需要对细菌引入一个表达载体。这种表达载体能够自我复制，并能依靠细菌基因组内的相关基因进行蛋白质表达。细菌表达载体的构建是本专业人员熟知的，只要编码目标蛋白质的核苷酸序列是已知的，或者是可以得到的。例如，DeBoer在美国专利4,551,433中公开了用于细菌表达载体的启动子，Goeddel等在美国专利4,601,980中，以及Riggs在美国专利4,431,739中，公开了用大肠杆菌表达系统生产哺乳动物蛋白质的方法；下列文献中公开了如何构建用于细菌表达的合成基因的方法Riggs，同上述，Ferretti等，美国国家科学院院刊83599(1986)，Sproat等，核酸研究132959(1985)，和Mullenbach等，生物化学杂志261719(1986)。很多细菌表达载体可从市售得到，或者通过美国典型培养物保藏中心(ATCC)(Rockville，Maryland)获得。
在一种细菌培养基中，将已经被表达载体转化的细菌，在刺激异源性蛋白质表达的条件下培养生长。这种含有转化细菌的细菌培养基被称为发酵液体培养基。
在本发明的第一个实施方案中，通过用标准的技术，在0-25℃的温度下，对发酵液体培养基作超声波处理或均质化处理，将表达异源性蛋白质的转化细菌裂解，优选的是转化的大肠杆菌。通常对整个发酵液体培养基的超声处理或均质化处理，应当持续进行直到全部细胞基本上都被裂解为止。这样可以通过后续的离心处理，从包涵体中有效地除去可溶性蛋白质和细胞小碎片，最后可以得到最高的蛋白质纯度。
超声处理通常可用于裂解包含在分析量体积(10-20ml)发酵液体培养基中的细菌。对于更大量的材料，应该用高压均质化处理。对于分析量体积(10-20ml)的发酵液体培养基，可用Heat-Systems-Ultrasonic，Inc的No.W-85型超声处理器(Ultrasonic ProcessorMode No.W-85)，它配有一个1/8英寸(3.2mm)的锥形微管头，对于总量为10ml的液体培养基，可优选地在50％工作循环下，用18分钟总超声处理时间，1秒脉冲(9分钟净超声处理时间)。
如果用均质化处理来裂解细菌，优选的是对发酵液体培养基进行多次处理。已经证明，在11000磅/英寸2(psi)的压力下，使发酵液体培养基3次通过MICROFLUIDIZER(M-110型微型流控器)是适当的。在超声处理或使用MICROFLUIDIZER均质化处理过程中，优选使系统密闭以防止活菌散发。大尺寸的均化器常常安装在密闭系统中。
然后将经超声处理或均质化处理的发酵液体培养基离心，得到含有包涵体的溶液和上清液。离心的速度应该足以使绝大多数包涵体被沉淀，但是，又应该足够慢，以保持绝大多数细胞碎片在上清液中悬浮。这种离心速度一般应该是大约5000rpm-10000rpm(转/分钟)。优选的是7000-10000rpm，用1.5英寸的锥形微型离心管，在Model No.5402EPPENDORF微型离心机中离心大约10分钟或一个等效的时间。然后除去上清液，得到含有异源性蛋白质的包涵体。
在本发明的第二个实施方案中，当细菌在发酵液体培养基中被裂解之后，使该液体培养基的温度下降到0-15℃。然后，在大约0-15℃的温度下用硫酸，磷酸，硝酸或盐酸使发酵液体培养基的pH降到大约2.0，再在此温度下温育该液体培养基，以便杀灭所有残存的细菌，典型地是温育大约1小时。这步操作是重要的，因为单纯均质化处理不能杀灭全部细菌。用于降低pH的优选的酸是磷酸或者硝酸。然后如上所述离心该发酵液体培养基，除去上清液，分离出包涵体沉淀。再将此包涵体沉淀悬浮于缓冲液中。可用于再悬浮这种沉淀的缓冲液是例如磷酸钠，磷酸钾和三(羟甲基)氨基甲烷盐酸(TRIS)。优选的缓冲液含有50mMTRIS，5mM EDTA和50mM NaCl，pH8.5(TEN缓冲液)。所形成悬浮液的最终pH可用适合的碱调整到大约为6.0-9.0，优选的是8.5。可用于pH调整步骤的适合的碱是例如NaOH，KOH等等。用于升高pH的优选碱溶液是25％w/v NaOH溶液。
然后将经pH调整的悬浮液，用超声处理或均质化处理再次进行裂解，以便使存在于悬浮液中的固体成分分散开，随后进行离心。最后，除去包含可溶性宿主细菌蛋白质和细胞碎片的上清液，回收含有不溶性哺乳动物蛋白质的沉淀。如果有必要，可用优选的约pH8.5的缓冲液将该沉淀洗一次或二次。在0-15℃的温度下加酸是必要的。其它所有的提取操作可在0-32℃的温度下进行。
在本发明的第三个实施方案中，表达异源不溶性蛋白质的细菌是培养在发酵液体培养基中。发酵液体培养基中的细菌，可用上述的超声处理或均质化处理使之裂解。然后该发酵液体培养基的温度下降至0-15℃，并将硝酸加到发酵液体培养基中，使该液体培养基的pH降至大约2.0。然后将该发酵液体培养基在0-15℃下温育，持续能杀灭所有残留细菌的必要时间长度，典型的是大约1小时。
然后再使该发酵液体培养基的pH上升至大约8.5，并通过均质化处理或超声处理，使包含有残留细菌的悬浮固体再次被裂解。在此第二次裂解处理之后，将该液体培养基离心，得到上清液和包涵体沉淀。然后除去上清液，得到被分离的含有不溶性异源蛋白质的包涵体。
在大批量操作时，优选的是采用实施方案2和3的酸杀菌方法，因为酸杀菌方法易于杀灭基本上100％的细菌。而仅用均质化处理要杀灭100％的细菌，成本上是不值得的。因为，为了达到这个目标，需要通过多次均质化处理。
分离出包涵体之后，可用标准的生物化学方法对异源性蛋白质进行去折叠，再折叠和进行纯化。可参见例如《蛋白质纯化指南》(Guide toProtein Purification，Deutscher等编辑(Academic Press，SanDiego，CA，1990))。
下列的实施例将对本发明作详细描述。显然，对于本领域的技术人员，有可能在不违背本发明的目的和意图的前提下，对材料和方法进行修改。
本发明可以用如下的，非限制性实施例来阐明。除非另有说明，对于如下固体混合物中的固体，液体中的液体，以及液体中的固体，所给出的百分数分别是基于重量/重量(wt/wt)，体积/体积(vol/vol)和重量/体积(wt/vol)。
实施例1(本发明的实施方案1)用于本实施例的人白介素-10(IL-10)表达质粒含有如下序列(a)人IL-10编码区核苷酸序列，Viere，P.等，美国国家科学院院刊，881172(1991)；(b)tac启动子，其3’末端与IL-10编码区核苷酸序列的5’末端并合，Zurawski，等，免疫学杂志，1373554(1986)；(c)lpp 3’编码区和非编码区，包括转录终止区，位于rh IL-10编码区的下游，Ghrayeb，J.等，EMBO.J.32437(1984)；(d)来自质粒pBR 322的四环素抗性基因，Sutcliff.J.G.，C.S.H.Sypmp.Quant.Biol.135612(1978)；(e)copTS可热诱导复制起点，Hakkaart，M.J.J.等，分子基因遗传学，183326(1981)和Andreoli，P.M.等，微生物学杂志，135612(1978)发酵将含有上述质粒的E.Coli K 12株培养物，在通气和振荡的条件下，在水基发酵培养基中培养。每升培养基含有30g酪蛋白氨基酸(Difco)，20g酵母膏(Difco)，5g磷酸二氢钾，20g甘油，1gMgSO4，和10mg四环素(Sigma)。用25％w/v NaOH调整pH至7.0，溶解氧在5psi的压力下，维持在相对于空气的30-100％饱和度。起始温度控制在30℃。当用配有NO.54绿色滤光片的Klett Summerson比色计测定，发现培养物的浊度达到大约100 Klett单位时，使温度上升到约38℃，12-14小时后收获培养物。
提取为了裂解细菌细胞，可在大约11000psi压力下，使全部发酵液体培养基通过MICROFLUIDZER M-110匀化器(Microfludics公司)三次。匀化器和产物容器都置于冰浴中，这样可使均质化悬浮液的温度保持在0-15℃。
然后将该发酵液体培养基的温度下降至4℃，并在pH7下振荡大约1小时。接着将该悬浮液分成250ml的等分量，在4℃下，用SORVAL离心机(RC5C型)，在GS-3转头中，以转速8000rpm离心65分钟。弃去上清液，被提取的IL-10留在沉淀中。可用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)(Laemmli，U.K.Nature 227680(1970))显示所得到包涵体的纯度，如
图1泳道1所示。按照这种方法，将此包涵体再悬浮于缓冲液中，使其浓度在1cm的光路(比色杯)中，与初始液体培养基的光密度差等于15 OD550。该缓冲液包含2.3％十二烷基磺酸钠(SDS)，10％甘油，0.062M Tris-HCl pH6.8，0.001％溴酚兰和5％β-巯基乙醇(新鲜加入)。用DAIICHI微型梯度凝胶板(共有12个加样孔)，每个加样孔加入10μl样品。凝胶板在电泳缓冲液中，在恒定的电流下(35mA/每块凝胶板)进行电泳。当兰色染料到达凝胶板底部时，切断电流，将凝胶板按Laemmli所述方法显影，文献同上。结果如附图中泳道1所示。
实施例2(本发明的实施方案2)如实施例1所述制备含有IL-10的包涵体，除有如下更改。当发酵液体培养基如实施例1中所述被均质化之后，使该液体培养基的温度降低至4℃，并通过加入85％w/w磷酸，使其pH降至2.0。然后将此酸化的悬浮液在4℃下振荡大约1小时。接着将此酸化的悬浮液分成250ml的等分量，在4℃下，用SORVAL离心机(RC5C型)，在GS-3转头中以转速8000rpm离心65分钟。弃去上清液，用1/4起始发酵液体培养基体积的TEN缓冲液再次悬浮包涵体沉淀，并用25％NaOH溶液使该缓冲液的pH上升至8.5。再使形成的悬浮液通过MICROFLUIDIZER M-110匀化器三次，并如上所述用SORVAL离心机，在GS-3转头中离心。弃去上清液，被提取的IL-10留在沉淀中。
用SDS-PAGE显示所得到包涵体的纯度，如附图中泳道2所示。
实施例3(本发明的实施方案2)如实施例2所述制备含有IL-10的包涵体，除有如下更改。用9NHNO3溶液，而不是用磷酸，使发酵液体培养基的pH降低至2.0。
用SDS-PAGE显示所得到包涵体的纯度，如附图中泳道3所示。
实施例4(本发明的实施方案2)如实施例2所述制备含有IL-10的包涵体，除有如下更改。用9NH2SO4溶液，而不是用磷酸，使发酵液体培养基的pH降低至2.0。
用SDS-PAGE显示所得到包涵体的纯度，如附图中泳道4所示。
实施例5(不是本发明的实施方案)如实施例2所述，用85％w/w磷酸酸化均质化液体培养基，制备含有IL-10的包涵体，除有如下更改。在将酸化的悬浮液振荡1小时之后，用25％w/v NaOH溶液使该悬浮液的pH上升至8.5。使该悬浮液通过MICROFLUIDIZER M-110匀化器三次，并分成250ml的等分量，在4℃下，用SORVAL离心机(RC5C型)，在GS-3转头中以转速8000rpm离心65分钟。弃去上清液，被提取的IL-10留在沉淀中。
用SDS-PAGE显示所得到包涵体的纯度，如附图中泳道5所示。
实施例6(实施方案3)如实施例5所述制备含有IL-10的包涵体，除有如下更改。用9NHNO3溶液降低发酵液体培养基的pH至2.0。
用SDS-PAGE显示所得到包涵体的纯度，如附图中泳道6所示。
实施例7(不是本发明的实施方案)如实施例5所述制备含有IL-10的包涵体，除有如下更改。用9NH2SO4溶液降低发酵液体培养基的pH至2.0。
用SDS-PAGE显示所得到包涵体的纯度，如附图中泳道7所示。
实施例8(不是本发明的实施方案)泳道8显示如国际专利申请PCT/US94/01909中所述的，从中国仓鼠卵巢中制备和纯化的IL-10的纯度。通过如实施例1中所述的SDS-PAGE图来测定纯度，不同的是对加样孔加入20ml样品。
实施例9(不是本发明的实施方案)泳道9显示一个高分子量标准标志物，用于估算图中其他泳道中蛋白质的分子量。
实施例10(现有技术)按实施例1发酵产生IL-10的细菌。发酵作用完成之后，用9NHNO3使该发酵液体培养基的pH降低至2.0，并振荡1小时。然后用25％W/V NaOH使该液体培养基的pH上升至8.5。使形成的悬浮液通过MICROFLUIDIZER M-110匀化器三次，并如上所述用SORVAL离心机在GS-3转头中离心。弃去上清液，被提取的IL-10留在沉淀中。
用SDS-PAGE显示所得到包涵体的纯度，如附图中泳道10所示。
实施例11(现有技术)如实施例10所述制备含有IL-10的包涵体，除有如下更改。用9NH2SO4溶液使发酵液体培养基的pH降低至2.0。
用SDS-PAGE显示所得到的包涵体的纯度，如附图中泳道11所示。
实施例12(现有技术)如实施例10所述制备含有IL-10的包涵体，除有如下更改。用85％w/w H3PO4溶液使发酵液体培养基的pH降低至2.0。
用SDS-PAGE显示所得到的包涵体的纯度，如附图中泳道12所示。
结论图1显示，本发明的实施方案具有获得含有低浓度杂质的包涵体的惊人能力，即此包涵体内仅含有低浓度不溶性宿主蛋白质。图中泳道1显示的含有IL-10的包涵体的SDS-PAGE凝胶，是按本发明的第一个实施方案，在实施例1中的提取结果。含有细菌的发酵液体培养基经过均质化处理和离心，得到被分离的高纯度包涵体。
图1泳道2，3和4显示按本发明的第二实施方案获得的包涵体的纯度。泳道2，3和4显示的包涵体，是分别按照实施例2，3和4得到的，其中对均质化的发酵液体培养基进行了酸化处理，并在0-15℃的温度下温育，然后离心得到包涵体沉淀和上清液。将此沉淀再悬浮于缓冲液中，使其pH上升至8.5，并将此悬浮液作均质化处理。然后再次离心，分离出包涵体沉淀。为了酸化该均质化处理的液体培养基，实施例2(泳道2)用磷酸，实施例3(泳道3)用硝酸，实施例4用硫酸。图1明显地表明，本发明的第二实施方案能获得高纯度的包涵体。
用实施例6的方法得到的泳道6，显示的是按照本发明的第三实施方案的方法获得的包涵体的SDS-PAGE凝胶。在此实施方案中，被均质化处理的发酵液体培养基的pH是用硝酸使之降低至大约2.0，并在0-15℃的温度下振荡大约1小时。然后再使该液体培养基的pH上升至大约8.5。接着将此液体培养基再次作均质化处理，并离心得到被分离的包涵体。按照本发明的第三实施方案，只有用硝酸才能得到高纯度的包涵体。如果用磷酸或者硫酸代替硝酸，将会得到含有不可接受的高浓度不溶性宿主细菌蛋白质的包涵体，分别如实施例5，泳道5和实施例7，泳道7所示。
泳道8是通过中国仓鼠卵巢(CHO)细胞产生的人IL-10 SDS-PAGE凝胶。泳道9是高分子量标准的SDS-PAGE凝胶。泳道10，11和12显示分别在实施例10，11和12中，按照现有方法得到的包涵体SDS-PAGE凝胶，表明与按照本发明的方法提取的包涵体相比较，用已前从细菌中提取异源性蛋白质的方法得到的包涵体，基本上都含有较高浓度的宿主蛋白质。
总之，按照本发明的所有实施方案都能获得较高纯度的包涵体，如图1中泳道1，2，3，4和6所示，而用其它方法提取包涵体时，会导致包涵体含有不可接受的高浓度宿主蛋白质。
当本发明以上述具体的实施方案被描述之后，本领域普通的技术人员可能知道多种本发明的替换，修改和变更。所有这些替换，修改和变更都应归入本发明的精神和范围之中，其只通过权利要求来加以限制。
权利要求
1.一种从表达异源性蛋白质的细菌中提取该异源性蛋白质的方法，其包括如下步骤(a)在发酵液体培养基中发酵细菌；(b)裂解包含在发酵液体培养基中的细菌；(c)离心该发酵液体培养基，得到包涵体沉淀和上清液；(d)除去上清液，得到分离的含有异源性蛋白质的包涵体沉淀。
2.一种从表达异源性蛋白质的细菌中提取该异源性蛋白质的方法，其包括如下步骤(a)在发酵液体培养基中发酵细菌；(b)裂解包含在发酵液体培养基中的细菌；(c)在大约0-15℃的温度下冷却或保持该发酵液体培养基；(d)向该发酵液体培养基加入酸，使其pH达到大约2.0；(e)在0-15℃的温度下温育被酸化的该发酵液体培养基，以杀灭所有残存的未被裂解的细菌；(f)离心发酵液体培养基，得到包涵体沉淀和上清液；(g)从包涵体沉淀上除去上清液；(h)将此包涵体沉淀悬浮在缓冲液中，得到悬浮液；(i)将pH调整溶液加入到该悬浮液中，使悬浮液的pH达到6-9。(j)裂解在步骤(i)的悬浮液中包含的悬浮固体；(k)离心该悬浮液，得到含有异源性蛋白质的包涵体沉淀和上清液；(l)除去上清液，得到分离的含有异源性蛋白质的包涵体。
3.权利要求2的方法，其中被酸化的发酵液体培养基被保持在0-25℃的温度。
4.权利要求2的方法，其中步骤(d)中被酸化的发酵液体培养基，在离心之前，在0-15℃的温度下温育大约1小时。
5.权利要求2的方法，其中所用的酸选自磷酸，硝酸，盐酸和硫酸。
6.一种从表达异源性蛋白质的细菌中提取该异源性蛋白质的方法，其基本上由如下步骤组成(a)在发酵液体培养基中发酵该细菌；(b)裂解包含在发酵液体培养基中的细菌；(c)在大约0-15℃的温度下冷却或保持该发酵液体培养基；(e)将硝酸加入到该发酵液体培养基中，使其pH达到约2.0；(f)在0-15℃的温度下温育被酸化的发酵液体培养基，以便杀灭细菌；(g)使该液体培养基的pH升到大约8.5；(h)使包含在该液体培养基中的固体裂解并分散开；(i)离心该发酵液体培养基，得到上清液和含有包涵体的包涵体沉淀；(j)除去上清液，得到分离的含有异源性蛋白质的包涵体。
全文摘要
从表达哺乳动物蛋白质的转化细菌中提取不溶性哺乳动物蛋白质，通过对发酵液体培养基作均质化处理，并离心该均质化的液体培养基，从含有包涵体的沉淀上除去上清液，从而避免了宿主细菌蛋白质的不可逆性不溶解化作用。在另一个实施方案中，将被均质化液体培养基的pH在离心之前调整到2.0。然后将这种酸化的液体培养基离心，并将其沉淀再悬浮在缓冲液中，再次进行均质化处理，再通过离心分离出包涵体。
文档编号C12P21/00GK1156481SQ95194734
公开日1997年8月6日 申请日期1995年6月19日 优先权日1995年6月19日
发明者Y·阿尔罗伊, J·朱, R·康登 申请人:先灵公司