专利名称：低温诱导性启动子序列的制作方法
技术领域：
本发明涉及具有在低温诱导基因表达性质的启动子序列。本发明的低温诱导性启动子序列适用于对低温储藏中的马铃薯块茎中的还原糖量的抑制、对马铃薯块茎发芽的抑制以及使植物具有低温耐性。
许多作物在收获后必须通过低温等处理以使其质量得以长期保持。然而，众所周知，马铃薯块茎在低温储藏中引起所谓低温甜化的还原糖积累，这时所生的还原糖引起在法式油炸马铃薯片、炸马铃薯片等的加工制作时的呈色反应(美拉德反应(maillard neaction))，从而使商品价值显著下降。又，已知果实等由于乙烯的生成而软化等。为解决这些问题的研究，也就是收获后生理研究(postharvest physio1ogy)是现代世界中广泛进行的研究领域之一。
在马铃薯块茎中特异地表达外来基因时，在世界上一直广泛地使用蛋白质翅膜(Patagium)(パタチン)基因的启动子(EMBO J.8(1)23～29，1989；植物分子生物学(plant Mo1.Biol.)1241～50，1989，生物学/工艺(Bio/Technology)121101～1105，1994等)。翅膜基因的表达随着块茎的发育、肥大而增加，但块茎的肥大同时也是其以从还原糖向淀粉转化为主的各种代谢系统活性化的时期。因此，按连接于翅膜启动子的基因的种类的不同，会涉及代谢系统的紊乱，进而涉及收获量减少等问题。为了回避这种问题，人们认为为了有效地保持储藏时的质量，对在通常条件下的植物体中表达量少并仅在低温储藏中的块茎能有效地表达的启动子加以离析和利用是很有必要。
低温诱导性基因不管是原核或真核生物，已有许多种类被离析并报道(作为综述的有《组织培养》19(10)357～361，1993等)。又，从马铃薯块茎也有离析例子(植物生理学(Plant Physiol.)104445～452，1994)。同样，酶原(osmogen)类基因从茄属植物被离析出来，有人报道这种基因是在低温被诱导的(Plant Mol.Biol.21729～735，1993)。关于从马铃薯块茎的离析例仅上述一个报道而已。
从马铃薯块茎已离析5种低温诱导性基因(cDNA)(植物生理学，104445～452，1994)，其中两种已被发现它们和其它植物的小热体克蛋白质(smallheat-shock protein)或其它种类植物低温诱导蛋白质、ABA诱导蛋白质的基因有类似性。而其它三种尚未解析。这些cDNA的核基因(含有启动子)尚未有报道。认为它们都是对低温的反应快(1个星期内反应)的基因。
将上述已知基因的启动子应用于必须低温储藏的作物(马铃薯等)当然也是可能的，然而，这些启动子(植物生理学，104445～452，1994等)是否仅在作为目的的器官上诱导高表达则尚不清楚(在低温时其它器官也可能诱导)。又，在常温下也可能有某种程度的表达。也就是，这些已知基因启动子是否在低温条件下仅在马铃薯块茎等以储藏为目的的器官中进行有效的基因表达尚不清楚，又因马铃薯块茎的储藏期达数个月的长时间，在其间，上述启动子是否还发挥其机能则也还不明了(植物生理学，104445～452，1994，在此文献中只调查一个月左右)。
本发明的目的在于提供一种新型低温诱导性启动子，该启动子在马铃薯块茎中、于低温下诱导基因表达，而在块茎以外的其它器官和在常温下则几乎不诱导基因表达；而且该表达经5个月以上的长时期仍然持续。
本发明目的还在于提供作为探针有用的DNA片段，该探针用于发现在马铃薯或其它植物中存在的新型低温诱导性启动子。
本申请发明人等经过专心研究后成功地发现新型低温诱导性启动子序列，该启动子序列在马铃薯块茎中、于低温下诱导基因表达，而在块茎以外的其它器官和在常温下则几乎不诱导基因表达；而且该表达经5个月以上的长时期仍然持续；还成功地决定其碱基序列，从而完成本发明。
也就是，本发明提供具有低温诱导性启动子活性的DNA序列，该DNA序列是由序列表的序列1所表示的碱基序列中、1号～3546号的碱基所组成的序列或者其具有低温诱导性启动子活性的一部分；或者在这些序列中有一个或多个核苷酸缺失、置换或者在这些序列中有一个或多个核苷酸插入或加入。
又，本发明提供具有低温诱导性启动子活性的DNA序列，该DNA序列是由序列表内的序列2所表示的碱基序列中、1号～第4120号的碱基所组成的序列或者其具有低温诱导性启动子活性的一部分；或者在这些序列中有一个或多个核苷酸缺失、置换或者在这些序列中有一个或多个核苷酸插入或添加。
按照本发明，提供一种新型低温诱导性启动子，该启动子在马铃薯块茎中、于低温下诱导基因表达，而在块茎以外的其它器官和在常温下则几乎不诱导基因表达；而且该表达经5个月以上的长时期仍然持续。通过利用本发明启动子序列，可以对低温储藏中的马铃薯块茎中的还原糖量进行抑制；对马铃薯块茎的发芽进行抑制并且使植物具有低温耐性。
以下通过附图对实施本发明方法进行详细说明。
附
图1是表示为导入LCIP2-10启动子的构型制备程序的说明图。
本发明的低温诱导性启动子序列包括，序列表的序列1所表示的碱基序列中、1号～3546号的碱基所组成的序列；或者序列2所表示的碱基序列中、1号～4120号的碱基所组成的序列。这些序列作为整体来说是能发挥其低温诱导性启动子活性，不过，即使是这些序列中的一部分仍然能发挥低温诱导性启动子活性，例如在序列表中的序列1所表示的碱基序列中、第2418号～3541号的碱基所组成的序列等也包含于本发明范围内。又，含有该序列1的序列的2418号～3541号的碱基所组成的序列并具有低温诱导性启动子的活性也包含于本发明范围内。
还有，序列表的序列1的3547号～3549号、或序列2的4121号～4123号的“ATG”是译码开始的密码子。又，序列1所表示的序列的第3503号以后的mRNA(cDNA)序列和其进行编码推定的氨基酸序列一起示于序列3。
在本说明书中，所谓“低温诱导性”是指由启动子所致基因的表达在6℃以下的温度被诱导，而且如果温度保持在6℃以下，则其表达持续5个月以上。
通常，具有生理活性的DNA的碱基序列有微小改变的情况下，也就是，该碱基序列中的一个或多个核苷酸被置换或缺失；或者有一个或多个核苷酸添加或插入的情况下，有时该DNA的生理活性也能够保持。因此，上述本发明的低温诱导性启动子序列在进行这样的修饰、并同时具有低温诱导性启动子活性的DNA序列也包含于本发明范围内。也就是，序列表的序列1所表示的碱基序列中、对1号～3546号碱基所组成的序列或者其具有低温诱导性启动子活性的一部分进行修饰、使这些序列中少数核苷酸缺失、置换或在这些序列中插入或添加少数核苷酸并具有低温诱导性启动子活性的DNA序列也包含于本发明范围内。又，作为序列一部分的2417号～3541号的碱基所组成的序列或者其具有低温诱导性启动子活性的一部分进行修饰，使这些序列中少数核苷酸缺失、置换或者在这些序列中插入或添加少数核苷酸、并具有低温诱导性启动子活性的DNA序列也包含于本发明范围内。
同样，如果序列表的序列2所表示的碱基序列中、由1号～4120号的碱基所组成的序列或者其中具有低温诱导性启动子活性的一部分上进行修饰，并使这些序列中少数核苷酸缺失、置换或者在这些序列中插入或添加少数核苷酸并具有低温诱导性启动子活性的DNA序列也包含于本发明范围内。
核苷酸的添加、插入、缺失或置换可通过例如众所周知的技术的诱发特异部位变异(例如核酸研究(Nucleic Acid Research)，Vol.10，NO.20，p6487～6500，1982)而进行实施，在本说明书中所谓“一个或多个核苷酸”是指通过特异部位的变异诱发法能够添加、插入、缺失或置换的多个核苷酸。
特异部位的变异诱发是例如，除了和所要求变异的特定不相容外，在应受变异的单链噬菌体DNA中使用互补性的合成寡核苷酸引物，按下列方法进行。也就是，使用作为引物的上述合成寡核苷酸在噬菌体中合成互补性的链，用所得的双链DNA将噬菌体支持性宿主细菌转化形质。将形质转化的细菌的培养物在琼脂中平板培养，从含有噬菌体的单一细胞形成斑点。这样，在理论上，50％新的菌落含有作为单链并具有变异的噬菌体，其余的50％仍具有原来的序列。将所得斑点和与上述具有所要求变异的DNA完全相容的进行杂化，而与具有原来链的不相容的在不进行杂化的温度下，与经激酶处理合成的探针进行杂化。其次，收集和该探针杂化所形成的斑点，进行培养，回收DNA。
再者，在启动子序列中作为未丧失低温诱导性启动子活性的一个或多个核苷酸的置换、缺失、附加或插入的方法，除上述特异部位的变异诱发法之外，还有用变异源处理基因的方法；以及将基因选择性地进行开裂，其次，将所选择的核苷酸除去、添加或置换，随后再连接的方法。
如在下述实施例中所详述那样，以序列1和2所表示的碱基序列经过如下的过程而决定。
(1)制定由长期间在4℃下保存的块茎的cDNA程序库，不使与发育中的各种马铃薯组织(叶、茎、根、愈合组织、发育中的块茎)的mRNA杂化(不严密)，将和低温储藏中的块茎mRNA杂化的cDNA克隆离析，决定碱序列并解析。
(2)使用上述(1)中所用的RNA进行Northern分析，再度确认在通常条件下发育中的马铃薯植物体中几乎没有表达。
(3)将收获后的块茎在各种温度(3、6、9、12、15、20℃)下长期(5～6个月)储藏，使用从这些块茎中提取的RNA用Northem法检测，是否可在低温下诱导；在什么温度下能诱导；在多长的期间表达；是否因从低温回到常温而表达解除等。结果认为在6℃以下的低温能诱导；表达长期(至少5～6个月)持续；由于从低温回到常温而表达解除等。
(4)用马铃薯试管植物体检测在低温下块茎以外的组织是否能诱导表达。结果认为，在块茎以外的组织能引起诱导的可能性是存在的(与低温处理块茎相比其明显的变化小)。
(5)通过Southern分析认为它是单复制基因。又，在稻、玉米、烟草等中未检出Southem带，作为其它植物的番茄中则检出了Southem带。
(6)将基因组克隆离析成二种，其中之一的开始ATG前后的序列与cDNA序列完全一致。另一种则完全不一致，认为它是将具有高相同性和相同机能的其它位置(locus)的基因进行编码。用反转录PCR作解析，结果认为两种基因的表达方式几乎相同。
(7)对基因组克隆的ATG上游区的碱基序列解析的结果，未发现在低温诱导性蛋白质中常见到的ABA诱导(反应)的基本特点，而在任一种克隆中也都看到了GA反应基本特点。离析的二种基因组克隆在达到ATG上游约500bp处彼此具有高的相同性(80.3％)，而在其更上游则未发现显示相同性的区域。
(8)将离析过的基因组克隆二种之一的启动子序列的一部分以荧光素酶基因(科学(Science)234856～859，1986)作为信息基而导入马铃薯。由所得的形质转化体进行微管的低温储藏试验，确认了启动子的低温诱导性。又，在形质转化体的叶子上仅发现少量低温诱导性。
本发明启动子序列由(1)～(8)的过程构成，从下述实施例中所详述的方法可以得到。按照本发明，由该启动子序列的碱基序列已清楚，所以含有该启动子序列的DNA可从将马铃薯的基因进行造型的PCR法等而容易地得到。
在序列1和2所记载的序列和来自公知马铃薯块茎的低温诱导性基因没有相同性。因此，可认为本发明的启动子序列是与公知的不同的新型启动子序列。
又，本发明的低温诱导性启动子序列在常温(20℃)下，在发育中的叶、根、茎、块茎中其基因表达非常弱。当将收获的块茎置于低温(6℃以下)时，能诱导其表达。用低温处理，除块茎外的器官(叶、茎、根)也能诱导，但极少。但是，在从低温储藏过的块茎所生萌芽中，则可进行相当多的诱导。另一方面，在已发表的报告(植物生理学(Plant Physiol.)104445～452，1994)中，没有谈及关于除块茎以外的器官的表达。本发明基因在严格的意义上还不能说是低温储藏块茎特异性基因，但可认为是与其相近的基因，可以说是有效地保持收获后的质量的基因(启动子)。
本发明的低温诱导性启动子序列在低温下能诱导基因表达，一旦回到常温，其表达即解除。按照文献(植物生理学，104445～452，1994)的分类，可认为本发明基因属于对低温的反应慢的一类(在低温处理约一星期，表达达不到平稳状态，Van Berkel等(植物生理学，104445～452，1994)对属于此类的基因的离析未获成功)。因此，通过温度进行表达的控制是可能的。
本发明的低温诱导性启动子序列在低温储藏时长时期地诱导表达(至少5个月)。另一方面，在已发表的报告(植物生理学，104445～452，1994)的基因中则对这一点未确认。通过使用本发明启动子序列可以长时期地控制基因。
作为其它植物的稻、玉米、烟草中未看到与本发明基因有高相同性的基因。而在番茄中是存在的。因此使用本发明的启动子导入稻、玉米、烟草等基因，以使基因不活动(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，881770～1774，1991)的少的基因表达。
从上述可知，本发明的低温诱导性启动子序列可以有以下用途。
(i)控制马铃薯低温储藏块茎中的还原糖量(还原糖量的抑制)通过在本发明的启动子序列下游连结下列基因，能够抑制低温储藏的马铃薯块茎中的还原糖量例如酸性转化酶抑制剂(Ovalle et al.，植物科学(PlantScience)108(1995)133-141)基因、液胞型酸性转化酶(EMBL数据库登记号(Data Library accession number)X76946)反义基因、PFK(EC 2.7.1.11.国际
发明者峰利喜, 大山晓男, 日吉彻, 笠冈启介 申请人:日本烟草产业株式会社