新的脂酶基因和用该基因产生脂酶的方法

专利名称：新的脂酶基因和用该基因产生脂酶的方法
技术领域：
本发明涉及编码脂酶(其作为去垢剂、食品加工、造纸和石油制造等的脂降解酶在工业上有用)的新基因及其核苷酸序列、编码参与脂酶产生之蛋白质的基因及其核苷酸序列、携带这些基因的重组载体、携带所说的重组载体的转化体以及使用所说的转化体产生脂酶的方法。
背景技术：
产生脂酶的微生物已知有假单胞菌属、产碱菌属、毛霉属、假丝酵母属、腐质霉属、根毛霉属等的微生物。曾从其中一些分离出基因，具体来说，从假单孢菌属微生物分离出许多脂酶基因。目前已知这样的脂酶基因包括从下列种获得的基因莓实假单胞菌(日本专利公开昭62-228279和平2-190188)、葱头假单胞菌(日本专利公开Sho 33-47079和Hei 387187)、恶臭假单胞菌(EP 268 452)、类产碱假单胞菌(日本专利公开Hei 3500845)、铜绿假单胞菌(EP 334 462)、荚壳伯克霍尔德氏菌(应用环境微生物，(1992)，3738-3791)以及荧光假单胞菌(应用环境微生物，(1992)58，1776-1779)。
已知由脂酶结构基因的下游基因区域编码的蛋白质在假单孢菌属的一些细菌中参与产生脂酶。下游区域中的基因对于在葱头假单胞菌中脂酶的产生是必要的，和宿主细菌的物种无关(EP 331 376)。另外已知和宿主细菌的物种无关，具有稳定脂酶作用的蛋白质由从荚壳伯克霍尔德氏菌产生的脂酶区域编码(EP 464 922)。
另外，类产碱假单胞菌的同源宿主-载体系统具有促进脂酶产生的作用，但在其异源的宿主-载体系统中下游区域的基因对于脂酶产生不是必要的(EP 334 462)。而且，下游区域中的基因在莓实假单胞菌中不存在。
通常知道，当去垢剂与脂酶混合以降解和除去要洗涤的物品上所附的脂类时可以提高去垢剂的洗涤效果。这种用途在H.Andree等，“作为去垢剂组分的脂酶”，应用生物化学杂志，2，218-229(1980)等中描述。
优选地，与去垢剂混合的脂酶在去垢剂溶液中可令人满意地发挥它的脂酶活性。在日常的洗涤条件下，洗涤溶液的pH值保持在碱性区，因此需要脂酶在碱性pH值下起作用。另外，已知脂类污迹通常在高温和高碱性的条件下相对容易除去，但在低温下(60或更低)洗涤不能充分地除去。不仅在日本洗涤通常在低温下进行，而且在欧洲各国和美国，洗涤的温度也可能降低。这样，优选地，混合在去垢剂中的脂酶即使在低温下也应令人满意地起作用。另外，更优选的是混合进去垢剂的脂酶在洗涤期间即使在去垢剂组分(如包含在许多去垢剂中的表面活性剂、蛋白酶或漂白剂)存在时应充分地显示出它的功能。而且，优选地，当包含在去垢剂中的组分共存甚至当脂酶在去垢剂中以混合状态存储时，混合进去垢剂的脂酶应该是稳定的。
产生脂酶的微生物已知有假单胞菌属、产碱菌属、无色杆菌属、毛霉属、假丝酵母属、腐质霉属、根毛霉属等的微生物。因为得自这些细菌菌株的大多数脂酶在中性至微碱性区域内具有最适pH，脂酶在碱性去垢剂溶液中不能有效地作用或是在其中很不稳定。而且，在阴离子表面活性剂存在时，得自无色杆菌属、毛霉属、假丝酵母属、腐质霉属的个别脂酶活性受到强烈的抑制。
假单孢菌属产生脂酶的细菌包括莓实假单胞菌、葱头假单胞菌、类产碱假单胞菌、铜绿假单胞菌以及荧光假单胞菌，但是从这些细菌菌株中分离的已知酶不能满足上述性质。
发明描述本发明涉及有效地产生用于工业领域且具有极好性质的脂酶(具体来说是得自菌株SD705的脂酶S(FERM BP-4772))的方法。
更具体来说，本发明涉及编码脂酶S的基因及其核苷酸序列、编码参与脂酶S产生的蛋白质的基因及其核苷酸序列、携带这些基因的重组载体、用这样的重组载体转化的转化体以及从这样的转化体产生所说的脂酶S的方法。
附图的简更描述

图1是质粒pS1的限制性图谱。
图2是质粒pS1S的限制性图谱。
图3是质粒pS1E的限制性图谱。
图4是质粒pSL1的限制性图谱。
图5是质粒pSL2的限制性图谱。
图6是质粒pSP1的限制性图谱。
图7是质粒pSP2的限制性图谱。
图8描述了质粒pAP1、pAP2和pAP3的构建。
图9描述了质粒pSB1的构建。
图10描述了质粒pSB2的构建。
发明详述从Pseudomonas sp.菌株SD705(保藏号FERM-4772，本发明发明人首次保存在生命工程和工业技术研究所，工业科学和技术机构，1-3，Higashi1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，日本，然后按布达佩斯条约转为国际保藏)，本发明发明人分离到了携带编码脂酶S的基因和编码参与脂酶产生的蛋白质的基因的DNA片段。假单孢菌属的菌株SD705属于产生可用于去垢剂等的脂酶S的细菌。把DAN片段导入宿主细胞并在培养基中培养形成的转化体，可以确认在培养物中产生了脂酶S。这样就达到了本发明的目的。
更具体来说，本发明提供了如下所描述的这些1.一种基因，该基因编码1号序列的氨基酸序列。
2.一种基因，该基因携带有2号序列的编码脂酶的核苷酸序列。
3.一种基因，该基因编码3号序列的氨基酸序列。
4.一种基因，该基因携带有如4号序列中描述的编码脂酶产生中所涉及的蛋白质的核苷酸序列。
5.一种基因，该基因是1至4之任一所描述的来源于假单胞菌属(Pseudomonas)细菌的基因。
6.一种基因，该基因是1至4之任一所描述的来源于Pseudomonas sp.SD705(FERM BP-4772)的基因。
7.一种DNA，该DNA包含1至6之任一所描述的基因的核苷酸序列的全部或者一部分。
8.一种DNA，该DNA可与3或4所描述的基因的核苷酸序列的全部或者一部分杂交。
9.一种重组DNA，该DNA是通过将至少一种1至4所描述的基因掺入用于表达所述基因之宿主微生物细胞中的可复制载体中产生的。
10.一种重组染色体DNA，该DNA是通过在微生物染色体中同源掺入至少一种1至4所描述的基因产生的。
11.一种转化的宿主微生物，该微生物已用9所描述的重组DNA转化过。
12.一种转化的微生物，该微生物包含10所描述的重组染色体DNA。
13. 11所描述的转化的微生物，其中所说的微生物是埃希氏杆菌属的细菌、假单胞菌属的细菌或芽孢杆菌属的细菌。
14. 12所描述的转化的微生物，其中所说的微生物是假单胞菌属的细菌或芽孢杆菌属的细菌。
15. 11或12所描述的转化的微生物，其中所说的微生物是产碱假单胞菌(pseudomonas alcaligenes)、类产碱假单胞菌(pseudomonaspseudoalcalinenes)、门多萨假单胞菌(pseudomonas mendocina)或枯草芽孢杆菌(Bacillus subutilus)。
16. 11或12所描述的转化的微生物，其中所说的微生物是Pseudomonassp.菌株SD705、产碱假单胞菌菌株SD702、芽孢杆菌属菌株NKS-21或它们的变体。
17.一种用于产生脂酶的方法，该方法包括培养至少一种11到16所描述的转化的宿主细胞以产生含有脂酶的培养物，并且分离所说的脂酶。
现在在下文中详尽地描述本发明。
分离基因按照本发明，可通过已知的方法(如菌落杂交和在平板培养基上形成澄清区域)从染色体DNA分离编码脂酶的基因。更具体来说，首先，制备染色体文库。如果已知脂酶氨基酸序列的全部或部分，然后就可以制备对应于序列的全部或部分的寡核苷酸探针，使用这种探针可通过菌落杂交分离编码脂酶的基因。
当完全不知脂酶的氨基酸序列时，对应于活性中心残基周围序列的寡核苷酸可用作探针，已知该序列通常在得自微生物有机体的脂酶中是高度保守的。
另外，使用作为独立地对应于两种不同的保守序列的引物寡核苷酸和作为模板的具有目的脂酶基因的染色体，在两种引物之间的序列可通过DNA聚合酶酶促合成以制备双链DNA，其中两条链都可用作探针。
另外，在无产生脂酶能力的细菌中制备染色体文库，然后在包含脂酶的少量可溶性底物的琼脂平板中培养染色体文库。包含携带脂酶基因的染色体DNA片段的细菌分解菌落周围的底物，以使在澄清区域形成的基础上可以进行细菌的筛选。通过这种方法，可以分离编码脂酶的基因，但这些方法中的任何一种都可令人满意地使用。
使用作为探针的的编码脂酶基因的全部或其3区域的一部分通过菌落杂交，编码参与脂酶产生的蛋白质的基因可作为脂酶基因下游的DNA片段从染色体DNA分离。
宿主任何能表达分离的基因的宿主可用作导入基因的宿主，包括，例如，假单孢菌属、埃希氏菌属和芽孢杆菌属的细菌。
假单孢菌属的细菌优选地是Pseudomonas sp.菌株SD705(保藏号FERM-4772)或其变体、产碱假单胞菌、类产碱假单胞菌和门多萨假单胞菌。更优选地，细菌是Pseudomonas sp.的菌株SD705或其变体、门多萨假单胞菌的菌株SD702(保藏号FERM BP-4291)或其变体。
埃希氏菌属的细菌优选的是大肠杆菌。
芽孢杆菌属的细菌优选地的枯草芽孢杆菌、液解化淀粉杆菌、地衣芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌以及嗜碱芽孢杆菌。更优选地是细菌属于Bacillus sp.的菌株NKS-21(保藏号FERM BP-93-1)或其变体。
转化把回收的脂酶基因和编码对脂酶产生起作用的蛋白质的基因导入宿主细菌。把这两个基因同时连接进一个载体，以使可以产生和染色体中相同的序列或把基因独立连接进可共存于一个宿主细胞中的两个载体。
如果使用除了假单孢菌属的细菌之外的宿主，把上述基因插入并连接于启动子、信号序列和终止子之间，两种基因在宿主中起作用以使基因可在宿主中表达。使用其中连接有基因的重组载体转化宿主细菌。当两种基因连接进不同的载体时，仅携带脂酶基因的载体可用于转化或两种重组载体同时用于转化。在如果用作宿主的大肠杆菌中，例如，可以使用pUC或pACYC的质粒。在如果用作宿主的芽孢杆菌属的细菌中，可使用pUB110和pE194质粒。
在如果用作宿主的假单孢菌属的细菌中，可以使用RSF1010质粒等。由此在宿主细菌的染色体外部可稳定携带基因。基因也可以通过把非复制形式的DNA掺入宿主细菌染色体的方法导入到宿主细菌中。
脂酶的产生在如果用作宿主的假单孢菌属的细菌中，脂酶可分泌进培养肉汤。从培养肉汤分离和纯化脂酶可进行如下向培养肉汤中加入硫酸铵、分级分离粗制脂酶、通过透析除去硫酸铵、通过CM纤维素柱分离脂酶、通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳作为单一带纯化脂酶。然而，脂酶的产生和纯化不限于以上所述的方法，当然其它方法也是适用的。
脂酶S的性质通过以上所述的方法产生的脂酶S具有下列性质。
1.作用脂酶S作用于甘油三酯以水解其酯。
2.底物特异性脂酶S水解各种甘油酯和酯。
3.活性pH值和最适pH当使用pH-stat方法于底物橄榄油上在pH值8至12的范围中测定时，活性pH值是8至12，最适pH大约是10.7。
4.活性温度和最适温度当使用油酸甘油酯乳液作为底物在30至80℃的范围内测量时，活性温度和最适温度分别是30℃至80℃和60±5℃。
5.去垢剂的影响脂酶S在各种包含蛋白酶的去垢剂溶液中有较高的活性。
实施本发明的最佳方式现在参考下列的实施例描述，但本发明不受这些实施例的限制。
实施例1染色体DNA的制备用10％碳酸钠(3ml)补加L培养基(1％聚胨、0.5％酵母抽提物和0.5％氯化钠)并把培养基的pH调整到9，然后在形成的L培养基(1000ml)上接种Pseudomonas sp.的菌株SD705，在35℃下培养过夜，离心形成的培养基，然后回收细菌。细菌悬浮在包含0.4M氯化钠和10mM EDTA的pH为8的50mMTris-HCl缓冲液(8ml)中。向其中添加溶菌酶和核糖核酸酶A以分别达到0.5mg/ml和0.05mg/ml的最终浓度，其后在37℃下轻轻振荡30分钟，再向形成的混合物添加十二烷磺酸钠(SDS)以达到1％的最终浓度，然后在37℃下轻轻振荡30分钟以溶解细菌。随后，细菌在60℃下加热10分钟以完全溶解。向形成的溶液添加相等量的用TE缓冲液(含1mM EDTA的10mMTris-HCl缓冲液，pH8)饱和的酚，其后轻轻进行混合，同时容器底部向上倒置，离心后回收形成的上层含水相。上述方法重复三次。向第三次回收的含水相添加3倍体积的在-20℃冷却的乙醇，通风并分离塑料条周围的沉淀。然后用乙醇漂洗沉淀，在低压下干燥并再次溶解在TE缓冲液(1ml)中。
实施例2染色体DNA文库的制备在用限制性内切核酸酶Sau3Aal对染色体DNA进行部分消化后，再进行琼脂糖电泳，回收2至10-kbp的DNA片段。另外，用BamHI消化质粒pUC118，尔后用碱性蛋白酶处理。两种片段与T4 DNA连接酶一起连接。在L培养基中培养形成的连接产物之后，把培养物添加到用50mM氯化钙处理的大肠杆菌菌株JM 101(0.3ml)中，其后在0℃下培养30分钟。向形成的混合物添加L培养基(至1ml的最终体积)，其后在37℃下振荡一小时。将形成的培养物涂覆在包含50ppm的氨苄青霉素的L平板培养基上，在37℃下培养过夜。随后，回收了大约1,000个菌落的转化体。
实施例3寡核苷酸探针的制备通过蛋白质测序仪Model 476A(由Applied Biosystems有限公司制造)分析了纯化的脂酶的N-末端氨基酸序列，即随后回收的序列号5。基于该序列，在DNA合成仪上制备了序列号6的寡核苷酸探针。使用ECL(商标名；3-寡核苷酸标记和检测系统，Amasham生命科学有限公司)标记探针。
实施例4编码脂酶基因的分离大约1,000个菌落的转化体置于L平板培养基上的尼龙滤膜上在37℃下培养过夜。剥去滤膜，细菌在用0.5M氢氧化钠/1.5M氯化钠饱和的滤膜上溶解10分钟，然后在用1.5M氯化钠/1M Tris-HCl缓冲液(pH7)的滤膜上中和两次7分钟。在80℃下加热滤膜2小时后，在0.5％SDS/6×SSC(1×SSC指150mM氯化钠/15mM柠檬酸钠溶液；n×SSC指n倍于150mM氯化钠/15mM柠檬酸钠溶液浓度的溶液)中洗涤剩余的细菌。在0.1％的SDS/5×SSC/5×Denhardts溶液
中，滤膜上的预杂交在60℃下进行1小时。向均一的溶液中添加用于在60℃下的滤膜上杂交过夜的标记寡核苷酸探针。其后，滤膜在60℃下于0.1％SDS/1×SSC中洗涤15分钟，然后再在60℃下于0.1％SDS/0.5×SSC中洗涤15分钟。滤膜按照ECL方案经受检测(商标名；3-寡核苷酸标记和检测系统)。
作为这样的菌落杂交的结果，回收了许多阳性菌落。从形成的菌落之一回收质粒，其后用限制性核酸内切酶EcoRI和PstI、SacI和XbaI消化以制备片段。通过琼脂糖电泳分离这些片段以估计所插入的片段的长度，这表明回收了大约7kbp的DNA片段。质粒pS1以各种限制性核酸内切酶消化以制备限制性图谱。然后，通过琼脂糖凝胶电泳分离质粒并吸附在尼龙滤膜上。通过和菌落杂交相同的方法，进行了Southern杂交。最后，质粒和大约4kbp的HindIII-SacI片段和大约2.7kbp的EcoRI片段杂交。因而，假定估计编码脂酶S的基因和编码参与其产生的蛋白质的基因分别携带大约4kbp的HindIII-SacI片段和大约2.7kbp的EcoRI片段。图1显示了pS1的限制性图谱。其中，白箭头指脂酶基因；黑箭头指对脂酶产生起作用的基因；“Plac”代表lac启动子；“ori”代表复制起点；“Ap”代表抗氨苄青霉素的基因。回收这些片段，并且把片段分别与质粒pUC118(由TaKaRa Brewery，K.K.制造)的HindIII-SacI位点或EcoRI位点连接，由此转化大肠杆菌菌株JM101，回收分别包含各自的DNA片段的质粒pS1S和pS1E。图2和3分别描述了pS1S和pS1E的限制性图谱(图中的符号与图1相同)。
实施例5使用质粒pS1E，按照Sanger的双脱氧方法(Sanger，F.，Nicklen，S.，Coulson，A.R.(1977)，美国科学院学报，74，5463)测定了编码脂酶S的基因和编码参与脂酶产生的蛋白质的基因的核苷酸序列。更具体地说，使用双脱氧终止子测序试剂盒(Applied Biosystems有限公司)在DNA测序仪(Model 307A；Applied Biosystems有限公司)上进行核苷酸测序。因而，回收了编码序列号2的脂酶的核苷酸序列和编码如序列号4显示的参与脂酶产生的蛋白质的核苷酸序列。基于这些序列推定的氨基酸序列在序列号1和3中显示。
实施例6重组载体的构建和转化体的制备i)大肠杆菌化学合成了序列号7的寡核苷酸，该寡核苷酸作用以把EcoRI位点添加至对应于包含核糖体连接位点的片断(SD序列)和脂酶基因的起始密码子的序列的5端。混合两种寡核苷酸(即寡核苷酸和市售的M13引物RV(由TaKaRa Brewery K.K.制造))和用于聚合酶链式反应(POLYMERASE CHAINREACTION(PCR))的质粒pS1E，产生了携带包括SD序列的脂酶基因和编码参与其产生的蛋白质的基因的DNA片段。在以EcoRI完全消化片段并通过琼脂糖凝胶电泳对所消化产物分级分离之后，从琼脂糖凝胶提取和纯化产物。在用EcoRI完全消化质粒pUC118并把形成的消化产物与这样纯化的DNA片段混合以把它们和转化大肠杆菌菌株JM101的T4 DNA连接酶连接，分离到了抗氨苄青霉素的转化体。从这些转化体中提取、纯化并分析质粒DNA以确认这样产生的转化体携带这样的质粒，其中含有携带脂酶基因和编码参与其产生的蛋白质基因的DNA片段并将其插入到pUC118的EcoRI限制位点中，以表达lac启动子下游的脂酶基因和编码参与其产生的蛋白质的基因。质粒定义为pSL1。图4显示了pSL1的限制性图谱(在图中的符号与图1相同)。
化学合成了如图8所示的把EcoRI位点添加到脂酶基因的3末端的寡核苷酸。混合寡核苷酸和预先合成寡核苷酸以及序列号7所示的用于聚合酶链式反应(PCR)的质粒pS1E，回收到了仅包含包括SD序列的脂酶基因的DNA片段。以EcoRI完全消化片段，然后以与以上所述的转化相同的方式和质粒pUC118连接，以回收携带质粒pSL2的转化体，在质粒pSL2中携带仅包含脂酶基因的DNA片段并将其插入到pUC118的EcoRI限制性位点中以表达lac启动子下游的脂酶基因。图5显示了pSL2的限制性图谱(在图中的符号和图1中相同)。
ii)假单孢菌属在用HindIII和SacI完全消化质粒pS1S之后，通过琼脂糖凝胶电泳和从琼脂糖凝胶中抽取和纯化分级分离包含脂酶基因和编码参与其产生的基因的DNA片段。在用HindIII和SacI完全消化质粒pMFY42之后，把形成的产物与这样纯化的DNA片段混合，然后用T4 DNA连接酶连接转化大肠杆菌菌株JM101以选择抗卡那霉素的菌落。从这些转化体中提取、纯化并分析质粒DNA以回收质粒pSP1，其中把携带脂酶基因和编码参与其产生的蛋白质基因的DNA片段插入到pMFY42的HindIII-SacI消化位点之间。图6显示了pSL1的限制性图谱。其中，白箭头和黑箭头与在图1所代表的相同。“Km”代表抗卡那霉素的基因；“Tc”代表抗四环素的基因。
混合两种寡核苷酸(即市售的M13引物M4(由TaKaRa Brewery K.K.制造)和在序列号9中所示的寡核苷酸)和用于聚合酶链式反应(PCR)的质粒pS1E，以回收仅包含脂酶基因的片段。用HindIII和SacI完全消化片段，然后把形成的消化产物以与以上所述的相同的方式与质粒pMFY42连接，以回收在pMFY42的HindIII和SacI消化位点之间仅包含脂酶基因的DNA片段。图7显示了pSP2的限制性图谱(符号在图6中的相同)。
使用质粒pSP1和pSP2，通过电泳转化假单胞菌属一个种的菌株SD705(保藏号FERM BP-4772)，选择抗卡那霉素的菌落。更具体地说，首先，在pH调整到9的L液体培养基(5ml)中培养菌株SD705直到OD值达到0.5。通过离心回收细菌。把细菌悬浮在无菌水中，然后再回收并重新悬浮在无菌水(0.5ml)中。向细菌悬浮液添加质粒DNA，然后用电极转移进细胞，对DNA施用高电压电脉冲。其后把pH为9的L液体培养基(1ml)加入细菌悬浮液，在37℃下振荡培养1小时，形成的悬浮液在包含50ppm的卡那霉素和作为脂酶底物的橄榄油乳液的pH9的L平板培养基上包衣。在35℃下培养过夜后，选择在其本身周围形成透明区域的培养菌落以回收转化菌株。
转化作为门多萨假单胞菌菌株SD702(保藏号FERM-4291)的脂酶缺失菌株LD9以产生转化体。通过使N-甲基-N-硝基-N-亚硝基胍作用于门多萨假单胞菌菌株SD702，然后将其接种于包含脂酶底物的平板培养基上以选择没有任何透明区域形成的菌株，这样，回收到了LD9菌株。
iii)芽孢杆菌属化学合成了能把XbaI位点添加至如序列号10所示的成熟脂酶N-末端的寡核苷酸。另外，化学合成了能把XbaI位点添加至如序列号11所示的编码参与脂酶形成的蛋白质的基因的3-末端的寡核苷酸。把这两种寡核苷酸与用于聚合酶链式反应(PCR)的质粒pS1E相混合，回收携带成熟脂酶基因和编码参与其形成的蛋白质的基因的DNA片段。在用XbaI完全消化片段并用质粒pUC118连接消化的片段之后，回收质粒pSM1，其中具有携带成熟脂酶基因和编码参与其产生的蛋白质的基因的DNA片段并将其插入pUC118的Xba1消化位点。
化学合成了如序列号13和14所示的寡核苷酸。把这两种寡核苷酸和用于聚合酶链式反应(PCR)的质粒pSDT812(日本专利
发明者米田正, 高田晴美, 大野桂, 贵家润治 申请人:诺沃挪第克公司