专利名称：乳房链球菌的camp因子的制作方法
技术领域：
本发明主要涉及细菌抗原。更特别地，本发明是关于乳房链球菌(S.uberis)CAMP因子的重组生产和CAMP因子在疫苗组合物中的应用。
乳房链球菌是奶牛乳腺炎的重要病因，并与约20％的所有乳腺炎临床病例有关(Bramley，A.J.和Dodd，F.H.(1984)乳品研究杂志(J.Dairy Res.)51481-512；Bramley，A.J.(1987)动物健康营养(Animal HealthNutrition)4212-16；Watts，J.L.(1988)乳品科学杂志(J.Dairy Sci.)711616-1624)。因为在治疗乳房链球菌乳腺炎中抗菌剂治疗基本无效，控制方法的发展必须以对参与攻击和保护乳腺的毒力因子和保护性抗原的了解为基础(Collins等(1988)乳品研究杂志5525-32；Leigh等(1990)兽医科学研究(Res.Vet.Sci.)4985-87；Marshall等(1986)乳品研究杂志53507-514)。
已知一些乳房链球菌株可产生透明质酸囊(Hill，A.W.(1988)兽医科学研究45400-404)，透明质酸酶(Schaufuss等(1989)Zentralbl.Bakteriol.Ser.A27146-53)，类R蛋白(Groschup，M.H.和Timoney，J.F.(1993)兽医科学研究54124-126)，和共溶血素，即CAMP因子，也被称为UBERIS因子(Skalka，B.和Smola，J.(1981)Zentralbl.Bakteriol.Ser.A 249190-194)。但是对他们的致病作用知之甚少。
CAMP因子的作用首先由Christie等在1944年所描述(Christie等(1944)澳大利亚实验生物医学科学杂志(Aus.J.Exp.Biol.Med.Sci.)22197-200)。这些作者发现B组链球菌(GBS)如无乳链球菌，当生长在金黄色葡萄球菌β-毒素(鞘磷脂酶)扩散带旁时，产生完全溶血的明显带，这种现象称为CAMP反应并且该反应中的化合物被称为CAMP因子，它是一种分子量为23,500Da的胞外蛋白(Bernheimer等(1979)感染免疫(Infect.Immun.)23838-844)。随后从如无乳链球菌中纯化了CAMP因子，被鉴定为25,000Da蛋白质，等电点(PI)为8.9(Jurgens等(1985)色谱学杂志(J.Chrom.)348363-370)。无乳链球菌CAMP因子的氨基酸序列由Ruhlmann等测定(Ruhlmann等(1988)FEBS Lett 235262-266)。
CAMP反应的机制已有描述。见如，Bernheimer等(1979)感染免疫23838-844；Sterzik等在Alouf等编著的《细菌蛋白质毒素》一书中的“来自无乳链球菌的CAMP因子与人工膜的相互作用”，伦敦学术出版公司，1984；195-196；Sterzik等(1985)Zentralbl.Bakteriol.Mikrrobiol.HYG.Abt.1 Suppl.15101-108；Fehrenbach等在Fehrenbach等编著的《细菌蛋白质毒素》一书中的“CAMP-因子在毒力上的作用”，StuttgartGustavFischer Verlag，1988；351-357；Fehrenbach等在Alouf等编著的《细菌蛋白质毒素》一书中的“两亲性细菌多聚肽与人工膜的相互作用”，伦敦学术出版公司，1984；317-324。
CAMP因子对各种靶细胞包括绵羊和牛红细胞及其中膜磷脂和鞘磷脂已由磷脂酶和鞘磷脂酶水解的人工膜有裂解活性。
CAMP因子在致病性中的作用还不清楚。部分纯化的来自无乳链球菌的CAMP因子静脉内注射兔子显示出致死性(Skalka，B.和Smola，J.(1981)Zentralbl.Bakteriol.Ser.A 249190-194)。而且，小鼠腹腔内注射纯化的CAMP因子显著地提高了亚致死剂量的B组链球菌的致病性(Fehrenbach等“CAMP-因子(蛋白B)在毒力上的作用，”收在Fehrenbach等编著的《细菌蛋白质毒素》一书中，StuttgartGustav Fischerverlag，1988；351-357)。另外，与金黄色葡萄球菌的蛋白A一样，GBS CAMP因子可以结合在免疫球蛋白的Fc段并因此被称为蛋白B(Jürgens等(1987)实验医学杂志(J.Exp.Med.)165720-732)。
除了GBS和乳房链球菌，其他细菌，包括单核细胞增生李斯特菌和斯氏李斯特菌(Rocourt，J.和Grimont，P.A.D.(1983)Int.J.Syst.Bacteriol.33866-869)、气单胞菌属菌种(Figura，N.和Guglielmetti，P.(1987)临床微生物学杂志(J.Clin.Microbiol)251341-1342)、马红球菌(Fraser，G.自然(Nature)189246)和某些弧菌属菌种(Kohler，W.(1988)Zentralbl.Bakteriol.Mikrrobiol.HYG.Ser.A 27035-40)都产生与CAMP效应相似的反应。
GBS和胸膜肺炎气单胞菌(A.pleuropneumoniae)的CAMP因子基因已在大肠杆菌中克隆和表达(Frey等(1989)感染免疫572050-2056；Schneewind等(1988)感染免疫562174-2179)。
但是直到现在，乳房链球菌的CAMP因子基因还未被克隆。更进一步，CAMP因子的保护力在以前还未被研究过。
本发明以乳房链球菌CAMP因子基因及CAMP因子能保护脊椎动物主体免于感染的发现为基础。CAMP因子、其活性免疫原性的片段、其活性类似物或包括相同组份的嵌合蛋白可以单独或与其他抗原组合用于可提供使脊椎动物主体免于细菌感染的保护的新的亚单位疫苗。
因此，在一实施方案中，本发明涉及一个含有免疫原性的乳房链球菌CAMP因子编码序列的分离的核酸分子。在另外的实施方案中，本发明涉及包含该核酸分子的重组载体、这些载体转染的宿主细胞和重组产生乳房链球菌CAMP因子的方法。
在另一实施方案中，本发明还涉及含有药学适用载体和一种免疫原性的CAMP因子的疫苗组合物。在特别优选的实施方案中，CAMP因子是一种链球菌CAMP因子。
在其他的实施方案中，本发明还涉及治疗和预防主体中细菌感染的方法，包括链球菌感染和乳腺炎，包括将治疗有效量的上述疫苗组合物施用于该主体。
在另外的实施方案中，本发明涉及生产疫苗组合物的方法，包括(a)提供至少一种免疫原性的CAMP因子；和(b)将免疫原性的CAMP因子与药学适用载体组合。
根据文中阐述，本发明的这些和其他实施方案将容易地由本领域普通技术人员实现。
图1描绘了重组质粒pJLD21及其亚克隆(命名为pJLD21-1和pJLD21-2)的限制酶切图谱。线代表乳房链球菌的插入DNA，盒子代表载体pTZ18R的多克隆位点。重组质粒pJLD21及其衍生亚克隆的CAMP活性在右侧显示(+，CAMP反应阳性；-，CAMP反应阴性)。小水平箭头代表测序实验的起始位点和方向。DNA印迹实验用的探针片段由大箭头表示。底部的阴影盒子代表乳房链球菌(cfu)CAMP因子基因的开放读码框架。
图2显示了应用乳房链球菌和重组大肠杆菌克隆的CAMP反应的结果。如材料和方法下的实验部分所述，在2#基础血平板上进行CAMP反应。竖直条S，金黄色葡萄球菌。水平条1，乳房链球菌；2，大肠杆菌pJF1754(pTZ18R)(阴性对照)3，大肠杆菌pJF1754(pJLD21)(CAMP-阳性重组体)4，大肠杆菌pJF1754(pJLD21-2)(CAMP-阳性亚克隆)。
图3A和3B代表乳房链球菌和无乳链球菌CAMP因子各自的SDS-PAGE和免疫印迹实验。图3A显示了考马氏亮蓝染色的12％聚丙稀酰胺-SDS胶。泳道1，部分纯化的乳房链球菌CAMP因子；泳道2，大肠杆菌pJF1754(pJLD21)的上清液(CAMP阳性)；泳道3，大肠杆菌pJF1754(pTZ18R)的上清液(阴性对照)；泳道4，无乳链球菌的上清液；泳道MW，预染的分子量标准。图左的数据显示了分子量标记的位置(以千计)。图3B显示图3A的胶的免疫印迹。样品转移到硝基纤维素膜上与鼠的抗纯化的乳房链球菌CAMP因子抗血清反应。
图4A-4C(SEQ ID NO＿)显示乳房链球菌CAMP因子基因的核苷酸序列及其启动子区域。+1代表转录的起始位点，启动子的-10和-35区域用下划线表示。推定的S-D序列显示为SD。推定的乳房链球菌CAMP因子的氨基酸序列用三字母密码显示在核苷酸序列的下方。信号肽和成熟肽被特别指明。
图5显示乳房链球菌CAMP因子基因启动子区域的引物延伸分析。如实施例中所述进行引物延伸反应。使用的细胞RNA来自乳房链球菌(泳道1)、大肠杆菌pJF1754(pJLD21)(泳道2)和大肠杆菌pJF1754(pTZ18R)(泳道3)。双脱氧测序序列梯利用相同的引物产生并在每条泳道上显示为T、G、C、A。
图6(SEQ ID NO＿)显示乳房链球菌CAMP因子(上线，称为“SUCAMP”)和无乳链球菌因子(下线，称为“SAGCAMP”)之间的比较。氨基酸以单字母密码标出。相同的氨基酸以双点标出()。对比的序列显示66.4％的一致性。序列中引入空区(用破折号标出)使排列对比最佳化。
图7显示不同乳房链球菌株的DNA印迹分析。所用探针的来源如图1所示；来自每株乳房链球菌的染色体DNA用HindIII酶切。泳道1、2、3和4是分别来自ATCC株9927、13386、13387和19436的DNA样品；泳道5、6、7和8是来自土壤分离株的DNA样品。右边的箭头表明了杂交的限制性酶切片段的位置和长度。每株的CAMP反应表型用“+”(CAMP反应阳性)和“-”(CAMP反应阴性)在底部被标出。
图8描绘了pGH-CAMP的结构。每个质粒来源克隆的CAMP反应显示在图右侧；+代表阳性反应，-代表阴性反应。空盒子代表pTZ18R，斜线盒子代表pGH433。
本发明的实施将采用(除非另有声明)分子生物学、微生物学、病毒学、重组DNA技术和免疫学中的常规技术，这些技术都在本领域技术人员的技术范围之内。这些技术可用文字完全解释。见如，Sambrook，Fritsch&Maniatis，分子克隆实验指南，第二版(1989)；DNA克隆，I和II卷(D.N.Glover编著1985)；寡核苷酸合成(M.J.Gait编著1984)；核酸杂交(B.D.Hames&S.J.Higgins编著1984)；动物细胞培养(R.K.Freshney编著1986)；固定化细胞和酶(IRL出版社，1986)；Perbal，B.，分子克隆实践指南(1984)；系列丛书《酶学方法》(S.Coloweik和N.Kaplan编著，学术出版社)；和实验免疫学手册，I-IV卷(D.M.Weir和C.C.Blackwell编著，1986，Blackwell科学出版社)。A.定义在本发明的描述中将采用下列术语，并打算如下文所述定义下列术语。
必须声明的是，除非文中明确声明，如本说明书及附加的权利要求中所用的，单数形式的“一个””、“一种””和“这种”包括多数所述事物。因此，如“一种CAMP因子”的提法包括两种或多种CAMP因子的混合物，依此类推。
词条“CAMP因子”或编码它的核苷酸序列，分别指的是衍生自各种细菌物种中所发现的CAMP因子基因的蛋白质或核苷酸序列，包括但并不限于乳房链球菌、B组链球菌(GBS)如无乳链球菌(Jurgens等(1985)色谱学杂志348363-370；和Ruhlmann等(1988)FEBS Lett 235262-266)、单核细胞增生李斯特菌和斯氏李斯特菌(Rocourt，J.和Grimont，P.A.D.(1983)Int.J.Syst.Bacteriol.33866-869)、气单胞菌属菌种(Figura，N.和Guglielmetti，P.(1987)临床微生物学杂志251341-1342)、马红球菌(Fraser，G.自然189246)和某些弧菌属菌种(Kohler，W.(1988)Zentralbl.Bakteriol.Mikrrobiol.HYG.Ser.A 27035-40)。
一个来自乳房链球菌代表性的CAMP因子基因存在于质粒pJLD21中，并如在图4A-4C所示(SEQ ID NO＿)。
衍生的蛋白质或核苷酸序列不必从上文所述的基因中自然得到，还可通过各种方式产生，包括如根据本文所提供的资料化学合成、分离(如，从产生CAMP因子的生物中得到)或通过重组方法产生。而且，该词条是指具有与该基因编码的连续氨基酸序列基本同源的氨基酸序列且显示免疫学活性的蛋白。因此，该词条包括全长的以及免疫原性的截短的部分序列，及该蛋白质的活性类似物和前体形式，如那些包括信号肽序列的形式，这将在下文详细描述。
本词条也包括中性形式或碱或酸加成盐形式的蛋白质，这取决于制备方式。这些酸加成盐可包括游离氨基基团，也可形成带有游离羧基的碱盐。药学适用的碱盐和酸加成盐下文将进一步讨论。另外，蛋白质可通过结合其他生物学材料而被修饰，如脂类(那些与蛋白质自然结合的或不破坏免疫学活性的其他脂类)和糖类，或通过侧链基团修饰，如氨基的乙酰化、羟基侧链的磷酸化、巯基的氧化、氨基酸残基的糖基化，以及对所编码的原始序列的其他修饰。
因此本词条包括序列的缺失、插入和取代，只要该多肽仍具有产生前文所规定的免疫学活性的功能。在此方面，特别优选的取代将是本质上保守的，例如，那些发生在一个氨基酸家族内的取代。例如，氨基酸主要分成四个家族(1)酸性的--天冬氨酸、谷氨酸；(2)碱性的--赖氨酸、精氨酸、组氨酸(3)非极性的--丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸；和(4)不带电荷的极性氨基酸--甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸。苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸有时被分类为芳香族氨基酸。例如可预测单独地用异亮氨酸或缬氨酸取代亮氨酸(反之亦然)；用谷氨酸取代天冬氨酸(反之亦然)；用丝氨酸取代苏氨酸(反之亦然)；或用结构相关的氨基酸进行相似的保守性的取代，对其生物学活性无重大影响。因而具有与所述分子基本相同的氨基酸序列，但有基本不影响蛋白质免疫原性的微小氨基酸取代的蛋白质都包括在所述多肽的定义范围之内。
词条“链球菌CAMP因子”指来自产生所述因子的链球菌菌株(包括乳房链球菌和GBS如无乳链球菌)的如上文所定义的CAMP因子。“乳房链球菌CAMP因子”是来自乳房链球菌的如上文所定义的CAMP因子。
“乳腺炎”意味着哺乳动物乳腺的发炎，包括奶牛、母羊、山羊、母猪、母马等，其由产生CAMP因子的各种细菌所引起，在下文中将完整描述。感染表现为乳腺中吞噬细胞的浸润。一般来说，发现有四个临床类型的乳腺炎(1)极急性，乳腺肿胀、发热、疼痛、和异常分泌并伴随着发热和系统性失调的其他症状，如明显的抑郁，脉搏快而微弱，眼睛内陷，虚弱和完全厌食；(2)急性，乳腺的变化和上述相似，但发热、厌食和抑郁为轻度到中度；(3)亚急性，未显示系统性的变化，乳腺的改变及异常分泌较不明显；和(4)亚临床性，只有通过针对乳腺炎的常规检查才检查到炎症反应。
检测乳腺炎的常规检查包括但不仅局限于加利福尼亚乳腺炎检查，威斯康星乳腺炎检查，Nagase乳腺炎检查，电子细胞计数和用来检测奶中持续的高白细胞数的体细胞计数。一般，奶中体细胞计数约为300,000--500,000个细胞/ml，表明有感染。因此，当例如奶中体细胞计数保持低于约500,000个细胞/ml时，疫苗被认为治疗和/或预防乳腺炎有效。关于乳腺炎的论述和其诊断，见，如Merck兽医手册《兽类疾病的诊断、治疗及预防和控制手册》，Merck公司，Rahway，New Jersey，1991。
一个“分离的”核酸分子是指与分子天然存在的完整生物分离和不连续的核酸分子；或不含全部或部分的天然与之相连的序列的核酸分子；或天然存在的但有与其相连的异源序列(如下所述)的序列。
词条“表位”指抗原或半抗原上的位点，针对该位点有特异的B细胞和T细胞应答。该词条也可以与“抗原决定簇”或“抗原决定簇位点”互换使用。识别同一个表位的抗体可以通过显示一个抗体封阻另一个抗体靶抗原结合位点的能力的简单免疫实验来鉴定。
针对一组合物或疫苗的“免疫应答”指在宿主中产生针对目的组合物或疫苗的细胞和/或抗体介导的免疫应答。通常情况下，一个“免疫应答”包括但不局限于一个或多个以下的效应产生特异性地针对包括在目的组合物和疫苗中的一个或多个抗原的抗体、B细胞、辅助T细胞、抑制T细胞、和/或细胞毒T细胞、和/或γδT细胞。优选宿主显示针对CAMP因子的保护性免疫应答，如，宿主将被保护免于随后的病原体的感染，并且该保护可通过减少或缺乏感染宿主一般所表现的症状或者较快的恢复时间加以证实。
词条“免疫原性”蛋白质或多肽指诱导出如上文所述的免疫应答的氨基酸序列。本文中所用的“免疫原性”蛋白质或多肽包括所述CAMP因子的全长序列，其中包括其前体和成熟的形式及类似物或其免疫原性片段。“免疫原性片段”是指含有一个或多个表位并因此能诱导出如上所述的免疫应答的CAMP因子的片段。该片段可以通过如下方法进行鉴别，如，在固相支持物上同时合成大量的多肽，这些多肽与蛋白质分子的部分相一致，并且当这些多肽仍附着在固相支持物上时多肽与抗体发生反应。这些技术为本领域已知并描述于，如，美国专利号4,708,871；Geysen等(1984)美国国家科学院院报(Proc.Natl.Acad，Sci，USA)813998-4002；Geysen等(1986)分子免疫学23709-715。
针对本发明目的免疫原性片段，通常约有至少两个氨基酸长度，更优选约五个氨基酸长度，最优选至少约10-15个氨基酸长度。片段的长度无严格的上限，它可以含有几乎蛋白质序列的全长，或者甚至含有两个或多个CAMP因子或所述因子的表位的融合蛋白。
“重组”多肽指由重组DNA技术产生的多肽；即，由编码所需多肽的外源DNA结构转化的细胞产生的多肽。“合成的”多肽是那些通过化学合成制备的多肽。
“载体”是一个复制子，例如一个质粒、噬菌体、或粘粒，另外的DNA片段可以连接到该载体上以便使连接片段进行复制。
特定蛋白的DNA“编码序列”或“编码它的核苷酸序列”，指一个当置于合适的调控元件的调控下时，在体内或体外转录和翻译成一个多肽的DNA序列。编码序列的界限由5’(氨基)末端的起始密码子和3’(羧基)末端翻译终止密码子所决定。一个编码序列可以包括，但并不局限于，原核序列、来自真核mRNA的cDNA、真核DNA基因组DNA序列(如，哺乳动物DNA)、和甚至是合成的DNA序列。转录终止序列通常位于编码序列的3’端。
DNA“调控元件”统指启动子、核糖体结合位点、聚腺苷酸信号、转录终止序列、上游调节区、增强子、和其他类似物，在宿主细胞中这些元件共同保证一个编码序列转录和翻译。只要所需基因能够被转录和翻译，并非所有这些调控元件需要总存在于一个重组载体中。
“可操作地连接”指元件的排列，其中所述成分的排列可使其执行它们的常规功能。因此，可操作地连接在编码序列的调控元件能够影响编码序列的表达。调控元件不必紧连编码序列，只要他们可执行指导其表达的功能即可。所以，例如，在启动子和编码序列之间可以插入不翻译的但可转录的序列，启动子仍被认为是与编码序列“可操作地连接的”。
相似地，一个编码序列被“可操作地连接在”另一个编码序列上(即，在嵌合蛋白的情况下)，即RNA聚合酶将这两个编码序列转录成mRNA，接着翻译成由这两个编码序列编码的多肽。编码序列不必紧连于另一个编码序列，只要使转录序列最终被加工而产生所需蛋白质即可。
一个调控元件，例如一个启动子，在细胞内对编码序列“指导转录”，即RNA聚合酶结合在启动子上并将编码序列转录成mRNA，紧接着mRNA翻译成编码序列编码的多肽。
“宿主细胞”是被外源核酸分子转化的细胞，或是能被其转化的细胞。
当外源DNA被引入细胞膜内时，该细胞就已被外源DNA“转化”。外源DNA可能或可能不被整合(共价连接的)进组成细胞基因组的染色体DNA中。在原核细胞和酵母中，例如，外源的DNA可能维持附加体形式，如质粒。而对于真核细胞，一个稳定的转化细胞是外源DNA已整合进染色体因而可以通过染色体复制将外源DNA遗传给子代细胞的细胞，真核细胞可建立由含有外源DNA的大量的子代细胞所组成的细胞系或克隆的能力证明了这种稳定性。
“同源性”指在两个多核苷酸或两个多肽部分之间一致性的百分率。一部分和另一部分序列之间的对应性可以用本领域已知的技术来测定。例如，通过两个多肽分子序列信息的排列比较并利用易于得到的计算机程序(如ALIGN，Dayhoff，M.O.(1978)《蛋白质序列和结构图集》5补3，国立生物医学研究基金会，华盛顿特区)来测定其同源性。
另外，可通过多聚核苷酸在一定的条件下同源区域间形成稳定双螺旋而杂交，然后用单链特异性的核酸酶进行消化，确定消化后片段的大小来确定同源性。当如上述方法测定在分子的限定长度上核苷酸或氨基酸分子中至少约80％，优选至少约90％，最优选至少约95％相匹配时，两个DNA或两个多肽序列是彼此“基本同源的”。在本文中，基本同源也指与特异的DNA或多肽序列显示同一性的序列。基本同源的DNA序列的可通过如特定系统所规定的严紧性条件下的DNA杂交实验来确定。确定适当的杂交条件在本领域技术人员的技术范围内。见，如，Sambrook等，同上；DNA克隆I&II卷，同上；核酸杂交，同上。
词条“功能相当的”指当与由所述CAMP因子的成熟序列或其免疫原性部分的一致性CAMP因子所诱导的应答相比较时，可诱导一个基本相当的或增强的如上文所规定的免疫应答的CAMP因子氨基酸序列。
DNA结构的“异源”区域是位于天然并未与其相连的另一DNA分子之中或与其相连的一种可鉴别的片段。因此，当该异源区域编码一个细菌基因时，这个基因的侧翼通常为在来源细菌基因组中该细菌基因侧翼所没有的DNA。异源编码序列的另一个例子是一个编码序列本身天然并不存在的结构(如，具有与亲本基因不同的密码子的合成序列)。等位基因突变或自然发生的突变事件并不构成本文所用的DNA异源区段。
本文所用的词条“治疗”指(i)防止感染或再感染(预防)，或(ii)减少或消除有关疾病的症状(治疗)。
“脊椎动物主体”指脊索动物亚门的任何一个成员，包括但不局限于哺乳动物如牛、绵羊、猪、山羊、马和人；家养的动物如狗和猫；和鸟类，包括家养的、野生的和猎狩的鸟类如公鸡和母鸡包括雏鸡、火鸡和其他的鹑鸡类鸟；和鱼。该词条没有声明特别的年龄。因此，成年的和新生的动物，以及胎儿都包括在内。B.一般方法本发明的中心内容是发现了CAMP因子在脊椎动物主体中能诱导保护性的免疫应答。乳房链球菌CAMP因子的基因已被分离和鉴定，并且因此编码的CAMP因子已被测序。乳房链球菌CAMP因子基因的蛋白质产物已显示能保护家畜免于随后的乳房链球菌的攻击。
特别是，乳房链球菌CAMP因子全部的DNA序列显示在图4A-4C中(SEQ ID NO＿)。发现CAMP因子基因的主要转录本在碱基“A”处开始(在图4中描绘在+1位置)。在如在图4中所示的转录起始位点的上游发现-10和-35区域，大肠杆菌启动子的特征区(Harley，C.B.和Reynolds，R.P(1987)核酸研究152343-2361)。一个开放读码框架开始于位于157-159位的ATG密码子并且终止于位于925-927位的终止密码子TAA。起始密码子ATG之前有一段大肠杆菌中为核糖体结合位点的嘌呤-富含区域(Stormo等(1982)核酸研究102971-2996)。
如图4A-4C中所示，乳房链球菌CAMP因子基因编码一个约256个氨基酸的(图4A-4C中的氨基酸残基1--256，含端值)、含有一个约28个氨基酸长度N-末端信号肽序列的前蛋白。前体分子计算的分子量为28，363Da。因此成熟的乳房链球菌CAMP因子包括29-256(含端值)的氨基酸残基，如图4A-4C中所示。如下文进一步的讨论，CAMP因子基因编码信号序列的部分可包括在编码CAMP因子的构建物中，以在表达过程中指导CAMP因子的分泌。另外，CAMP因子的信号序列和编码信号序列的核酸序列可用于异源蛋白质和核酸分子，以指导它们的分泌。
如图6所示(SEQ ID NO＿)，无乳链球菌CAMP因子的226个氨基酸序列和乳房链球菌推定的256个氨基酸序列的排列对比表明66.4％的氨基酸残基是一致的。另外，针对纯化的乳房链球菌CAMP因子产生的抗体与无乳链球菌的蛋白B有交叉反应。如实施例中所示，当在大肠杆菌中重组表达产生时，乳房链球菌CAMP因子是被分泌的。
精确的定位和CAMP因子基因序列的体外突变研究可估计CAMP蛋白不同结构域的功能。同样，本发明的资料允许通过基因取代和其他分子技术得到稳定的CAMP因子合成缺陷突变体。乳房链球菌的亲本株和突变株在动物中的毒力的比较提供了关于该CAMP因子在表达CAMP因子细菌的致病性中的作用的重要信息。
CAMP因子、其免疫原性片段或包含相同组份的嵌合蛋白可包含在亚单位疫苗组合物中，该蛋白质及其抗体可以用作检测脊椎动物主体中的感染的诊断试剂。相似地，编码蛋白质的基因可被克隆并用于设计探针来检测和分离其他细菌株中的同源基因。
本发明的疫苗组合物可用于治疗或预防多种细菌在脊椎动物主体中的感染。例如，包括乳房链球菌和/或B组链球菌(GBS)(如无乳链球菌)来源的CAMP因子的疫苗组合物，可用于治疗脊椎动物中由这些细菌引起的链球菌感染。特别是，乳房链球菌和无乳链球菌是牛、马、羊和山羊乳腺炎的共同细菌病原体。另外，B组链球菌，如无乳链球菌，已知可引起脊椎动物中大量的其他感染，包括败血症、脑膜炎、菌血症、脓疱病、关节炎、尿道感染、脓肿、自发流产等。因此，含有链球菌CAMP因子的疫苗组合物将可用于治疗和/或预防广泛的链球菌感染。
相似地，来自单核细胞增生李斯特菌和斯氏李斯特菌、气单胞菌属菌株、马红球菌、和弧菌属菌株的CAMP因子将可用于治疗由这些菌株引起的细菌感染。例如，CAMP因子可用于预防或治疗大范围的动物和鸟类包括人类中的李斯特菌病。在反刍动物和禽类如鹅、小鸡、火鸡、鸭子、金丝雀和鹦鹉中的感染表现为脑炎和脑膜脑炎；在单胃动物、新生反刍动物和家禽中表现为败血症；和在多种动物中表现为自发流产和潜伏感染。气单胞菌属引起鱼类的感染，包括鲑科、水族馆中的鱼、金鱼、淡水和海水鱼；同样也感染笼养的鸟和两栖动物及爬行动物。马红球菌引起马的呼吸道感染、淋巴管炎、腹膜炎、肠炎、脓肿和自发流产。弧菌属引起许多培养的、水族馆中的和野生海洋及港湾野生鱼类的弧菌病；鲸目动物的创口的感染；和引起小鸡中禽类弧菌性肝炎和禽类感染性肝炎。
因此CAMP因子疫苗可在大量的物种中用于治疗和/或预防大量的细菌感染。
多种菌株来源的CAMP因子可单独或组合地用于本发明的的疫苗组合物中。例如，本发明的疫苗组合物中有时优选具有一种或多种CAMP因子的不止一个的表位，使得可对目标主体提供广谱的抗感染保护。在其最简单的形式中，可通过应用编码其中一种CAMP因子的完整序列的多肽，或组合编码两种或多种CAMP因子或CAMP因子的表位的序列的多肽来实现。因此疫苗组合物可包含，例如一种或多种CAMP因子的各种组合，或多个CAMP因子或甚至来自CAMP因子的多种表位的组合。
而且，本发明的疫苗组合物可包括其他细菌、真菌、病毒或原虫的抗原。这些抗原可以单独提供或由含有融合到这些抗原上的一种或多种CAMP因子的融合蛋白来提供。
CAMP因子的产生上述的CAMP因子和其活性片段、类似物和从中衍生的嵌合蛋白，可以通过多种方法产生。特别是，CAMP因子可以从表达该因子的细菌中直接分离。这一般首先通过制备缺乏细胞组分和一些胞外蛋白的粗提物来完成。接着所需蛋白可进一步纯化如，通过柱层析、HPLC、免疫吸附技术或其他本领域已熟知的常规方法。
更特别的是，分离CAMP因子的技术已在下列文献中描述，如，Skalka，B.和Smola，J.(1981)Zbl.Bakt.Hyg.，I.Abt.Orig.A249190-194；Skalka等(1980)Zbl.Vet.Med.B27559-566；Skalka等(1979)Zbl.Vet.Med.B26679-687；Bernheimei等(1979)感染免疫23838-844；Jurgens等(1985)色谱学杂志348363-370；Jurgens等(1987)实验医学杂志165720-732。
另外，如本文所述，该蛋白质可以由重组产生。如上文所解释，这些重组体可采用下述形式，部分蛋白质序列的形式、全长序列形式、包括信号序列的前体形式，没有信号序列的成熟形式、或甚至融合蛋白形式(如，融合了重组体宿主的合适先导序列，或链球菌或另一病原体的另一个亚单位抗原序列)。
本发明的CAMP因子基因可以根据蛋白质产物显示CAMP活性的能力来分离，利用如下文所示的CAMP分析实验。因此，可以构建基因文库并且所得克隆用于转化适当的宿主细胞。菌落可被汇总并筛选有CAMP活性的克隆。菌落同样可用所需抗原的多克隆血清或单克隆抗体进行筛选。
此外，一旦氨基酸序列被决定，可制备含有已确定氨基酸序列部分的密码子的寡核苷酸探针，并用于从DNA文库中筛选编码目的蛋白质的基因。制备寡核苷酸探针和DNA文库的基本策略及利用核酸杂交的筛选，都已被本领域的普通技术人员所熟知。见，如，DNA克隆卷I，同上。核酸杂交，同上；寡核苷酸合成，同上；Sambrook等，同上。一旦在筛选文库中检测到杂交阳性的克隆，它可以用限制酶切分析和DNA测序来证实该特定文库片段含有所需CAMP因子基因或其同源基因。
另外，编码所需蛋白质的DNA序列可通过合成而不是克隆来制备。可根据特别的氨基酸序列用适当的密码子设计DNA序列。一般，如果该序列将用来表达，人们将选择所用宿主惯用的密码子。通过通常方法制备的重叠寡核苷酸组合成完整的序列，并组合成一个完整的编码序列。见，如，Edge(1981)自然292756；Nambair等(1984)科学2231299；Jay等(1984)生物化学杂志2596311。
一旦所需蛋白质的编码序列已制备好或已被分离到，它们可被克隆进任何合适的载体或复制子。大量的克隆载体为本领域的技术人员所熟知，适当的克隆载体的选择只是一个选择问题。用来克隆的重组DNA载体和它们可转化的宿主细胞的实施例包括细菌噬菌体λ(大肠杆菌)、pBR322(大肠杆菌)、pACYC177(大肠杆菌)、pKT230(革兰氏阴性细菌)、pGV1106(革兰氏阴性细菌)、pLAFR1(革兰氏阴性细菌)、pME290(非大肠杆菌的革兰氏阴性细菌)、pHV14(大肠杆菌和枯草芽孢杆菌)、pBD9(芽孢杆菌)、pIJ61(链霉菌)、pUC6(链霉菌)、YIp5(酵母菌)、YCp19(酵母菌)、和牛乳头瘤病毒(哺乳动物细胞)。见，分子克隆I和II卷，同上；Sambrook等，同上；B.Perbal，同上。
该基因可置于启动子、核糖体结合位点(对细菌表达)和按需要可选择的操作子(这里统称为“调控元件”)的控制之下，使得在含有该表达结构的载体转化的宿主细胞中编码所需蛋白质的DNA序列被转录成RNA。编码序列可以含或不含有信号肽或先导序列。如果包含信号序列，它们可以是亲本的、同源的序列或异源的序列。例如，乳房链球菌CAMP因子的信号序列(如图4A所示)，可被用于多种CAMP因子的分泌，同样一些其它的信号序列也可以如此，这在本领域是熟知的。通过宿主的翻译后加工过程可以除去先导序列。见，如，美国专利号4,431,739；4,425,437；4,338,397。
还可能需要允许调节与宿主细胞的生长有关的蛋白序列表达的其他调节序列。调节序列已为本领域技术人员所熟知，实例包括响应于一个物理或化学的刺激(包括调节化合物的存在)引起基因表达的开启和关闭的那些调节序列。其他类型的调节元件也可引入载体中，例如，增强子序列。
调控序列和其他调节序列可以被连接到编码序列上，然后插入载体中，如上文所述的克隆载体。或者，编码序列可以直接被克隆进一个已含有调控序列和合适的限制酶切位点的表达载体中。
在某些情况下，编码序列可能必须被修饰以使得该序列可以合适的取向与控制序列相连；即，维持正确的读码框。有时也需要产生CAMP因子的突变体或类似物。可以通过蛋白质编码序列部分的缺失来制备突变体或类似物，也可以通过一个序列的插入，和/或通过序列中一个或多个核苷酸的取代。修饰核苷酸序列的技术，例如定点突变，被描述在，如，Sambrook等，同上；DNA克隆，卷I&II，同上；核酸杂交，同上。
该表达载体接着被用于转化一个适当的宿主细胞。本领域已知许多哺乳动物细胞系，包括可从美国典型培养物保藏中心(ATCC)获得的无限增殖细胞系，例如，但不局限于，中国仓鼠卵巢细胞(CHO)、HeLa细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、猴肾细胞(COS)、人肝癌细胞(如，Hep G2)、Madin-Dary牛肾(“MDBK”)细胞、以及其他一些细胞。相似地，细菌宿主如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、和链球菌菌种可用于本表达结构中。在本发明中有用的酵母宿主特别包括啤酒糖酵母、白色假丝酵母、麦芽糖假丝酵母、多形汉逊氏酵母、胞壁克鲁维氏酵母、乳克鲁维氏酵母、季也蒙毕赤酵母、巴斯德毕赤酵母、粟酒裂殖糖酵母和Yarrowialipolytic。用于杆状病毒表达载体的昆虫细胞特别包括埃及伊蚊、苜蓿银纹夜蛾、家蚕、黑尾果蝇、草地夜蛾、和粉纹夜蛾。
根据表达系统和所选择的宿主，本发明的蛋白质通过如上文所述的表达载体转化的宿主细胞在一定条件下培养使所需的蛋白质得到表达来获得。接着从宿主细胞中分离并纯化该蛋白质。如果表达系统能够分泌蛋白质到培养介质中，蛋白质可直接从培养基中纯化。如果蛋白质不分泌，就在细胞裂解液中分离蛋白质。合适培养条件和回收方法的选择在本领域技术人员的技术范围内。
本发明的蛋白质也可以通过化学合成而产生，例如固相肽合成，利用已知的氨基酸序列或目的基因的DNA序列得来的氨基酸序列。这些方法是本领域的技术人员已知的。如果抗原的一个小片段能够激发目标主体的免疫应答，则多肽的化学合成可能是优选的。
CAMP因子、片段、类似物和含有它们的嵌合物，可以利用几种标准实验的任一种来检测CAMP活性。例如，CAMP因子已知对多种靶细胞(包括牛和羊红细胞)显示裂解活性。因此，一个检测CAMP因子活性的简便方法即为利用羊或牛红细胞的标准溶血反应来进行。见，如，Christie等，(1944)澳大利亚实验生物医学科学杂志22197-200；Brown等，(1974)感染免疫9377-383；Darling，C.L.(1975)临床微生物学杂志1171；Wilkinsin，H.W.(1977)临床微生物学杂志642；Bernheimer等(1979)感染免疫23838-844；Skalka，B和Smola，J.(1981)Zbl.Bakt.Hyg.，I.Abt Orig A249190-194；Huser等，(1983)普通微生物学杂志(J.Gen.Microbiol.)1291295。
活性还可以通过监测对CAMP因子分解敏感的物质组成的脂质体中截留的标记分子的释放来检测。例如，CAMP因子活性可利用含[14C]标记的葡萄糖的脂质体进行监测，脂质体由如鞘磷脂、胆固醇和磷酸二(十六烷基)酯制成，并检测由于CAMP因子的分解脂质体中截留的[14C]标记的葡萄糖的释放。见，Bernheimer等(1979)感染免疫23838-844。相似地，可检测CAMP因子存在下脂质体中ATP的释放，如Sterzik等(1984)所述，“无乳链球菌的CAMP因子与人工膜的相互作用”，载于Alouf等编著的《细菌蛋白质毒素》中，伦敦学术出版公司，1984195-196；和Sterzik等(1985)Zentralbl.Bakteriol.Mikrobiol.Hyg.Abt 1 Suppl.15101-108。也见于，Fehrenbach等(1984)“两亲性的细菌多肽与人工膜的相互作用”，载于Alouf等编著的《细菌蛋白质毒素》中，伦敦学术出版公司，1984317-324。
本发明的CAMP因子或其片段可用于产生抗体，包括多克隆抗体和单克隆抗体。如果需要多克隆抗体，用本发明的抗原或其片段或突变的抗原免疫选择的哺乳动物(如，小鼠、兔子、山羊、马等)。收集免疫动物的血清并根据已知的程序进行处理。见，如，Jurgens等(1985)色谱学杂志348363-370。如果利用含有多克隆抗体的血清，可以通过免疫亲和层析按已知程序纯化多克隆抗体。
CAMP因子和其片段的单克隆抗体也可以由本领域技术人员容易地制得。利用杂交瘤技术制备单克隆抗体的一般方法是己知的。永生化产生抗体的细胞系可通过细胞融合得到，也可通过其他技术如用癌基因DNA直接转化B淋巴细胞，或用EB病毒转染。见，如，M.Schreier等，杂交瘤技术(1980)；Hammerling等，单克隆抗体和T细胞杂交瘤(1981)；Kennett等，单克隆抗体(1980)；也见于美国专利号4,341,761；4,399,121；4,427,783；4,444,887；4,452,570；4,466,917；4,472,500；4,491,632；和4,493,890。产生的一系列针对所述CAMP因子或其片段的单克隆抗体，可以根据多种特性来筛选；例如，根据同型的(Ig)、表位、亲和性等。单克隆抗体在利用免疫亲和层析技术纯化其所直接对应的单个抗原方面是有用的。多克隆抗体和单克隆抗体也可应用于被动免疫或可与亚单位疫苗制品结合来增强免疫应答。
疫苗制品和给药本发明的CAMP因子可配制在疫苗组合物中，单独或与其他抗原组合，用于按如下文所示免疫主体。制备该制品的方法如以下文献中所述，如，Remington’s药学，Mack出版公司，Easton，Pennsylvania，18版，1990。典型地，本发明的疫苗可制备成可注射制品，或溶液形式或悬液形式。也可制备适于在注射前溶于或悬于液体介质中的固体形式。该制品也可被乳化或活性成分被包裹入脂质载体中。活性免疫原性成分一般与相容性药物载体混合，例如水、盐水、右旋糖、甘油、乙醇、或其类似的物质和其组合。另外，如果需要，载体可含少量的辅助物质如润湿剂或乳化剂以及pH缓冲试剂。
增强疫苗效力的佐剂也应被加入制剂中。佐剂可包括例如胞壁酰二肽、阿维丁(avridine)、氢氧化铝、二甲基二(十八烷基)溴化铵(DDA)、油、水包油乳液、皂苷、细胞因子、和本领域已知的其他物质。
为增强其免疫原性，CAMP因子可以与一个载体相连。合适的载体包括大的代谢缓慢的大分子如蛋白质，包括血清白蛋白、槭形血蓝蛋白、免疫球蛋白分子、甲状腺球蛋白、卵清蛋白、和本领域的技术人员已熟知的其他的蛋白质；多糖，如琼脂糖凝胶、琼脂糖、纤维素、纤维素珠和其他类似物；聚合的氨基酸如聚谷氨酸、聚赖氨酸、和其他类似物；氨基酸共聚物；和失活的病毒颗粒。
CAMP因子可以其天然的形式使用或其功能基团成分被修饰，例如赖氨酸残基的琥珀酰化或与半胱氨酸-硫代内酯的反应。巯基基团也可包含在载体(或抗原)中，如通过氨基功能团与2-亚氨基硫杂环戊烷或3-(4-二硫吡啶)丙酸的N-羟基琥珀酰亚胺脂反应。适当的载体也可被修饰而含有间隔臂(如六亚甲基二胺或其他的相似大小的双功能分子)以与多肽连接。
本发明CAMP因子的其他合适的载体包括逆转录病毒的VP6多肽，或其功能性片段，如美国专利号5,071,651所揭示。也可以使用病毒蛋白与免疫原的融合产物，其制备方法揭示于美国专利号4,722,840。还有其他合适的载体包括细胞，如淋巴细胞，由于以这种形式的提呈模仿了在主体中提呈的自然模式，因此产生了免疫状态。或者，本发明的蛋白质可与红细胞偶联，优选与主体自己的红细胞偶联。肽与蛋白质或细胞偶联的方法是本领域技术人员所熟知的。
另外，CAMP因子(或其复合物)可以中性或盐形式配制成疫苗组合物。药学适用的盐包括酸加成盐(由活性多肽的游离氨基形成)，它们由无机酸如盐酸或磷酸，或有机酸如乙酸、草酸、酒石酸、苯乙醇酸等形成。由游离羧基形成的盐可来自无机碱如氢氧化钠、钾、铵、钙、或亚铁，和有机碱如异丙基胺、三甲基胺、2-乙氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等。
注射用的疫苗制剂将含有“治疗有效量”的活性成分，即，一个能够在给予该组合物的主体中诱导免疫应答的量。例如在治疗和预防乳腺炎中，“治疗有效量”将优选控制感染的量，如通过检测如组合物维持或降低奶中体细胞数低于约500,00个细胞/ml的能力来确定。精确的量可由本领域技术人员利用常规实验容易地确定。CAMP因子在组合物中典型的含量为从1％到95％(w/w)的范围，或如果适当甚至更高或更低。根据本疫苗组合物，当给予每个动物1-3ml剂量时，注射溶液中含有20到500μg/ml的活性成分应足以激发免疫应答。
为免疫主体，该疫苗一般以肠胃外方法给药，常通过肌肉内注射。但其他的给药方如皮下、腹膜内和静脉内注射也是可接受的。给药量依赖于被治疗的动物、动物的免疫系统合成抗体的能力、以及所需保护的程度。本领域普通技术人员可通过常规实验建立的剂量效应曲线容易地确定有效剂量。给予至少一个剂量的疫苗来免疫主体，优选两个剂量。但是，动物可以接受维持对感染的免疫状态所需的多个剂量。
适合于其他给药方式的疫苗制剂包括栓剂和在某些情况下的气雾剂、鼻腔内的、口服的制剂、和持续释放的制剂。对于栓剂，载体成分将包括传统的粘合剂和载体，例如，聚亚烷基二醇或甘油三酯。这些栓剂可由含有约0.5％-10％(w/w)的活性成分(优选约1％-2％)的混合物形成。口服载体包括那些正常使用的赋形剂，例如，药物级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精纤维素纳、碳酸镁等。这些口服疫苗组合物可以采用下列形式；溶液形式、悬液形式、片剂形式、丸剂形式、胶囊形式、持续释放制剂形式、或粉剂形式，并含有从约10％到约95％的活性成分，优选从约25％到约70％。
鼻腔内制剂将通常包含既不刺激鼻粘膜也不显著干扰纤毛功能的载体。稀释剂如水、盐水或其他已知物质可用于本发明。鼻腔内制剂还可含有防腐剂如，但不局限于，氯代丁醇和氯洁尔灭。可加入表面活性剂来增强鼻粘膜对本发明蛋白质的吸收。
可控制的或持续释放的制剂可通过将蛋白质掺入下列载体或介质中而制成，载体或介质如脂质体、不可吸收不可渗透的聚合物如乙烯乙酸乙烯酯共聚物和Hytrel共聚物，或可膨胀的聚合物如水凝胶，或可再吸收的聚合物如胶原蛋白和某些聚酸或聚酯如用于形成可再吸收缝合的那些。CAMP因子也可利用植入的微小泵导入体内，这在本领域是熟知的。
本发明的CAMP因子也可通过表达它的病毒载体来给药。用于本发明的载体病毒包括但并不局限于痘苗病毒和其他痘病毒、腺病毒、和肝炎病毒。例如，表达该新蛋白的痘苗病毒重组体可由如下方式构建。编码蛋白质的DNA首先插入一个适当的载体中，使该DNA紧连于痘苗病毒的启动子且侧翼为痘苗病毒DNA序列如编码胸苷激酶(TK)的序列。该载体然后用于转染同时感染了痘苗病毒的细胞。同源重组作用将痘苗病毒的启动子连着编码本发明蛋白质的基因插入到病毒基因组中。产生的TK-重组体可在5-溴脱氧尿嘧啶的存在下培养细胞来选择并从其中选择抗性病毒噬斑。
另一给药途径涉及基因治疗或核酸免疫。因此，编码本发明CAMP因子的核苷酸序列(和伴随的调节元件)可以被直接给予主体以在体内从中翻译蛋白质。或者，基因转移可由离体转染主体的细胞或组织并重新将已转化的材料导入宿主体内来完成。DNA可直接导入宿主器官中，例如通过注射(见国际
发明者M·江, A·A·泼特尔, P·R·马克拉切兰 申请人:萨斯喀彻温大学