专利名称:重组蛋白的运出系统的制作方法
技术领域:
本发明涉及用于制备由载体蛋白和过客(passenger)蛋白组成的稳定融合蛋白的载体,宿主载体结合物以及方法,其中融合蛋白的表达导致过客蛋白区暴露于细菌细胞尤其是大肠杆菌细胞表面上。如果需要,过客区可通过蛋白酶释放至培养基中,如通过选择的宿主因子,例如OmpT。
本发明进一步涉及来自以数据库或存储资料中的氨基酸序列存在,并且根据它们的性质被称为自身转运蛋白的天然蛋白质的载体蛋白或载体蛋白部分的用途。
本发明可提供鉴定和选择在它们表面上表达至少一种对结合配体具有确定亲和力的过客蛋白的细菌的方法以及其用于诊断目的的用途,尤其是,根据本发明的方法使得肽文库在细菌细胞表面表达,在它的帮助下,例如可确定在抗体、MHC分子或免疫系统其它成分的情况下具有最大亲和力的配体。
通过本发明的方法,还可实现制备由重和轻抗体区的某些部分和自身转运蛋白组成的融合蛋白,和其通过细菌细胞外被的运输。最后,在一个具体的实例中,可获得具有结合活性的重组抗体的靶向变异,和它们在大肠杆菌的细胞表面的功能性呈现。
根据本发明的方法通常允许(可能为受体或配体的)重组蛋白在细菌表面表达以及基于与结合配体的结合亲和力的选择,这种选择使得与此相关的克隆生产者的选择成为可能。
本发明还涉及在细胞表面表达蛋白融合物、并以与载体物质结合或在溶液中的形式存在的细菌用于特异富集或纯化对暴露在该表面的蛋白区显示亲和力的结合配体的用途。而且,本发明还涉及具有生物、化学或相关工业性质的酶或其它蛋白的表面表达,以及需要时,其向周围培养基中的特异性释放。
重组蛋白在细菌细胞表面上的暴露是一种有大量微生物学,分子生物学,免疫学或工业应用可能的方法用这种方法制备重组蛋白不需要进一步的步骤,例如破碎生产细胞,而获得它们的一些性质,例如结合亲和力或酶活性(Francisco等,生物技术(Bio.Technology)11(1993)491-495)。由于仅仅一些有限数量的因子在细菌表面天然表达,因此与胞质制备相比,另外还存在重组蛋白的特异性富集。另一个显著的优点是还可采用用来选择所寻找的重组蛋白的相同方法来分离该蛋白的生产者,即细菌细胞,因此可获得可被永久性贮藏、稳定繁殖及大规模生长的克隆生产者。
迄今许多系统已被用来在细胞表面呈递重组蛋白,但这些毫无例外地也被自然地用于细菌表面蛋白的转运或分泌(Little等,TIBTECH11(1993),3-5)。很明显,在这种情况下,天然编码将要转运的蛋白(过客蛋白)的DNA区被所需重组蛋白的编码DNA区所置换或补充,虽然负责转运的蛋白区(载体蛋白)的编码区通常保持不变。很显然其中过客蛋白和载体成分以紧密相邻的形式存在或在一个基因中被编码的系统,即所谓的单成分系统,与具有几个独立成分的系统(Gentschev等,Behring Inst Mitt.95(1994)57-66)相比,具有显著的优点,尤其是在制备除开稳定复制的性质、一个或多个选择标记以及转运所需蛋白区外,还必须包含编码过客蛋白的DNA片段的插入位点的普遍可使用的载体方面。用于迄今采用的许多单成分系统中的载体蛋白为大肠杆菌外膜蛋白。这些包括尤其是Lamb(Charbit等,基因70(1988),181-189),PhoE(Agterberg等,基因59(1987),145-150)或OmpA(Franscisco等,美国国家科学院学报(Proc.Natl.Acad.Sci)(1992),2713-2717),然而,它的应用必然伴有缺点。例如,另外的蛋白序列仅可被整合在暴露在表面的环中,这在一方面导致在侧翼载体蛋白序列中的固定的氨基和羧基末端,并且另一方面,对被导入的序列长度具有限制作用。虽然使用肽聚糖结合的脂蛋白(PAL)作为载体蛋白导致转运至外膜上,但天然蛋白质序列与此在大肠杆菌表面的呈递是不可能的(Fuchs等,生物技术,9(1991),1369-1372)。使用OmpA和Lpp的融合作为载体蛋白部分可进行相对大的蛋白质的表面表达,其中过客蛋白序列与它的羧基末端相连(Fanscisco等,Proc.Natl.Acad.Sci(1992),2713-2717)。在这种情况下不得不接受的不足是过客蛋白N末端的固定可能阻止正确的折叠或发挥作用。
还已知所谓包含自身转运蛋白的蛋白质,即在革兰氏阴性细菌中的一类分泌蛋白。Jose等人的公开(分子微生物学(Mol.Microbiol)18(1995),377-382)提到这些自身转运蛋白的一些实例。这些蛋白包含能使N-末端相连的蛋白区通过由革兰氏阴性菌的外膜中的β-折叠片结构形成的孔状结构而被转运的蛋白域。含自身转运蛋白的蛋白以所谓的多蛋白前体分子的形式合成。该前体蛋白的典型结构被分成三部分。在N-末端,存在一个通过内膜,利用存在于宿主中并在此期间缺失的Sec转运器负责转运的信号序列。与这相连的是待分泌的蛋白区,接着是在外膜形成一个孔的C-末端辅助区,通过它待分泌的N-末端相连的蛋白区被运输到表面。取决于要完成的功能,所述蛋白仍与辅助区连接,在细菌表面正起着膜锚的作用,或被蛋白水解作用除去,这种蛋白水解活性可能为待分泌蛋白区所固有或为来自宿主的性质或为外在/特异性添加的活性(例如凝血酶,IgA蛋白酶)。业已知使用基于自身转运蛋白的表达系统来分泌异源多肽或蛋白。因此,如从EP-A-0254090或Klauser等人的公开(EMBO J.11(1992),2327-2335)已知来自淋病奈瑟球菌(N.gonorrhoeae)的IgA的辅助区可在异源大肠杆菌细菌菌株和鼠伤寒杆菌中表达作为过客区的异源多肽。
此外,在Suzuki等(生物化学杂志170(1995)30874-30880)中描述了通过志贺菌的蛋白VirG的细胞外转运。该蛋白同样是能表达外源多肽(如MalE和PhoA)的IgA蛋白酶样自身转运蛋白,其中外源多肽被共价连接到VirG的自身转运蛋白区的N末端。此外,Shimada等人的论文(生物化学杂志,116(1994),327-334)描述了在大肠杆菌中,使用来自粘质沙门氏菌(S.marcescens)的丝氨酸蛋白酶的自身转运蛋白区的异源多肽(即来自粪产碱杆菌假天青蛋白)的细胞外转运。
然而,现有技术中描述的借助于自身转运蛋白系统来制备异源过客蛋白表达的方法中,已发现了很多不足。因此,在作为宿主菌株的大肠杆菌中使用来自淋病奈瑟球菌的IgA蛋白酶的转运蛋白或辅助区时,经常产生显著的相容性问题。过度表达导致细胞溶解或甚至中度表达时细菌显示出生长被降低,在这两种情况下,这导致融合蛋白产率的显著降低和显示系统稳定性差。由此本发明是基于提供尤其是在使用大肠杆菌作为宿主菌株时不导致这些不足的载体蛋白的技术问题,因为出于各种原因,作为宿主菌株,大肠杆菌优于如淋病奈瑟球菌。另一方面,甚至可以在具有安全水平1的简单的实验室中培养具有重组DNA的大肠杆菌菌株。此外,大肠杆菌菌株已被用于商业化生产重组蛋白。这意味着与其它宿主菌株相比,在重组大肠杆菌的处理和操作中具有相当大的优点。另外,已经存在大量准确表征的大肠杆菌突变菌株,并允许根据所需用途选择宿主菌株。
这个问题通过一种用于在革兰氏阴性宿主细菌的表面上呈递肽或/或多肽的方法而得到解决,其中a)提供用载体转化的宿主细菌,其中与启动子操作性相连的包含下面部分的融合核酸序列位于载体上(i)编码信号肽的核酸部分,(ii)编码待呈递的过客肽或/和过客多肽的核酸部分,(iii)适宜时,编码蛋白酶识别位点的核酸部分(iv)编码跨膜接头的核酸部分和(v)编码自身转运蛋白的转运区的核酸部分;和(b)在表达融合核酸序列并在宿主细菌表面呈递由核酸部分(ii)编码的肽或多肽的条件下培养宿主细菌,特征在于核酸部分(ii)相对于编码转运蛋白区的核酸部分(v)为异源性的,以及宿主细菌相对于编码转运蛋白区的核酸部分(v)为同源性的。
通过使用相对于编码转运蛋白区的核酸部分为同源性的宿主细菌可令人惊奇地实现肽或/和多肽,尤其包括具有长度优选为4-50个氨基酸长度的短合成肽或真核多肽的表面呈递,其与现有技术相比有明显的改进。
在根据本发明的方法中,提供了用一个或多个相容重组载体转化的宿主细菌。这种类型的载体包含操作性地与启动子和适宜的其他表达所需的序列相连的融合核酸序列。该融合的核酸序列包含(i)编码信号肽的部分,优选编码使通过内膜进入周质的革兰氏阴性菌信号肽的部分。该融合的核酸序列(ii)还包含编码待呈递的过客肽或多肽的部分。适宜时,编码蛋白酶识别位点的核酸部分(iii)位于这个部分的3′端。适宜的蛋白酶识别位点的例子为固有的识别位点,也就是说天然存在于宿主细胞中,或外加的蛋白酶中。外加的蛋白酶的例子为IgA蛋白酶(如EP-A-0254090),凝血酶或因子X。固有蛋白酶的例子为OmpT,OmpK或蛋白酶X。在这部分的3′端,存在一个编码跨膜接头的核酸部分(iv),它使得由部分(iii)编码的肽或多肽呈现在宿主细菌的外膜的外面成为可能。在这个部分的3′端是编码自身转运蛋白的转运区的核酸部分。
尤其优选采用的跨膜接头区相对于自身转运蛋白为同源的,也就是说跨膜接头区由直接位于自身转运蛋白区的5′端的核酸部分所编码。跨膜接头的长度优选为30-16个氨基酸。
转运蛋白区能在宿主细菌的外膜形成所谓的β-桶。该桶由偶数的反向平行两亲性的β-折叠片组成。该结构类似于革兰氏阴性细菌外膜的其它蛋白,在C-末端也具有芳香氨基酸,如苯丙氨基或酪氨酸。此后接着的是交替的带电荷(极性)和不带电荷(疏水性)的氨基酸,该结构看来在膜折叠中起作用。该两亲性的β-折叠片的数目和位置可借助于适宜的计算机程序来鉴定,并可借助于与已知其结晶结构(Cowan等,自然358(1992)727-733)的外膜膜孔蛋白的类推而被用来构建桶状结构模型。优选如下构建桶状结构9-14,尤其是约12个氨基酸(AA)用于膜通道;在β-折叠片中,没有或最少数目的带电AA指向外部;小环,或根本没有环指向内部,适宜时,大的或非常大的环指向外部;β-桶由12,14,16或18个,尤其是14个反向平行β-折叠片组成。
从桶模型出发,目前可在基因水平上建立通过外膜的自身转运所必需的区并与信号肽和过客区连接。接着,该构建物的表达可使该过客蛋白转运至细菌表面,信号肽可最初来源于过客蛋白或来自其它蛋白。在这方面必须考虑具有适当长度和序列并通过已形成的孔延伸并确保过客区被完全暴露在表面的接头区也适当地与β-桶相连。
本发明方法的一个重要特征是该宿主细菌相对于编码转运蛋白区的核酸部分为同源的,也就是说该宿主细胞和转运蛋白区选自同源科,例如肠细菌科,优选来自同源属,例如埃希氏菌属,沙门氏菌属或螺杆菌属,尤其优选来自同源种,例如大肠杆菌,鼠伤寒杆菌。尤其优选使用沙门氏菌或大肠杆菌作为宿主细菌和同样来自沙门氏菌或大肠杆菌的转运蛋白区或其变异体。
这里可提到的尤其适宜的大肠杆菌宿主菌株是为ompT、dsbA-并携遗传标记fpt的菌株JK 321(DSM 8860),它在igaβ辅助蛋白的帮助下导致甚至是大蛋白的稳定表面表达,例如抗体的Vh链。
在一个优选的具体实例中,本发明因而涉及执行自身转运蛋白功能并可能在大肠杆菌中以高产率完成重组蛋白的表面暴露的载体。在一个典型的实例中,这是来自大肠杆菌的“参与扩散粘附的粘附素(AIDA-I)”的自身转运蛋白(Benz和Schmidt,传染免疫学(InfectImmun.)57(1989),1506-1511)。AIDA-I蛋白的转运蛋白区描述在图2中。除开该特定的序列,还可使用可通过例如修饰不参与膜通道的环结构中的氨基酸序列产生的它的变异体。适当时,也可将编码表面环的核酸部分完全去除。
还可在两亲性β-折叠片结构中进行保守的氨基酸替换,也就是说用其它亲水性氨基酸取代一个亲水性氨基酸或/和用其它疏水性氨基酸取代一个疏水性氨基酸。至少在β-折叠片结构区中,变体优选具有与图2说明的AIDI-I自身转运蛋白区的序列至少80%和尤其是至少90%的同源性。
在另一个典型实例中,采用的是来自弗氏志贺氏菌的SepA蛋白的自身转运蛋白(Benjellou-Touimi等,分子微生物学17(1995)123-135)或其变异体。在另一个典型实例中,它为来自弗氏志贺氏菌的IcsA蛋白的自身转运蛋白(Goldberg等,细菌学杂志175(1993),2189-2196)或来自大肠杆菌的Tsh蛋白的自身转运蛋白(Provence等感染免疫学62(1994),1369-1380)。在另一个典型实例中,它为来自鼬鼠螺杆菌的Hsr蛋白的自身转运蛋白(O′Toole等,分子微生物学11(1994),349-361),来自博德氏菌的Prn蛋白的自身转运蛋白(Charles等,Proc.Natl.Acad.Sci USA 86(1989),3554-3558;Li等,普通微生物学杂志138(1992),1697-1705);来自粘化沙雷氏菌的Ssp蛋白的自身转运蛋白(例如在Yanagida等,细菌学杂志166(1986),937-944或Genbank登记号X59719,D78380),来自流感嗜血菌的Hap蛋白的自身转运蛋白(StGeme等,分子微生物学14(1994),217-233),来自百日咳博德特氏菌的BrkA蛋白的自身转运蛋白(Fernandez和Weiss,感染免疫学62(1994),4727-4738),来自幽门螺杆菌的VacA蛋白的自身转运蛋白(Schmitt和Haas,分子微生物学12(1994),307-319)或各种立克次氏体蛋白(例如190kDa细胞表面抗原,基因库(Genbank)登记号M31227;Spap、CarL等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87(1990),8237-8241;rOmpB,Gilmore等,分子微生物学5(1991),2361-2370和Slp T,Hahn等,基因133(1993),129-133)或如上定义的它们的变异体。
上述自身转运蛋白的DNA序列和由其产生的氨基酸序列描述在图7-24中。
细菌表面蛋白或分泌的细菌蛋白中的其它自身转运蛋白区可从存在于数据库中的蛋白序列,从基于数据库可获得的DNA序列的蛋白序列,或从直接序列分析或间接借助DNA序列而确定的蛋白序列而产生。相应的编码区(基因)可被用来制备可在革兰氏阴性菌尤其是大肠杆菌中产生高效的过客蛋白的表面表达的载体或融合蛋白基因。
根据本发明的表面呈现或暴露指融合蛋白或过客区位于细菌外膜对培养基的一侧。在完整的革兰氏阴性菌中,暴露在表面的过客蛋白可自由地与结合配体接触。
在一个优选具体实例中,本发明因此有可能实现肽的表面呈递或在另一个具体实例中,在革兰氏阴性菌,尤其是在大肠杆菌中肽文库的表面呈递,以及其在确定对抗体或其它受体的亲和力或在表位作图中的用途。表位作图指对抗体或其它受体具有最大亲和力的肽被鉴定暴露在生产菌株的表面。与以前使用的用于表达肽文库的噬菌体系统(Makowski,基因128,(1953),5-11)相比,这使得本发明的关键性优点变得更为清晰。在根据本发明的细菌系统中,具有所需特性的肽的鉴定与克隆生产菌的选择同时进行。后者可直接培养并被用来产生更大量的所需肽而不需如对噬菌体系统进行的感染(噬菌体复制)和选择(噬菌体选择)的复杂循环。表达暴露在表面的正确肽的菌株的生长发生在与相应编码基因的扩增相同的时间,其中用简单和已建立的方法对它的序列分析允许对该肽进行明确的鉴定和表征。根据本发明的这些优点适用于通过使用本发明被表达暴露在表面的所有过客区,也就是说肽和多肽。
由此,根据本发明产生的肽文库,包含由自身转运蛋白(尤其优选的AIDA自身转运蛋白)和在革兰氏阴性菌优选在大肠杆菌中被表达暴露在表面的肽组成的融合蛋白。典型地由信号肽和自身转运蛋白的编码区之间的简并性合成制备的寡核苷酸的克隆产生多种不同的表达肽。
在另一个优选的具体实例中,本发明使在革兰氏阴性菌优选大肠杆菌表面表达作为抗原的蛋白或蛋白片段成为可能。根据本发明,使用毒素霍乱弧菌(CtxB)的β亚单位作为过客蛋白和AIDA自身转运蛋白作为载体蛋白进行这种类型融合蛋白的构建。根据本发明,通过用对CtxB特异性的抗血清标记已证实表面暴露的抗原区对适宜结合配体的可接触性。这表明包埋在大肠杆菌宿主菌株外膜的重组融合蛋白可达全部细胞蛋白的5%,这意味着与其它系统相比显著提高的效率。本文描述的方法因此可实现具有抗原活性的蛋白或蛋白片段在革兰氏阴性菌表面的稳定产生和呈现,以及在一个优选的具体实例中其作为活疫苗,用于口服接种或用于筛选血清或抗体库的应用。与抗原的细胞内细菌表达相比,有抗原活性的蛋白被表达暴露在表面的细菌细胞,如减毒的沙门氏菌菌株(Schorr等,疫苗9(1991)675-681)的应用已被证明在活体接种中是有利的。
在一个优选的具体实例中,本发明通常允许其必要成分为肽或蛋白的所有过客蛋白在革兰氏阴性菌尤其是大肠杆菌表面的表面表达。
在另一个优选的具体实例中,AIDA蛋白的C-末端区(即AIDA自身转运蛋白)起着免疫系统重组多肽呈递的膜锚的作用,例如革兰氏阴性菌表面上的重组抗体区。重组抗体片段的表面表达使得有可能迅速修饰它们以及评价和研究它们的抗原结合特性。例如,可以产生暴露在表面的功能性抗体片段的全部文库,以及检测它们给定的结合特性或亲和力。与以前采用的噬菌体系统相比,本发明的优点是变化即遗传操作和蛋白的产生可在相同的宿主生物中发生。使用简并核苷酸还可进行靶向(定点诱变)或随机的遗传操作,以合成作为过客蛋白的抗体编码区和作为载体蛋白的自身转运蛋白的完整融合体。同样可通过将包含融合蛋白基因的细菌暴露在高能辐射(例如UV)或具有诱变效果的化学试剂而以体内诱变的形式进行遗传操作。
根据本发明,具有正确结合特性的分子的选择与生产性细菌细胞的选择一起进行。从这显然可见根据本发明这个步骤在其由变化和后面的选择组成的策略是基于免疫系统进行免疫原分子结合特性的最佳适应的天然策略。根据本发明的各个步骤可适用于抗体的功能性抗原结合部分在革兰化阴性菌优选大肠杆菌的表面表达,所述抗体部分通常未被糖基化。两个一价片段可通过轻链(VL)和重链(VH)各与自身转运蛋白单独融合而一起呈递,其中它们通过不同的相容性载体或在宿主细胞中的相同载体上的不同启动子的控制下相互独立地表达。被呈递暴露在表面的两个抗体区在表面组装形成功能性Fv片段,有可能通过化学诱导的二硫桥形成或其它类型的化学交联提高相互作用的稳定性。
在根据本发明的另一个方法中,提供了融合蛋白的制备,其中该融合蛋白包含自身转运蛋白作为载体蛋白,抗体的抗原结合区的轻链(VL)和重链(VH)作为过客蛋白,其中它们借助于允许两条链正确组装形成功能性Fv片段的短接头肽(例如[Gly4Ser]3)相连。为了构建该单链(sc)Fv片段,可将轻链的N末端与重链的C末端连接或将重链的N末端与轻链的C-末端连接(Pluckthun免疫学综述130(1992),151-188)。还可使用描述的方法来制备完整的Fab片段。
在另一个优选的具体实例中,本发明使得有可能在大肠杆菌中,在适宜时以确定的包埋肽形式表面暴露地表达II类MHC分子。为此可设想两种策略。在一个方案中,在宿主细胞中将均包含自身转运蛋白作为载体蛋白的两种不同的融合蛋白在不同的相容载体或一个载体中在不同启动子的控制下表达。一方面,采用的过客蛋白为所需MHC II亚型的α链,另一方面,为该亚型的β链,所需肽可借助于接头与其N末端相连(Kozono等,自然369(1994)151-154)。
在第二个方案中,将由肽、β链和α链组成的过客蛋白融合至自身转运蛋白上。α链和β链在细菌表面组装而形成功能性MHC分子,并伴随着该肽被正确包埋在结合腔中。复合物的稳定性可通过化学诱导的二硫桥的形成而被增加。通过定点诱变或/和在制备编码融合蛋白的DNA片段中使用简并寡核苷酸以及使用高能辐射或/和化学诱变的体内诱变方法可进行包埋肽的变异。
可再次看到根据本发明的方法的优点。在一个宿主菌株中可进行结合配体的变化、表达、具有最佳特性的分子的选择、序列分析和稳定的产生。这还使得可以例如迅速表征具有改进的结合特性的以前已知的配体的变异体,以及由此产生的配体或受体的最佳化。
在另一个优选的具体实例中,本发明使得有可能表面表达免疫调节受体,例如CD1,Fc受体或MHCI类分子,及其特异性变异。
在另一个优选的具体实例中,本发明使得有可能表面表达T细胞受体或其某些部分,以及真核细胞或免疫系统细胞的其它表面抗原。
在另一个优选的具体实例中,在表面表达的蛋白片段或肽为在被适宜细胞系或初级细胞如巨噬细胞摄入后,以包埋在I或II类的MHC分子中的肽形式呈递的并且可用来刺激特异性T细胞的T细胞表位。
在一个尤其优选的具体实例中,根据本发明的方法使得有可能进行对结合配体具有亲和性的肽或多肽,配体,受体,抗原,毒素结合蛋白,具有酶活性的蛋白,核酸结合蛋白,抑制剂,具有螯合剂特性的蛋白,抗体或抗体的抗原结合区的表面表达和变化。
根据本发明,术语“结合配体”指因子,分子,化合物或大分子,其中结合配体和/或表达融合蛋白的细菌分子为游离的可溶形式,与基质结合或与生物膜相结合。
根据本发明,术语“抗原结合区”指至少足以进行抗原特异性结合的抗体分子的某一区。
在另一个优选的具体实例中,本发明使得有可能将表面暴露的过客肽或多肽或其部分进行化学、物理或/和酶促修饰,可能的修饰为共价修饰,非共价修饰,糖基化,磷酸化或蛋白酶解。
本发明用于制备暴露于表面的肽的变异体群以及用于鉴定带有具特定要求特性的肽或多肽的细菌的方法分为下面几个步骤(1)通过在至少一个载体中将所需过客蛋白的编码序列与自身转运蛋白的转运蛋白区和信号肽的编码序列克隆在同框内来制备一个或多个融合基因,其中各个亚片段可通过PCR而被扩增或从其它DNA的限制性消化而产生;(2)通过诱变,例如通过在PCR中使用简并寡核苷酸引物的定点诱变,通过化学诱变或通过使用高能辐射进行过客蛋白的变异;(3)将该载体或多个载体导入宿主细菌中;(4)在将该融合蛋白或多种融合蛋白稳定地呈递在表面的宿主细胞中表达该融合基因或多个融合基因,(5)在例如液体培养基或琼脂平板上培养该细菌,以产生暴露在表面稳定呈递的该过客蛋白或暴露在表面稳定呈递的多种过客蛋白;(6)适宜时,选择在表面带有具所需特性的过客蛋白或多种过客蛋白的细菌;(7)适宜时,鉴定具有最佳特性的过客蛋白的结合配体。
根据本发明还可将该过程进行多次以使表面暴露的肽或多肽的特性逐步适应所需的结合行为,或在第一步骤中将结合配体一个方面的特性最佳化,在第二步中将一个或多个其他特性最佳化。然而,根据本发明,取决于所需用途还可仅将该方法的一些组成步骤结合在一起,在一个典型实例中,将组成步骤(1),(3),(4)和(5)结合在一起,但还有其它所有可能的组合。
在该方法的一个优选的具体实例中,该融合蛋白包含作为载体蛋白的使得融合蛋白的分泌成为可能的AIDA蛋白的自身转运蛋白区或其变异体。
在该方法的另一个优选的具体实例中,该融合蛋白包含作为载体蛋白的SepA自身转运蛋白或其一部分,或IcsA自身转运蛋白或其一部分,或Tsh自身转运蛋白或其一部分,Ssp自身转运蛋白或其一部分,Hap自身转运蛋白或其一部分,Prn自身转运蛋白或其一部分,Hsr自身转运蛋白或其一部分,BrkA自身转运蛋白或其一部分,VacA自身转运蛋白或其一部分,或立克次氏体自身转运蛋白或其一部分,其中每一种使得融合蛋白的分泌成为可能。
根据本发明通过在一个细胞中制备不同的融合蛋白并在表面组装而形成功能性单元可表达多聚体蛋白。
用作宿主生物的细菌的短的世代时间使得有可能具有一个持久性变异和选择循环,使得能以渐进方式让过客蛋白及自身转运蛋白适应给定的特性。在一个典型实例中,这可包括过客蛋白和结合配体之间的结合亲和性。在该方法的一个优选的具体实例中,通过与固定化或/和标记的结合配体如基质固定的结合配体、具有荧光标记的结合配体、用磁颗粒标记的结合配体、具有显色标记的结合配体结合来进行具有稳定暴露的融合蛋白的细菌的分离。在另一个优选的具体实例中,将结合配体修饰,这样它可在第二个步骤中通过对修饰特异的结合配体而被检测。
本发明的另一个目的是提供稳定表达的融合蛋白或其某些部分或在细菌表面稳定表达的融合蛋白,以及其用于治疗目的或诊断目的的用途,在污染物浓缩或除去、毒素灭活、原材料的活动化、食品生产或加工、去污剂生产、被选择的真核或原核细胞的标记中的用途。根据本发明可以使用在表面稳定的细菌表达的抗体或抗体片段,在一个典型实例中使用AIDA自身转运蛋白作为转运蛋白区,来制备这些抗体或抗体片段,随后采用这些抗体或抗体片段(适宜时在纯化后)用于诊断或治疗目的。例如可使用这些抗体或抗体片段来特异性鉴定或选择具有特定表面标记的细胞,这里可提到的一个典型实例为肿瘤抗原。在另一个典型实例中,标记的表面标记为受体,在这种情况下,标记与这种或一种受体特性的阻断一起发生,这使得可特异性地抑制由受体诱导或介导的信号转导以及与此相关的细胞功能。
图1AIDA-I蛋白的C-末端300个氨基酸的疏水性。
革兰氏阴性菌外膜中的自身转运蛋白的典型孔由两亲性β-折叠片结构形成,也就是说通过具有β-折叠片结构的区和交替疏水性和亲水性氨基酸。这可通过将氨基酸的相对疏水性值对氨基酸位置作图来证实,其中已借助于特定的算法算出了各个氨基酸的疏水性值。采用Vogel和Jahnig算法(分子生物学杂志190(1986)191-199)。箭头表明可能的膜通道,指向左边的箭头表明膜通道从内向外,指向右边的箭头说明膜通道从外向内。SP表明由Emini等(病毒学杂志55(1985),836-839)方法计算的氨基酸的相对表面概率。图2AIDA-I蛋白的自身转运蛋白模型从氨基酸的相对疏水性对其位置的图出发(图1),可将由反向平行两亲性β-折叠片形成的桶状结构描绘成模型。在此被描绘成被打开的桶状结构在膜中通过第一个与反向平行的最后一个膜通道的相互作用而被封闭。菱形内书写的氨基酸位于膜区中,用粗线包围的那些为相对疏水性的,并朝向桶的外侧,也就是说朝向膜,而用细线包围的那些为相对亲水性的,并且它们的侧链指向孔的内部。在圆形环中所示的氨基酸在膜外。模型位置1的丙氨酸在AIDA-I全部序列中为1014号,而末端苯丙氨酸在全部序列中为1286号(Benz和Schmidt,分子微生物学11(1992),1539-1546)。图3a用于表面表达CtxB的载体pJMT的制备pJMT包含霍乱毒素B和AIDA接头/β-桶区的基因融合体(FP59)。该基因融合体在具有高拷贝数的载体中,在人工启动子PTK(Klauser等EMBO J.9(1990)1991-1999)的控制下被组成性表达。通过使用来自质粒pYK1的寡核苷酸EF16和JM6的PCR扩增ctxB基因(Klauser等,EMBO J.(1990)1991-1999)。通过使用来自大肠杆菌EPEC 2787的质粒DNA制备的寡核苷酸JM1和JM7的扩增来扩增由来自AIDA-I的β-桶和接头区组成的自身转运蛋白(Benz和Schmidt,感染免疫学57(1989),1506-1511)。寡核苷酸JM1在其5′突出端包含Bgl II识别序列,寡核苷酸JM6和JM7各自包含KpnI识别序列。将载体DNA(pBA)用ClaI和BamHI水解,接着在扩增后将两个PCR产物用ClaI和KpnI(EF16/JM6片段)或用Bgl II和KpnI(JM7/JM1片段)切割。将用这种方法产生的三个片段在连接反应中缩合。图3b用于肽表面表达的载体pJM22的制备pJM22产生由三个区组成的融合蛋白FP50。在N-末端存在确保产生的融合蛋白通过细胞膜输出的CtxB信号序列(Sec介体)。这之后是过客区,这里是一种肽,即表位PEYFK。在融合蛋白C-末端的为AIDA β-桶/接头区,即自身转运蛋白,它通过信号肽将具有N-末端平截的过客区输送至大肠杆菌的表面。为了构建pJM22,首先将pJM7的DNA用XhoI水解,通过使用寡核苷酸JM7和JM20的PCR扩增pJM7的载体部分。这使得除去了其信号序列以外的ctxB基因。寡核苷酸JM20在其5′突出端除开KpnI裂解序列外,还包含编码氨基酸PEYFK的五个密码子。该氨基酸序列代表单克隆抗体Dul42的线性表位。将PCR产物用KpnI水解并自身连接。图4表达的检测和蛋白酶敏感性由于在大肠杆菌中融合蛋白FP59(来自pJM7)和FP50(来自pJM22)的强稳定表达,它们可很容易在用考马氏亮兰染色的全细胞溶胞产物中被鉴定出来。蛋白酶的可接近性代表确定蛋白位置的常规方法。只有当它们存在于细菌的表面或如果细菌外膜对蛋白酶是可穿透的时,才可期望接近细胞内在蛋白。为了排除后者,可使用被已知天然存在于周质中的蛋白酶敏感标记。只有当标记不被所采用的蛋白酶攻击时才能确保外膜的完整性。将大肠杆菌UT 5600或JK321的细胞在LB琼脂(50mg/L氨苄青霉素)上培养过夜并悬浮在PBS中。将细胞悬液调节到OD578=4.0。在台式离心机将0.5mL细胞悬液的细胞沉降1分钟并重新悬浮在200uL含0.1mg/mL蛋白酶的PBS中。37℃下,将混合物保温20分钟并通过冷却至0℃来终止,沉降1分钟并将沉淀重新悬浮在40uL SDS-PAGE样品缓冲液中并立即煮沸15分钟。SDS-PAGE后,通过蛋白质印迹(4b和4c)或通过用考马氏亮兰染色(4a)进行鉴定。通过不仅采用对过客蛋白区特异性的抗血清,而且采用对OmpA的C末端部分特异性的抗血清排除蛋白酶与周质接触,OmpA的C末端在周质中以难以接近的形式自然存在,因此应该不能被外加蛋白酶如胰蛋白酶攻击(4c)。图4aSDS-PAGE和随后用考马氏亮兰染色以检测蛋白酶敏感性和定量表达。加样大肠杆菌JK 321和大肠杆菌UT 5600的全细胞溶胞产物。泳道1 JK321 pJM7 C*泳道2 JK321 pJM7 T**泳道3 JK321 pJM7-***泳道4 分子量标记(94,67,43,30,20和14 kDa)泳道5 JK321 pJM22 C泳道6 JK321 pJM22 T泳道7 JK321 pJM22 -泳道8 JK321 pJM61 C泳道9 JK321 pJM61 T泳道10 JK321 pJM61 -泳道11 UT5600 pJM7 C泳道12 UT5600 pJM7 T泳道13 UT5600 pJM7-泳道14分子量标记(94,67,43,30,20和14 kDa)泳道15 UT5600 pJM22 C泳道16 UT5600 pJM22 T泳道17 UT5600 pJM22 -泳道18 UT5600 pTK61 C泳道19 UT5600 pTK61 T泳道20 UT5600 pTK61 -C*用胰凝乳蛋白酶消化的细胞T**用胰蛋白酶消化的细胞***天然细胞图4b检测表达和蛋白酶敏感性的蛋白质印迹加样大肠杆菌JK 321和大肠杆菌UT 5600的全细胞溶胞产物。电泳后,通过半干燥法将蛋白从凝胶转移到硝酸纤维素膜上。将滤膜用封闭溶液(含0.5%Tween 20和0.5M NaCl的PBS)封闭10分钟,加入第一抗血清,即以1∶200稀释在封闭溶液中的AK 55(兔抗霍乱毒素B)。为了检测表位PEYFK,加入以1∶35稀释在封闭溶液中的杂交瘤上清液Du 142。将滤膜与一抗一起保温1小时,接着洗涤三次,与蛋白A-碱性磷酸酶结合物(以1∶500稀释在封闭溶液中)一起保温30分钟。将滤膜用NBT/BCIP显色溶液展开。泳道1 JK321 pJM7 C*泳道2 JK321 pJM7 T**泳道3 JK321 pJM7-***泳道4 分子量标记(106,80,50,32,27和18 kDa)泳道5 JK321 pJM22 C泳道6 JK321 pJM22 T泳道7 JK321 pJM22 -泳道8 JK321 pJM61 C泳道9 JK321 pJM61 T泳道10 JK321 pJM61 -泳道11 UT5600 pJM7 C泳道12 UT5600 pJM7 T泳道13 UT5600 pJM7 -泳道14 分子量标记(106,80,50,32,27和18 kDa)泳道15 UT5600 pJM22 C泳道16 UT5600 pJM22 T泳道17 UT5600 pJM22 -泳道18 UT5600 pTK61 C泳道19 UT5600 pTK61 T泳道20 UT5600 pTK6 1-C*用胰凝乳蛋白酶消化的细胞T**用胰蛋白酶消化的细胞***天然细胞图4c用蛋白质印迹分析证实外膜的完整性加样大肠杆菌JK 321和大肠杆菌UT 5600的全细胞溶胞产物。电泳后,通过半干燥法将蛋白从凝胶转移到硝酸纤维素膜上。将滤膜用封闭溶液(含0.5%Tween 20和0.5M NaCl的PBS)封闭10分钟,加入第一抗血清,以1∶1000稀释在封闭溶液中的K56(兔抗OmpA)。将滤膜与一抗一起保温1小时,接着洗涤三次并与蛋白A-碱性磷酸酶结合物(以1∶500稀释在封闭溶液中)一起保温30分钟。将滤膜用NBT/BCIP显色溶液展开。OmpA是具有C-末端周质部分的大肠杆菌的外膜蛋白。该周质部分为胰蛋白酶敏感性的,如果胰蛋白酶接触到周质,大小约10-11KDa的部分从成熟OmpA(35kDa)上被消化下来。因此消化将导致在蛋白质印迹中OmpA带从35kDa移位至25kDa(Klauser等,EMBO J.9(1990)1991-1999),使用转运重组蛋白的AIDA-I自身转运蛋白的情况显然不是如此。泳道1 JK321 pTK1 T*泳道2 JK321 pJM7 T泳道3 JK321 pJM22 T泳道4 JK321 pTK61 T泳道5 分子量标记(106,80,50,32,27和18 kDa)泳道6 JK321 pTK1-**泳道7 JK321 pJM7 -泳道8 JK321 pJM22 -泳道9 JK321 pTK61 -泳道10 空的泳道11 UT5600 pTK1 T*泳道12 UT5600 pJM T泳道13 UT5600 pJM22 T泳道14 UT5600 pTK61 T泳道15分子量标记(106,80,50,32,27和18 kDa)泳道16 UT5600 pTK1-**泳道17 UT5600 pJM7 -泳道18 UT5600 pJM22 -泳道19 UT5600 pTK61 -T*用胰蛋白酶消化的细胞***天然细胞图5免疫荧光完整非透化细胞的免疫荧光代表了检测暴露在细胞表面的决定簇的常规方法。其中采用的检测决定簇的抗体太大以致不能通过完整的外膜。用于鉴别和测定在周质或细胞表达的决定族的本底活性的对照包括针对分别在周质或细胞表达的抗原的抗体。
将包含质粒pBA,pTK1,pTK61,pJM7或pJM22中一种的大肠杆菌UT 5600的细胞在LB琼脂(氨苄青霉素50mg/l)上培养过夜并悬浮在PBS中至在578nm处光密度为0.1。500ul的该细胞悬液被用来覆盖被放置在24孔微量滴定板中的盖玻片。在平板离心机中将细胞沉淀5分钟至盖玻片。吸取450μl上清并用含2.5%PFA(多聚甲醛)的PBS所取代,用它进行固定20分钟。将上清全部吸出,用500μl PBS进行三次洗涤。通过与300μl含1%FCS的PBS一起保温5分钟来封闭非特异性结合位点。将封闭溶液全部吸出,并将盖玻片放在它们各孔的中心,用15ul以1∶100稀释的兔血清AK 55(针对霍乱毒素B)覆盖,室温下,在恒湿室中保温1小时。这之后是三次每次均用500μl PBS进行的洗涤,用350μl PBS/FCS封闭5分钟,并与15μl以1∶100稀释的山羊抗兔Texas红色结合物一起保温30分钟。在随后的三次洗涤后,将盖玻片放在载玻片上并使用包埋介质包埋。在显微镜下评价并通过使用相等长度的曝光时间的照相记录免疫荧光的结果。a)大肠杆菌UT 5600 pBA(被用作阴性对照,仅包含没有插入物的克隆载体的菌株)。b)大肠杆菌UT 5600 pTK1(产生被运至周质的霍乱毒素B。该构建物被用来确定周质表达的霍乱毒素B的本底活性)。c)大肠杆菌UT 5600 pJM7(表达FP59,AIDA和霍乱毒素B的融合蛋白,它被呈递在大肠杆菌的表面)。d)大肠杆菌UT 5600 pJM22(表达FP50,AIDA和表位PETFK的融合蛋白,该构建物被用来证明FP59和FP50的AIDA部分没有显示出与用于本实验的AK55的交叉反应性)。e)大肠杆菌UT 5600 pTK61(产生被呈递在大肠杆菌表面的霍乱毒素B和Iga-β融合蛋白(Klauser等,EMBO J.9(1990)1991-1999)。用来与AIDA构建物FP59进行比较)。图6所用寡核苷酸的DNA序列图7-24细菌自身转运蛋白的DNA序列(非编码链)和由其产生的氨基酸序列图7对来自大肠杆菌的AIDA-I自身转运蛋白的膜整合部分的描述(Benz和Schmidt,分子微生物学6(1992),1539-1546)。图8对来自百日咳博德特氏菌的BrKA自身转运蛋白的膜整合部分的描述(Fernandez和Weiss,感染免疫学62(1994),4727-4738)。图9对来自流感嗜血菌的Hap自身转运蛋白的膜整合部分的描述(StGeme等,分子微生物学14(1994),217-233)。图10对来自鼬鼠螺杆菌的Hsr自身转运蛋白的膜整合部分的描述(O′Toole等,分子微生物学11(1994),349-361)。图11对来自弗氏志贺氏菌的IcsA自身转运蛋白的膜整合部分的描述(Goldberg等,细菌学杂志175(1993),2189-2196)。图12对来自百日咳博德特氏菌的Prn(外膜蛋白P96)自身转运蛋白的膜整合部分的描述(Charles等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86(1989),3554-3558)。图13对来自副百日咳博德特氏菌的Prn(P70 pertactin)自身转运蛋白的膜整合部分的描述(Li等,普通微生物学杂志138(1992),1697-1705)。图14对来自立氏立克次氏体的190kDa细胞表面抗原自身转运蛋白的膜整合部分的描述(Anderson等,未发表,Genbank登记号M31227)。图15对来自普氏立克次氏体的SpaP自身转运蛋白的膜整合部分的描述(Carl等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87(1990),8237-8241)。图16对来自立氏立克氏次体的120kDa外膜蛋白(rOmp B)自身转运蛋白的膜整合部分的描述(Gilmore等,分子微生物学5(1991),2361-2370)。图17对来自斑疹伤寒立克次化氏体的SlpT自身转运蛋白的膜整合部分的描述(Hahn等,基因133(1993),129-133)。图18对来自弗氏志贺氏菌的SepA自身转运蛋白的膜整合部分的描述(Benjellou-Touimi等,分子微生物学17(1995),123-125)。图19对来自粘质沙雷氏菌PH1的Ssp自身转运蛋白的膜整合部分的描述(Rho,未发表,Genbank登记号X59719)。图20对来自粘质沙雷氏菌IFO-3046克隆pSP11的Ssp自身转运蛋白的膜整合部分的描述(Yanagida等,细菌学杂志166(1986),937-944)。图21对来自粘质沙雷化菌菌株IFO 3046的Ssp-h1自身转运蛋白的膜整合部分的描述(Onishi和Horinouchi,未发表,Genbank登记号D 78380)。图22对来自粘质沙雷化菌菌株IFO3046的Ssp-h2自身转运蛋白的膜整合的描述(Onoshi和Horinouchi,未发表,Genbank登记号D 78380)。图23对来自大肠杆菌的Tsh自身转运蛋白的膜整合部分的描述(Provence等,1994,感染免疫学62(1994),1369-1380)。图24对来自幽门螺杆菌的VacA自身转运蛋白的膜整合部分的描述(Schmitt和Haas,分子微生物学12(1994),307-319)。在幽门螺杆菌中至少还已知3种其它形式的VacA,但它们在所述区域中仅有很小程度的不同。实施例实施例1大肠杆菌表面蛋白中的自身转运蛋白的鉴定和定位为了寻找适宜于所需用途的自身转运蛋白,也就是说适应于过客蛋白和将要使用的宿主菌株,必需进行所研究的蛋白的C-末端的氨基酸序列。这可能是已被鉴定为表面因子的蛋白,或为保存在数据库中的未知功能的蛋白质的氨基酸序列,或为来自保存在数据库中的DNA序列的蛋白质的氨基酸序列,或为来自序列分析后的基因的蛋白质的氨基酸序列。该蛋白的N末端应包含信号肽序列以便可以进行跨内膜转运,整合至膜的部分应从具有芳香氨基酸苯丙氨酸或酪氨酸的C末端开始,接着是交替的极性(带电荷)和疏水性(或芳香)氨基酸。过客区应包含很少的半胱氨酸以及根本不含二硫桥,因为已表明这阻断过客蛋白通过形成的孔的转运。疏水性图应说明组成外膜孔的两亲性β-折叠片结构的偶数数目。两亲性β-折叠片结构应为约12个氨基酸长且包含最少量的朝向膜侧的带电荷的氨基酸,连入膜通道的环包含很少朝向基质的氨基酸。相当多的氨基酸可以朝向外侧(基质)的形式存在。疏水性图中的这个结果是除开第一和最后一个膜通道的反向平行对中膜通道的总和,第一和最后一个膜通道通过以反向平行的方式装配在一起而构成了孔的桶状结构。按照这些标准,现可构建一个自身转运蛋白的模型,它可被用来确定转运必需的氨基酸的位置和长度。除开孔所需的氨基酸,融合蛋白对于能发挥作用的自身转运蛋白而言还必须包括从位于周质中的从β-桶结构的N-末端通过孔至表面的所谓接头区,这样完全确保了所有过客区的表面暴露。
本发明的第一个目的是提供用于在大肠杆菌中重组蛋白最佳表面暴露的系统。这就是为什么在大肠杆菌天然表面蛋白中寻找自身转运蛋白的原因。选择落在了在数据库中可获得其序列的粘附素AIDA-I上(参与扩散粘附的粘附素,Benz和Schmidt,感染免疫学57(1989)1506-1511)。本发明显示了在N末端的具49个氨基酸的信号序列,而根据本发明的在C末端的要求由氨基酸序列FSYKI(苯丙氨酸-丝氨酸-酪氨酸-赖氨酸-异亮氨酸)来满足,被转运区不含半胱氨酸,且疏水性图(图1)表明14个反向平行两亲性的β-折叠片结构。因此,为了形成孔,至少需要从全部氨基酸序列第1014位的丙氨酸(Benz和Schmidt,分子微生物学6(1992)1539-1546)至第1286位的苯丙氨酸的氨基酸(图2)。另外选择作为接头区的是与N-末端侧第1014位的丙氨酸相连的氨基酸。接着可通过PCR从相应大肠杆菌EPEC2787的DNA来分离用这种方式选择的功能性自身转运蛋白区并用它来构建融合蛋白。实施例2具有作为过客蛋白的抗原决定簇的表面暴露的融合蛋白的构建根据AIDA-I为自身转运蛋白,并且任何所需过客蛋白和大肠杆菌固有的自身转运蛋白(即AIDA-β)的基因融合应比相同过客蛋白与异源自身转运蛋白(例如Iga-β)的基因融合更与大肠杆菌相容的假设,在aida-β和过客蛋白基因之间产生一融合基因。为了确保过客蛋白的转运,不仅克隆AIDA-β,而且克隆位于β-桶N-末端侧的连接区(接头)。
选择CtxB作为过客蛋白,通过使用寡核苷酸EF16和JM6的PCR扩增来自pTK1的相应基因(Llauser等,EMBO J.9(1990),1991-1999)。因为AIDA-I在大肠杆菌EPEC 2787中被质粒编码(Benz和Schmidt,感染免疫学57(1989),1506-1511)。所以同样通过使用寡核苷酸JM1和JM7的PCR从大肠杆菌EPEC 2787的质粒制备物扩增具有接头区的AIDA-I自身转运蛋白。将两个PCR产物用其识别序列存在于寡核苷酸中的限制性酶消化。将用这种方式产生的两个片段克隆至具有高拷贝数目的被适当预消化的克隆载体(pBA)中。这产生了在基因融合体之前具有人工组成型启动子(PTK;Klauser等,EMBO J.9(1990)1991-1999)的构建物,融合基因的组成是5′端的ctxB(编码氨基酸1-113),接着是AIDA-I接头(编码融合蛋白的第116-279位氨基酸)和位于3′末端的AIDA-I自身转运蛋白(编码融合蛋白的第280-563位氨基酸)(图3a)。产生的基因融合被称为FP 59。
通过全细胞溶胞产物的比较电泳明确地证实了本质上大于用以前存在的Iga-β系统的表达,并且这是在没有用Iga-β时观察到的溶胞趋向的情况下实现的(图4a)。
通过各种方法提供了对FP59的表面暴露的证明。通过加入胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶使分子量降低在蛋白质凝胶中显示了FP59的蛋白酶敏感性(图3a)。在各种情况下产生质量为33-35kDa的抗蛋白酶片段(图3a)。这些抗蛋白酶片段包含过客蛋白的非免疫原性部分。这通过使用抗霍乱毒素B血清的全细胞溶胞产物的蛋白质印迹分析并与蛋白酶消化的及未被消化的表达FP59的大肠杆菌进行比较而被证实(图4b,4a和4b的比较)。
膜被保持的胰蛋白酶消化产物的部分N-末端序列测定表明在AIDA自身转运蛋白中的膜接头区具有55个氨基酸的长度。
还可用蛋白酶消化来显示表达FP 59的大肠杆菌的外膜的完整性(图4c)。为了这个目的,在胰蛋白酶消化后,通过使用抗OmpA血清的免疫印迹展示全细胞溶胞产物。未消化和胰蛋白酶消化的细胞都显示出完整的OmpA,如对具完整外膜的细胞所期望的一样。
通过免疫荧光研究还可显示FP59的表面暴露和强的表达(图5)。通过结合荧光标记的抗体可以证实在具有完整外膜的细菌细胞上的抗原的表面暴露。这由表达FP59的大肠杆菌通过强的荧光来显示。用作阴性对照、具有周质表达的霍乱毒素B、具有表面暴露的FP50(图3b)和具非重组克隆载体的大肠杆菌细胞明显为阴性。周质霍乱毒素B表明抗体的周质不可接近性(图5b),使用FP50的免疫荧光的阴性结果使得可以排除所使用的抗血清(针对过客蛋白)与FP59的AIDA部分的交叉反应性(图5d)。使用非重组克隆载体的免疫荧光是对该测定方法所固有的背景染色的测定(图5a)。这还使得可以将FP59的表达与B61的表达,即由pTK61产生的表面呈现的霍乱毒素B-Iga-β融合蛋白(图5c和5e)进行比较,同样使得可以证明根据本发明的新的系统的显著优点。实施例3表面呈递的肽融合物的构建一种作为单克隆抗体(Du 142)线性表位的肽在表面呈递并被检测。使用极其适合于肽文库产生和表面暴露的依赖PCR的方法克隆该肽。这使得能形成ctxB转运信号(碱基1-81),编码肽的短序列(碱基82-96)和aida接头/aida-β区(碱基103-1450)的三基因融合物。
将pJM7(图3a)用XhoI线性化并用作使用寡核苷酸JM7和JM20(图6)的PCR的模板。两种寡核苷酸在它们的5′末端具有KpnI识别序列。选择JM7用来在PCR中扩增aida接头/aida-β区。选择JM20,这样PCR产物包含存在于ctxB中用于通过细胞质膜的依赖于Sec的跨膜转运的信号肽和其后的六个密码子。此外,JM20在其5′单链末端包含不与模板互补的编码抗体Du 142的线性表位的五个密码子。KpnI识别序列位于这些密码子的上游。在PCR后,将产生的产物用KpnI水解,自身连接并接着转化至大肠杆菌中。通过菌落免疫印迹鉴定正确的基因融合(没有图)。用类似于实施例2描述的方法,通过蛋白酶消化产物的蛋白质印迹分析和对凝胶中蛋白染色的分析来证实表达和表面暴露(图4a,b,c)。
可通过略微修改本文描述的克隆方法来产生大量肽文库。为了此目的,必须改变用于描述该寡核苷酸的各种功能区的JM 20的各个组成部分,这样编码线性表位的区由在寡核苷酸合成期间被有目的地进行简并的区所取代。简并是指在替代位于该功能区所有位置的所给碱基中,存在单个、多个或所有碱基被由多达四个不同碱基组成的碱基混合物所取代。这指各个密码子可编码多达20个不同的氨基酸,而不是编码一个氨基酸,从而产生从理论上对于在给定长度的肽中所有可设想的氨基酸组合均为可能的编码序列库。现在可分离携带具有所需特性的肽的细胞,其通过表面暴露肽与例如为固定在基质上的具有荧光标记或被偶联至磁颗粒的结合配体的结合来介导,并用于连续的生产和表征。
权利要求
1.一种在革兰氏阴性宿主细菌表面呈递肽或/和多肽的方法,其中(a)提供一种用载体转化的宿主细菌,其中包括下面部分的操作性地与启动子相连的融合核酸序列位于载体上(i)编码信号肽的核酸部分,(ii)编码待呈递的过客肽或/和过客多肽的核酸部分,(iii)适宜时,编码蛋白酶识别位点的核酸部分,(iv)编码跨膜接头的核酸部分和(v)编码自身转运蛋白的转运区的核酸部分;和(b)在表达融合核酸序列并在宿主细菌表面呈递由核酸部分(ii)编码的肽或多肽的条件下培养宿主细菌,其特征在于核酸部分(ii)相对于编码转运蛋白区的核酸部分(v)为异源性的,以及宿主细菌相对于编码转运蛋白区的核酸部分(v)为同源性的。
2.根据权利要求1的方法,其特征在于所采用的自身转运蛋白来自于肠细菌属,并被用在肠细菌属的宿主细菌中。
3.根据权利要求1或2的方法,其特征在于采用来自大肠杆菌的Aida蛋白的转运蛋白区或其变异体。
4.根据权利要求1或2的方法,其特征在于采用来自弗氏志贺氏菌的SepA蛋白的转运蛋白区或其变异体。
5.根据权利要求1或2的方法,其特征在于采用来自弗氏志贺氏菌的IcsA蛋白的转运蛋白区或其变异体。
6.根据权利要求2的方法,其特征在于采用来自大肠杆菌的Tsh蛋白的转运蛋白区或其变异体。
7.根据权利要求2的方法,其特征在于采用来自粘性沙雷氏菌的Ssp蛋白的转运蛋白区或其变异体。
8.根据权利要求1的方法,其特征在于采用来自鼬鼠螺杆菌的Hsr蛋白的转运蛋白区,来自博德特氏菌属菌种的Prn蛋白的转运蛋白区,来自流感嗜血菌的Hap蛋白的转运蛋白区,来自百日咳博德特氏菌的BrkA蛋白的转运蛋白区,来自幽门螺杆菌的VacA蛋白的转运蛋白区或来自190kDa的立克次氏体细胞表面蛋白SpaP、rOmpB或SlpT之一的转运蛋白区。
9.根据权利要求1-8任一项的方法,其特征在于呈递一种或多种肽,尤其是具有4-50个氨基酸长度的肽。
10.根据权利要求1-8任一项的方法,其特征在于呈递一种或多种真核细胞多肽。
11.根据权利要求10的方法,其特征在于过客多肽为抗体或抗体的抗原结合区,其中抗原结合区指至少足够抗原特异性结合的抗体分子区域。
12.根据权利要求10的方法,其特征在于过客多肽为MHC II类分子的α链。
13.根据权利要求10的方法,其特征在于过客多肽为MHC II类分子的β链。
14.根据权利要求13的方法,其特征在于过客多肽为MHC II类分子的β链,其中与该链N端相连的是作为肽的能包埋于功能性MHC分子的结合腔中的氨基酸。
15.根据权利要求1-14任一项的方法,其特征在于变异的过客肽或多肽库在宿主细胞中产生、表达并在表面被呈递。
16.根据权利要求15的方法,其特征在于变异的过客肽或多肽以过客多肽的恒定环境被呈递。
17.根据权利要求1-16任一项的方法,其特征在于宿主细菌细胞呈递不同的各自与转运蛋白区相连的过客肽或多肽。
18.根据权利要求17的方法,其特征在于不同的转运蛋白区用于不同的过客肽或多肽。
19.根据权利要求15-18任一项的方法,进一步包括从变异肽或多肽中选择单个过客肽或多肽这一步骤。
20.用于制备表面暴露的肽或多肽的变体群并鉴定携带具有特定所需特性的肽或多肽的细菌的方法,该方法包括下面步骤(1)通过在至少一个载体中所需过客蛋白的编码序列与自身转运蛋白的转运蛋白区和信号肽的编码序列用克隆在同框内来制备一个或多个融合基因;(2)通过诱变进行过客肽或多肽的变异;(3)将该载体中多个载体导入能将过客蛋白或多种过客蛋白稳定地呈递在表面的宿主细菌中;(4)在宿主细菌中表达该融合基因或多个融合基因;(5)培养细菌以产生暴露在表面稳定呈递的过客蛋白或暴露在表面稳定呈递的多种过客蛋白;(6)适宜时,选择在表面携带具有所需特性的过客蛋白或多种过客蛋白的细菌,和(7)适宜时,鉴定具有最佳特性的过客蛋白的结合配体。
21.根据权利要求20的方法,其中可省去该方法中的单个步骤。
22.根据权利要求20的方法,其中将该方法进行数次。
23.根据权利要求20的方法,其中采用转运蛋白区AIDA-I或其变异体。
24.根据权利要求20-23任一项的方法,其中存在于融合蛋白中的过客蛋白为对结合配体具有亲和性的肽或多肽,或为配体,受体,抗原,毒素结合蛋白,具有酶活性的蛋白,核酸结合蛋白,抑制剂,具有螯合剂特性的蛋白,抗体或抗体的抗原结合区。
25.根据权利要求20-24任一项的方法,其中通过与固定化或/和标记的结合配体结合来鉴定呈递具有所需结合亲和性的被表面暴露的过客蛋白的细菌。
26.根据权利要求20的方法,其中结合配体被修饰,以致它可在第二个步骤中通过对修饰特异的结合配体而被检测。
27.根据权利要求1-26任一项的方法,其特征在于过客蛋白或其某些部分在细菌表面被化学或酶促修饰。
28.根据权利要求27的方法,其特征在于修饰为非共价修饰。
29.根据权利要求27的方法,其特征在于修饰为共价修饰。
30.根据权利要求29的方法,其特征在于修饰为糖基化。
31.根据权利要求29的方法,其特征在于修饰为磷酸化。
32.根据权利要求27的方法,其特征在于修饰为蛋白酶解。
33.根据权利要求32的方法,其特征在于通过固有或外加的蛋白酶,将过客蛋白或其某些部分选择性地从细菌表面释放。
34.根据权利要求33的方法,其特征在于通过宿主细菌所固有的酶,尤其是OmpT蛋白酶、OmpK蛋白酶或蛋白酶X来释放过客蛋白或其某些部分。
35.根据权利要求33的方法,其特征在于通过外加的蛋白酶,尤其是IgA蛋白酶、凝血酶或因子X来释放过客蛋白或其某些部分。
36.重组载体,其中包含下面部分的操作性地与启动子相连的融合核酸序列位于其中(i)编码信号肽的核酸部分,(ii)编码待呈递的过客肽或/和过客多肽的核酸部分,(iii)适宜时,编码蛋白酶识别位点的核酸部分,(iv)编码跨膜接头的核酸部分和(v)编码自身转运蛋白的转运蛋白区的核酸部分;其中核酸部分(ii)相对于编码转运蛋白区的核酸部分(v)为异源性的。
37.重组革兰化阴性宿主细菌,其特征在于它已用根据权利要求36的载体转化。
38.根据权利要求37的宿主细菌,其特征在于它相对于编码转运蛋白区的核酸部分(v)为同源性的。
39.根据权利要求38的宿主细菌,其特征在于它为大肠杆菌细胞。
40.根据权利要求37-39任一项的宿主细菌,其特征在于核酸部分(v)编码AIDA蛋白的转运蛋白区或其变异体。
全文摘要
本发明涉及用于制备由载体蛋白和过客蛋白组成的稳定的融合蛋白的载体,宿主载体结合物和方法。其中该融合蛋白的表达导致过客区暴露在细胞表面,尤其是大肠杆菌细胞表面。如果需要,可通过蛋白酶,如选择的宿主因子,如OmpT将过客区释放至培养基中。
文档编号C12N15/70GK1216065SQ96180254
公开日1999年5月5日 申请日期1996年3月15日 优先权日1996年3月15日
发明者J·马里尔, J·乔斯, T·F·梅尔 申请人:柏林马普科技促进协会