专利名称：Rage肿瘤排斥抗原的制作方法
技术领域：
本发明涉及对肿瘤排斥抗原和其前体进行编码的核酸分子。特别是被加工到由HLA分子所呈现的至少一种肿瘤排斥抗原中的肿瘤排斥抗原前体。该核酸分子、由该核酸分子编码的蛋白质、从中衍生出来的肽，相关的抗体和细胞毒性淋巴细胞，特别有用于诊断和治疗方面。
本发明的技术背景哺乳动物免疫系统对外源物质和异物的识别以及反应过程是很复杂的。在该系统中，T细胞是非常重要的一部分。T细胞可以识别其它细胞并与其反应，这是通过在其它细胞上的被称作人白细胞抗原(“HLA”)的分子和肽所组成的细胞表面复合物或主要组织学相容的复合物(“MHC”)来实现的。所述的肽是从被细胞加工的并且呈现HLA/MHC分子的大分子衍生出来的。参见Male等人的高级免疫学[Male et al.，Advanced Immunology(J.P.LipincottCompany，1987)]，特别是第6-10章。T细胞与HLA/肽复合物之间的反应是限制性的，特定的T细胞需要特定的HLA分子和肽的复合物。如果缺少特定的T细胞，即使有其对应物存在，也不会发生T细胞反应。同样，如果缺少特定的复合物，即使有T细胞存在，也不会发生T细胞反应。该机制涉及免疫系统对外源物质的反应，自体免疫病理学，以及对细胞异常的反应。
T细胞识别外源物质的机制还被牵涉于癌症。已经描述了的有一些直接抵抗自体黑素瘤的细胞溶解性T淋巴细胞(CTL)克隆。在某些情况下，被这些克隆识别的抗原已经被特征化了。在1992年11月26日公开的PCT专利申请PCT/US92/04354中，揭示了对肿瘤为特异性的一组基因，即“MAGE”组。这些基因的表达产物被加工为肽，然后，这些肽再于细胞表面上被表达。这可以导致特异性CTL造成的肿瘤细胞溶胞。这些基因被认为是编码“肿瘤排斥抗原前体”或“TRAP”分子的，并且从中衍生的蛋白质被称为“肿瘤排斥抗原”或“TRA”。参见Traversari等人的文章，《免疫遗传学》[Traversari et al.，Immunogenetics 35145(1992)]；van derBruggen等人的文章，《科学》[van der Bruggen et al.，Science 2541643(1991)]，可以得到进一步关于这一组基因的信息。还可以参见美国专利第5,342,774号。
在美国专利第5,405,940号中，揭示了MAGE九肽(nonapeptide)，它们是由HLA-A1分子所呈现的。如果知道对某一HLA分子的某一肽的特异性，那么，人们就可以知道某一肽会与某一HLA分子反应，而不同其它分子反应。这一点非常重要，因为不同的个体具有不同的HLA表型。结果是，虽然对某一肽作为某一特定HLA分子的对象的鉴定具有诊断学和治疗学的应用，但是，它们只是与那些具有该种HLA表型的个体有关。因此，在该领域中，存在着深入研究的需要，因为细胞的异常并不限制于某种特定的HLA表型，并且目标治疗方法也需要对异常细胞的表型的了解。
还被发现的是MAGE表达产物又被加工为第二种TRA。该第二种TRA是由HLA-C克隆10分子呈现的。因此，某一给定的TRAP可以得到多种TRA。
在1994年7月7日公开的PCT WO94/14459号专利申请中，酪氨酸酶已经被描述为肿瘤排斥抗原前体了。该篇文献揭示了某些正常细胞(例如黑素细胞)所产生的分子被加工到肿瘤细胞中并得到由HLA-A2分子所呈现的肿瘤排斥抗原。
在1997年9月29日公开的PCT WO94/21126号专利申请中，已经指出一种并非由酪氨酸酶衍生的第二TRA是由HLA-A2呈现的。该TRA是从TRAP衍生来的，但是由非MAGE基因编码。该篇文献表明某一HLA分子可以呈现从不同来源衍生出来的TRA。
在1995年1月5日公开的PCT WO95/00159号专利申请中，描述了一种被称作“BAGE”前体的非相关的肿瘤排斥抗原前体。还描述了由TRAP衍生的TRA。它们与MHC分子HLA-C-克隆10形成复合物。
在1995年2月2日公开的PCT WO95/03422号专利申请中，描述了另外一种被称作“GAGE”前体的非相关肿瘤排斥抗原前体。该GAGE前体与BAGE或MAGE组都无关。
各种文献，专利和专利申请中所介绍的工作大都是针对MAGE基因组，BAGE基因和GAGE基因的。这些基因在一些肿瘤中被表达，但是，它们在除了睾丸以外的其它正常组织中却是毫无声息的。它们在肾癌中都不被表达。
现在发现了另一个基因组，即“RAGE”基因组，它们编码另外的肿瘤排斥抗原和其前体。该RAGE基因组没有显示出与MAGE基因组、BAGE基因组、以及GAGE基因组的同源性。RAGE基因组在肾癌细胞中得到表达，但在正常肾细胞中不表达。该RAGE基因组还在其它一些肿瘤细胞中被表达。
以下对本发明给予进一步的描述。
本发明的概述本发明涉及分离的核酸分子、含有这些分子的表达载体、和被这些分子转染的宿主细胞。本发明还提供分离的蛋白质和肽，以及这些蛋白质和肽的抗体。此外，还提供含有上述分子的试剂盒。以上所述的材料都可以用于特征为RAGE TRA和RAGE TRAP表达的疾病的各种诊断和治疗。
根据本发明的一个方面，提供了被分离的多肽。它至少包括序列编号为40(SEQ.ID.NO.40)的氨基酸序列，而且它是RAGETRA。在优选的实施方案中，被分离的多肽包括至少SEQ.ID.NO.43氨基酸序列。在其它实施方案中，被分离的肽可以基本上或完全是由SEQ.ID.NO.40或SEQ.ID.NO.43的氨基酸序列所组成。
根据本发明的另一方面，提供了被分离的核酸分子。该分子编码包括由SEQ.ID.NO.40和SEQ.ID.NO.43组成的一组中的多肽。该被分离的核酸可以包括SEQ.ID.NO.44，并且优选包括SEQ.ID.NO.45。在其它的实施方案中，被分离的核酸基本上或者完全是由SEQ.ID.NO.44或SEQ.ID.NO.45组成。
根据本发明的另一方面，提供了被分离的核酸分子，该核酸分子与编码RAGE TRA或TRAP的含有核酸序列SEQ.ID.NO.1、SEQ.ID.NO.4、SEQ.ID.NO.6、SEQ.ID.NO.10、SEQ.ID.NO.12、SEQ.ID.NO.13、SEQ.ID.NO.14、SEQ.ID.NO.15、SEQ.ID.NO.17、SEQ.ID.NO.23、和/或SEQ.ID.NO.35的分子在严紧条件下杂交，条件是被分离的核酸分子不编码MAGE、GAGE或BAGE的TRA或TRAP。在优选的实施方案中，被分离的核酸分子是mRAN分子或cDNA分子。在其中的一种实施方案中，被分离的核酸分子是对SEQ.ID.NO.1的204-326、SEQ.ID.NO.1的313-399、SEQ.ID.NO.1的444-665、SEQ.ID.NO.12的273-449、SEQ.ID.NO.12的217-276、SEQ.ID.NO.13的185-247、SEQ.ID.NO.14的269-832各个核苷酸为互补的。在另一个实施方案中，被分离的核酸分子基本上由核酸序列SEQ.ID.NO.1、SEQ.ID.NO.4、SEQ.ID.NO.6、SEQ.ID.NO.10、SEQ.ID.NO.12、SEQ.ID.NO.13、SEQ.ID.NO.14、SEQ.ID.NO.15、SEQ.ID.NO.17、SEQ.ID.NO.23、SEQ.ID.NO.35、SEQ.ID.NO.44和/或SEQ.ID.NO.45组成。
根据本发明的另一方面，提供了表达载体和包括该表达载体的宿主细胞。该表达载体包括上述的被分离的核酸分子的任何一种或多种。在一个实施方案中，表达载体包括被分离的核酸分子SEQ.ID.NO.44或SEQ.ID.NO.45。根据本发明的其它表达载体包括上述的被分离的核酸分子和编码可以将本发明的TRA呈现给T细胞的HLA分子的核酸分子。它的一个例子是HLA-B7。所述的宿主细胞可以内源表达该HLA分子，例如HLA-B7。
根据本发明的另一方面，提供了SEQ.ID.NO.1、SEQ.ID.NO.12、SEQ.ID.NO.13、SEQ.ID.NO.14或它们的互补物的特征片段的被分离的核酸分子。这些特征片段被用于鉴定或选择性扩增以上所述的核酸。当把这些特征片段用于鉴定上述核酸分子的表达的时候，则该特征片段的长度优选在200-1310个核苷酸之间、200-1234核苷酸之间、200-2050核苷酸之间、或200-1167核苷酸之间。当把这些特征片段用于扩增上述的核酸分子的时候，则该特征片段的长度为12-32核苷酸之间。应该理解的是，扩增程序不是唯一的可以用来鉴定核酸分子的程序。
根据本发明的另一方面，提供了对是否有TRA或TRAP表达进行检测的试剂盒。该试剂盒包括两种或更多种的上述核酸分子，分别装在相互隔离的容器内，并处于一个包装中。在其中的一种试剂盒中，提供了一对扩增引物，其中的每一个引物基本上包括SEQ.ID.NO.1的长度为12-32个核苷酸的邻接片段或其互补物、SEQ.ID.NO.12的长度为12-32个核苷酸的邻接片段或其互补物、SEQ.ID.NO.13的长度为12-32个核苷酸的邻接片段或其互补物、SEQ.ID.NO.14的长度为12-32个核苷酸的邻接片段或其互补物，并且其中的邻接片段不重叠。优选的扩增引物是PCR引物，其中的一个引物是Watson链的邻接片段，另一个引物是Crick链的邻接片段的互补物。在一些实施方案中，为了选择性扩增和/或鉴定RAGE组中的一个，例如RAGE1或RAGE1的一部分等，对引物进行了相应的构建和安排。例如，一对引物可以是RAGE1基因中的邻接片段和其等位变型，但是不能够是RAGE2、3和4基因中的邻接片段。更具体的例子是，第一引物是含有SEQ.ID.NO.50-57中任何一个的核酸，而第二引物可以基本上是SEQ.ID.NO.1的长度为12-32核苷酸的邻接片段或其互补物，具体要根据所选择的第一引物来决定。
根据本发明的另一种试剂盒是表达试剂盒，该试剂盒包括分开放置的编码RAGE TRAP或包括RAGE TRA分子的被分离的核酸分子，和与TRA形成刺激T细胞反应的复合物的HLA呈现分子。这种试剂盒中的一种包括编码SEQ.ID.NO.40或SEQ.ID.NO.43的肽的核酸，以及编码HLA-B7的核酸分子。根据本发明的另一种试剂盒是分别放置有被分离的核酸分子的表达试剂盒，该被分离的核酸分子在严紧条件下与由编码RAGE TRAP的SEQ.ID.NO.1、SEQ.ID.NO.4、SEQ.ID.NO.6、SEQ.ID.NO.10、SEQ.ID.NO.12、SEQ.ID.NO.13、SEQ.ID.NO.14、SEQ.ID.NO.15、SEQ.ID.NO.17、SEQ.ID.NO.23和/或SEQ.ID.NO.35的核酸序列组成的分子杂交，以及编码HLA-B7的核酸分子。
根据本发明的另一方面，提供了上述分子和其有用片段编码的被分离的多种TRAP。还提供了对这些分子以及对HLA与多种RAGE TRA的复合物的抗体。
根据本发明的另一方面，提供了对以RAGE TRAP表达为特征的紊乱的诊断方法。其中的一种方法涉及RAGE TRAP，它被加工为RAGE衍生的TRA，并可与HLA分子形成复合物。这种方法包括将获得的生物学样品与可同复合物结合的试剂相接触，然后通过确定复合物与试剂的结合来确定紊乱。在一个实施方案中，该方法确定试剂与RAGE TRA和HLA-B7复合物的结合。在该实施方案中，RAGE TRA可以选自SEQ.ID.NO.40和SEQ.ID.NO.43的肽。另一种方法涉及将获得的生物学样品与对RAGE核酸分子或其表达产物为特异性的试剂相接触。然后确定试剂与核酸或其表达产物的相互作用，这种相互作用是紊乱的指标。该试剂可以是在严紧条件下与由编码TRAP的SEQ.ID.NO.1、SEQ.ID.NO.4、SEQ.ID.NO.6、SEQ.ID.NO.10、SEQ.ID.NO.12、SEQ.ID.NO.13、SEQ.ID.NO.14、SEQ.ID.NO.15、SEQ.ID.NO.17、SEQ.ID.NO.23和SEQ.ID.NO.35的核酸序列所组成的一组核酸序列中所选择的核酸分子杂交，条件是被分离的核酸分子不编码MAGE、GAGE、和BAGE的TRAP。另一种方法涉及将生物学样品与对RAGE肿瘤排斥抗原肽为特异性的试剂相接触，然后确定肽与试剂之间的相互作用来确定紊乱。在一个实施方案中，肽选自包括SEQ.ID.NO.40和SEQ.ID.NO.43的一组之中。
根据本发明的另一方面，提供了被分离的生物学制剂。该制剂包括对HLA分子和RAGE TRA的复合物为特异性的溶胞性T细胞。在其中的一个实施方案中，溶胞性T细胞是对HLA-B7分子和TRA的复合物为特异性的。在该实施方案中，抗原可以是选自由SEQ.ID.NO.40的肽和SEQ.ID.NO.43的肽所组成的一组中的肽。
根据本发明的另一个方面，提供了包括有对HLA分子与RAGETRA复合物为特异性的溶胞性T细胞的T细胞种群数量进行选择性富集的方法。该方法包括将分离的含有溶胞性T细胞的一群T细胞与试剂相接触，得到RAGE TRA和HLA呈现分子的复合物，其数量是足以使含有所述的溶胞性T细胞的T细胞种群得到选择性的富集。在一个优选的实施方案中，HLA分子是HLA-B7，而RAGETRA则选自以含有SEQ.ID.NO.40的氨基酸的肽和含有SEQ.ID.NO.43的氨基酸的肽所组成的一组之中。
根据本发明的另一个方面，提供了治疗以RAGE TRA或TRAP的表达为特征的紊乱。其中的一种方法是给需要这种治疗的患者施以有效剂量的试剂，该试剂可以选择性地在存在着有HLA和RAGETRA复合物的患者身上增强T细胞与该复合物的反应，并足以减缓所述的紊乱。这种试剂包括各种RAGE TRAP以及表达HLA和RAGE TRA复合物的重组细胞。在一个实施方案中，这种试剂包括对HLA-B7和以SEQ.ID.NO.40的肽或以SEQ.ID.NO.43的肽构成的肽所组成的复合物进行表达的细胞。另一种方法包括给患者足够数量的自体溶胞性T细胞以减缓紊乱，其中的自体溶胞性T细胞是对HLA分子和RAGE TRA的复合物为特异性的。
与上述的任何分离的编码TRAP或TRA的核酸相联系，本发明还包括对仅仅由于遗传密码的简并而与分离的核酸在密码子序列上有所不同的核酸以及上述任何核酸的互补物。
本发明还包括所有上述分子的功能性变体和等价体。
本发明还涉及发现和分离在肿瘤细胞中进行表达的各种TRAP和TRA，特别是在肾肿瘤细胞中被表达，而在正常的肾细胞中不被表达的TRAP和TRA。在本发明之前，虽然已经鉴定了许多其它细胞类型的其它的TRAP和TRA，但是，本文所述的TRAP和/或TRA对于肾癌却是未知的和未被鉴定的。令人惊奇的是，本发明的RAGE-1基因仅仅在57例肾癌中的一例中得到表达，而且最佳的对特定细胞毒性T细胞克隆的抗原肽被发现为是十聚肽，而不是九聚肽。因此，根据本发明的另一方面，本发明提供了TRAP、TRA，编码TRAP和TRA的核酸，它们不是MAGE、BAGE和GAGE的TRAP、TRA和核酸，它们是在肿瘤细胞中被表达的，特别是在肾癌细胞中被表达，但是，它们不在正常的肾细胞中被表达，而且可以通过下述方法获得从患者中分离肾肿瘤细胞；从患者中分离淋巴细胞；在体外将该肾肿瘤细胞与该淋巴细胞相接触；从与肾肿瘤细胞反应的淋巴细胞中分离细胞毒性T细胞克隆；从肾肿瘤细胞的mRNA制备表达文库；用细胞毒性T淋巴细胞克隆在该表达文库中筛选出与细胞毒性T细胞克隆反应的文库成员；分离所述的与细胞毒性T细胞克隆反应的文库成员；以及对所述文库成员的肾细胞核酸测序，所述的肾细胞核酸编码TRAP(或其一部分)，包括编码TRA。
本发明还提供了具有与这些核酸同源的并编码与肾相关的TRAP和TRA的序列、在严紧条件下与这些核酸杂交的并编码与肾相关的TRAP和TRA的序列、互补物、特征片段、和前述各物质的简并物、TRAP和TRA本身、以及前述任何物质的功能性变型物和等同物，它们都可以被认为是RAGE核酸，TRAP和TRA。
本发明还提供了在对象中选择性提高HLA/RAGE TRA复合物的试剂作为药物使用。这种制剂包括但不限于，RAGE TRA和/或RAGE TRAP、表达RAGE TRA和/或RAGE TRAP的重组细胞、以及表达适当的HLA分子的重组或不是重组的细胞、以及前述各物质的功能性变型物和等同物。具体的例子包括SEQ.ID.NO.43的RAGE TRA；SEQ.ID.NO.5的RAGE TRAP的任何含有SEQ.ID.NO.43的TRA的片段；SEQ.ID.NO.5的RAGE TRAP；表达SEQ.ID.NO.43的TRA和HLA-B7的重组细胞；和/或任何其它的RAGE TRA；RAGE TRAP或其功能性片段、和/或表达这些分子的细胞。
本发明还提供了在对象中选择性提高HLA/RAGE TRA复合物的试剂以用于生产治疗癌症的药物。这些试剂包括但不限于RAGETRA和/或RAGE TRAP；表达RAGE TRA和/或RAGE TRAP的重组细胞以及表达适当HLA分子的重组或不重组的细胞；以及前述的各物质的功能性变型物和等同物，具体的例子包括SEQ.ID.NO.43的RAGE TRA、SEQ.ID.NO.5的RAGE TRAP的包括SEQ.ID.NO.43的TRA的任何片段；SEQ.ID.NO.5的RAGE TRAP；表达SEQ.ID.NO.43的TRA和HLA-B7的重组细胞；和/或任何其它的RAGE TRA，RAGE TRAP或它们的功能性片段，和/或这些分子的表达细胞。
本发明还提供了对于HLA和RAGE TRA复合物为特异性的细胞毒性T细胞作为药物使用。一种非限定性的例子是对表达HLA-B7和RAGE TRA复合物的肿瘤细胞为特异性的自体细胞毒性T细胞。
本发明还提供了对HLA和RAGE TRA复合物为特异性的细胞毒性T细胞用于生产治疗癌症的药物。一种非限定性的例子是对表达HLA-B7和RAGE TRA复合物的肿瘤细胞为特异性的自体细胞毒性T细胞。
本发明还提供了含有任何一种或多种上述和本说明书中所述的药物的药物制剂。这些药物制剂可以含有药学上可接受的稀释载体或赋形剂。
本发明的这些以及其它的目的将结合以下详述给以更为细致的描述。
附图的简要说明
图1显示的是CTL克隆263/17与被HLA-B7 cDNA和编码RAGE TRAP的cDNA转染的COS细胞结合后所产生的肿瘤坏死因子水平。
图2是RAGE-1、2、3、和4的cDNA的结构图。充满黑点的部分指示在三个读码中每一个ORF的不同。在RAGE-2、3、和4的cDNA中的阴影部分代表与RAGE-1无关的序列，包括两个插入部分。通过PCR获得的5’终端序列由虚线部分表示。该PCR序列的3’端与RAGE-2、3、和4的cDNA的重叠5’终端序列完全相同。显示了由RAGE-1所编码的抗原肽。
图3显示的是CTL克隆263/17与被HLA-B7 cDNA和编码RAGE TRAP的cDNA或编码RAGE TRAP的ORF2的微小基因转染的COS细胞结合后所产生的肿瘤坏死因子水平。
图4显示的是CTL克隆263/17与被RAGE基因的ORF2编码的肽片段和HLA-B7转染的COS细胞结合后所产生的肿瘤坏死因子水平。
图5显示的是CTL克隆267/17对经过提高包括RAGE TRA的肽的浓度后的HLA-B7 LA23-EBVB细胞的溶胞活性。
序列的简要描述SEQ.ID.NO.1是RAGE-1 cDNA的核苷酸序列。SEQ.ID.NO.2是SEQ.ID.NO.1的cDNA的开端读码1(ORF1)。SEQ.ID.NO.3是SEQ.ID.NO.2转译的氨基酸序列。SEQ.ID.NO.4是SEQ.ID.NO.1的cDNA的开端读码2(ORF2)。SEQ.ID.NO.5是SEQ.ID.NO.4转译的氨基酸序列。SEQ.ID.NO.6是SEQ.ID.NO.1的cDNA的开端读码3(ORF3)。SEQ.ID.NO.7是SEQ.ID.NO.6转译的氨基酸序列。SEQ.ID.NO.8是SEQ.ID.NO.1的cDNA的开端读码4(ORF4)。SEQ.ID.NO.9是SEQ.ID.NO.8转译的氨基酸序列。SEQ.ID.NO.10 是SEQ.ID.NO.1的cDNA的开端读码5(ORF5)。SEQ.ID.NO.11 是SEQ.ID.NO.10转译的氨基酸序列。SEQ.ID.NO.12 是RAGE-2的cDNA的核苷酸序列。SEQ.ID.NO.13 是RAGE-3的cDNA的核苷酸序列。SEQ.ID.NO.14 是RAGE-4的cDNA的核苷酸序列。SEQ.ID.NO.15 是SEQ.ID.NO.12的cDNA的开端读码2’(ORF2’)。SEQ.ID.NO.16 是SEQ.ID.NO.15转译的氨基酸序列。SEQ.ID.NO.17 是SEQ.ID.NO.12的cDNA的开端读码3’(ORF3’)。SEQ.ID.NO.18 是SEQ.ID.NO.17转译的氨基酸序列。SEQ.ID.NO.19是SEQ.ID.NO.12的cDNA的开端读码4(ORF4)。SEQ.ID.NO.20是SEQ.ID.NO.19转译的氨基酸序列。SEQ.ID.NO.21是SEQ.ID.NO.12的cDNA的开端读码5(ORF5)。SEQ.ID.NO.22是SEQ.ID.NO.21转译的氨基酸序列。SEQ.ID.NO.23是SEQ.ID.NO.13的cDNA的开端读码6(ORF6)。SEQ.ID.NO.24是SEQ.ID.NO.23转译的氨基酸序列。SEQ.ID.NO.25是SEQ.ID.NO.13的cDNA的开端读码2’(ORF2’)。SEQ.ID.NO.26是SEQ.ID.NO.25转译的氨基酸序列。SEQ.ID.NO.27是SEQ.ID.NO.13的cDNA的开端读码3’(ORF3’)。SEQ.ID.NO.28是SEQ.ID.NO.27转译的氨基酸序列。SEQ.ID.NO.29是SEQ.ID.NO.13的cDNA的开端读码4(ORF4)。SEQ.ID.NO.30是SEQ.ID.NO.29转译的氨基酸序列。SEQ.ID.NO.31是SEQ.ID.NO.13的cDNA的开端读码5(ORF5)。SEQ.ID.NO.32是SEQ.ID.NO.31转译的氨基酸序列。SEQ.ID.NO.33是SEQ.ID.NO.14的cDNA的开端读码2’(ORF2’)。SEQ.ID.NO.34是SEQ.ID.NO.33转译的氨基酸序列。SEQ.ID.NO.35是SEQ.ID.NO.14的cDNA的开端读码3”(ORF3”)。SEQ.ID.NO.36是SEQ.ID.NO.35转译的氨基酸序列。SEQ.ID.NO.37是SEQ.ID.NO.14的cDNA的开端读码4’(ORF4’)。SEQ.ID.NO.38是SEQ.ID.NO.37转译的氨基酸序列。SEQ.ID.NO.39是含有与图4有关的RAGE肿瘤排斥抗原的十二聚肽。SEQ.ID.NO.40是在SEQ.ID.NO.39中描述的肽的九聚肽(1-9氨基酸)片段。SEQ.ID.NO.41是在SEQ.ID.NO.39中描述的肽的九聚肽(2-10氨基酸)片段。SEQ.ID.NO.42是在SEQ.ID.NO.39中描述的肽的九聚肽(3-11氨基酸)片段。SEQ.ID.NO.43是在SEQ.ID.NO.39中描述的肽的十聚肽(1-10氨基酸)片段。SEQ.ID.NO.44是编码SEQ.ID.NO.40的肽的DNA的核苷酸序列。SEQ.ID.NO.45是编码SEQ.ID.NO.43的肽的DNA的核苷酸序列。SEQ.ID.NO.46是用于RAGE TRAP表达试验中的有意义引物。SEQ.ID.NO.47是用于RAGE TRAP表达的PCR试验中的反义引物。在各种测试过的RAGE基因中都相同。SEQ.ID.NO.48是用于RAGE-1 TRAP基因表达的PCR试验中的对RAGE-1为特异性的反义引物。SEQ.ID.NO.49代表RAGE基因对ORF2插入点和指定为N的插入的侧翼区。SEQ.ID.NO.50-57 是有用于鉴定RAGE1的PCR引物。本发明的详细描述由HLA-B7限制酶切的自体CTL所识别的肾细胞癌的抗原是由以前所不知道的基因编码的。这个基因在所有正常组织(包括睾丸组织)中都是沉默的，除了在视网膜中以外，并且在几例肿瘤样品中被表达。本发明的最佳实施例实施例1第LE9211号患者的抗肾细胞癌CTL克隆肿瘤系LE9211-RCC是被定为LE9211号的女性患者的肿瘤样品中衍生出来的肾细胞癌细胞系。样品经过照射使其不繁殖。然后，使用这些被照射过的细胞去分离对其为特异性的溶胞性T细胞克隆(“CTL”)。
从LE9211号患者获取的外周血单核细胞(“PBMC”)样品与被照射过的癌细胞接触。14天后，观察该混合物的癌细胞溶胞情况，溶胞的发生表示在样品中存在有对癌细胞所带来的肽和HLA分子的复合物为特异性的CTL。
所使用的溶胞检测是根据Herin等人[Herin et al.，Int.J.Cancer39390-396(1987)]的铬释放检测。该检测的简要描述为，体外培养目标癌细胞，然后悬浮于107细胞/毫升的Dulbecco修饰过的Eagles培养基(DMEM)中并补以30％FCS，在37℃以200μCi/ml的Na(51Cr)O4培养45分钟。用DMEM洗标记过的细胞3次。然后重悬浮于配有10mM Hepes和10％小牛血清(FCS)的DMEM中，此后，将含有103个细胞的100微升的等份试样分布到96孔微滴盘中。加入在10微升同样培养基中的淋巴细胞，检测进行双份。以100g对微滴盘离心4分钟，在37℃的8％CO2气体中培养4小时。
再次对微滴盘离心，收集100微升的上清液等份试样并计数。对所释放的51Cr的百分率的计算如下
其中ER是观测到的试验的51Cr释放；SR是在200微升培养基中培养103标记的细胞的同时释放的测定；MR是通过加入100微升0.3％Triton X-100到目标细胞中所得到的最大释放。
那些表现出高度CTL活性的单核血液样品被通过限制稀释而扩增和克隆，并使用同样的方法再次筛选。然后分离得到第一个CTL克隆。此后，该克隆称为263/17。用同样的实验方法获得了称为361A/17的第二CTL克隆，并在CTL 263/17的无限生长失败的时候使用，具体使用见后面所述。
CTL克隆263/17和361A/17能够特异性溶胞自体肿瘤细胞，但对NK-目标K562细胞不发生溶胞。NK-目标K562细胞可以从美国马里兰州洛克维尔市的ATCC获得。
当用自体肿瘤细胞刺激后，CTL克隆263/17产生TNF。为了鉴定给CTL克隆263/17提供了抗原的HLA分子，进行了抑制实验，其中，在有抗HLA分子或抗CD4/CD8辅助分子的单克隆抗体存在的条件下对TNF的生产进行实验。发现有四种单克隆抗体抑制CTL263/17生产TNF，它们是(1)单克隆抗体W6/32，它直接抗所有的HLA类的I型分子(Parham et al.，1979，J.Immunol.，123342)；(2)抗体B1.23.2，它识别HLA-B和C分子(Rebai et al.，1983，TissueAntigens，22107)；(3)特异性识别HLA-B7的抗体ME-1(Ellis et al.，1982，Hum.Immunol.，549)；以及(4)抗CD8的抗体B9.4.1。没有发现直接抗HLA类II DR分子的抗体(L243Lampson et al.，1980，J.Immunol.，125293)和抗HLA-A3(GAPA 3Berger et al.，1982Hybridoma，187)的抗体或抗CD4(13B.8.82)的抗体的抑制作用。结论是，CTL263/17是CD8型的，并识别由HLA-B7呈现的抗原。
为了确定这个CTL克隆的肿瘤特异性，从另外的HLA-B7(PTEC-HLA-B7细胞)的患者得到的正常肾细胞用于实验。这些细胞得自于近端管状上皮细胞，该位点是肾细胞癌的始发点。PTEC-HLA-B7细胞不被CTL溶胞，表明抗原在肿瘤上为特异性表达。
得自于另外一个HLA-B7患者的肾细胞癌系MZ-1851也被CTL溶胞，表明该抗原是由独立的肿瘤所共有的。实施例2对CTL263/17所识别的抗体进行直接表达的cDNA克隆的分离A.cDNA文库从LE-9211-RCC分离了RNA，聚-A-RNA由寡-dT结合提纯。cDNA的制备是用含有Not I位点的寡-dT逆转录，然后合成第二条链(Superscript Choice System，BRL，Life Technologies)。该cDNA再与BstX I连接物连接，用Not I消化，按照大小分份(SephacrylS-500 HR柱，BRL，Life Technologies)，并以单一方向克隆到pcDNA-I-Amp(Invitrogen)的BstXI和Not I位点。然后将该重组的质粒电穿孔到DH5αE.coli中。对100个重组细菌的1500个试样进行扩增，通过碱溶胞、乙酸钾沉淀和酚提取来得到每一个试样的质粒DNA。
B.COS细胞的转染从不同试样来的质粒DNA与60ng的HLA-B7的cDNA(从另外一个HLA-B7患者来的cDNA经PCR克隆并插入质粒载体pcDSRalpha)共转染到COS细胞中。该转染进行双份。简言之，样品COS-7细胞以每井15,000个细胞的数量接种到平底组织培养微滴盘，使用配以10％小牛血清的DMEM。37℃过夜培养细胞，移去培养基，以50微升/井的量加入DMEM培养基，该培养基含有10％Nu-血清(Collaborative Research，Bedford，MA)、400μg/ml的DEAE-葡聚糖、100μM绿奎、和100ng的质粒。在37℃培养4小时后，移去培养基，添加50μl的含有10％二甲亚砜(DMSO)的PBS。两分钟后，移去该培养基并取代以配有10％FCS的DMEM200μl。
改变了培养基之后，COS细胞在37℃培养24-48小时。然后用CTL263/17筛选转染物。第一次移去培养基后，每井中加入放在含有25U/ml IL-2的100μl培养基中的3000CTL 263/17细胞。然后以对WEHI 164.13细胞的细胞毒性实验测定上清液中存在着的TNF数量。大多数试样的结果是TNF的浓度低于10pg/ml。有两个试样(1157和1319)的双份小井中的结果是高浓度的(24-37pg/ml)。1319试样的细菌克隆后，得到1200个克隆。提取它们的质粒DNA并与HLA-B7一起转染到COS细胞中。用CTL263/17筛选转染物。有一个cDNA克隆(9H3)对CTL263/17高产TNF。图1显示的是当该cDNA(60ng)与HLA-B7 cDNA(60ng)一起转染到COS细胞后，用CTL263/17筛选的结果。
该cDNA还被稳定地转染到HLA-B7肉瘤系中的一种细胞系，即LB23-SAR细胞中。然后用识别与CTL克隆263/17相同抗原的CTL克隆361A/17进行溶胞试验。对这些稳定地转染的细胞的识别与COS-HLA-B7-cDNA 9H3细胞的相同。实施例3cDNA 9H3的序列cDNA克隆9H3的长度为1130碱基对。这个cDNA是不完全的，因为它比在Northern blot中观察到的mRNA(1.6kb)小。该cDNA的5’终端由RACE-PCR克隆，并且确定了其整个序列。该整个序列如SEQ.ID.NO.1所示。与数据库中所报道的序列比较显示，在3’终端与尚不知道其功能的称作“表达序列标记”的235碱基对的短序列有高度同源性(I)，在5’终端则与被称作RTVL-H2和RGH2(2，3)的两个人内源逆病毒的反义链有限制性同源性(在95个碱基上有75％)。
对肾肿瘤AntiGEn来讲，该基因称作RAGE。
该序列含有5个开放读码，即ORF199个碱基对，编码32个残基的蛋白质；ORF2123个碱基对，编码40个残基的蛋白质；ORF387个碱基对，编码28个残基的蛋白质；ORF4288个碱基对，编码95个残基蛋白质；ORF5222个碱基对，编码73个残基的蛋白质(分别为SEQ.ID.NO.2，4，6，8和10)。SEQ.ID.NO.4编码TRAP，与CTL263/17(作为HLA-B7/肽复合物)反应的抗原肽从其衍生得到。实施例4其它RAGE基因的鉴定本实施例描述了三种另外的RAGE基因的鉴定，而且确定了只有上面的实施例中鉴定的RAGE基因，即现在被称作RAGE-1的基因编码与CTL263/17反应的RAGE TRA。
从RAGE-1 cDNA制备探针，用于在LE9211-RCC的cDNA文库中筛选另外的RAGE基因。分离出来了三种分别标记为RAGE-2(SEQ.ID.NO.12)，RAGE-3(SEQ.ID.NO.13)和RAGE-4(SEQ.ID.NO.14)的与RAGE同源的cDNA。用标准方法对RAGE-2、3、和4基因探测序列。将这些RAGE cDNA的核苷酸序列与RAGE-1 cDNA进行比较，表明在新鉴定出来的RAGE cDNA中存在着截断过的新的开放读码(ORF)。RAGE-2、RAGE-3、和RAGE-4含有在RAGE1的249位置的37个碱基对的插入[在与RAGE-1的ORF2(SEQ.ID.NO.4)相对应的序列之内]。对于RAGE-2的cDNA而言，与装配型质粒比较表明这个插入相应于外显子的开始。RAGE-1的cDNA不含有它的原因可能是使用了另外的下游方的接受位点。此外，RAGE-2、3、和4与RAGE-1不同，缺少RAGE-1的第192位置的核苷酸。这些变化显著地改变了与RAGE-1的ORF2和3同源的RAGE-2、3、和4的ORF。此外，RAGE-3在5’端还另外有一个47碱基对的插入。除了这些不同之处以外，RAGE-1、2、和3的序列完全相等。
RAGE-4的长度大约比其它的RAGE cDNA长800个碱基对。它的5’端序列与RAGE-2的相同，但是，从434到聚-A尾部，RAGE-4的序列与其它的RAGE cDNA完全不同。RAGE-4 cDNA没有显示出为嵌合性的。3’无关序列的起始位置与RAGE基因组序列的外显子-内含子的交界相对应，该3’无关序列存在于RAGE基因的3’端。因此，该RAGE-4 cDNA好象是RAGE-2基因的不同剪切的结果。图2给出了四种cDNA的排序。在四种RAGE的cDNA中，共有17种ORF。这17种内有10种不相同。这些ORF如下基 因ORF核苷酸号 SEQ.ID.NO.
RAGE-1 ORF1173-271 2ORF2204-326 4ORF3313-399 6ORF4323-610 8ORF5444-665 10RAGE-2 ORF2’ 217-276 15ORF3’ 273-449 17ORF4373-660 19ORF5494-715 21RAGE-3 ORF6185-247 23ORF2’ 274-333 25ORF3’ 330-506 27ORF4430-717 29ORF5551-772 31RAGE-4 ORF2’ 213-272 33ORF3” 269-832 35ORF4’ 369-557 37RAGE-2、RAGE-3、和RAGE-4的cDNA用标准技术克隆到表达载体中，并按照所述与HLA-B7一起转染到COS-7细胞中，从而确定这些cDNA是否编码被CTL 263/17所识别的抗原。同时进行平行对照实验，使用的是RAGE cDNA(现在称作为RAGE-1)和LE9211-RCC细胞。
由RAGE-1和带有CTL 263/17的HLA-B7共转染的LE9211-RCC细胞或COS-7细胞经过培养后，CTL263/17引起TNF的强烈释放。对用RAGE-2、RAGE-3、或RAGE-4和HLA-B7进行的共转染没有引起TNF的释放。因此，只有RAGE-1能够对CTL263/17识别的抗原进行转移表达。实施例5对含有RAGE肿瘤排斥抗原的ORF的鉴定在RAGE-2、3、和4中的37个碱基对的插入，就在这三个基因中过早地终止了ORF2。因此，据信，被CTL263/17识别的抗原肽是由ORF2的3’端所编码的。为了检验这个理论，将相应于RAGE-1的ORF2的DNA序列、相应于RAGE-2和RAGE-3的ORF2’的DNA序列克隆到表达载体中，并按照上述与HAL-B7一起转染到COS-7细胞中。作为阳性对照，使用的是RAGE-1 cDNA与HLA-B7共转染的COS-7细胞、或使用LE2911-RCC细胞。这些转染物或LE2911-RCC细胞用于激起CTL 263/17释放TNF。在ORF转染物中，只有从RAGE-1来的ORF2成功地刺激了CTL 263/17细胞对TNF的释放(图3)。这个实验确认了CTL 263/17细胞识别的RAGE抗原肽是由RAGE-1的ORF2的3’端编码的。实施例6鉴定RAGE肿瘤排斥抗原肽合成相应于RAGE-1的ORF2的3’端的合成肽，并测试其对CTL263/17细胞释放TNF的刺激。按照上述用HLA-B7转染COS-7细胞，并将相应于ORF2的3’端的合成肽加入培养物中。加入CTL263/17细胞，18小时后，测定TNF的生产(图4)。肽SPSSNRIRNTST(SEQ.ID.NO.39)有效地刺激了CTL 263/17对TNF的释放。由于HLA类的I型分子所呈现的肽一般都是9个氨基酸的长度，所以我们试验了从前面用于刺激CTL 263/17细胞对TNF的释放的10聚肽(SEQ.ID.NO.39)所衍生的9聚肽(SEQ.ID.NO.40，41和42)。这些实验的结果见于图4。其中的一个肽(SPSSNRIRN，SEQ.ID.NO.40)被CTL 263/17识别，但是其识别程度远远低于对10聚肽的识别，这就表明9聚肽不是最佳的肽。10聚肽(SPSSNRIRNT，SEQ.ID.NO.43)可以被CTL263/17很有效地识别。实施例7RAGE肿瘤排斥抗原九聚肽和十聚肽的活性本实施例显示RAGE TRA肽对HLA-B7表达细胞溶胞的诱导和九聚肽及十聚肽的相对活性。
在剂量反应检测中对RAGE肽(分别是SEQ.ID.NO.40和43)的九聚肽和十聚肽试验它们诱导CTL 263/17细胞对HLA-B7-LB23-EBVB细胞的溶胞。将冻干的肽溶于20mg/ml的DMSO中，用10mM乙酸稀释为2mg/ml并于-80℃保藏。靶子细胞，即HLA-B7-EBV-转染的淋巴母细胞(LB23-EBV细胞)，用51Cr按照前述于37℃标记1小时，然后充分清洗，去掉未结合的标记物。在有不同浓度的肽的96井微滴盘中于37℃培养LB23-EBV细胞30分钟。然后以有效物对目标为10∶1的比率加入处于等体积培养基中的CTL 263/17。4小时后测量51Cr的释放。图5给出了计量反应检测的结果。浓度为30ng/ml的SPSSNRIRNT肽(SEQ.ID.NO.43)引导了LB23-EBV细胞的最大溶胞半数值。实施例8RAGE-1基因的表达用PCR测试RAGE的表达，使用的引物如下SEQ.ID.NO.46-GTG TCT CCT TCG TCT CTA CTA(有义引物)SEQ.ID.NO.47-GGT GTG CCG ATG ACA TCG(对所有RAGE基因相同的反义引物)SEQ.ID.NO.48-GAG GTA TTC CTG ATC CTG(对RAGE-1为特异性的反义引物)首先，用常规技术从特定样品中获取全RNA。用该RNA制备cDNA。制备该cDNA的程序操作包括合并4μl的5x反转录酶缓冲液，1μl的各种dNTP(10mM)，2μl的二硫苏糖醇(100mM)，2μl的dT-15引物(20μM)，0.5μl的RNasin(40单位/μl)，和1μl的M-MLV反转录酶(200单位/μl)；然后加入6.5μl的模板RNA(1μl/3.25μl水，或2ug全模板RNA)；混合物的总体积是20μl；混合后在42℃培养60分钟，然后放置于冰上冷却；然后加入共80μl水使体积达到100μl。将该混合物在-20℃保藏直至使用于PCR。
PCR中使用的试剂包括■5μl的10x DyanZyme缓冲液■每种引物各20pmole■每种dNTP各5nanomole■1单位聚合酶“Dynazyme”(2单位/μl)■5μl的cDNA(相应于100ng全RNA)■水，加至最终体积为50μl
合并混合物，用一滴矿物油分层。混合物转移到预热至94℃的热循环器内，扩增包括在94℃进行一个15分钟的循环，然后进行33个循环如下■在94℃1分钟■在56℃或60℃2分钟(参见下述)■在72℃3分钟最后进行72℃的15分钟延长步骤。全体RAGE基因的表达用pan-RAGE有义引物(SEQ.ID.NO.46)和反义引物(SEQ.ID.NO.47)的PCR扩增来检测，其中采用了2分钟60℃的淬灭。单独RAGE-1基因的表达用pan-RAGE有义引物(SEQ.ID.NO.46)和RAGE-1特异性反义引物(SEQ.ID.NO.48)的PCR扩增来检测，其中采用了2分钟56℃的淬灭。在含有溴化乙锭的琼脂糖凝胶(1.5％)上可以肉眼看到PCR的产物，即194碱基对(对所有受试的RAGE基因通用)和239碱基对(对RAGE-1基因为特异性)的产物。
该基因为肿瘤特异性的。在所有实验的正常组织中，该基因都是沉默的，除了在视网膜中以外。特别是，该基因在肾上腺、膀胱、骨髓、脑、乳房、小脑、结肠、心脏、肾、肝、肺、黑素细胞、肌肉、神经、卵巢、胎盘、前列腺、皮肤、脾细胞、胃、睾丸、胸腺细胞、子宫和愈伤组织中都是沉默的。然而，该基因被发现在肿瘤细胞系和肿瘤组织样品中表达(参见表1)。而且，该基因还在其它一些这里没有列出的肿瘤中被表达，虽然频率很低。
表1.RAGE-1基因在肿瘤样品中的表达表达的肿瘤数目组织学类型全部RAGE RAGE-1肿瘤样品肾癌2/57 1/57肉瘤5/25 3/25膀胱癌 表面的-0/29 0/29渗入的-3/37 3/37黑素瘤 原发性-2/60 2/60转移性-8/177 6/177头颈癌 2/50 1/50乳房癌 3/128 1/128前列腺癌0/22 0/22结肠癌 0/48 0/48白血病 0/19 0/19肺癌(NSCLC1) 0/59 0/59(SCLC) 0/5 0/5间皮癌 1/3 0/3脑癌0/11 10/11食道癌 0/7 0/7卵巢癌 0/3 0/3肿瘤细胞系肾癌8/19 7/19膀胱癌 3/3 3/3间皮癌 11/19 8/19头颈癌 3/7 1/7肉瘤2/6 1/6黑素瘤 11/78 7/78结肠癌 1/17 1/17肺癌(NSCLC1) 0/2 0/2(SCLC) 0/26 0/26白血病/淋巴癌 0/11 0/11脑癌0/1 0/1胃癌0/2 0/21NSCLA非小细胞肺癌上述实施例给出了对编码TRAP的核酸的分离。然而，这个TRAP编码分子与上述引用的文献中已经揭示的编码序列都没有同源性。因此，本发明的一个方面是分离包含SEQ.ID.NO.1、SEQ.ID.NO.4、SEQ.ID.NO.6或SEQ.ID.NO.10的全部核酸或其中独特部分核酸的核酸分子。还可以期望的是由SEQ.ID.NO.12、13和14所编码的RAGE ORF衍生出来的抗原可以被CTL 263/17以外的其它细胞溶解性T淋巴细胞克隆所识别。因此，本发明的另一个方面涉及RAGE组基因中的一个或多个，包括其被分离的独特部分，例如编码从其衍生的各种TRAP和TRA、各种RAGE TRAP和RAGE TRA，以及与其相关的诊断和治疗方法。前述的序列不是MAGE、BAGE或GAGE序列，正如将其与各种文献中所描述的MAGE、BAGE或GAGE序列进行比较时可以看到的那样。
另外，本发明另一方面是编码那些非MAGE、非BAGE和非GAGE的肿瘤排斥抗原前体、但又可以在严紧条件下与含有上述核苷酸序列的核酸分子杂交的核酸序列。术语“严紧条件”在本文中指的是本领域技术人员所熟知的技术参数。具体地讲，其在本文中指的是在65℃的杂交缓冲液(3.5xSSC，0.02％Ficoll，0.02％聚乙烯吡咯烷酮，0.02％牛血清白蛋白，25mM NaH2PO4(pH7)，0.5％SDS，2mM EDTA)中进行的杂交。SSC是0.15M氯化钠/0.15M柠檬酸钠，pH7；SDS是十二烷基硫酸钠；EDTA是乙二胺四乙酸。杂交之后，对转移了DNA的膜在室温用2xSSC清洗，然后在65℃用0.1xSSC/0.1xSDS清洗。
可以获得同样严紧条件的还有其它的条件和试剂。本领域的技术人员都很熟悉它们，因此没有必要在此赘述。本领域的技术人员所熟悉的还有筛选细胞特别是筛选癌细胞的方法，表达所述的分子的方法，常规的分离方法，以及随后对核酸的分离方法。
在筛选RAGE组成员时，可以进行Southern blot，使用前述的条件，并采用32P探针。在对DNA最后被转移到其上的膜进行清洗后，用该膜进行X-光照相来检查放射性信号。
因此，本发明还提供了被分离的SEQ.ID.NO.1的独特片段或其互补物。独特的片段指的是对RAGE基因为‘签名’的片段。例如，它的长度足够保证它的精确序列不会在RAGE组以外的分子中被发现，如同权利要求第23项所述。优选的独特片段是那些仅仅在ORF2或其互补物中见到的片段。这些独特片段可以在Southern blot检测中作为探针来鉴定那些包括表达ORF2的RAGE组的成员，或者可以用于扩增检测，例如用于那些使用了PCR的检测。正如本领域技术人员所熟知的那样，在某些应用中，例如在Southern blot中，优选使用比较大的探针，例如200个碱基对以上的探针，而较小的片段则优选用于如PCR中。正如可以被本领域技术人员所认识到的那样，独特片段的大小将取决于其在遗传密码中的保守性。因此，SEQ.ID.NO.1，SEQ.ID.NO.12，SEQ.ID.NO.13和SEQ.ID.NO.14的一些区域将需要比较长的独特片段，而其它的则要求比较短的片段，通常为12-32碱基对(例如，12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31和/或32个碱基对长)。实际上，SEQ.ID.NO.1的任何具有18个或更多个核苷酸的片段都是独特的。本领域技术人员都非常熟悉选择这些序列的方法，都会根据独特片段的性质而选择性地将它们同非该组成员分开。通常所需要的就是将该片段的序列同已知的数据库进行比较，虽然也可以进行体外的确认性杂交和序列分析。
为选择性扩增RAGE-1的任何一对PCR引物的构建和安排都可以使用RAGE-1的特异性引物。这样的引物是RAGE-1的连续延长，它与ORF2的插入点的两端杂交，该ORF2被插入其它的RAGE基因的核苷酸而改变了。这样的特异性引物将只能够与RAGE-1的核苷酸的连续延长完全杂交，但是，将只会与那些不共享ORF2的RAGE基因发生部分杂交。对于PCR引发的效果和RAGE1的鉴定而言，RAGE 1特异性引物的构建和安排应该使其3’端不能够与RAGE 1以外的其它RAGE基因有效杂交。为了达到这一点，引物可以被描述为具有两个端点一个5’端，与插入点的一侧邻接并互补，并直接连接到一个3’端，而该3’端是与插入点的另一侧邻接和互补的。使引物的5’端比3’端长，并使3’端较短(即1-4个核苷酸)，则杂交的动力学就强烈倾向于在5’端进行杂交。此时，仅仅在5’端和3’端都与核酸杂交后才开始发生3’起始的PCR延长，即仅仅于ORF2存在并没有插入时发生。
如上所述，RAGE-1特异性引物可以引发DNA双螺旋链中的任何一条的合成，在此描述为Watson链和Crick链。RAGE 1中的侧翼覆盖插入点的序列是5’-CAAACANGGATCA-3’(SEQ.ID.NO.49；Watson链，N是插入的核苷酸)。为扩增RAGE-1的Watson链而设计的RAGE-1特异性引物一般含有12、优选15或更多个与插入点的Watson链的3’端的核苷酸有关的核苷酸。引物的其余部分会是1-4个核苷酸长，并互补于插入点的5’序列。这样的引物将与在RAGE-1中的互补部分完全互补和邻接。该引物的3’端将与Watson链的互补部分杂交并开始延长。在RAGE-1以外的RAGE基因中，在ORF2插入点插入非互补核苷酸会基本消除RAGE-1特异性引物的3’端对插入点的Watson链5’端的杂交。这种在引物的3’端与不是RAGE-1的RAGE基因杂交时发生的误配，将排除这些基因的有效扩增。举例性的引物的序列组成基本如下，其中N是0、在适宜的Watson或Crick链上的1个或更多个邻接核苷酸5’-NTATTCCTGATCCT-3’(SEQ.ID.NO.50)；5’-NTATTCCTGATCCTG-3’(SEQ.ID.NO.51)；5’-NTATTCCTGATCCTGT-3’(SEQ.ID.NO.52)；5’-NTATTCCTGATCCTGTT-3’(SEQ.ID.NO.53)；5’-NCAAGTTCAAACAG-3’(SEQ.ID.NO.54)；5’-NCAAGTTCAAACAGG-3’(SEQ.ID.NO.55)；5’-NCAAGTTCAAACAGGA-3’(SEQ.ID.NO.56)；以及5’-NCAAGTTCAAACAGGAT-3’(SEQ.ID.NO.57).
RAGE-1的表达还可以由PCR检测，使用的引物在插入点的相对一侧起始延长。对扩增产物的分析可以通过扩增产物的长度的比较来将RAGE-1扩增产物与非RAGE-1扩增产物区分开来。因为RAGE-1基因不含有其它RAGE基因中存在的插入，因此，从RAGE-1衍生的扩增产物将比其它RAGE基因的扩增产物短(约短37个碱基对)。这个差别可以用本领域的常规方法区分开来。此外，对于本领域技术人员来讲，其它的区别基本同源的核苷酸序列的方法，例如LCR(ligase chain reaction)等等，都是很明显的。用相似的方法可以制备RAGE 2、3和4的特异性引物。
本发明还包括含有编码相同于RAGE基因所编码的氨基酸残基的密码子的核酸序列的应用。例如，如同上述实施例7所揭示的，十聚肽SPSSNRIRNT(SEQ.ID.NO.43)是RAGE肿瘤排斥抗原。丝氨酸残基(SEQ.ID.NO.40的第1、3、和4氨基酸)，可以由例如密码子TCA、AGT和TCA分别编码。除了TCA和AGT以外，丝氨酸残基还可以由密码子TCC、TCG、TCT和AGC编码。这六个密码子中的任何一个在编码丝氨酸残基时是相等的。因此，对于本领域技术人员来讲，任何编码丝氨酸的核苷酸三联体都可以被用于指导在体内或体外的蛋白质合成来加入丝氨酸残基。同样，编码其它含有RAGE肿瘤排斥抗原的氨基酸残基的核苷酸序列三联体包括CCA、CCC、CCG和CCT(脯氨酸密码子)；CCA、CGC、CGG、CGT、AGA和AGG(精氨酸密码子)；ACA、ACC、ACG和ACT(苏氨酸密码子)；AAC和AAT(天冬酰胺密码子)；和ATA、ATC和ATT(异亮氨酸密码子)。其它的氨基酸残基也可以通过类似的情况由多联核苷酸序列编码。因此，本发明包括对那些由于遗传密码的简并性而使其与生物学分离得到的核酸在密码子序列上不同的核酸的简并。
以上的实施例给出了RAGE TRA这类肽的分离。这些代表性的肽是由SEQ.ID.NO.1的核酸的转译产物经过加工得到的。因此，对本领域技术人员来讲，用来加工成为RAGE TRA的最终表达形式的转译产物可以是任何长度的含有RAGE TRA的序列。如同上述实施例所揭示的那样，各种大小的肽和蛋白质，例如，小到9、10、或12个氨基酸的肽或蛋白质，大到由ORF1编码的氨基酸序列等，都可以被适当地加工，由HLA-B7呈现，并由CTL263/17识别。SEQ.ID.NO.23的肽可以在其两端分别或同时加上1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、甚至更多个氨基酸。这种肽的抗原性部分可以在生理条件下剪切下来由HLA类的1型分子呈现。
衍生RAGE TRA的蛋白质和肽的氨基酸序列可以是天然的或非天然的，也就是说，它们可以含有天然的RAGE TRAP分子或含有经过修饰的序列，只要其氨基酸序列保留有在呈现于细胞表面时可以被CTL识别的肿瘤排斥抗原序列即可。例如，本文中的RAGE肿瘤排斥抗原可以是RAGE肿瘤排斥抗原的蛋白质和无关的氨基酸序列的融合体、RAGE-1基因的ORF2的转译多肽、SEQ.ID.NO.39，40和43中所显示的氨基酸序列的合成肽、标记的肽、从患有肾癌的患者分离的肽、从表达RAGE-1的细胞培养物分离的肽、与非肽分子例如一些药物传递系统中的非肽分子结合的肽，和其它含有SEQ.ID.NO.40的氨基酸序列的分子。
从以上的实施例中还可以看出本发明还包括序列在表达载体中的应用，以及转染的宿主细胞和细胞系，包括原核细胞(例如，大肠杆菌)和真核细胞(例如，CHO细胞，COS细胞、酵母表达系统和在昆虫细胞中表达的重组杆状病毒)。这些表达载体要求相关的序列，即上述的序列，是被可操作的连接到启动子上。正如以上所发现的那样，人的HLA-B7呈现从这些基因中衍生出来的TRA，且表达载体还可以包括编码HLA-B7的核酸序列。当载体含有这两种编码序列的时候，就可以用它来转染通常并不表达这两种序列之一的细胞。TRAP和TRA编码序列可以被单独使用，例如，当宿主细胞已经表达HLA-B7时。当然，具体使用的宿主细胞并没有特殊的限制。因为当需要的时候，含有两种编码序列的载体可以被用于HLA-B7呈现细胞中，所以，编码TRAP或TRA的核酸序列就可以被用于不表达HLA-B7的宿主细胞中。
本发明还包括所谓的表达试剂盒，其可以使本领域的技术人员制备所需要的一种或多种表达载体。这种表达试剂盒包括至少分开放置的以上所述的材料中的两种。同时，还可以含有其它需要的成分。
为了将本发明的核酸分子和TRAP与以前的MAGE类、BAGE基因和GAGE基因相区分，则对本发明的就被定为RAGE类基因和TRAP。因此，本文中的“RAGE”出现之处，就已经MAGE、BAGE和GAGE基因、基因产物、TRAP和TRA。
本发明具有多种用途，其中的一些在此给予了描述。首先，本发明使得本领域技术人员可以对以TRAP表达为特征的紊乱进行诊断。这些方法涉及对TRAP基因和/或从其衍生的TRA，例如，由HLA-B7呈现的TRA的表达进行确定。在前者的情况下，这种确定可以通过任何标准的核酸检测来完成，包括聚合酶链反应，或带有标记的杂化探针的检测。在后一种情况下，则优选使用包括对TRA和HLA复合体为结合伙伴的检测，例如使用抗体的检测。另一种确定的方法是TNF释放检测，如以上所述。
对TRAP基因的分离使得对TRAP分子本身和或由其衍生的TRA的分离成为可能，特别是含有SEQ.ID.NO.1或4编码的氨基酸序列的TRAP或TRA分子。在此所详细描述的方法还可以分离其它的由SEQ.ID.NO.1，12，13和14所编码的被其它CTL克隆识别的并/或被其它HLA分子所呈现的另外的TRAP和TRA。(本领域的技术人员已经知道了多种的HLA分子，包括但不限于那些由HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-E、HLA-F和HLA-G基因编码的)很多种本领域的技术人员所熟知的方法都可以用来分离TRAP分子，和/或由其而衍生来的TRA。从天然产生蛋白质的细胞中可以分离出来蛋白质。另外，可以将表达载体引入到细胞中引起蛋白质的生产。在另一种方法中，mRNA转译物可以被微注射到细胞中或用其它的方法引入到细胞中来引起生产编码的蛋白质。在不含细胞的的提取物中例如在织网红细胞的溶胞系统中翻译mRNA也可以生产蛋白质。含有本发明的TRA的肽也可以在体外合成。本领域的技术人员可以根据已知的分离蛋白质的方法获得分离的TRAP和/或由其衍生的TRA。具体的方法包括但不限于免疫色谱、HPLC、大小排除色谱、离子交换色谱和免疫亲和色谱。当这些分子被加工并以TRA或以TRA和HLA例如HLA-B7的复合物的形式被呈现的时候，它们还可以结合有其它的材料如为制备用于治疗以TRAP分子的表达为特征的紊乱的疫苗而使用的附剂。此外，疫苗的制备也可以使用在表面上有TRA/HLA复合物呈现的细胞，例如非繁殖的癌症细胞，非繁殖的转染物等等。在所有这些使用细胞的疫苗中，细胞都可以是经过刺激CTL反应所需要的一种或两种成分的编码序列所转染的细胞，或是不需要转染就可以表达该两种分子的细胞。疫苗还包括编码RAGE TRA或其前体的裸DNA或RNA，它们可以是体外产生的，使用的方法可以是注射、粒子轰击、鼻腔喷雾或其它的方法。“裸核酸”型的疫苗已经被证明可以刺激免疫反应，包括刺激对裸核酸所编码的肽为特异性的CTL的产生(Science 2591745-1748，1993)。
TRAP分子、与其相关的TRA、以及TRA和HLA的复合体都可以通过本领域已知的标准方法来制备抗体。主要的介绍抗体生产标准技术的指导原则的文献有，Catty.D.，Antibodies.A PracticalApproach.Vol.1.IRL Press.Washington DC(1988)；Klein.J.，ImmunologyThe Science of Cell-Non-Cell Discrimination.John Wileyand Sons.New York(1982)；Kennett，R.et al.，Monoclonal Antibodies，Hybridoma.A New Dimension In Biological Analyses，Plenum Press，New York(1980)；Campbell.A.，Monoclonal Antibody Technology，inLaboratory Techniques and Biochemistry and Molecular Biology，Vol.13(Burdon，R.et al.EDS.)，Elsevier Amsterdam(1984)；和Eisen.H.N.，Microbiology，third edition，Davis，B.D.et al.EDS.[Harper&Rowe，Philadelphia(1980)]。
本发明的抗体的制备是使用任何适合的方法给动物以蛋白质、蛋白质的片段、表达这些蛋白质或蛋白质片段的细胞等诱发多克隆抗体的产生。单克隆抗体的产生根据的是本领域熟知的方法。正如本文中所详细描述的那样，这样的抗体可以用来鉴定表达蛋白质的组织或纯化蛋白质。抗体还可以结合有用于成像的标记试剂或抗肿瘤剂，包括但不限于氨甲蝶呤、放射性碘标记的化合物、毒素例如蓖麻毒、其它的细胞抑制的或细胞溶解的药物等等。根据本发明制备的抗体优选对本文所述的TRA/HLA复合物为特异性的。
本文中所用的术语“紊乱”指的是任何肿瘤排斥抗原前体被表达的病理状态，例如癌症，特别是肾癌。
根据本发明的一些治疗方法的前提是患者的免疫系统的反应，导致TRA呈现细胞的溶解，例如HLA-B7细胞。这种方法中的一种是给具有所述表型的非正常细胞的患者使用对复合物为特异性的自体CTL。本领域技术人员可以在体外制备这种CTL。一般而言，先从患者身上取来细胞样品，例如血细胞，然后与呈现所述复合物并能够刺激CTL繁殖的细胞相接触。目标细胞可以是转染物，例如以上所述类型的COS细胞。这些转染物在其表面上呈现着所需的复合物，并且在与所需CTL结合时，刺激它的繁殖。COS细胞，例如在此所述的COS细胞是可以从很多地方获得的，其它的适宜的宿主细胞也是如此。对CTL克隆的生产已经在上面给出了具体的描述。然后将经过克隆扩展的自体CTL给予患者。由RAGE-2、3、或4编码的其它的对RAGE-1为特异性的CTL或对RAGE TRA为特异性的CTL都可以用相似的方法分离和使用。
为实现具体的治疗方法，例如称作获得性转移的方法[参见Greenberg.J.Immunol.136(5)1917(1986)；Riddel et al.，Science257238(7-10-92)；Lynch et al.，Eur.J.Immunol.211403-1410(1991)；Kast et al.，Cell 59603-614(11-17-89)]，将呈现所需复合物的细胞与CTL结合，导致对该特异性的CTL的繁殖。随后将繁殖的CTL给予患有细胞异常的患者，该异常的特征为呈现具体复合物的细胞异常。然后，CTL就溶解异常细胞，从而达到所需的治疗目标。
上述的治疗的理论是至少有一些患者的异常细胞呈现相关的HLA/TRA复合物。这一点非常容易确定，本领域技术人员都熟悉鉴定呈现某一HLA分子的细胞的方法，以及鉴定表达具有相关序列的DNA的细胞的方法，在此为RAGE序列。一旦通过上述筛选方法鉴定了呈现相关的复合物的细胞后，就可以使它们同患者的含有CTL的样品相接触。如果呈现复合物的细胞被混合CTL的样品溶解了，那么就可以假设RAGE衍化了，呈现了TRA，则患者就是适宜于使用上述治疗方法的患者。
获得性转移并不是本发明允许的唯一治疗方法。诸多的方法都可以使CTL在体内得到刺激。方法之一就是使用上面已经详述过的表达复合物的非繁殖细胞。在该方法中使用的细胞可以是通常表达复合物的细胞，例如经过辐射的肿瘤细胞，或者用对于呈现复合物为必须的一种或两种基因转染的细胞。Chen等人发表在Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88110-114(January，1991)的文章中，给出了这种方法的实例，介绍了使用转染的细胞在治疗过程中表达HPVE7肽。可以使用的细胞有多种。同样地，可以使用含有一种或两种所需基因的载体。优选病毒性和细菌性的载体。例如，将编码RAGE TRA的核酸可操作地连接到启动子上或连接到在某些组织或细胞中直接表达RAGE TRA的增强序列上。核酸可以被引入到表达载体中。表达载体可以是未经修饰的外源染色体核酸，质粒，或为了插入外源性核酸例如编码RAGE TRA的核酸而经过修饰和构建的基因组。编码RAGE TRA的核酸还可以被插入到逆病毒基因组中，从而促进该核酸在目标组织或细胞的基因组中的整合。在这些系统中，所需要的基因是由微生物携带的，例如，Vaccinia病毒，逆病毒或细菌BCG，以及事实上“侵染”宿主细胞的物质。所得到的细胞呈现所需的复合物，被自体CTL识别，然后使CTL繁殖。
通过TRAT或其刺激性的片段与促进在体内引入HLA-B7的辅剂相结合，也可以获得类似的效果。TRAP经过加工后，得到HLA分子的互补肽，而TRA的呈现不需要进一步的加工。一般而言，患者可以接受皮内注射有效剂量的RAGE TRAP，和/或由其衍生的TRA。初始剂量之后，可以给予增强剂量，按照本领域的常规免疫手册进行。
作为免疫手册的一部分，可引起免疫反应的物质可以被与癌症疫苗的核酸或肽的成分一起使用。这种可以引起免疫反应的化合物可以被分类为辅剂和细胞素。辅剂可以通过提供抗原库(细胞外源的或在巨噬细胞内)来增强免疫学反应，活化巨噬细胞和刺激特定的淋巴细胞。本领域中有许多已知的辅剂，具体的例子有MPL(SmithKline Beecham)，经过提纯和对Salmonella minnesota Re 595脂多聚糖的酸性水解而得到的异系同基因，QS21(SmithKlineBeecham)，从Quillja saponaria提取物中纯化的QA-21皂角苷，以及由多种生物级油例如鲨烯和/或生育酚制备的油包水乳剂。细胞素由于具有刺激淋巴细胞的性质而在免疫手册中是有用的。本领域的技术人员都熟知多种这类的细胞素，包括人体介素-12(IL-12)，它已经显示了对疫苗的增强保护性质(Science 2681432-1434，1995)。
在使用的时候，本发明的治疗组合物以药物学可接受的制剂的形式给药。这类制剂通常可以含有药物学可接受的浓度的盐，缓冲剂，保存剂，相容的载剂，辅助性免疫潜在剂，例如辅剂和细胞素，还可以含有或不含有其它的药剂。
本发明的制剂以有效剂量使用。有效剂量指的是一种药剂的本身或与其它药剂一起刺激得到所需反应的剂量。在治疗癌症的时候，所需的反应是抑制癌症的发展。可以是暂时地减慢疾病的发展，更为理想的是永久性地停止疾病的发展。用常规的方法就可以检测这些结果，或通过本发明所述的诊断方法来达到。
当需要用本发明的药物组合物刺激免疫反应的时候，可以包括刺激体液抗体反应得到血清中抗体效价的提高，克隆性扩展细胞毒性淋巴细胞，或其它的所需免疫学反应。据信，根据使用的方法，免疫原的剂量在1纳克/公斤至100毫克/公斤的范围内是有效的。优选的剂量范围是500纳克/公斤至500微克/公斤的范围。实际的剂量将取决于众多的因素，包括选用的材料，单剂量或多次剂量，患者的参数，例如年龄，身体状况，身高，体重，以及疾病的程度。这些因素对本领域的技术人员来讲都是熟知的，他们都可以按照常规的实验搞清楚它们。
本发明的其它的方面对本领域的技术人员来讲都是明了的，无须赘述。
本文中使用的术语和表达都是描述性，而不是限定性的，使用这些术语和表达没有排斥任何上述特征和部分的等同物的意思，应该理解的是，在本发明的范围内，还有众多的变型。
文献1.《(在从视网膜色素上皮细胞提取的文库中的染色体定位和表达的序列标记》(Gleser，L.，and Swaroop，A.1992.Expressed sequencetags and chromosomal localization of cDNA clones from asubtracted retinal pigment epithelium library. Genomics 13.873-876.)2.《带有与人T细胞淋巴病毒相关的人内源逆病毒类似基因组C型pol序列和gag序列》(Mager，D.，and Freeman，J.D.1987.Human endogenous retrovirus-like genome with Type C polsequences and gag sequences related to human T-cell lymphotropicviruses.J.Virol.61.，4060-4066.)3.《在人内源性逆病毒类似成分中RTVL-H组成员中env基因的存在》(Hirose，Y.，Takamatsu.M.，Harada，F.1993，Presence of envgenes in members of the RTVL-H family of human endogenousretrovirus-like elements.Virology 192，52-61.)
序列表(1)背景资料(i) 申请人(A)名称LUDWIG癌症研究所(B)街道地址Americas大街1345号(C)城市纽约(D)州名纽约(E)国家美国(F)邮政编码10105(i) 申请人(A)名称LEIDEN大学(B)街道地址Stationsweg大街46号(C)城市Leiden(D)国家荷兰(E)邮政编码2312AV(ii)发明名称RAGE肿瘤排斥抗原(RAGE TUMORREJECTION ANTIGENS)(iii)序列数57(iv)通信地址(A)收信人WOLF，GREENFIELD & SACKS，P.C.
(B)街道地址大西洋大街600号(C)城市波士顿(D)州名马萨诸塞(E)国家美国(F)邮政编码02210
(v)计算机阅读方式(A)媒介类型软盘(B)计算机IBM PC兼容(C)操作系统PC-DOS/MS-DOS(D)软件PatentIn Release#1.0，#1.25版(vi)申请现况(A)申请号(B)提交日期(C)分类(vii)在先申请状况(A)申请号US 08/401,015(B)提交日期1995年3月21日(vii)在先申请状况(A)申请号US 08/530,569(B)提交日期1995年9月20日(viii)律师/代理人信息(A)姓名GATES，EDWARDR.
(B)注册号码31，616(C)查寻/案卷号L0461/7002WO(ix)电信号码(A)电话617-720-3500(B)传真617-720-2441(2)第1序列资料(i) 序列特征(A)长度1311碱基对(B)类型核酸
(C)链数单链(D)构象线性(ii) 分子型式cDNA(iii)假设无(iv) 反义链无(v) 来源(A)有机体人(xi)序列描述第1序列GGTGAGCAGC CAAAGCAGGC ATCCCCGCAG TTGACTTGCC ACCAAGGGAA TGTGGGTGAA 60TGACCAAGGC AGGCATCCTC GCGGTGATCA GACACCAATG GAGTGTGGGT GAATAATCAG 120GCAGGCATCC CCGCAGTGAT TAAACACCAA GAGAAGACTA TTCCTGAGTC TGTGACTGGT 180GCTGGAGTTT TGAGTCCACA GATAAAATGT GTCTCCTTCG TCTCTACTAG AGAGGAAAAA 240GAACTGGAAT TGGAAGAACA GGGAGACTGA AGGGTAGCAA GAGAGGCTGG AGAAGAGAGT 300GAAAAGACCG CTTACCTGAT TTGAAATTGT CTGCAGCCCC TCTTTCCTGG AGTAAATGAA 360CTGGACCAAA TCTCAAAAAA TCCACGATGT CATCGGCACA CCCGCTCAGA AGATCCTCAC 420CAAGTTCAAA CAGGATCAGG AATACCTCTA CTAACAACCA ATTTGTCCCC ACAATGCCTC 480TCCCTCCTGC ACGCAATGGT GGCCTATGAT CCCGATGAGA GAATCGCCGC CCACCAGGCC 540CTGCAGCACC CCTACTTCCA AGAACAGAGA AACAGTCCCT AAAGCAAGAG GAGGACCGTC 600CCAAGAGACG AGGACCGGCC TATGTCATGG AACTGCCCAA ACTAAAGCTT TCGGGAGTGG 660TCAGACTGTC GTCTTACTCC AGCCCCACGC TGCAGTCCGT GCTTGGATCT GGAACAAATG 720GAAGAGTGCC GGTGCTGAGA CCCTTGAAGT GCATCCCTGC GAGCAAGAAG ACAGATCCGC 780AGAAGGACCT TAAGCCTGCC CCGCAGCAGT 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30TAA99(2)第3序列资料(i) 序列特征(A)长度32个氨基酸(B)类型氨基酸(D)构象线性(ii) 分子型式蛋白质(xi) 序列描述第3号序列MetAsnTrpThrLysSer GlnLysIleHisAspValIleGlyThrPro1 510 15AlaGlnLysIleLeuThr LysPheLysGlnAspGlnGluTyrLeuTyr20 25 30(2)第4序列资料(i) 序列特征(A)长度123碱基对(B)类型核酸(C)链数单链(D)构象线性(ii) 分子型式cDNA(iii)假设无(iv) 反义链无(v) 片段类型内片段(vi) 来源(A)有机体人(ix) 特点(A)名称/图例CDS(B)定位1..123(xi) 序列描述第4序列ATG TCA TCG GCA CAC CCG CTC AGA AGA TCC TCA CCA AGT TCA AAC AGG48Met Ser Ser Ala His Pro Leu Arg Arg Ser Ser Pro Ser Ser Asn Arg15 10 15ATC AGG AAT ACC TCT ACT AAC AAC CAA TTT GTC CCC ACA ATG CCT CTC96Ile Arg Asn Thr Ser Thr Asn Asn Gln Phe Val Pro Thr Met Pro Leu20 25 30CCT CCT GCA CGC AAT GGT GGC CTA TGA 123Pro Pro Ala Arg Asn Gly Gly Leu35 40(2)第5序列资料(i) 序列特征(A)长度40个氨基酸(B)类型氨基酸(D)构象线性(ii) 分子型式蛋白质(xi) 序列描述第5号序列Met Ser Ser Ala His Pro Leu Arg Arg Ser Ser Pro Ser Ser Asn Arg1 5 10 15Ile Arg Asn Thr Ser Thr Asn Asn Gln Phe Val Pro Thr Met Pro Leu20 25 30Pro Pro Ala Arg Asn Gly Gly Leu35 40(2)第6序列资料(i) 序列特征(A)长度87碱基对(B)类型核酸(C)链数单链(D)构象线性(ii) 分子型式cDNA(iii)假设无(iv) 反义链无(v) 片段类型内片段(vi) 来源(A)有机体人(ix) 特点(A)名称/图例CDS(B)定位1..87(xi) 序列描述第6序列ATG GTG GCC TAT GAT CCC GAT GAG AGA ATC GCC GCC CAC CAG GCC CTG 48Met Val Ala Tyr Asp Pro Asp Glu Arg Ile Ala Ala His Gln Ala Leu1 5 10 15CAG CAC CCC TAC TTC CAA GAA CAG AGA AAC AGT CCC TAA 87Gln His Pro Tyr Phe Gln Glu Gln Arg Asn Ser Pro20 25(2)第7序列资料(i) 序列特征(A)长度28个氨基酸(B)类型氨基酸(D)构象线性(ii) 分子型式蛋白质(xi) 序列描述第7号序列Met Val Ala Tyr Asp Pro Asp Glu Arg Ile Ala Ala His Gln Ala Leu1 5 10 15Gln His Pro Tyr Phe Gln Glu Gln Arg Asn Ser Pro20 25(2)第8序列资料(i) 序列特征(A)长度288碱基对(B)类型核酸(C)链数单链(D)构象线性(ii) 分子型式cDNA(iii)假设无(iV) 反义链无(v) 片段类型内片段(vi) 来源(A)有机体人(ix) 特点(A)名称/图例CDS(B)定位1..288(xi) 序列描述第8序列ATG ATC CCG ATG AGA GAA TCG CCG CCC ACC AGG CCC TGC AGC ACC CCT48Met Ile Pro Met Arg Glu Ser Pro Pro Thr Arg Pro Cys Ser Thr Pro1 510 15ACT TCC AAG AAC AGA GAA ACA GTC CCT AAA GCA AGA GGA GGA CCG TCC96Thr Ser Lys Asn Arg Glu Thr Val Pro Lys Ala Arg Gly Gly Pro Ser20 25 30CCA GAG ACG AGG ACC GGC CTA TGT CAT GGA ACT GCC CAA ACT AAA GCT144Gln Glu Thr Arg Thr Gly Leu Cys His Gly Thr Ala Gln Thr Lys Ala35 4045TTC GGG AGT GGT CAG ACT GTC GTC TTA CTC CAG CCC CAC GCT GCA GTC192Phe Gly Ser Gly Gln Thr Val Val Leu Leu Gln Pro His Ala Ala Val50 55 60CGT GCT TGG ATC TGG AAC AAA TGG AAG AGT GCC GGT GCT GAG ACC CTT240Arg Ala Trp Ile Trp Asn Lys Trp Lys Ser Ala Gly Ala Glu Thr Leu6570 75 80GAA GTG CAT CCC TGC GAG CAA GAA GAC AGA TCC GCA GAA GGA CCT TAA288Glu Val His Pro Cys Glu Gln Glu Asp Arg Ser Ala Glu Gly Pro85 90 95(2)第9序列资料(i) 序列特征(A)长度95个氨基酸(B)类型氨基酸(D)构象线性(ii) 分子型式蛋白质(xi) 序列描述第9号序列MetIleProMetArgGluSerProProThr ArgProCysSerThrPro1 51015ThrSerLysAsnArgGluThrValProLys AlaATgGlyGlyProSer20 2530GlnGluThrArgThrGlyLeuCysHisGly ThrAlaGlnThrLysAla35 40 45PheGlySerGlyGlnThrValValLeuLeu GlnProHisAlaAlaVal50 5560ArgAlaTrpIleTrpAsnLysTrpLysSer AlaGlyAlaGluThrLeu65 7075 80GluValHisProCysGluGlnGluAspArg SerAlaGluGlyPro85 9095(2)第10序列资料(i) 序列特征(A)长度222碱基对(B)类型核酸(C)链数单链(D)构象线性(ii) 分子型式cDNA(iii) 假设无(iv) 反义链无(v) 片段类型内片段(vi) 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GlyArg6570(2)第12序列资料(i) 序列特征(A)长度1168碱基对(B)类型核酸(C)链数单链(D)构象线性(ii) 分子型式cDNA(iii)假设无(iv) 反义链无(v) 片段类型内片段(vi) 来源(A)有机体人(xi) 序列描述第12序列CTGTGACTGG TGCTGGAGTT TTGAGTCCAC AGATAAAATG TGTCTCCTTC GTCTCTACTA60GAGAGGAAAA AGAACTGGAA TTGGAAGAAC AGGGAGACTG AAGGGTAGCA AGAGAGGCTG120GAGAAGAGAG TGAAAAGACC GCTTACCTGA TTTGAAATTG TCTGCAGCCC CTCTTTCCTG180GAGTAAATGA ACTGGACCAA ATCTCAAAAA TCCACGATGT CATCGGCACA CCCGCTCAGA240AGATCCTCAC CAAGTTCAAA CAGTCGAGAG CTATGAATTT TGATTTTCCT TTTAAAAAGG300GATCAGGAAT ACCTCTACTA ACAACCAATT TGTCCCCACA ATGCCTCTCC CTCCTGCACG360CAATGGTGGC CTATGATCCC GATGAGAGAA TCGCCGCCCA CCAGGCCCTG CAGCACCCCT420ACTTCCAAGA ACAGAGAAAC AGTCCCTAAA GCAAGAGGAG GACCGTCCCA AGAGACGAGG480ACCGGCCTAT GTCATGGAAC TGCCCAAACT AAAGCTTTCG GGAGTGGTCA GACTGTCGTC540TTACTCCAGC CCCACGCTGC AGTCCGTGCT TGGATCTGGA ACAAATGGAA GAGTGCCGGT600GCTGAGACCC TTGAAGTGCA TCCCTGCGAG CAAGAAGACA GATCCGCAGA AGGACCTTAA660GCCTGCCCCG CAGCAGTGTC GCCTGCCCAC CATAGTGCGG AAAGGCGGAA GATAACTGAG720CAGCACCGTC GTCTCGACTT CGGAGGCAAC ACCAAGCCCG ACCGGGCCAG 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1.一种被分离的多肽，它包括SEQ.ID.NO.40的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的被分离的多肽，其中所述的被分离的多肽包括SEQ.ID.NO.43的氨基酸序列。
3.根据权利要求1所述的被分离的多肽，其中所述的被分离的多肽包括实质上由SEQ.ID.NO.40和SEQ.ID.NO.43所组成的一组中所选择的氨基酸序列。
4.根据权利要求1所述的被分离的多肽，其中所述的被分离的多肽包括由SEQ.ID.NO.40和SEQ.ID.NO.43所组成的一组中所选择的氨基酸序列。
5.一种被分离的编码选自由权利要求1的多肽、权利要求2的多肽、权利要求3的多肽、和权利要求4的多肽所组成的组中的多肽的核酸序列。
6.根据权利要求5所述的核酸，其中所述的核酸包括SEQ.ID.NO.44。
7.一种表达载体，它包括可操作地连接有启动子的权利要求5的被分离的核酸。
8.根据权利要求7所述的表达载体，其中所述的核酸包括SEQ.ID.NO.44。
9.根据权利要求7或8所述的表达载体，还进一步包括编码HLA-B7的核酸。
10.一种被选自由权利要求7的表达载体、权利要求8的表达载体和权利要求9的表达载体所组成的组中的表达载体所转染的或转化的宿主细胞。
11.一种被选自由权利要求7的表达载体、权利要求8的表达载体所组成的组中的表达载体所转染的或转化的宿主细胞，其中所述的宿主细胞表达HLA-B7。
12.一种用于检测肿瘤排斥抗原前体表达的试剂盒，该试剂盒包括第一引物，是选自SEQ.ID.NO.50-57中任何一个的核酸，和第二引物，是按照与第一引物一起选择性地扩增ORF2中的RAGE1基因特征部分而构建和安排的。
13.一种用对RAGE肿瘤排斥抗原为特异性细胞溶解性的T细胞来选择性地增加T细胞数量的方法，该方法包括对被分离的一群T细胞用呈现RAGE肿瘤排斥抗原和HLA呈现分子的复合物的试剂接触，所使用的数量是足以对所述被分离的T细胞群用所述的细胞溶解T细胞进行选择性地扩增。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述的HLA呈现分子是HLA-B7并且所述的RAGE肿瘤排斥抗原选自下组含有SEQ.ID.NO.40的氨基酸的多肽和含有SEQ.ID.NO.43的氨基酸的多肽。
15.一种诊断特征为RAGE肿瘤排斥抗原肽的表达的紊乱的方法，该方法包括将患者的生物学样品与对RAGE肿瘤排斥抗原肽为特异性的试剂相接触，和确定该试剂与RAGE肿瘤排斥抗原肽的相互作用，从而确定该紊乱。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述的肽选自下组含有SEQ.ID.NO.40的氨基酸的肽和含有SEQ.ID.NO.43的氨基酸的肽。
17.一种诊断特征为与HLA-B7分子形成复合物的RAGE肿瘤排斥抗原肽的紊乱的方法，该方法包括将患者的生物学样品与结合该复合物的试剂相接触；和确定该复合物与该试剂的结合作为对该紊乱的确定。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述的肽选自下组含有SEQ.ID.NO.40的氨基酸的肽和含有SEQ.ID.NO.43的氨基酸的肽。
19.一种治疗特征为RAGE肿瘤排斥抗原表达的紊乱的方法，该方法包括给患者施以足够改变所述紊乱的剂量的能够选择性地增加HLA-B7与RAGE肿瘤排斥抗原的复合物数量的试剂。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述的肿瘤排斥抗原选自下组含有SEQ.ID.NO.40的氨基酸的肽和含有SEQ.ID.NO.43的氨基酸的肽。
21.一种治疗患有特征为RAGE肿瘤排斥抗原表达的紊乱的患者方法，该方法包括给患者施以足够减缓所述紊乱的剂量的细胞溶解性T细胞，该细胞溶解性T细胞具有对HLA-B7分子和RAGE肿瘤排斥抗原的复合物的特异性。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述RAGE肿瘤排斥抗原选自下组含有含有SEQ.ID.NO.40的氨基酸的肽和含有SEQ.ID.NO.43的氨基酸的肽。
23.一种被分离的核酸分子，它(a)可以在严紧条件下杂化选自SEQ.ID.NO.1、 SEQ.ID.NO.4、 SEQ.ID.NO.6、SEQ.ID.NO.10、 SEQ.ID.NO.12、 SEQ.ID.NO.13、SEQ.ID.NO.14、 SEQ.ID.NO.15、 SEQ.ID.NO.17、SEQ.ID.NO.23、和/或SEQ.ID.NO.35的编码肿瘤排斥抗原前体的分子，条件是该被分离的核酸分子不对MAGE、GAGE、BAGE肿瘤排斥抗原前体进行编码；并且(b)与(a)中的核酸分子由于遗传密码的简并性而在密码子序列上不同的核酸分子相杂化。
24.根据权利要求23所述的被分离的核酸分子，其中所述的被分离的核酸是cDNA分子或mRNA分子。
25.根据权利要求23所述的被分离的核酸分子，其中所述的被分离的核酸分子编码由SEQ.ID.NO.1、SEQ.ID.NO.12、SEQ.ID.NO.13和/或SEQ.ID.NO.14组成的的一组中所选的一个所编码的肿瘤排斥抗原前体。
26.根据权利要求23所述的被分离的核酸分子，其中所述的被分离的核酸分子包括对选自SEQ.ID.NO.1的204-326、SEQ.ID.NO.1的313-399、SEQ.ID.NO.1的444-665、SEQ.ID.NO.12的273-449、SEQ.ID.NO.12的217-276、SEQ.ID.NO.13的185-247、和/或SEQ.ID.NO.14的269-832的核苷酸为互补的核酸分子。
27.一种被分离的核酸分子，它包括选自以SEQ.ID.NO.1、SEQ.ID.NO.4、 SEQ.ID.NO.6、 SEQ.ID.NO.10、SEQ.ID.NO.12、SEQ.ID.NO.13、SEQ.ID.NO.14、SEQ.ID.NO.15、SEQ.ID.NO.17、SEQ.ID.NO.23、SEQ.ID.NO.35、和/或SEQ.ID.NO.45所组成的一组中的所选的核苷酸序列。
28.一种表达载体，它含有可操作地连接有启动子的根据权利要求23、24、25、26或27所述的被分离的核酸分子。
29.一种以权利要求28所述的表达载体所转染的或所转化的宿主细胞。
30.一种被分离的核酸，它含有以SEQ.ID.NO.1、SEQ.ID.NO.12、SEQ.ID.NO.13、SEQ.ID.NO.14、SEQ.ID.NO.1的互补物、SEQ.ID.NO.12的互补物、SEQ.ID.NO.13的互补物、和/或SEQ.ID.NO.14的互补物所组成的一组中所选择的独特的序列片段。
31.根据权利要求30所述的被分离的核酸，其中所述的片段的长度在200-2050核苷酸之间。
32.根据权利要求30所述的被分离的核酸，其中所述的片段是长度为12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31和/或32个核苷酸。
33.一种检测肿瘤排斥抗原前体存在的试剂盒，它包括一对为选择性地扩增权利要求23的被分离的核酸分子而构建和安排的被分离的核酸分子。
34.根据权利要求33所述的试剂盒，其中所述一对被分离的核酸分子是PCR引物。
35.一种由权利要求23、24、25、26或27的核酸分子所编码的被分离的肿瘤排斥抗原前体。
36.一种诊断特征为RAGE肿瘤排斥抗原前体的表达的紊乱的方法，其中所述的抗原前体被加工为RAGE衍生的肿瘤排斥抗原并与HLA分子组成复合物，该方法包括将患者的生物学样品与结合所述复合物的试剂相接触；和确定所述复合物与所述试剂的结合来确定所述的紊乱。
37.一种诊断特征为由一种核酸所编码的RAGE肿瘤排斥抗原前体的表达的紊乱的方法，该方法包括将患者的生物学样品与对所述核酸或其表达产物为特异性的试剂相接触，其中，所述的核酸可以在严紧条件下杂化选自SEQ.ID.NO.1、SEQ.ID.NO.4、SEQ.ID.NO.6、SEQ.ID.NO.10、SEQ.ID.NO.12、SEQ.ID.NO.13、SEQ.ID.NO.14、SEQ.ID.NO.15、SEQ.ID.NO.17、SEQ.ID.NO.23、和/或SEQ.ID.NO.35的编码肿瘤排斥抗原前体的分子，条件是该被分离的核酸分子不对MAGE、GAGE、BAGE肿瘤排斥抗原前体进行编码；以及确定所述的试剂和所述的核酸或所述的表达产物的相互作用来确定所述的紊乱。
38.根据权利要求37所述的方法，其中所述的核酸分子选自由SEQ.ID.NO.1、SEQ.ID.NO.12、SEQ.ID.NO.13、SEQ.ID.NO.14、SEQ.ID.NO.1的独特片段、SEQ.ID.NO.12的独特片段、SEQ.ID.NO.13的独特片段、和SEQ.ID.NO.14的独特片段所组成的一组分子。
39.一种治疗患有特征为RAGE肿瘤排斥抗原前体的表达的紊乱的患者的方法，该方法包括给所述患者足以减缓所述紊乱的剂量的试剂，该试剂选择性地增加由权利要求23、24、25、26或27所述的分子编码的肿瘤排斥抗原前体所衍生的肿瘤排斥抗原和HLA的复合物。
40.一种治疗患有特征为RAGE肿瘤排斥抗原前体的表达的紊乱的患者的方法，该方法包括给所述患者足以减缓所述紊乱的剂量的自体细胞溶解性T细胞，该细胞溶解性T细胞对由权利要求23、24、25、26或27所述的分子编码的肿瘤排斥抗原前体所衍生的肿瘤排斥抗原和HLA分子的复合物为特异性的。
全文摘要
本发明涉及RAGE肿瘤排斥抗原前体,包括编码这些肿瘤排斥抗原前体的核酸,肿瘤排斥抗原肽或其前体,以及相关的抗体。对以RAGE肿瘤排斥抗原前体的表达为特征的状态的诊断和治疗都提供了相应的方法和物质。
文档编号C12Q1/68GK1179180SQ96192650
公开日1998年4月15日 申请日期1996年3月21日 优先权日1996年3月21日
发明者比崔西·高格勒, 本罗依特·温登因德, 彼得·司科瑞尔, 拿沙利·布劳温斯汀, 梯尔瑞·布恩-法莱尔 申请人:路德维格癌症研究所, 莱顿大学