新的非甲非乙非丙非丁非戊型肝炎病毒的核酸扩增和检测的制作方法

专利名称：：新的非甲非乙非丙非丁非戊型肝炎病毒的核酸扩增和检测的制作方法
技术领域：
：本发明的主题是一种用于扩增病毒核酸的试剂和利用该试剂检测病毒的方法，所述病毒是一种与非甲非乙非丙非丁非戊型(N-ABCDE)肝炎有关的病毒。除了已知的和已被鉴定的甲肝病毒(HAV)和乙肝病毒(HBV)外，最近，其他几种与肝炎有关，但形成独立病毒群的病毒也已被鉴定出来。这些病毒群一般如此命名即将群按连续的大写字母排列。每种新发现的与肝炎有关的病毒同先前病毒的不同之处在于，它不属于先前已知的病毒群。这就是丙肝病毒(HCV)也被称作非甲非乙型肝炎病毒的原因。本发明涉及这样一种病毒，它显然不属于HAV、HBV、HCV、HDV和HEV病毒群。WO94/18217描述了一种病毒，它不属于上面列出的五个病毒群。本发明涉及的核苷酸序列被证实与WO94/18217描述的序列不同。WO95/21922也描述了一种不属于上面列出的五个病毒群的肝炎试剂。在下文中，本发明限定的与肝炎有关的病毒群被称作HGV。目前可以得到的关于HGV的资料表明，这种病毒属于黄病毒科。本发明的主题是一种用于扩增HGV特异性核苷酸序列的试剂，其中HGV被限定为这样一种病毒，它的基因组由RNA构成，该RNA的5′端序列与SEQ.ID.NO.1的核苷酸有至少80％，优选90％的同源性；它包含两种HGV特异性引物，每种引物都带有可延伸的末端，其中一种引物含有15至30个碱基，它与SEQ.ID.NO.1的核苷酸的连续碱基有高达80％以上，优选至少90％的互补性；另一种引物含有15至30个碱基，它与SEQ.ID.NO.1的核苷酸的连续碱基有高达80％以上，优选至少90％的同源性。引物的可延伸末端被如此选择，使得当引物延伸时，各引物能够与另一引物的延伸产物杂交，并且各延伸产物可用作另一引物延伸所需的模板。在本发明中，扩增应被理解为制备碱基序列大量拷贝的方法。已知的方法，例如US-A-4,683,202中描述的聚合酶链式反应可供使用。引物应被理解为在其主链上具有一定数目核酸碱基的分子。主链是一种聚合物基本结构。特别为人熟知的是例如核酸(如DNA和RNA)的糖磷酸酯基本结构。能够与互配杂环形成氢键的杂环化合物与这些主链共价结合。它们通常是指天然存在的腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶碱基。但是，也有天然存在的其他碱基。这些碱基的序列被如此选择，使得它与将要扩增的核苷酸序列的连续碱基有90％以上的互补性。这些分子各自具有至少一个可延伸末端。延伸应被特别理解为在三磷酸单核苷或寡核苷酸的帮助下进行的碱基单元酶促催化添加。当用三磷酸单核苷单元完成延伸时，优选的酶是DNA聚合酶。含有将要被扩增的核苷酸序列的核酸可以用作碱基特异性掺入的模板。模板序列决定了与引物连接的碱基序列。用有15至30个碱基的分子作为引物是有利的，因为它们的化学合成相对来说容易完成。当使用DNA聚合酶时，优选将3′末端作为可延伸末端。当试剂用于从HGV的基因组RNA直接扩增核苷酸序列时，优选使用逆转录酶(RNA依赖性DNA聚合酶)。由于逆转录酶也具有DNA依赖性DNA聚合酶活性，所以首先从如此得到的cDNA生成大量的DNA。生成DNA之后，可以应用另一种DNA依赖性DNA聚合酶，例如得自大肠杆菌或水生栖热菌的DNA聚合酶。根据PCR原理，用逆转录酶(RT-PCR)扩增核苷酸序列的方法可以从例如US-A-5,310,652或WO91/09944获知。为确定反应条件，在此引入这些专利申请的内容。这两种与核苷酸序列不同的链互补的引物被用来生成这样一种核酸，它的长度由两个引物的两个彼此远离的末端确定，这两个引物优选地不可延伸。总的来说，这些核酸(也可被称作扩增物)的长度可以包括SEQ.ID.NO.1的全部区域，即长达348个碱基。扩增物的优选长度大于100个碱基。在特别优选的方式中，扩增物的长度范围在150至200个核苷酸(nt)之间。除了引物序列外，扩增物还含有由掺入三磷酸单核苷酸或多核苷酸而新生成的区域。优选地，本发明的引物不与其他肝炎相关病毒群的成员杂交，具体地说，不与甲肝、乙肝、丙肝、丁肝或戊肝病毒杂交。而且，它们优选地不与人血中其他核酸杂交。优选的引物可以与SEQ.ID.NO.1的部分序列完全互补或同源。然而实践表明，在有些情况下可以选择这样一些核苷酸，它们相对于SEQ.ID.NO.1的序列有一个错配。但是，错配优选地不位于引物的3′端。HGV特异性核苷酸序列应被理解为这样一段序列，该序列存在于HGV中，但不存在于其他病毒或真核细胞中。HGV亚型特异性核苷酸序列应被理解为这样一段HGV特异性序列，该序列不存在于所有HGV亚型中。HGV亚型是指这样一种病毒，该病毒具有HGV的全部表型特征，但它的核苷酸序列与其他HGV不同。偏差量至少为10％，并且优选地位于SEQ.ID.NO.1的核苷酸64-348内。事实表明HGV亚型彼此不同，特别是在核苷酸区域74-92、186-223、255-283和303-306中，而且它们更特别地与SEQ.ID.NO.1不同。在亚型特异性检测中，优选地至少一个引物或探针如此选择，以便使其序列完全或部分覆盖这些区域中的一个。假定SEQ.ID.NO.1是HGV的第一亚型，那么根据图1的排列可以确定亚型2a和2b。图1只显示了其序列与SEQ.ID.NO.1中的序列不同的那些核苷酸。在亚型特异性检测过程中，可以选择一个引物为HGV亚型特异性的，另一个引物为HGV亚型非特异性的。图1显示来自不同受试者的对应于SEQ.ID.NO.1的核苷酸64-348的HGV核苷酸，可以看出，根据上面给出的定义，第一HGV(Sa1134至Sa1172)属于第一亚型(2a)，而余下的HGV属于其自身的亚型(2b)。注意，与SEQ.ID.NO.1相比，在位置255处有一个缺失。图1也显示了保守区和可变区。HGV亚型非特异性序列是这样一些HGV特异性序列，这些序列可以与所有已知的HGV亚型杂交。它们特别包括SEQ.ID.NO.1的保守区域，优选在92和186、223和255以及315和348之间。HGV检测应被理解为确定样品中HGV存在的方法。优选的样品是血样。确定HGV亚型的方法既可以是确定亚型的方法，也可以是确实HGV自身的方法。除HGV特异性核苷酸序列外，本发明的引物也可含有这样的核苷酸序列，它们既不是HGV特异性的，也不能与通常存在于样品中的核酸杂交。它们优选地存在于引物的不可延伸末端。这些附加的核酸序列可用于捕获扩增物。可以通过连接可检测或可固定化基团进一步修饰引物。这些基团包括例如可直接或间接检测的基团，例如放射性、着色或荧光基团。可间接检测的基团包括免疫或酶促活性化合物，如半抗原或酶。它们在后续的反应或反应序列中被检测。EP-B-0324474(地高辛配基)是特别优选的。生物素被证明是好的可固定化基团，因为它能在包被了抗生物素蛋白和链亲和素蛋白的表面上很好地固定。这使得既可以在固相上捕获扩增物并除去样品组分，也可以检测影响扩增反应的物质。特别优选的引物含有六个连续碱基的序列或其互补序列，所述六个连续碱基包含于SEQ.ID.NO.2或3或5至20的序列中。特别优选的引物如SEQ.ID.NO.2或3或5-20所示。SEQ.ID.中出现的核苷酸Y和R是指所描述的引物涉及一种混合物，该混合物符合字母Y和R的含义。本发明的另一主题是用于特异性检测HGV的试剂盒，它含有权利要求1至4之一的试剂，以及含有这样一种碱基序列的探针，所述碱基序列位于在扩增反应中形成的延伸产物内部，即在引物的被延伸的末端之间。探针应被理解为同引物一样的在主链上具有一定数目核酸碱基的分子。但是，探针不一定具有可延伸末端。探针的特征在于它含有可识别的基团。可识别的基团可以是可检测基团或被固定或可固定的基团。对这样的基团的定义已在本文涉及引物的部分中给出。在特别优选的方式中，探针具有可固定化的残基，即在后续或同时的反应中可以与固相或固体结合的残基。如果可固定化基团是生物素残基，则固相可以是链亲和素或抗生物素蛋白包被的微量滴定平板或试管的表面。在优选方式中，试剂盒含有引物和探针，它们处于分立的容器中。此外，试剂盒可含有扩增和检测必需的或有用的其他组分，比如逆转录酶，三磷酸单核苷，它优选地被标记以便检测；用于捕获由探针和扩增物组成的杂交物的固相，以及缓冲性物质。因此，本方法的另一主题是在样品中检测HGV的方法，其特征在于由HGVRNA的一部分生成cDNA，并在利用权利要求1至4之一的试剂扩增cDNA；将扩增产物与含有这样的碱基序列的探针接触所述碱基序列位于引物的可延伸末端之间；确定探针与扩增产物的杂交物的形成，从而表明样品中HGV的存在。本发明有利地提供了一种用于检测HGV的特异性方法，它也可用于分析患者的样本，所述患者据信是各不相同的HGV亚型阳性，但末显示出HCV的存在。此外，本发明方法可以对HGV进行高灵敏度检测。Southern印迹中的特异性也很高。而且，如果需要可靠的诊断，可以将根据本发明方法进行的检测与针对HGV基因组另一位点的RNA检测方法相结合；具体地说，与在编码非结构化HGV蛋白的区域上的RT-PCR相结合。非结构化区域的序列可以根据EP-B-0318216中描述的方法来测定。为完成序列测定，可以从SEQ.ID.NO.1序列开始，将引物沿基因组的3′方向延伸；随后测定延伸产物的序列。该序列随后被用于制备一个引物，该引物被用于沿基因组的3′方向的另一延伸反应，并如此进行下去。成功地完成两个扩增反应中的至少一个之后，可以确定HGV是否存在。下面的实施例更详细地阐明本发明实施例1HGV特异性检测试剂-QIAamp，HCV试剂盒(QIAgenCat.NO.29504)-M-MuLV-逆转录酶(宝灵曼公司，1062603)-PCR核苷酸混合物(宝灵曼公司，1581295)-六聚物随机混合物(宝灵曼公司，1277081)-RNase抑制剂(宝灵曼公司，799017)-无菌的重蒸水-引物1(SEQ.ID.NO.2)-引物2(SEQ.ID.NO.3)-生物素化的探针核酸(SEQ.ID.NO.4)，通过氨基连接物(应用生物系统公司)而生物素化，-PCRELISA(DIG标记试剂盒，宝灵曼公司，1636120)(或单试剂RCR-DIG-标记混合物(宝灵曼公司，1585550)和Taq-DNA聚合酶(宝灵曼公司，1146165))-Enzymun-TestDNA检测(宝灵曼公司，1447777)一般性介绍全部过程应在三个不同的工作场所进行，即其中一个用于RNA分离，一个用于准备和进行逆转录和扩增反应，一个用于扩增产物的检测。各工作场所应配备单独的若干套移液吸管(pipette)。为避免污染，应用封闭的气溶胶密闭移液吸管或特殊的PCR移液吸管。每天重新配制试剂，按常规方法去除所有移液吸管上的污染物。各工作场所应用新手套。样品制备根据制造商的说明书用QIAampHCV试剂盒从人血清中制备总RNA。可以用其他RNA制备方法，如Chomczynski的酸酚抽提法或用异硫氰胍。cDNA合成(逆转录)逆转录和扩增混合物的制备在单独的工作场所，用独立的一套移液吸管完成。反应中所用试剂列于下表。表1<tablesid="table1"num="001"><tablewidth="849">试剂贮存液体积/反应RT缓冲液中的终浓度5x逆转录酶缓冲液5x4μl1xPCRdNTP-Mixje10mM0.2μl100μM随机六聚物20μM0.5μl200nMRNase抑制剂40U0.5μl1UH2O…3.8μl…M-MuLV-逆转录酶20U/μl1μl20U/反应RNA10μl/反应</table></tables>将10μlRTmix加入PCR反应管中。随后，加入10μlRNA溶液。将混合物在旋涡混合器上短暂处理，离心后在室温下保温10分钟，在42℃下保温30分钟，在95℃下保温5分钟。随后将反应混合物在4℃下保存，直至进行进一步处理。标记反应扩增混合物的制备在单独的工作场所，用独立的一套移液吸管完成。不必将扩增混合加至冰上。所用试剂列于下表。表2<tablesid="table2"num="002"><tablewidth="856">试剂贮存液体积/反应终浓度10xPCR温育缓冲液10x5μl1xPCRDig-标记混合物dATPdCTPdGTPdTTPDig-11-dUTP2mM2mM2mM1.9mM0.1mM5μldesDig-标记混合物200μM200μM200μM190μM10μM引物1(SEQ.ID.NO.2)5μM2μl200nM引物2(SEQ.ID.NO.3)5μM2μl200nMTaqDNA聚合酶5U/μl0.5μl2.5U/反应H2O补足至40μlcDNA-溶液10μl</table></tables>在反应管中制备40μl扩增混合物。加入10μlcDNA合成溶液。将混合物在旋涡混合器上短暂混合，然后离心。随后，将反应管置于Perkin-Elmer热循环仪(PE9600)中，进行40个循环(94℃15秒，55℃30秒，72℃30秒)。随后，将反应混合物在4℃下保存，直至进行检测反应。如果需要将混合物长期保存，应将其保存在-20℃。扩增产物的检测地高辛配基标记的扩增产物的检测用Enzymun-TestsDNA检测法(用宝灵曼ES仪器)或用PCRELISA测试法(用宝灵曼微量滴定平板)进行。扩增产物的加入和它们的检测在第三工作场所进行。在打开反应管之前，将反应物短暂离心。用上面列出的试剂盒中的变性溶液将溶液进行1∶10稀释。捕获探针在杂交溶液中的浓度优选地为75ng/ml。检测扩增反应物的详细方案在上面ES系统(ES300，ES600，ES700)和用于微量滴定平板方式的PCRELISA试剂盒(Enzymun-TestDNA检测)中给出。借助于引物2/3和2/8，可达到低于10至30拷贝/沉淀物的检测范围。可选引物根据本发明，SEQ.ID.NO.5、6、7、8和9的引物已被证明是有效的，特别是当5/6、5/7和2/9组合时。对于引物组合2/8，可以检测出三种不同的基因型；因此这是一种HGV亚型特异性检测。实施例2HGV亚型分类(HGV-Subtypisierung)除引物外，应用实施例1中列出的全部条件。某些成对物(SEQ.ID.NO./SEQ.ID.NO.)被用作引物；结果由表1给出。超过100的数值(吸收值)被看作阳性测试结果。这表明可以通过选择某些引物对来选择性地检测各个的亚型(如2/14，2/15和2/16)。表3带有灰色阴影的数值与期望值不同；但是，当在修正的严谨条件下重复进行实验时，数值是匹配的(2/12阴性；2/20阳性)。表4是引物序列和它们各自HGV特异性的列表。表4<tablesid="table3"num="003"><tablewidth="859">SEQ.ID.NO.基因型的识别序列(5’-3’)2所有的CGGCCAAAAGGTGGTGGATG8所有的AACACCTGTGGACCGTGCG101CAATGACTCGGCGCCGAC112a+bTGATGGCCCYGCGCCRAA121AGAGGAATCTTAACCTTCTC132a+bAGAGGGACCGTAGCCTCCC141GGTCTCGCCGCAGGCACA152aCGTTCTCGCCACGGGCATT162bCTTTCYCTCCRTAAGCGCG171TCGGGCCCTTATTCACACC182a+bCCGGGYCCTTATTACACC191+2aTAACGACGAGCCTGACGTC202bTAACGGCGTGCCTAGCGCC31+2aCGACGAGCCTGACGTCGGG</table></tables>序列(1)一般资料(i)申请人(A)姓名BoehringerMannheimGmbH(B)街道Sandhoferstr.116(C)城市Mannheim(E)国家DE(F)邮编68305(G)电话06217594348(H)电传06217594457(ii)发明名称ReagenzundVerfahrenzumNachweisvonNonA，NonB，NonC，NonD，NonE-Virus(iii)序列数目20(iv)计算机可读形式(A)介质类型软盘(B)计算机IBMPC兼容型(C)操作系PC-DOS/MS-DOS(D)软件PatentInRelease#1.0，Version#1.30(EPA)(2)SEQIDNO1的资料(i)序列特征(A)长度348碱基对(B)类型核苷酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型基因组-RNA(iii)假设序列非(iv)反义是(viii)基因组中的位置(A)染色体/片段非翻译区(xi)序列描述SEQIDNO1ACGTGGGGGAGTTGATCCCCCCCCCCCGGCACTGGGTGCAAGCCCCAGAAACCGACGCCT60ATCTAAGTAGACGCAATGACTCGGCGCCGACTCGGCGACCGGCCAAAAGGTGGTGGATGG120GTGATGACAGGGTTGGTAGGTCGTAAATCCCGGTCACCTTGGTAGCCACTATAGGTGGGT180CTTAAGAGAAGGTTAAGATTCCTCTTGTGCCTGCGGCGAGACCGCGCACGGTCCACAGGT240GTTGGCCCTACCGGTGGGAATAAGGGCCCGACGTCAGGCTCGTCGTTAAACCGAGCCCGT300TACCCACCTGGGCAAACGACGCCCACGTACGGTCCACGTCGCCCTTCA348(2)SEQIDNO2的资料(i)序列特征(A)长度20碱基对(B)类型核苷酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其他核酸(A)描述/desc＝“寡聚脱氧核糖核苷酸”(iii)假设序列非(xi)序列描述SEQIDNO2CGGCCAAAAGGTGGTGGATG20(2)SEQIDNO3的资料(i)序列特征(A)长度19碱基对(B)类型核苷酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其他核酸(A)描述/desc＝“寡聚脱氧核糖核苷酸”(iii)假设序列非(xi)序列描述SEQIDNO3CGACGAGCCTGACGTCGGG19(2)SEQIDNO4的资料(i)序列特征(A)长度19碱基对(B)类型核苷酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其他核酸(A)描述/desc＝“寡聚脱氧核糖核苷酸”(iii)假设序列非(ix)特征(A)名称/键miscfeature(B)位点1..19(D)其它信息/note＝“Gam5′-EndeistueberAminolinkkovalentmitBiotinverbunden”(xi)序列描述SEQIDNO4GGTAGCCACTATAGGTGGG19(2)SEQIDNO5的资料(i)序列特征(A)长度19碱基对(B)类型核苷酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其他核酸(A)描述/desc＝“寡聚脱氧核糖核苷酸”(iii)假设序列非(xi)序列描述SEQIDNO5CCAGAAACCGACGCCTATC19(2)SEQIDNO6的资料(i)序列特征(A)长度20碱基对(B)类型核苷酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其他核酸(A)描述/desc＝“寡聚脱氧核糖核苷酸”(iii)假设序列非(xi)序列描述SEQIDNO6CTTATTCCCACCGGTAGGGC20(2)SEQIDNO7的资料(i)序列特征(A)长度20碱基对(B)类型核苷酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其他核酸(A)描述/desc＝“寡聚脱氧核糖核苷酸”(iii)假设序列非(xi)序列描述SEQIDNO7CAAGAGAGACATTGAAGGGC20(2)SEQIDNO8的资料(i)序列特征(A)长度19碱基对(B)类型核苷酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其他核酸(A)描述/desc＝“寡聚脱氧核糖核苷酸”(iii)假设序列非(xi)序列描述SEQIDNO8AACACCTGTGGACCGTGCG19(2)SEQIDNO9的资料(i)序列特征(A)长度20碱基对(B)类型核苷酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其他核酸(A)描述/desc＝“寡聚脱氧核糖核苷酸”(iii)假设序列非(xi)序列描述SEQIDNO9CCACTGGTCCTTGTCAACTC20(2)SEQIDNO10的资料(i)序列特征(A)长度18碱基对(B)类型核苷酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其他核酸(A)描述/desc＝“寡聚脱氧核糖核苷酸”(iii)假设序列非(xi)序列描述SEQIDNO10CAATGACTCGGCGCCGAC18(2)SEQIDNO11的资料(i)序列特征(A)长度18碱基对(B)类型核苷酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其他核酸(A)描述/desc＝“寡聚脱氧核糖核苷酸”(iii)假设序列非(xi)序列描述SEQIDNO11TGATGGCCCYGCGCCRAA18(2)SEQIDNO12的资料(i)序列特征(A)长度20碱基对(B)类型核苷酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其他核酸(A)描述/desc＝“寡聚脱氧核糖核苷酸”(iii)假设序列非(xi)序列描述SEQIDNO12AGAGGAATCTTAACCTTCTC20(2)SEQIDNO13的资料(i)序列特征(A)长度19碱基对(B)类型核苷酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其他核酸(A)描述/desc＝“寡聚脱氧核糖核苷酸”(iii)假设序列非(xi)序列描述SEQIDNO13AGAGGGACCGTAGCCTCCC19(2)SEQIDNO14的资料(i)序列特征(A)长度18碱基对(B)类型核苷酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其他核酸(A)描述/desc＝“寡聚脱氧核糖核苷酸”(iii)假设序列非(xi)序列描述SEQIDNO14GGTCTCGCCGCAGGCACA18(2)SEQIDNO15的资料(i)序列特征(A)长度19碱基对(B)类型核苷酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其他核酸(A)描述/desc＝“寡聚脱氧核糖核苷酸”(iii)假设序列非(xi)序列描述SEQIDNO15CGTTCTCGCCACGGGCATT19(2)SEQIDNO16的资料(i)序列特征(A)长度19碱基对(B)类型核苷酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其他核酸(A)描述/desc＝“寡聚脱氧核糖核苷酸”(iii)假设序列非(xi)序列描述SEQIDNO16CTTTCYCTCCRTAAGCGCG19(2)SEQIDNO17的资料(i)序列特征(A)长度19碱基对(B)类型核苷酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其他核酸(A)描述/desc＝“寡聚脱氧核糖核苷酸”(iii)假设序列非(xi)序列描述SEQIDNO17TCGGGCCCTTATTCACACC19(2)SEQIDNO18的资料(i)序列特征(A)长度18碱基对(B)类型核苷酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其他核酸(A)描述/desc＝“寡聚脱氧核糖核苷酸”(iii)假设序列非(xi)序列描述SEQIDNO18CCGGGYCCTTATTACACC18(2)SEQIDNO19的资料(i)序列特征(A)长度19碱基对(B)类型核苷酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其他核酸(A)描述/desc＝“寡聚脱氧核糖核苷酸”(iii)假设序列非(xi)序列描述SEQIDNO19TAACGACGAGCCTGACGTC19(2)SEQIDNO20的资料(i)序列特征(A)长度19碱基对(B)类型核苷酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其他核酸(A)描述/desc＝“寡聚脱氧核糖核苷酸”(iii)假设序列非(xi)序列描述SEQIDNO20TAACGGCGTGCCTAGCGCC19权利要求1.一种用于扩增HGV特异性核苷酸序列的试剂，其中HGV被定义为一种病毒，该病毒的基因组由RNA组成，所述RNA在其5′端含有与SEQ.ID.NO.1有至少80％同源性的核苷酸序列，该试剂含有两个HGV特异性引物，每个引物具有一个可延伸的末端，其中一个引物含有15至30个碱基的序列，该序列与SEQ.ID.NO.1的连续碱基有超过80％的互补性，另一个引物也含有15至30个碱基的序列，该序列与SEQ.ID.NO.1的连续碱基有超过80％的同源性，引物的可延伸末端被如此选择，使得当每一引物延伸时，该引物能够与相应的另一引物的延伸产物杂交，相应的延伸产物起到另一引物延伸所需模板的作用。2.权利要求1的试剂，其特征在于引物中的至少一个含有6个连续碱基的序列，该序列包含在SEQ.ID.NO.1的序列或其互补序列之中。3.权利要求1或2的试剂，其特征在于引物中的至少一个含有SEQ.ID.NO.2或3或5-20的序列。4.上述权利要求中任一权项的试剂，其特征在于引物中的至少一个被可检测地标记。5.上述权利要求中任一权项的试剂，其特征在于引物中的一个或几个是HGV亚型非特异性的。6.权利要求1至4中任一权项的试剂，其特征在于引物中的一个或几个是HGV亚型特异性的。7.权利要求5或6的试剂，其特征在于一个引物是HGV亚型非特异性的，另一个是HGV亚型特异性的。8.用于特异性检测HGV的试剂盒，其包括上述权利要求中任一权项的试剂和一个探针，该探针包含位于在引物延伸末端之间形成的延伸产物中的碱基序列。9.权利要求8的试剂盒，其特征在于碱基序列含有至少6个连续的碱基，这些碱基包含在SEQ.ID.NO.2-20的序列或其互补序列之中。10.用于特异性检测HGV的试剂盒，其包括权利要求1至7中任一权项的试剂和另一种含有附加引物的试剂，所述附加引物被用于扩增HGV核苷酸序列。11.权利要求10的试剂盒，其针对每对引物都包含用于检测延伸产物的探针。12.检测HGV样本的方法，其特征在于由HGV-RNA的一部分形成cDNA，通过权利要求1至7的试剂的引物的延伸来扩增该cDNA，在形成扩增产物时，将扩增产物与一个探针接触，该探针含有位于引物可延伸末端之间的碱基序列，确证探针和扩增产物之间杂交的形成，以证实样本中HGV的存在。13.检测样本中HGV的方法，其特征在于-由HGV-RNA的两个或更多的部分形成cDNA，用权利要求1至4中任一权项的试剂和附加的HGV特异性引物对来扩增cDNA，-将扩增产物与各扩增部分的探针接触，-确证探针和扩增产物之间杂交的形成，-评价探针和扩增产物之间杂交的形成，其中若一个扩增产物形成杂交物，则可确定样本中存在HGV。全文摘要一种用于完成检测庚型肝炎病毒(HGV)的RT－PCR的引物。文档编号C12Q1/70GK1178558SQ96192499公开日1998年4月8日申请日期1996年11月20日优先权日1996年11月20日发明者V·施吕特,A·安吉尔,G·荷西,B·奥芬罗赫－黑恩勒申请人:曼海姆泊灵格股份公司