专利名称:编码羊腺病毒(oav287)的dna及其作为病毒载体的应用的制作方法
技术领域:
本发明涉及一种新的全长基因组克隆,它是从澳大利亚绵羊中分离出的良性的腺病毒(OVA287)中获得的。本发明还涉及从良性羊腺病毒中获得的新的病毒载体,并且还涉及这些载体向动物传递和在动物中表达编码功能性RNA分子或多肽的核酸序列的应用。
背景技术:
由传染性病原体和寄生虫侵染引起的疾病会导致家养动物的健康问题和生产损失,但是对许多传染性病原体并不存在疫苗。因此,在世界范围内开展了许多研究工作以开发出新的,可以预防疾病的疫苗。
当从传染性病原体和寄生虫中鉴别出一些保护性抗原后,它们若要作为疫苗成功使用需要开发出能够将这些抗原有效地传递给宿主的系统。主要从痘病毒中获得的多种重组基因表达载体已经被使用,因为它们普遍具有较低的病原性。重组病毒载体感染之后的外源蛋白质表达有可能激发宿主体内保护性的免疫应答反应。
但是,没有一种病毒载体具有各种情况下所需的所有的属性。由于一些载体所具有的生物学特性,它们比其它载体更适合某些特殊的目的。例如,常常会发现很难激发有效的具有防病作用的粘膜免疫应答。对人类,腺病毒被口服接种来预防呼吸系统疾病(1)。由于腺病毒的预防作用包括对粘膜表面的保护作用,因此很明显,它在这方面具有潜力。人的腺病毒也已被用于向肌肉(2)和其它组织传递基因。虽然在通常情况下,腺病毒并不将其DNA整合到细胞的基因组中去,然而,DNA持续存在,并且观察到了蛋白质的长期表达。从这样的细胞中表达适当的抗原可以产生全身性免疫应答,该应答可以预防同源的致病病原体。
已知的腺病毒基因组都是线性双链DNA分子,每个末端都具有一个反向末端重复序列(ITR),并且有一个蛋白质共价结合在5’末端的C残基上(3)。2、5、12和40型人腺病毒的基因组序列和结构已被完全确定,大量其它类型的已被部分确定,包括一些从动物中分离出的(参见Genebank和EMBL核酸数据库)。2型人腺病毒是第一个要被测序的基因组,但是一般来说,它的基因组的排列被保留在其它被表征的腺病毒中,即早期区域E1-E4和结构蛋白同系物可以在基因组的相似位置被识别出来。具体地说,E1A/E1B区位于基因组左侧的末端,E4总是位于基因组右侧的末端。早期区域E3总是位于结构蛋白pVIII和尾丝的基因之间,虽然它的大小和复杂程度随种的不同而变化,举例来说,它在人腺病毒中为3kb,有至少10个开放阅读框架,在鼠腺病毒中为大约0.7kb,只有2个明显开放阅读框架(4,5)。对于重组病毒的构建来说,E3是一个关键区域,因为它是体外复制所非必需的(6)。晚期的L区域从主晚期启动子开始表达,主晚期启动子和结合的复合体产生了mRNA系,它编码大部分结构病毒蛋白。IVa2和IX蛋白看来具有它们自己的启动子。
虽然有一些可以用于医疗目的的人病毒载体,但是很少有适合于兽医应用的动物病毒载体。为了获得一种更加适合的动物病毒载体,本发明人纯化了一种从西澳大利亚的绵羊身上分离出的羊腺病毒(OAV287)。该羊腺病毒从血清学角度与7型牛腺病毒有关,但是从遗传学角度,它不同于牛腺病毒和其它澳大利亚羊分离物,正如在限制性酶图谱的基础上进行的羊和牛腺病毒的比较所显示的(8)。本发明的病毒的基因组排列显著不同于所有其它已知的腺病毒。本发明的腺病毒的DNA分子适合于用作病毒载体,当用于兽医学目的时,该载体能够表达多种多肽。
发明概述第一方面,本发明涉及分离的DNA分子,它包含编码基本上如
图1所示的羊腺病毒(OAV287)基因组的核酸序列,或功能等价核酸序列。优选地,核酸序列编码基本上如图1所示的腺病毒的基因组。
在本发明第一方面的更优选的实施方案中,DNA分子包含编码羊腺病毒(OAV287)的基因组的核酸序列,其中去除或改变了腺病毒基因组中的一部分,该部分是天然腺病毒维持或生存所非必需的。
第二方面,本发明涉及一种DNA分子,它包括至少一个15核酸碱基序列,该序列对示于图1的羊腺病毒(OAV287)基本上是特异性的。在本发明第二方面的优选实施方案中,至少十五个核酸碱基的序列编码一个羊腺病毒(OAV287)的功能性元件。优选地,该功能性元件选自启动子、基因、反向末端重复序列、病毒包装信号和RNA加工信号。羊腺病毒(OAV287)的反向末端重复序列包含该病毒双链DNA基因组的每条链上5,末端的最初46个核酸碱基。
第三方面,本发明涉及一种质粒,它包含本发明第一方面或第二方面的DNA分子。优选地,该质粒包含本发明第一方面的DNA分子,其中编码腺病毒基因组的核酸序列连接于编码复制启始区的核苷酸序列,以及编码标记物的另一核苷酸序列。优选地,编码标记物的核酸序列编码一种抗生素的抗性。更优选地,该抗生素是氨苄青霉素。
在本发明第三方面的其他优选实施方案中,编码腺病毒反向末端重复序列的序列是相连的。
第四方面,本发明涉及一种病毒载体,它包含本发明第一方面的DNA分子,以及至少一段编码非腺病毒一种或几种多肽的核苷酸序列。
优选地,编码一种或几种非腺病毒多肽的核苷酸序列是从细菌、病毒、寄生虫或真核细胞中获得的。更优选地,非腺病毒多肽是轮病毒(rotavirus)VP7sc抗原,寄生虫多肽是蛇形毛圆线虫17kD抗原、羊绦虫45W抗原或来自铜绿蝇PM95抗原。
本发明也涉及病毒载体,该载体包含本发明第一方面的DNA分子,并且至少一个核酸序列编码功能性RNA分子。本领域的专业人员都知道,功能性RNA分子可以包括信使RNA分子、反义RNA分子或核酶。
第五方面,本发明涉及向靶细胞传递具有编码一种或几种非腺病毒多肽的核酸序列的DNA分子的方法,该方法包括用本发明第四方面的病毒载体感染靶细胞,这样,编码一种或几种多肽的DNA分子被表达,并且该一种或几种多肽由靶细胞产生。
第六方面,本发明涉及向动物传递具有编码一种或几种非腺病毒多肽的核酸序列的DNA分子的方法,该方法包括给动物施用本发明第四方面的病毒载体,使该病毒载体感染动物的至少一个细胞,并且被感染的细胞表达编码一种或几种多肽的DNA分子,同时产生一种或几种多肽。优选地,动物是食草动物,更优选地,食草动物是绵羊。
本发明也涉及向动物传递具有编码功能性RNA分子的核酸序列的DNA分子的方法,该方法包括给动物施用本发明第四方面的具有编码功能性RNA分子的核酸序列的病毒载体,使该病毒载体感染动物的至少一个细胞,并且被感染的细胞表达编码功能性RNA分子的DNA分子,同时产生该功能性RNA分子。
这里所使用的术语“功能等价核酸序列”包括羊腺病毒(OAV287)DNA分子中较小的变化,由于DNA密码的简并性,这些变化并不会导致编码不同病毒多肽的分子的产生。而且,该术语包括这样的DNA密码的变化,这些变化会导致所编码的多肽的改变,但是这些改变基本上不会影响这些病毒多肽的生物活性。
这里使用的术语“功能元件”包括编码启动子、基因、反向末端重复序列、病毒包装信号和RNA加工信号的核酸序列。本领域的专业人员应知道,从羊腺病毒(OAV287)获得的编码这些功能元件的特异性序列可能在其它系统(包括质粒和非羊腺病毒载体)中是有用的。
为了使本发明的特征能够被更清楚地理解,其优选方式将用以下的实施例和附图描述。
附图的简要说明图1是OAV287基因组的核酸序列,开始于左侧ITR的第一碱基。
图2显示了用Ad2进行同源检测得到的OAV287基因的排列。标有问号的区域是尝试性的确定,因为缺少明显的同源性。
图3显示了OAV287的假定的E1区中的主要开放阅读框架。星号显示了可能的启始密码子的位置。一个编码加工过的结构蛋白的以前未识别的基因(p28kD)在互补链上被编码。
图4显示了OAV287区域中可能包含E3的开放阅读框架。但是,因为pVIII和尾丝基因之间的间隙只有197个核苷酸,E3是缺少的。该图还指出了以后插入ApaI/NotI多聚连接子的位点。
图5显示了OAV287的可能的E3区中的主要开放阅读框架。星号显示了可能的启始密码子的位置。该图还指出了被末端填充和再连接修饰的SalI位点,以及后来基因组中插入多聚连接子序列的,没有失去感染性的改变的位点。
图6描述质粒(pOAV287Cm)的构建,该质粒包含一个在SalI位点插入了pACYC184序列的OAV287基因组的全长克隆。实心区域表示OAV287序列,交叉网格表示的序列来自质粒pUC13或Bluescribe M13+(AMPR),打点区域表示的序列来自pSELECT(TetR),空心区表示的序列来自pACYC184(CmR)。该图只指出了用于质粒构建的关键的限制性位点。
图7显示了质粒pOAV100、pOAV200、pOAV600和pOAV600S的图谱。箭头指示了反向末端重复序列和主要晚期启动子(MLP)的大致位置。该图还指示了突变的SalI位点和ApaI/NotI多聚连接子序列插入的位点。光温育显示了插入KpnI位点的修饰的Bluescribe基因。线性的、有感染性的基因组(暗温育)被KpnI切割而除去。
图8显示了通过转染重组质粒pOAV100和pOAV200至CSL503细胞而获救(rescued)的羊腺病毒OAV100和OAV200的筛选结果。基因组中跨越(A)OAV100中突变的SphI位点和(B)OAV200中ApaI/EcoRV/NotI多聚连接子插入位点的部分用从野生型OAV287中获得的相应区域进行PCR扩增。扩增产物用SphI(A,泳道3和5)和ApaI、EcoRV、NotI(B,分别为泳道3-5和泳道8-10)切割。(U)指示未被切割的样品。
图9显示用于组装基因表达盒的质粒pMT的图谱。包含OAV287主要晚期启动子和三分(tripartite)引导序列的片段被连接在一起,并且置于插入目的基因所需的多克隆位点的前面。之后是串联的多聚腺苷酸信号(AATAAA)。
图10显示了从相应的感染质粒中获救的重组病毒的一览表,以及它们携带的基因表达盒。如图所示,表达盒在OAV基因组中pVIII和尾丝基因之间被插入。
图11显示了在通过OAV205和OAV210病毒感染CSL503细胞后,羊绦虫45W和铜绿蝇PM95抗原分别在这些细胞中的表达(A)和用病毒OAV204感染后,VP7sc在CSL503和牛鼻甲细胞中的表达(B)。(I)感染的细胞,(U)未感染的细胞。(M)指示显示大小的标记蛋白。
图12显示了在用OAV206病毒感染后,VP7sc在(A)CSL503细胞和(B)兔肾和牛鼻甲细胞中的表达。(I)感染的细胞,(U)未感染的细胞。(M)指示显示大小的标记蛋白。
发明描述方法OAV287的生长和纯化1985年从绵羊中分离出的病毒从西澳大利亚大学农业系动物健康实验室的R.L.Peet处获得。分离的病毒在绵羊胚胎肺细胞(CSL503)中生长,准备贮存前在固体覆盖层下进行两次蚀斑纯化。用以前描述过的方法(18,22)从CSL503中纯化病毒。用蛋白酶K切割病毒,从中提取DNA。
基因组片段的克隆在下文述及的工作中使用的用于处理、修饰和转化质粒DNA的分子生物学技术在(9)以及相似的出版物中被描述。OAV287的DNA用包括BamHI、SphI、SmaI和SalI在内的不同的限制性内切酶切割,以推断这些位点的位置(18)。
腺病毒基因组中有一个蛋白共价结合到线性双链DNA的每个末端(24)。分别约为8kb和4kb的BamHI A和D片段被确定为末端基因组片段,因为它们在琼脂糖凝胶中的迁移依赖于病毒DNA用蛋白酶K的预消化。大小分别为6.2、5.1、3.4和1.1kb的内部BamHI片段B、C、E和F在琼脂糖凝胶中被分开,它们被回收并用标准的连接和转化方法克隆进BamHI切割后的pUC13(9)。为了克隆末端BamHIA和D片段,病毒DNA(10μg)用蛋白酶K(在pH8.0,包含1mM EDTA和0.5%SDS的10mMTris/HCl中有50μg/ml)在65℃消化60分钟以除去末端蛋白。DNA用苯酚/氯仿提取两次,用乙醚提取一次,用乙醇沉淀回收。然后3’末端(未知序列)在pH8.0的缓冲液中存在dATP(100μM)的情况下,在37℃用T4 DNA聚合酶(5单位,Toyobo,东京,日本)对核酸外切割15分钟,该缓冲液中包含Tris Hcl(50mM)、氯化镁(7mM)、2-巯基乙醇(7mM)和BSA(10μg/ml)。DNA再次用上述苯酚提取和乙醇沉淀的方法纯化。为了除去单链末端区并形成平末端,该DNA在用苯酚/氯仿提取和用乙醇沉淀之前,用1个单位的绿豆核酸酶(Pharmacia,North Ryde,澳大利亚)在37℃切割10分钟,缓冲液pH为4.6,其中包含醋酸钠(30mM)、氯化钠(50mM)以及氯化锌(1mM)。最后,DNA用BamHI(Pharmacia)切割,并用低融点琼脂糖电泳分离片段。BamHI A和D片段在转化到大肠杆菌JM109之前被切下,用NACS色谱柱(BRL,Gaithersburg,Md)回收,开连接到BamHI/HincII剪切的Bluescribe M13+质粒(Stratagene,La Jolla,Ca)上。确定出带有所需大小的片段的阳性克隆,将它们进行限制性切割并通过核苷酸测序与从基因组DNA直接得到的部分已经确定的序列比较来确认其正确性。这说明三个3’末端核苷酸在克隆过程中被除去。
OAV287基因组的核苷酸测序OAV287基因组的全序列是通过使用Sanger法(25)和由供应商提供的不同的试剂盒来测定BamHI片段A-F的序列来确定的。嵌套缺失是用双链嵌套缺失试剂盒(Pharmacia)为五个最大的片段构建的。使用标准引物对其测序。在新确定的序列基础上,用DNA合成仪(AB1,391型)合成其它的核苷酸引物。用这种方法既测定了整个基因组两条链的序列,也测定了片段之间的结合区的序列。
OAV287基因组的诱变为了构建一个全长的OAV287克隆以及随后对它进行修饰以建立例如pOAV200和pOAV600的质粒的某种突变体。基因组相关的部分被亚克隆进Bluescribe(Stratagene,La Jolla,Ca)或类似的质粒中,它允许单链DNA获救。之后,有可能将双链DNA用于诱变。合成所需的寡聚核苷酸序列,并对它进行磷酸化处理,然后按照Muta-gene Phagemid(Biorad Labs,Ca)或Altered Site II(Promega,Wi)诱变试剂盒的生产厂家的说明,将其用作引物。突变的确定一般是通过使用适当的限制性酶切割的方法或核苷酸测序的方法,或两种方法同时使用。通过使用适当的单一限制性位点,将含有导入突变的基因组片段亚克隆,以构建更大的质粒,例如pOAV200。
OAV287全长基因组克隆的构建末端BamHI A和D片段(克隆进Bluescribe M13+)分别被诱变修饰,以加入在克隆过程中丢失的核苷酸和KpnI位点。KpnI位点的最后一个碱基在每个基因组反向末端重复序列的5’末端掺入C。这样产生了质粒pAK和pDK(图6)。
基因组左侧大约21.5kb的序列是从BamHI B和D片段以及大约13kb的SphI A片段构建的。克隆进pUC13的基因组BmHI B片段通过诱变修饰(GCATGC变至GCATCC)在8287位去除了SphI位点,产生pUC13B。修饰的片段通过用BamHI切割释放出来,并被克隆进pDK,后者已经用BamHI剪切并被去磷酸化。携带重组质粒pDBM(图6)的克隆通过使用跨越BamHI B/D结合区的寡聚核苷酸筛选来确定。将SphI A片段(大约13kb)克隆进pSELECT(Promega)的SphI位点形成pSESPH。该片段在其左侧末端附近包含一个在pDBM中常见的SmaI位点。从pDBM中获得的KpnI/SmaI片段被亚克隆进也已被KpnI/SmaI剪切的pSESPH从而形成pSELLH,这是一种基于pSELECT的,包含了OAV287 DNA左侧大约21.5kb序列的质粒。
基因组的右侧末端是由包含基因组右侧大约8.6kb序列的pAK构建的,并且覆盖了SphI A片段。pAK被SalI剪切,并被连接到SalI剪切的pACYC184上以形成pACm(图6),pACYC184是一个4.24kb的质粒,它包含编码氯霉素(Cm)抗性基因和DNA复制的启始点。该质粒用SphI和KpnI剪切以产生掺入pACYC184序列的基因组右侧片段。它被连接到由pSELLH制备的大约21.5kb的左侧KpnI/SphI片段以产生最终质粒pOAV287Cm(图6)。该质粒在大肠杆菌体内稳定地复制,因此没有为进行进一步研究而繁殖病毒以获得基因组DNA的必要。质粒pOAV287Cm中的重组基因组与野生型病毒基因组的不同在于SphI位点中的单位点突变(8287位碱基),在SalI位点有pACYC184序列以及在反向末端重复序列中加入GTAC序列。但是,在SalI位点插入pACYC184序列破坏了两个功能未知的重要的开放阅读框架。如果其中任何一个基因产物是复制所必需的,那么pOAV287Cm在转染后就不能生产传染性的病毒。为了避免这一潜在的问题,pOAV287Cm被进一步修饰。首先,将Bluescribe M13质粒(Stratagene,La Jolla,Ca)用HindIII剪切,然后平末端。再将线性质粒用SmaI剪切,连接平末端并转化。所得的质粒包含一个氨苄青霉素抗性基因和复制启始位点,缺少SalI和SphI位点但是保留了单一KpnI位点。该质粒被KpnI剪切并连接到KpnI剪切过的pOAV287Cm上。筛选并培养具有氨苄青霉素和氯霉素双抗性的质粒。它们中的一个用SalI剪切以释放pACYC184序列,然后再连接和转化。所得质粒pOAV100包含插入基因组反向末端重复序列之间的KpnI位点的氨苄青霉素抗性基因和复制启始位点(图7)。在氨苄青霉素(200μg/ml)存在的情况下,该质粒在大肠杆菌JM109内稳定复制。为进行转染研究,生长了大量的质粒。
DNA的转染和病毒获救(rescue)为了确定重组的基因组克隆是否有感染性,将pOAV100用KpnI剪切以释放线性病毒基因组,并使用LIPOFECTAMINE(Gibco BRL)将DNA转染进CSL503绵羊胚胎肺细胞。溶液(A)包含质粒DNA(2-10μg)和300ulEMEM(包含HEPES+谷氨酰胺),但是没有胎牛血清(FCS),溶液(B)包含LIPOFECTAMINE(10μl)+300μl EMEM(包含HEPES+谷氨酰胺),但是没有FCS,溶液(A)和溶液(B)合并,轻轻混合并在室温温育45分钟。在60mm佩特里培养皿中的亚汇合的CSL503细胞用没有FCS的3mlEMEM(加HEPES和谷氨酰胺)清洗。没有FCS的EMEM(加HEPES和谷氨酰胺)(2.4ml)加入溶液A和B的混合液,轻轻混合并加入清洗过的CSL503细胞。细胞在37℃、5%二氧化碳的环境中温育5小时。温育介质改成加FCS(10%)的完全EMEM,细胞在37℃、5%二氧化碳的环境中温育,直到可以观察到病毒斑或细胞病变为止(7-15天)。
为了确认从转染pOAV100和pOAV200中获救的病毒是来自于那些质粒,用PCR扩增野生型OAV287、OAV100和OAV200病毒基因组的一部分。对于OAV100,使用的是在8287-8292位碱基跨越突变的SphI位点区域的引物对。对于OAV200,引物对跨越了pVIII和尾丝基因之间ApaI/NotI多聚连接子的插入位点。在每种情况下,野生型OAV287 DNA作为对照被扩增。从野生型OAV287扩增所得的DNA用SphI剪切,而从OAV100扩增所得DNA的不剪切(图8A)。同样地,OAV200 DNA用ApaI、EcoRV和NotI剪切,因为OAV287 DNA不剪切(图8B)。其它病毒类似地以限制性酶切割表征。
MLP/TLS元件的确定和pMT的构建用如下方法和(17)所描述的方法确定OAV287 TLS元件。存在于OAV287感染的CSL503细胞中的信使RNA利用与IIIa或尾丝基因互补的引物,通过逆转录被复制成cDNA。被认为属于TLS外显子1的引物于是与用于PCR的每个cDNA引物配对。DNA被成功地扩增、克隆和测序。这样确定了TLS外显子2和3(它们分别相当于图1的8083-8145和8350-8412碱基)以及TLS外显子1的3’边界,后者位于图1的5044碱基。然后使用第二PCR方案以获得适合于组装进pMT的MLP和TLS片段。被认为包含有MLP的图1中核苷酸4861和5023之间的区域通过PCR被扩增,使用了在5’末端加入ApaI序列的高敏感度(plus sense)的引物,以及在5012位碱基的突变点引入NdeI位点的3’低敏感度(minus sense)引物。同样地,TLS的扩增使用了在5012位碱基引入了NdeI位点的高敏感度引物和一个与碱基8396-8412互补的低敏感度引物,它在PCR产物的3’末端加入了一个HindIII位点。PCR片段分别用ApaI/NdeI和NdeI/HindIII切割,然后将片段克隆进用ApaI/HindIII剪切过的Bluescribe SK+(Stratagene)质粒。所得的质粒用HindIII/NotI切割,一个具有HindIII/NotI末端的合成的寡聚核苷酸和图9所示的序列被克隆以产生质粒pMT。目的基因于是被克隆进NCS中方便的限制性位点。基因表达盒被作为ApaI/NotI片段亚克隆进pOAV200或获救成感染性病毒。
细胞的感染和抗原的表达CSL503和其它的细胞如前所述(21),以20pfu/细胞的感染多重性感染。感染持续24-60小时。然后细胞在无甲硫氨酸的培养基中温育,该培养基中存在35S-甲硫氨酸以标记新合成的蛋白。使用针对表达蛋白的特殊抗血清的免疫沉淀反应从细胞裂解液中回收目的蛋白(21)。回收的蛋白用聚丙烯酰胺凝胶电泳分析,用放射自显影法检测或使用PHOPHORIMAGER(Molecular Dynamics)。
结果为了从分子水平上表征基因组,用Sambrook(9)和类似的出版物中描述的方法,将代表整个OAV287基因组的BarnHI限制性片段克隆进不同的质粒并测序。通过使用嵌套缺失突变组以及由新确定的序列合成的寡聚核苷酸引物,对两条链都测序。
29544个核苷酸的病毒序列(图1)与人的腺病毒序列相比短许多(大约6.5kb),但是用它们与它们的Ad2同系物的同源性确定了许多编码结构蛋白的基因(图2)。但是,很明显,与所有目前研究的其他腺病毒相比,羊腺病毒基因组显示了较多的结构和序列上的不同(图2),这种不同既存在于编码结构蛋白的区域,也存在于编码非结构蛋白的区域。具体地说,(a)初步被确定为形成E1A/B区的阅读框架主要基于它们在基因组中的位置而被命名。在44.5kD的开放阅读框架(orf)和其它腺病毒的大TE1B蛋白之间检测到很有限的同源性。到目前为止还没有检测到OAV287的推定的E1A区的同源性;(b)在其它的腺病毒中,E4区通常位于基因组的右侧末端。OAV287的E4?区只有在存在蛋白质序列基元HCHC...PGSLQC的基础上才被初步确定,该基元被发现于这一区域的18.8kD和30.85kD的开放阅读框架中。相同或非常类似的基元被发现于人的Ad2和Ad4中的E4 34kD蛋白以及鼠的腺病毒;(c)在其它病毒中被限定为E3区的pVIII末端和尾丝起始点的距离只有197个核苷酸(图4)。E3区的等价区如果在羊腺病毒中存在的话,它可能包括一组存在于互补DNA链上从右至左方向的开放阅读框架,位于基因组的右侧末端(图2和图5)。但是,这些序列没有表现出与任何其它腺病毒的可以检测到的同源性,这些蛋白质的功能不能从这样的比较中推知;(d)有一个位于E3?和E4?之间的大约1kb的区域,它具有很高的A/T含量(70.2%)(图1)。由于任何一条DNA链上都没有编码在长度上大于大约30个氨基酸的开放阅读框架,因此该区域不太可能编码任何蛋白质,除非信使RNA是由非常复杂的拼接过程产生的。该区域在任何其它的腺病毒中没有已知的等价区;(e)其它的不同之处在病毒的结构蛋白中是显而易见的。OAV287缺少Ad2蛋白的V和XI的同源性。但是,OAV287具有一个编码p28kD的全新的基因,它位于E1A?区的互补链上(图2和图3)。这是一个结构蛋白,通过SDS PAGE电泳确定的表观分子量为28kD,根据N末端测序的数据,它是从一个更大的前体上切下的。没有发现该蛋白与数据库中其它蛋白之间有同源性;(f)在其它大多数的基因组中,VA RNA基因位于末端蛋白和52/55k基因之间。在OAV287中,由于阅读框架的重叠,没有留给这些基因的空间。
这些不同之处可以用作强调OAV287分离物与其它人和动物的腺病毒相比的独特的特点。另外,由于OAV287的非结构蛋白区几乎没有显示出与其它腺病毒中等价区之间有同源性,序列对比不能揭示基因组中可能的非必需区域的特性。而且病毒DNA不能很容易地被操纵以检测非必需的序列。
本发明人已经制备出一种质粒,它包含羊腺病毒基因组的全长感染性拷贝,其中反向末端重复序列与一个产生特异性限制性酶切位点的短序列连接。还制备出一种质粒,它包含羊腺病毒基因组的全长感染性拷贝,并连接到细菌DNA复制启始位点和一个标记基因上。OAV287基因组DNA的部分克隆被特异性修饰并插入基因组特异性的SalI位点而初始连接到一个基因上,该基因编码抗生素抗性和复制启始点(图6,并参见方法)。这样的质粒可以在细菌中生长并更容易被操纵。
环形基因组克隆与存在于Ad5感染的细胞中的(10)和可能存在于OAV287感染的细胞中的天然存在的环的不同之处在于,40个碱基的反向末端重复序列由一个GTAC连接子连接。当反向末端重复序列从头连到尾时,这个序列与基因组的最后一个和第一个核苷酸(分别为G和C,见图1)一起,形成了一个单一KpnI位点(GGTACC)。因为其它的腺病毒基因组的3’和5’末端的核苷酸分别是G和C,所以其它的具有以G开始并以C结束的识别序列的位点,例如EcoRI,BamHI,SalI,KasI等,如果是单一的,也将是适合的。具有适合的抗生素抗性,例如ampR抗性基因和复制启始位点的质粒,可以被插入基因组中的特定位点或其它地方以形成可以在细菌体内繁殖的质粒。在存在200μg/ml的氨苄青霉素的条件下在大肠杆菌JM109和DH5α中繁殖的质粒保留了KpnI位点和插入序列,说明OAV287反向末端重复序列用这种方法连接是稳定的。该方法可能因此被用于处理其它的腺病毒基因组。如果需要,可以除去GTAC连接子序列,并且在用KpnI(或另外的适合的酶)切割并与T4 DNA聚合酶温育以产生平末端来转染之前,重新生成真正的末端(9)。
从环形质粒生成线性感染性基因组的方法包括用限制性酶KpnI切割包含OAV287基因组的全长拷贝的环形质粒,以产生具有真正的5’核苷酸dCMP的基因组。线性DNA于是用作为转染试剂的LIPOFECTAMINE导入CSL503细胞。
为了用病毒基因组作为载体,有必要识别出基因组中功能上非必需的区域。这些区域可以被取代或删除以为外源DNA留出空间(11,12),或者它们可能作为外源DNA的插入位点。在人的腺病毒基因组中,DNA被取代或插入到E1和E3区(13,14,15),以及基因组右侧最末端的E4和反向末端重复序列之间,通常伴随非必需区域的删除以使基因组的包装变得容易(16)。腺病毒可以将基因组包装到最大比野生型大~6%,可能是由于外壳结构所决定的物理局限性造成的(11)。
OAV287基因组中非必需位点通过插入包含ApaI和NotI限制性位点的多聚连接子序列来识别。该连接子通过定点诱变,被导入pOAV100中的基因组拷贝中如图1所示的核苷酸22、139和22、130之间,以生成质粒pOAV200(图7)。它相当于一个在pVIII和尾丝蛋白的基因之间的位于基因间区域的位点,因为它没有破坏该区域中的RNA加工信号。L4家族的RNA转录终止位点位于上游26个核苷酸中,相应地,三分先导序列和尾丝信使RNA之间的拼接结合区位于插入位点下游144个核苷酸中(17)。将pOAV200转染到CSL503细胞中导致了病毒OAV200的获救。多聚连接子插入的第二个位点位于图1中的26,645至26,646碱基之间。它生成了质粒pOAV600(图7)。该插入位点相当于富含A/T区(图2)的右侧末端,其功能和确切的界限尚未确知。选择该位点是因为它是转录终止位点左侧的六核苷酸,该位点是RNA从E3?区开始自右向左转录的终止位点(图2)。这是通过测定RT-PCR扩增的克隆的cDNA的序列来确定的,该cDNA是使用与pVIII/尾丝区的相同的方法得到的(17)。将pOAV600转染到CSL503细胞中生产出病毒OAV600。
以上的插入方案确定了基因组的两个区域,它们可以被打断并产生亚克隆基因表达盒的位点。
其它的非必需位点是通过使用位于图1中碱基28644-28649的单一SalI位点来确定的。该位点用SalI切割,末端填充,并被重新连接以破坏跨越该位点的阅读框架。丢失了该位点的质粒pOAV600S(图7)是用SalI切割来确定的。当pOAV600S被转染到CSL503细胞后,回收病毒OAV600S。该病毒中SalI位点的缺失是通过将病毒基因组用SalI切割来确认的。由于该SalI位点落入了两个重要的开放阅读框架中(它在互补链碱基28457和29014之间以及碱基28511和28699之间),这两个开放阅读框架被末端填充和重连接所破坏,所以从这两个阅读框架得到的基因产物可能也是非必需的。这组阅读框架可能因此构成OAV287的E3区,因为在任何其它的腺病毒中没有其它的基因产物是体外复制所非必需的。这意味着有可能删除图2中被标作E3?的整个区域。另外,在其它的实验中,图2中被标作E4?区的一个1kb的NotI片段被删除。该删除破坏了该区中的几个阅读框架。没有病毒从该质粒中获救,这意味着它不是非必需的,也就是说,它可能是E4。
许多病毒在异源的宿主中不完全复制,经常进入细胞但是由于复制循环的阻断,不能产生成熟的病毒颗粒。在重组病毒载体的角度上,这代表了一种所需的安全特性,这种特性所提供的是在外源基因适当的、有效的表达出现之前,复制不被阻断。OAV287在异源细胞类型中不能高效复制(18),目前唯一的例外是在牛鼻甲细胞中,在那里病毒的效价与CSL503细胞相比显著降低。OAV287的重组形式已经被构建,用于确定报告基因的表达是否受控于适当的启动子的存在。
外源基因的表达要求这些基因被功能性地连接到启动子上。该启动子可能是基因组中固有的病毒启动子,或者是与目的基因一起亚克隆到适当位点上的外源启动子。驱动基因表达的启动子一定要在CSL503细胞,以及一定范围内的优选的其它细胞类型中起作用。在本发明中,最初使用的是一个OAV287基因组启动子。后来也使用了异源启动子。在腺病毒中,结构蛋白的表达是被主晚期启动子(MLP)所驱动。从MLP获得的RNA转录物家族包含一个共同序列元件,即在5’末端的三分引导序列(TLS)。本发明人通过使用RT-PCR扩增mRNA晚期转录物以及测定克隆的cDNA的序列,已经从OAV287基因组中确定出了那些包含TLS的序列(17),该mRNA转录物存在于OAV287感染的细胞中。推测一种候选的MLP正好存在于TLS外子1的左侧(图2)。使用PCR技术将MLP和TLS元件亚克隆进单独的质粒pMT(图9)中,并与目的基因相连。这些启动子/基因盒作为ApaI/NotI片段被亚克隆进pOAV200的多聚连接子ApaI/NotI位点。用这种方案构建质粒pOAV203、pOAV204、pOAV205和pOAV210。这些引入的基因分别编码来自蛇形毛圆线虫17kD的可溶蛋白、轮病毒VP7sc基因(19)、来自羊绦虫的45W抗原(20)和来自铜绿蝇的膜蛋白(PM95)。质粒pOAV202包含17kD的抗原,但缺失MLP/TLS元件。这些质粒被转染进CSL503细胞,并分别以病毒OAV202、OAV203、OAV204、OAV205和OAV210获救(图10)。
人巨细胞病毒的即早期IE94启动子和增强子的也被连接到轮病毒VP7sc抗原基因上,它们在一定范围内的人和动物的细胞类中起作用(21)。这个基因盒是用HCMV增强子-启动子区域取代pMT/VP7sc中的MLP/TLS元件来组装的。该基因盒被插入pOAV200以构建pOAV206。pOAV206被转染到CLS503细胞中,病毒OAV206获救(图10)。
用上述病毒转染CLS503和其它细胞,在转染后不同时刻,细胞用35S-甲硫氨酸标记。目的蛋白通过使用适当的抗血清进行的免疫沉淀反应从细胞的裂解液中回收。回收的蛋白用聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分析,并用放射自显影仪检测。
当使用OAV202病毒时,用免疫荧光法没有观察到蛇形毛圆线虫17kD的抗原的表达。由于该病毒缺失MLP/TLS元件并只携带17kD基因,这一结果表明在pVIII和尾丝基因之间的插入位点的上游或相邻位置没有可以驱动基因表达的病毒启动子。这一情况与使用人的Ad5 E3重组体观察到的情况形成对比(21)。在这种情况下,插入pVIII基因3’端的无启动子的基因被表达,可能始自相邻的E3启动子或上游的MLP(15,21)。这一结果进一步强调了OAV287基因的独有性质。携带MLP/TLS元件的重组OAV287病毒被检测出在CLS503细胞中表达。使用OAV204,在转染后24小时很容易观察到在转染的细胞中表达,但没有在未转染的细胞中观察到表达(图11A)。类似地,当病毒OAV205和OAV210被测试时,分别观察到24kD的和大约95kD的基因产物(图11B)。因此很明显,MLP/TLS元件包含驱动基因在可以自由复制的条件下,在同源细胞系中表达的必要信息。但是,当OAV204用不能在其中有效复制表达的异源的兔肾细胞系检测时,没有观察到VP7sc的表达。虽然比在CLS503细胞中的效价低,在牛鼻甲细胞中有一些复制发生。在后者的细胞中,在用OAV204转染后检测到VP7sc的表达(图11B)。
包含HCMV增强子/启动子元件的、连接到VP7sc基因上的病毒OAV206被用于检测异源启动子在OAV287基因组情况下的功效。在转染后24-48小时,CLS503细胞用准备表达VP7sc抗原的病毒转染(图12A)。使用该病毒,在不能表达的兔肾细胞系和牛鼻甲细胞中也观察到VP7sc的表达(图12B)。这些结果表明,为了驱动OAV重组体的基因在不允许表达的细胞中表达,HCMV或相同结构的启动子可能优于MLP。
一种重组的病毒也被施用到绵羊上。五只绵羊用0.7×108pfu的OAV203在结膜内和鼻内接种。接种后第三天,从一只绵羊的鼻拭标本和两只绵羊的结膜拭标本中回收病毒,并且通过PCR分析确认重组病毒。动物没有因为这样的接种而表现出明显的不良后果。
本发明的病毒载体可被用于在食草动物中传递和表达治疗基因。对于一般情况下不感染羊腺病毒的品种,预先存在的免疫力的缺失可能造成有效的感染、基因传递和表达。该基因可以编码疫苗抗原、促进动物产量增加的分子、通过操纵激素应答而改变生产特性的分子以及其它生物活性或治病分子。该病毒在许多非羊细胞中不能高效复制,但是异源启动子的使用允许基因的传递和表达,同时最大限度地降低了病毒传播到非目标宿主的可能性。由于腺病毒载体的DNA可以在细胞中以非整合的形式存留,通过选择恰当的启动子,可以实现长期表达。
参考文献1.R.B.CouCh等,Am Rev Resp Dis,88,394-403页(1963)。2.T.Ragot等,自然,361,647-650页(1993)。3.M.S.Horwitz,《病毒学》,B.N.Fields,D.M.Knipe编著,(拉文出版社,纽约,1990),1679-1721页。4.W.S.M.Wold,L.R.Gooding,病毒学,184,1-8页,(1991)。5.K.S.Raviprakash,A.Grunhaus,M.A.El Kholy,M.S.Horwitz,病毒学杂志,63,5455-5458页(1989)。6.A.M.Lewis等,病毒学杂志,11,655-664页(1973)。7.R.L.Peet,W.Coackley,D.A.Purcell,C.W.Robartson,B.M.Micke,AustVet J,60,307-308页,(1983)。8.M.Benko,A.Bartha,G.Wadell,国际病毒学,29,346-350页,(1988)。9.J.Sambrook,E.F.Fritsch,T.Maniatis编著,《分子克隆实验室手册》,(冷泉港实验室出版社,冷泉港,1989)。10.F.L.Graham,EMBO杂志,3,2917-2922页,(1984)。11.F.L.Graham,L.Prevec,《分子生物学方法》,E.J.Murray,J.M.Walker编著,(Humana出版社,Clifton,新泽西,1991),第7卷,1-19页。12.F.L.Graham,L.Prevec,《疫苗免疫问题的新进展》,R.W.Ellis编著,(巴特沃斯-海因曼,斯通海姆, Ma,1992),363-390页。13.M.Levrero等,基因(Amst),101,195-202页,(1991)。14.J.E.Morin等,美国国家科学院院刊,84,4626-4630页,(1987)。15.G.W.Both等,病毒学,193,940-950页,(1993)。16.P.K.Chanda等,病毒学,175,535-547页,(1990)。17.S.V.Vrati,D.B.Boyle,R.Kockerhans,G.W.Both,病毒学,209,出版中,(1995)。18.D.B.Boyle等,兽医微生物学,41,281-291页,(1994)。19.M.E.Andrew等,病毒学杂志,64,4776-4783,(1990)。20.K.S.约翰森等,自然338,585-587页,(1989)。21.Z.Z.Xu,V.Krougliak,L.Prevec,F.L.Graham,G.W.Both,普通病毒学杂志,出版中,(1995)。22.S.H.Larsen,H D.,病毒学,82,182-195页,(1977)。23.E.Nakano,D.Panicali,E.Paoletti,美国国家科学院院刊,79,1593-1596页,(1982)。24.D.M.K.Rekosh,W.C.Russell,A.J.D.Bellet,A.J.Robinson,细胞,11,283-295页,(1977)。25.F.Sanger,S.Nicklen,A.R.Coulson,美国国家科学院院刊,74,5463-5467页,(1977)。
本领域的专业人员知道,在没有背离本发明的宗旨和范围的情况下,本发明可能有众多的变异和/或修改,如特定的实施方案所示。因此,这些实施方案在所有方面应被看作是例示性的和非限制性的。
权利要求
1.一种分离的DNA分子,它包含编码羊腺病毒(OAV287)基因组的,基本上如图1所示的核苷酸序列,或功能等价的核酸序列。
2.权利要求1中的DNA分子,其中编码羊腺病毒基因组的核酸序列基本上如图1所示。
3.一种分离的DNA分子,它包含编码羊腺病毒(OAV287)基因组的,基本上如图1所示的核酸序列,其中腺病毒基因组中对天然腺病毒维持或生存非必需的部分被删除或改变。
4.一种分离的DNA分子,它包含至少15核酸碱基序列,该序列对于图1所示的羊腺病毒(OAV287)核酸序列基本上是特异性的。
5.权利要求4中的DNA分子,其中至少15核酸碱基序列编码羊腺病毒(OAV287)的一个功能元件。
6.权利要求5中的DNA分子,其中功能元件选自启动子、基因、反向末端重复序列、病毒包装信号和RNA加工信号。
7.权利要求6中的DNA分子,其中功能元件是具有图1所示的1-46核酸碱基序列的反向末端重复序列。
8.一种包含权利要求1至7中任一权项的DNA分子的质粒。
9.一种包含权利要求1至3中任一权项的DNA分子的质粒,其中编码腺病毒基因组或其一部分的核酸序列与编码复制启始区的核酸序列以及编码标记物的另一核酸序列相连。
10.权利要求9中的质粒,其中编码腺病毒反向末端重复序列的核酸序列是连接在一起的。
11.权利要求9或10中的质粒,其中编码标记物的核酸序列编码一种抗生素抗性。
12.一种包含DNA分子的病毒载体,所述DNA分子含有基本上如图1所示的编码羊腺病毒(OAV287)基因组的核酸序列或功能等价核酸序列或其一部分,以及编码一种或几种非腺病毒多肽的至少一个核酸序列。
13.权利要求12中的病毒载体,其中编码腺病毒基因组的核酸序列基本上如图1所示。
14.一种包含DNA分子的病毒载体,所述DNA分子含有基本上如图1所示的编码羊腺病毒(0AV287)基因组的核酸序列,以及编码一种或几种非腺病毒多肽的至少一个核酸序列,所述腺病毒基因组中对天然腺病毒维持或生存非必需的部分被删除或改变。
15.权利要求12至14中任一权项的病毒载体,其中编码一种或几种多肽的核酸序列编码从细菌、病毒、寄生虫或真核细胞中获得的一种或几种多肽。
16.权利要求15中的病毒载体,其中非腺病毒多肽是轮病毒VP7sc抗原,寄生虫多肽是蛇形毛圆线虫17kD抗原、羊绦虫45W抗原或来自铜绿蝇的PM95抗原。
17.一种将具有编码一种或几种非腺病毒多肽的核酸序列的DNA分子传递给靶细胞的方法,该方法包括用权利要求12至16中任一权项的病毒载体感染靶细胞,使编码这一种或几种多肽的DNA分子表达,从而使靶细胞生产这一种或几种多肽。
18.一种将具有编码一种或几种非腺病毒多肽的核酸序列的DNA分子传递给动物的方法,该方法包括向动物施用权利要求12至16中任一权项的病毒载体,该病毒载体感染动物的至少一个细胞,被感染的细胞表达编码所述一种或几种多肽的DNA分子,并生产该一种或几种多肽。
19.权利要求18中的方法,其中动物是食草动物。
20.权利要求19中的方法,其中食草动物是绵羊。
21.一种包含DNA分子的病毒载体,所述DNA分子含有基本上如图1所示的编码羊腺病毒(OAV287)基因组的核酸序列或功能等价的核酸序列或其一部分,以及编码功能性RNA分子的至少一个核酸序列。
22.权利要求21中的病毒载体,其中功能性RNA分子是反义RNA分子或核酶。
23.一种将具有编码功能性RNA分子的核酸序列的DNA分子传递给动物的方法,该方法包括向动物施用权利要求21或22中的病毒载体,该病毒载体感染动物的至少一个细胞,被感染的细胞表达编码功能性RNA分子的DNA分子,并生产该RNA分子。
全文摘要
本发明涉及一种分离的DNA分子,它包含羊腺病毒OVA287的基因组、功能等价DNA分子或其部分。本发明还涉及包含该DNA分子的质粒和病毒载体。本发明还涉及编码一种或几种多肽的非腺病毒DNA分子向动物,特别是食草动物的传递方法。
文档编号C12N7/01GK1161715SQ95195268
公开日1997年10月8日 申请日期1995年7月26日 优先权日1994年7月26日
发明者G·W·布思, D·B·博伊尔, S·弗拉提 申请人:联邦科学及工业研究组织