专利名称：冬虫夏草菌深层培养液的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种真菌的深层培养液。
冬虫夏草是传统的名贵中药之一，具有益肾阳、补肺、止血化痰、补虚损等功效。它常用于治疗虚弱症、肺结核出血、老年衰弱的慢性咳喘、盗汗贫血等。由于野生资源有限人们采用人工方法来弥补野生资源的不足。其中人工有性栽培冬虫夏草工序复杂、培养条件严格；费时费工、周期长产量低，因而人们又转向人工无性培养。如在《微生物与生物工业》(门大鹏等科学出版社1989年12月第一版P290)中介绍冬虫夏草菌的摇瓶培养物(深层培养物)成分与天然冬虫夏草成分类似，具有平补肺肾、填精益髓、强化体质等功能。经临床300多例验证，冬虫夏草人工无性培养物对甲状腺机能减退、冠心病、变态反应性鼻炎、自觉耳鸣、慢性支气管炎等有明显疗效。另外它还具有一定的免疫增强功能，但是效果不理想。
本发明的目地在于提供一种免疫增强效果较明显的冬虫夏草菌深层培养物。
本发明的目的由以下措施来实现一种冬虫夏草菌深层培养液，其特征在于它是冬虫夏草菌在复合液体培养基中培养出的产物，其中复合液体培养基为沙氏葡萄糖液体培养基与中药水提取液的混合物，两者的体积比为4∶1，中药水提取液是由枸杞子、白术、女贞子、黄芪、茯苓、无花果、党参、黄精、薏苡仁中的三味与山药、玉竹、肉苁蓉中的一味组成配方，各味药用量相等，煎煮时所加水量是各组药重量之和的10倍，煎煮后得到的中药水提取液是所加水重量的1/2。一种冬虫夏草菌深层培养液的制备方法，其特征在于①种子液的制备将斜面上培养出的菌丝移种到沙氏葡萄糖培养基中，于25～31℃温度摇床培养5天，②中药水提取液的制备取甲组中药材3味乙组中药材1味加水煎煮，沸腾后文火煎煮35～50分钟，使得到的水提取液是所加水体积的一半，过滤备用，③配制将沙氏葡萄糖液体培养基与中药水提取液按4∶1的体积比混合成复合液体培养基，再按种子液复合液体培养基＝1∶50(体积比)的比例将种子液加入复合培养基中，④培养在25～31℃温度摇床或发酵罐培养7天。
本发明主要是向普通培养基中加入中药水提取液，用该复合培养基对冬虫夏草菌进行深层培养所获得的产物即为本发明的产物。
本发明所采用的菌为冬虫夏草菌(Cordyceps sinensis(Berk)sacc)。复合液体培养基中的普通培养基为沙氏葡萄糖液体培养基(即40.0克葡萄糖、10.0克蛋白胨、1000毫升蒸馏水)。复合液体培养基中的中药水提取液它是选用具有增强免疫功能、抗癌和升白作用的中药材如枸杞子、白术、女贞子、黄芪、茯苓、无花果、党参、黄精、薏苡仁(甲组)及传统的保健药品如山药、玉竹、肉苁蓉等(乙组)。其中每方含有甲组中药材3味，乙组中药材1味，而且各味药材用量相等，煎煮时所加水量是各组药量(重量)之和的10倍。煎煮后得到的中药水提取液是所加水重量(或体积)的1/2。沙氏葡萄糖液体培养基与上述中药水提取液的体积比为4∶1。
本发明的深层培养液的制备方法如下
1、种子液的制备将冬虫夏草菌种保存培养于沙氏葡萄糖琼脂斜面上，其中葡萄糖10.0克、蛋白胨10.0、琼脂20.0克、蒸馏水1000毫升。将斜面上培养出的菌丝用接种钩移种到沙氏葡萄糖液体培养基中，该培养基每1000毫升含40.0克葡萄糖、10.0克蛋白胨、0.3克磷酸二氢钾、0.3克磷酸氢二钾、0.2克硫酸镁，于28±3℃温度摇床(120转/分)培养5天，得到的产物简称为种子液。
2、中药水提取液的制备取含甲组中药材3味、乙组中药材一味的一组中药材，加水煎煮，沸腾后文火煎煮35～50分钟，使得到的水提取液是所加水体积的一半，过滤备用。
3、配制将沙氏葡萄糖液体培养基与中药水提取液按4∶1的体积比配制成复合液体培养基，再按种子液复合液体培养基＝1∶50(体积比)的比例将种子液加入复合培养基中。
4、培养在28±3℃温度、摇床(120转/分)或发酵罐(以120转/分速度搅拌)培养7天。如果采用发酵罐还要向罐内通入无菌空气。
5、后处理将培养液过滤，滤饼为菌丝体，其经加工可制成药品。滤液为深层培养液，经灭菌即可分装。如将其制成口服液还需加入糖和香精调整口感。
本发明的产物除具有普通冬虫夏草深层培养液的作用外，更具有较强免疫增强功能，尤其是抗肿瘤效果十分显著。
例1
将冬虫夏草菌种保存培养于沙氏葡萄糖琼脂斜面上，其中葡萄糖0.1克、蛋白胨0.1克、琼脂0.2克、蒸馏水10毫升。将斜面上培养出的菌丝用接种钩移种到300毫升沙氏葡萄糖液体培养基中，该培养基含12克葡萄糖，3克蛋白胨，0.09克磷酸二氢钾、0.09克磷酸氢二钾、0.06克硫酸镁。在25～31℃温度摇床培养5天(120转/分)得到内含直径0.1～1.5mm菌丝球的淡黄色悬浊液即为种子液。
取无花果、茯苓、白术、山药各20克加水800毫升，煮沸后改文火煎煮35～50分钟，得水提物400毫升，过滤备用。取200毫升沙氏葡萄糖液体培养基与50毫升中药水提取液混合，得到250毫升复合液体培养基。再取5毫升种子液将其加到250毫升复合培养基中，在25～31℃温度摇床(120转/分)培养7天，过滤培养物得到外观为淡棕黄色液体，即为深层培养液，经灭菌后即可分装。
例2
重复例1的操作，其中中药配方的组成为枸杞子、黄芪、黄精和玉竹各20克。
例3
重复例1的操作，其中中药配方的组成为女贞子、党参、薏苡仁和肉苁蓉各20克。
将本发明的深层培养液分别与冬虫夏草在沙氏液体培养基中的深层培养液(简称单纯培养物)及中药水提取液给小鼠口服进行对照，结果如下
由上表可见本发明产物的抑癌率明显优于其它两者，并且也高于其它两者之和。
2、在测定荷瘤鼠腹腔巨噬细胞杀瘤活性实验中
由上表可见口服本发明产物的荷瘤小鼠其腹腔巨噬细胞的杀瘤活性明显高于其它两对照组。
3、在测定肿瘤特异性杀伤T细胞杀瘤活性实验中
由上表可见口服本发明产物的荷瘤小鼠其肿瘤特异性杀伤T细胞的杀癌活性明显高于其它两对照组。
4、在对健康BAL B/C纯系小鼠进行的免疫指数测定实验中
刀豆蛋白A(Con A)刺激脾淋巴细胞增殖的刺激指数(StimulationIndex SI)反映机体细胞免疫功能状态，脂多糖(LPS)刺激的SI反映机体体液免疫功能状态。由上表可见本发明产物的免疫增强作用优于其它两组。
权利要求
1、一种冬虫夏草菌深层培养液，其特征在于它是冬虫夏草菌在复合液体培养基中培养出的产物，其中复合液体培养基为沙氏葡萄糖液体培养基与中药水提取液的混合物，两者的体积比为4∶1，中药水提取液是由构杞子、白术、女贞子、黄芪、茯苓、无花果、党参、黄精、薏苡仁中的三味与山药、玉竹、肉苁蓉中的一味组成配方，各味药用量相等，煎煮时所加水量是各组药重量之和的10倍，煎煮后得到的中药水提取液是所加水重量的1/2。
2、一种冬虫夏草菌深层培养液的制备方法，其特征在于①种子液的制备将斜面上培养出的菌丝移种到沙氏葡萄糖培养基中，于26～31℃温度摇床培养5天，②中药水提取液的制备取甲组中药材3味乙组中药材1味加水煎煮，沸腾后文火煎煮35～50分钟，使得到的水提取液是所加水体积的一半，过滤备用，③配制将沙氏葡萄糖液体培养基与中药水提取液按4∶1的体积比混合成复合液体培养基，再按种子液复合液体培养基＝1∶50(体积比)的比例将种子液加入复合培养基中，④培养在25～31℃温度摇床或发酵罐培养7天。
全文摘要
一种冬虫夏草菌深层培养液,它是冬虫夏草菌在由沙氏葡萄糖液体培养基与中药水提取液组成的复合液体培养基中培养出的产物。中药水提取液是由枸杞子、白术、女贞子、黄芪、茯苓、无花果、党参、黄精、薏苡仁中的三味与山药、玉竹、肉苁蓉中的一味组成的配方。将由菌丝培养出的种子液在复合液体培养基中再培养7天,得到的液体即为本发明的产物。本发明产物除具有普通冬虫夏草深层培养液的作用外,更具有较强的免疫增强功能。
文档编号C12N1/14GK1176107SQ9611558
公开日1998年3月18日 申请日期1996年9月6日 优先权日1996年9月6日
发明者于芒 申请人:于芒