专利名称：用微生物生产转谷氨酰胺酶的方法
技术领域：
本发明涉及从诸如细菌，霉菌和酵母的微生物生产转谷氨酰胺酶(下文称为“TG”)的方法，以及用由此获得的TG生产胶状蛋白质的方法。
TG是催化肽链中谷氨酰胺残基的γ-羧基酰胺的酰基转移反应的酶。当TG作为酰基受体与蛋白质中赖氨酸残基的ε-氨基反应时，在分子内和分子间形成ε-(γ-Glu)-Lys交联键。当水作为酰基受体时，该酶帮助谷氨酰胺残基的脱酰胺反应以形成谷氨酸残基。
本发明生产的TG用于生产胶状蛋白质，后者作为胶体食物，胶状化妆品等有用，该TG类似于已知的来自放线菌属的TG。
背景技术：
迄今已知在各种动物组织中含有TG。例如，在豚鼠肝脏中含有TG且对其进行了研究〔Connellan等，生物化学杂志，Vo1.246，10931098(1971)〕。然而，至于从微生物产生的TG，仅报道了由放线菌属和枯草芽孢杆菌(M.V.Ramanujam等，FASEB J.Vol.4，A2321)和Myxomycetes(J.D.Klein等，细菌学杂志，Vol.174，2599至2605)产生的TG。
目前，由放线菌属产生的TG在实践上用于工业规模上〔日本专利未审公开申请(下文称为“J.P.KOKAI”)No.Sho 64-27471〕。
来自动物的TG用于工业，特别是用于生产胶状蛋白质时具有下列缺陷(1)难以以低花费获得大量来自动物的TG。
(2)TG的应用受到限制，因为需要钙离子。
来自放线菌属的TG具有的缺陷是，由于放线菌属的微生物生长速率通常低于细菌，需要较长的培养时间，所以导致生产成本增加。
发明公开至于来自动物的TG的实际应用，从未期望过这类应用，因为其需要钙的特征限制了其用途且其低成本的大量生产是不可能的。来自放线菌的TG比来自细菌的TG具有较低的生长速率且从花费来看是不利的。
因此，本发明的目的是提供用从古代就常用于食品的微生物以高生长速率和以合理花费生产TG的新方法。
经过对解决上述问题的目的进行深入研究后，发明人发现特定的微生物在其培养过程中产生TG或它们在其细胞中积累TG。根据这一发现完成了本发明。
即，本发明提供了生产转谷氨酰胺酶的方法，包括在培养基中培养微球菌属，梭状芽孢杆菌属，球拟酵母属，根霉属和红曲霉属中任一种的微生物以便在培养基中或在微生物细胞中生产目的转谷氨酰胺酶，然后分离该转谷氨酰胺酶，还提供了用由此获得的TG生产胶状蛋白质的方法。
附图简述
图1显示了用于食品的细菌及相同属的细菌在固体培养中的腐胺掺入活性。
图2显示了用于食品的细菌及相同属的细菌在液体培养中的腐胺掺入活性。
图3显示了在用于食品的细菌及相同属的细菌的液体培养物的上清液中掺入腐胺的活性。
图4显示了用于食品的酵母及同属的酵母在固体培养物中的腐胺掺入活性。
图5显示了用于食品的酵母和同属的酵母在液体培养物中的腐胺掺入活性。
图6显示了用于食品的酵母和同属的酵母的液体培养物上清液中的腐胺掺入活性。
图7显示了用于食品的丝状真菌和同属的另一丝状真菌在液体静止培养物中的细胞腐胺掺入活性。
图8显示了用于食品的丝状真菌和同属的另一丝状真菌的液体摇动培养物中的细胞腐胺掺入活性。
图9显示了用于食品的丝状真菌和同属的另一丝状真菌在液体摇动培养物的上清液中的腐胺掺入活性。
图10显示了含担子菌(Basidiomycoea)破碎细胞的悬液中的腐胺掺入活性。
图11显示了商业供应蛋白酶的腐胺掺入活性。
图12显示了蛋白酶抑制剂对腐胺掺入活性的影响。
图13显示了蛋白酶抑制剂对α-胰凝乳蛋白酶和米曲霉的培养物上清液中蛋白酶活性的影响。
实施本发明的最佳方式本文的术语“TG”指催化肽链中谷氨酰胺残基的γ-羧基酰胺基团的酰基转移反应的酶。当TG作为酰基受体作用于蛋白质赖氨酸残基的ε-氨基时，在分子中和分子间形成ε-(γ-Glu)-Lys交联键。
在本发明中，转谷氨酰胺酶优选经过在培养基中培养上面限定的微生物以便在培养基或在细胞中生产目的转谷氨酰胺酶，然后(1)从培养基中分离转谷氨酰胺酶或(2)破碎细胞或经过裂解，然后如果需要溶解该产物来获得。
经过对从古代就在培养液中或将细胞用于生产食品的各主要的细菌，酵母，真菌等的TG活性的深入研究，发明人发现了一些具有TG活性的菌株。
下面将对细胞或其培养液中具有TG活性的细菌的例子进行描述。
优选可用于食品的微球菌属和梭状芽孢杆菌属的细菌。特别优选藤黄微球菌和丙酮丁醇梭状芽孢杆菌。具体地说，优选藤黄微球菌ATCC400和丙酮丁醇梭状芽孢杆菌ATCC 4259。
然后，对于在细胞或其培养液中具有TG活性的酵母的例子将在下面进行描述。
优选可用于食品的球拟酵母属酵母。特别优选易变球拟酵母。具体地说，优选易变球拟酵母NRRL·Y-6652。
对于在细胞或其培养液中具有TG活性的真菌的例子将在下面进行描述。
优选可用于食品的根霉属和红曲霉属的真菌。特别优选米根霉，中国根霉，德列马根霉，爪哇根霉和紫色红曲霉。
更具体地说，可用米根霉FERM BP-5546和FERM BP-5549，中国根霉JCM 5596，德列马根霉JCM 5564，爪哇根霉JCM 5574和紫红色曲霉ATCC 16360。“JCM”是日本微生物保藏中心的缩写(下文将使用相同的缩写)。
然后，将对微生物的培养方法和纯化获得TG的方法进行描述。在本发明的实施中，培养形式可以是液体培养或固体培养。当以工业规模进行培养时，在搅拌条件下通气的培养具有优势。
使用的营养培养基的营养成分包括碳源，氮源，无机酸和其它常用于微生物培养的微量营养成分。另外，微生物可利用的营养成分是可获得的。
(1)细菌和酵母的培养条件与(2)真菌略有不同。首先对(1)细菌和酵母的培养条件进行描述。在使其能生长产生TG的培养温度范围内，在需氧条件下培养细菌和酵母。可在厌氧条件下培养经厌氧培养可培养的细菌和酵母。
尽管条件不受严格限制，但培养温度通常是10到50℃，优选25到40℃。根据温度和其它条件可改变培养时间以产生最大量的TG。培养时间通常是5小时至14天，优选大约10小时到7天。
下面将对真菌进行描述。
在需氧条件下在使其能生长产生TG的培养温度范围内培养真菌。培养温度通常是10到50℃，优选20到35℃。根据培养条件可改变培养时间使产生最大量的TG。培养时间通常是1到20天，优选2到14天。
培养完成后，经过滤从培养液中去掉固体，且从过滤液中获得在培养液中积累的TG。经过用于纯化酶的任一普通方法从培养滤液中获得纯TG。
例如，经过用诸如乙醇、丙酮或异丙醇的有机溶剂处理，用硫酸铵，食盐或类似物的盐析，透析，超滤，离子交换色谱，吸附色谱，凝胶过滤，用吸附剂吸附，等电点分离可获得纯TG。当经过适当结合这些方法可提高TG的纯度时，这种结合也是可能的。
如果需要，可向上述获得的酶溶液中加入盐，糖类，脂，蛋白质，表面活性剂等作为稳定剂，然后对溶液进行超滤浓缩，反向渗透浓缩，减压干燥，冷冻干燥，喷雾干燥或等以获得纯化的液体或固体TG。
培养完成后从培养液中回收细胞收集在细胞中积累的TG。破碎或裂解(细菌裂解)细胞后，由此获得的产物可就此或浓缩后用作胶化试剂。
经过诸如超声处理，用珠或类似物研磨，加压破碎和冷冻破碎的各种方法可进行破碎。
如果必须经过各种溶解方法溶解处理的细胞也可回收可溶部分中的TG活性。例如，(1)经过用诸如Triton X-100或烷基葡糖苷的表面活性剂处理细胞可溶解细胞。(2)经过用酸性或碱性缓冲液进一步处理已处理的细胞可溶解活性部分。(3)经过将它们悬浮于缓冲液中并将温度升高到例如10℃或以上可溶解处理的细胞。以各类方法由此溶解的TG也可用作胶化试剂。
具有更高比活的纯化TG可用任意常用于如上所述从培养液纯化TG的酶纯化方法从溶解的含TG的溶液获得。由此获得具有更高效力的胶化试剂TG。
如下所述经过测定将腐胺掺入二甲基酪蛋白的活性(下文称为腐胺掺入活性)测定TG活性。经过使用以14C标记的腐胺和二甲基酪蛋白作底物进行反应。用10％TCA沉淀与腐胺键合的二甲基酪蛋白且沉淀吸附于滤纸上。用液闪计数器或类似方法测量由此处理的滤纸的放射活性以进行测定。
然而，腐胺掺入二甲基酪蛋白中也是由蛋白酶脱水键合或转变(transition)反应引起的反应。因此，存在检测蛋白酶活性作为TG活性的可能性。
因此，经过检查蛋白酶抑制剂对腐胺掺入活性的抑制可证实实际TG活性。即，当样品的腐胺掺入活性不受蛋白酶抑制剂抑制时，其TG活性是实际活性。证实实际TG活性的详情在下面所述的实施例中描述。
因此，本发明提供了筛选生产转谷氨酰胺酶的微生物的方法，它包括在不存在蛋白酶抑制剂的条件下将微生物样品与含14C标记的腐胺和二甲基酪蛋白的底物反应以选择产生与腐胺键合的二甲基酪蛋白的微生物，在选自大豆Bawman-Birk抑制剂，胰凝乳蛋白酶抑制剂和卵抑制剂的蛋白酶抑制剂存在的条件下用含14C标记的腐胺和二甲基酪蛋白的底物进行相同的反应，比较在蛋白酶抑制剂存在下进行的反应获得的产物量和在缺乏蛋白酶抑制剂时进行的反应获得的与腐胺键合的二甲基酪蛋白的量，选择在各蛋白酶抑制剂存在时产生的与腐胺键合的二甲基酪蛋白量基本上不减少的微生物。优选的微生物当在缺乏蛋白酶抑制剂的条件下培养产生的与腐胺键合的二甲基酪蛋白为100份时，在存在一种上述蛋白酶抑制剂的条件下能产生至少65份，优选75到100份与腐胺键合的二甲基酪蛋白。即，选择在三种培养条件之一的条件下(即在大豆Bawman-Birk抑制剂，胰凝乳蛋白酶抑制剂和卵抑制剂之一存在的条件下)能产生至少65份与腐胺键合的二甲基酪蛋白的微生物。
在这一过程中，待试验的微生物在最佳条件下培养。14C-标记的腐胺的量优选为1到2000nmol，底物中的二甲基酪蛋白的量优选为1到200mg/ml。培养时间优选大约1分钟到6小时。
下面将对本发明的另一实施方案，即，用TG生产胶状蛋白质的方法进行描述。以异议日本专利公开(下文称为“J.P.KOKOKU”)NoHei 6-65280和J.P.KOKAI No.Hei 6-225775(本文引用其说明书以供参考)揭示的方法可生产胶状蛋白质。
用于胶状蛋白质生产的TG包括纯化的TG，具有TG活性的培养溶液和具有TG活性的级分，它经过破碎或裂解具有TG活性的细胞获得。而且，上述可溶级分也是可用的。即，任何具有TG活性的级分都是可用的。
可用作底物的蛋白质的来源和特性不受限制，只要它具有赖氨酸残基和谷氨酰胺残基且只要它与上述催化剂反应。另外，用蛋白酶或类似物部分切割的肽，合成肽和化学修饰的各种蛋白质也可用作该酶的底物，只要它们含有赖氨酸残基和谷氨酰胺残基。
当将本发明获得的TG加入含该蛋白质的液体或悬液中进行反应时，1)当该蛋白质浓度较高时获得具有高粘度的产物或胶体形式的产物，或2)当蛋白质浓度较低时获得溶液或沉淀形式的交联高分子产物。至于反应条件，反应溶液的pH大约为4到10，反应温度大约为5到80℃，反应时间一般为大约10秒到24小时。
经过选择蛋白质的类型和其量可改变交联的程度，因此根据目的和用途可改变凝胶的特性和水含量。
下面的实施例将进一步说明本发明，但并不意味着限制本发明的技术范围。
实施例1在本实施例中，使用可用于食品的下列细菌菌株。
表1乳酸乳球菌(1) FERMP-14972乳酸乳球菌(2) AJ11145乳酸乳球菌(3) AJ5805耐久肠球菌 AJ3805粪肠球菌ATCC12984嗜热链球菌 AJ3809玫瑰色葡糖杆菌 IAM1838氧化葡糖杆菌(1) IFO3172氧化葡糖杆菌(2) IFO3189乳酸片球菌 ATCC8042亨利伯建氏片球菌AJ3157戊糖片球菌 IFO3182易变微球菌 IAM1314藤黄微球菌(1) ATCC400藤黄微球菌(2) IFO3333凝聚微球菌 AJ1062巴斯德氏醋杆菌 FERMP-14973醋酸化醋杆菌(1) IFO3281醋酯化醋杆菌(2) IFO3288植物乳芽孢杆菌 ATCC8014清酒乳芽孢杆菌 ATCC9338干酪乳芽孢杆菌 ATCC7469德彼利氏乳芽孢杆菌 ATCC9649保加利亚乳芽孢杆菌 ATCC11842发酵乳芽孢杆菌 JCM1173肠系膜状明串珠菌FERMP-14974大肠杆菌ATCC27325乳发酵短杆菌ATCC13869亚麻短杆菌 ATCC9172丙酮丁醇梭状芽孢杆菌ATCC4259
在上表中，AJ和IAM分别是Ajinomoto公司中心研究实验室和IAM培养物保藏中心的缩写(下文将应用该缩写)。
上面列出的菌株的固体培养基或液体摇动培养基用胰胨大豆培养基，乙酸细菌培养基，MRS培养基等进行。在固体培养物中，培养2到4天后收集合适量的细胞。
经过向20ml试管中加入5ml培养基〔每升培养基中含5g葡萄糖，0.9g(NH4)2SO4，0.45g KH2PO4，0.075g K2HPO4，0.09gMgSO4·7H2O，0.9g NaCl，0.09g CaCl2·2H2O，10g胰胨(BBL)，5g酵母提取物(Difco)，2g肉提取物(Difco)，0.007g氯高铁血红素，4g Na2CO3，0.3g L-半胱氨酸HCl·H2O和0.001g刃天青，pH 7.2〕培养梭状芽孢杆菌属的细菌，然后控制气相组成为N2/CO2/H2＝80/10/10，接种细菌并在厌氧条件下37℃进行培养。
在液体培养物中，取10ml培养液并在对数生长期(在附图中称作“log”)(培养大约3到5小时后达到)和在静止期(培养6到10小时后达到)，开始后0，5，10和20小时离心以获得沉淀和上清液。作为沉淀获得的细胞悬浮于1ml Tris缓冲液(20mM Tris，pH 7.5)中并用玻璃珠破碎。含破碎细胞和上清培养液的悬液用作待测样品。
在固体培养基中，细菌在含琼脂的培养基中培养2到4天，然后收集合适量的细胞。用铂环刮取细胞。由此获得的适量细胞悬浮于1ml Tris缓冲液(20mM Tris，pH 7.5)中并用玻璃珠破碎。含破碎细胞的上清和上清培养液用作待测样品。
经过测量腐胺掺入活性可测定TG活性。含10μl待测样品的50μl反应液(pH 7.5的100mM Tris缓冲液，含6.3mg/ml二甲基酪蛋白和10nm14C-腐胺1.2μCi)37℃反应30分钟，然后将40μl反应产物吸附于滤纸上并用10％TCA固定。用5％TCA溶液洗涤3次后，用液闪计数器测定产物的放射活性以测定腐胺掺入活性。菌株样品的测定结果在图1至3中显示。
如图1至3所示，腐胺掺入活性在Lactococcus，肠球菌属，葡萄杆菌属，片球菌属，微球菌属，醋杆菌属，乳芽孢杆菌属，明串珠菌属，短杆菌属，埃希氏杆菌属或梭状芽孢杆菌属的细菌细胞中或在其培养液中识别。
其中，亚麻短杆菌，藤黄微球菌，乳酸乳球菌，干酪乳芽孢杆菌，粪肠球菌，氧化葡糖杆菌，戊糠片球菌，巴斯德氏醋杆菌，肠系膜状明串珠菌，大肠杆菌和丙酮丁醇梭状芽孢杆菌具有相当高的腐胺掺入活性。
实施例2在本实施例中，使用可用于各种食品的酵母菌株或类似物，如下面表2所示。
表2易变球拟酵母NRRLY-6652汉逊氏德巴利氏酵母 IFO0644Pichia anomala(1) IFO0130Pichia anomala(2) IFO0144肋状复膜孢糖酵母IFO0103卡尔斯伯糖酵母 CBS1513巴扬氏糖酵母(1) CBS395巴扬氏糖酵母(2) CBS380弗罗棱糖酵母AJ4100薛氏糖酵母 CBS400啤酒糖酵母 CBS1171Zygosaccharomyces rouxii(1) CBS726Zygosaccharomyces rouxii(2) IFO0495Zygosaccharomyces mrakiiCBS4218耐热接合糖酵母 CBS6340戴尔凯氏有孢圆酵母(1) IFO1129戴尔凯氏有孢圆酵母(2) CBS817马克斯克鲁维氏酵母 IFO0288在上表中，CBS是真菌菌株保藏中心(Centraalbureau voorSchimmelcultures)的缩写。
上面所述的各菌株的细菌用YM培养基或类似物在28℃经液体摇动培养来进行培养。在对数生长期(培养大约3到6小时后达到)，在静止期开始时(培养大约6到12小时后达到)(即，第0天后)及在第二和第四天取10ml培养液并离心以获得沉淀和上清液。作为沉淀获得的细胞悬浮于1ml Tris缓冲液(20mM Tris，pH 7.5)中并用玻璃珠破碎。按与实施例1相同的方式对含破碎细胞的悬液和上清培养液进行腐胺掺入活性的试验。
按与实施例1相同的方式进行固体培养，由此获得的产物也用作按与实施例1相同的方式进行腐胺掺入活性的试验的样品。
液体培养物和固体培养物中的菌株样品的测定结果在图4至6中显示。
如图4至6所示，在球拟酵母属，有孢圆酵母属，糖酵母属，接合糖酵母属，复膜孢糖酵母属，克鲁维氏酵母属和毕赤氏酵母属的酵母细胞中或在其培养液中检测到腐胺掺入活性。其中，易变球拟酵母，Pichiaanomala，啤酒糖酵母，耐热接合糖酵母，肋状复膜孢糖酵母，戴尔凯氏有孢圆酵母和马克斯克鲁维氏酵母具有高腐胺掺入活性。
实施例3在本实施例中，使用可用于各种食品的丝状真菌菌株或类似物，如下面表3所示。
表3酪生青霉 IFO5849柑桔青霉 ATCC9849娄格法尔特氏青霉 IFO4622酱油曲霉 RIB1045米曲霉ATCC11494塔木里氏曲霉 JCM2259宇佐美氏曲霉 IAM2185灰绿曲霉 IAM2124Aspergillus saitoiIAM2190黑色曲霉 ATCC16404卷枝毛霉 ATCC15242Rhizomucor pusillus IFO4578紫色红曲霉ATCC16360中国根霉 JCM5596德列马根霉JCM5564爪哇根霉 JCM5574日本根霉 AJ6076米根霉(1) FERM BP-5549米根霉(2) FERM BP-5546(AJ6168)
在上面表中，RIB是国际酿酒研究所的缩写(下文将使用相同的缩写)。
上面列出的细菌菌株按如下方式培养使用YM培养基(包含5g/l蛋白胨，3g/l酵母提取物，3g/1麦芽提取物，10或200g/l葡萄糖)进行液体静止培养，使用EPS培养基(包含3g/l大豆粉，3g/l Pharmamedia，10g/l可溶淀粉，3g/l酵母提取物，3g/l Nzamine A型，2g/l CaCO3和10或40g/l葡萄糖，pH 6.5)进行液体摇动培养。培养温度为25℃。在静止培养物中，在第3，7和11天收集细胞。在摇动培养物中，在第3，5和7天取10ml培养液并离心将它分成上清液和细胞。
由此获得的细胞悬浮于5到10ml Tris缓冲液(20mM Tris，pH7.5)中并用玻璃珠破碎。按与实施例1相同的方式分别测定(1)经静止培养获得的且含破碎细胞的溶液，(2)经摇动培养获得的且含破碎细胞的溶液，(3)经摇动培养获得的上清液中的腐胺掺入活性。
如图7至9所示，在曲霉属，青霉属，根霉属，红曲霉属，毛霉菌和Rhizomucor属的丝状真菌中检测到腐胺掺入活性。
其中，Aspergillus saioti，米根霉，中国根霉，德列马根霉，爪哇根霉，柑桔青霉，卷枝毛霉，Phizomucor pusillus和紫色红曲霉中具有相当高的腐胺掺入活性。参考实施例1在用于小球藻属的培养基〔包含0.15g/l Ca(NO3)2·4H2O，0.1g/lKNO3，50mg/l磷酸甘油钠，40mg/l MgSO4·7H2O，0.1g/l维生素B12，0.1g/l生物素，0.01mg/l盐酸硫胺素，0.5g/l tris(羟甲基)氨基甲烷，3ml/l PIV金属，pH 7.5，其中PIV金属是0.196g/lFeCl3·6H2O，36mg/l MnCl2·4H2O，22mg/l ZnSO4·7H2O，4mg/l CoCl2·6H2O，2.5mg/l MoO4·2H2O和1g/l Na2EDTA·2H2O〕中在25℃下和30001x(光照期间为12小时，黑暗期间为12小时)条件下经摇动培养来培养属于单细胞绿藻的粉核小球藻NIES-226和普通小球藻。在第14天，离心5ml培养液以获得细胞。细胞悬浮于1ml Tris缓冲液(20mM Tris，pH 7.5)中并用玻璃珠破碎。以与实施例1相同的方式对含破碎细胞的悬液进行腐胺掺入活性的试验。
试验结果表明，这些种类的小球藻属具有腐胺掺入活性，如表4中所示。
表4菌株 腐胺掺入活性(dpm)粉核小球藻881普通小球藻156参考实施例2可食用的担子菌微生物主要用于研究。使用了商用的和天然的担子菌微生物。
大约2g子实体切成小片。向其中加入10ml Tris缓冲液(20mMTris，pH 7.5)先用匀浆器再用玻璃珠将其破碎。按与实施例1相同的方式对子实体的破碎细胞进行腐胺掺入活性的试验。结果在图10中表示。
如图10所示，各种担子菌微生物具有腐胺掺入活性。
Roseofomes subflexibilis，Russula delica和Grifola frondosa具有特别强的活性。参考实施例3腐胺掺入活性随温度的改变如上所述经过测定腐胺掺入二甲基酪蛋白的活性确定TG活性。已知由TG形成的交联结构可经物理化学因素形成。特别是已知经加热形成交联结构。因此，根据条件，可检测到非酶促的掺入活性。另外，腐胺经过脱水键或蛋白酶的转移反应掺入二甲基酪蛋白，作为表观TG活性可检测到该效果。在环境条件下，进行了下列试验1)腐胺掺入活性随温度的变化，2)腐胺掺入活性随pH的变化，3)商品蛋白酶的腐胺掺入活性。
首先检测了腐胺掺入活性随温度的改变。
在30，40，50，60，70，80和90℃下处理与实施例1相同的反应溶液(除了不含用作酶来源的样品)30分钟。按与实施例1相同的方式用液闪计数器测定掺入二甲基酪蛋白的腐胺的量。
表5温度(℃) 304050607080腐胺掺入活性(dpm) 231 322 507 816 1526 3183从表5中很明显地看出即使不存在TG时，随温度的升高腐胺掺入活性增加。参考实施例4腐胺掺入活性随pH的改变在7，8，9，10或11的不同反应pH下处理与实施例1相同的反应溶液(除了不含用作酶来源的样品)。按与实施例1相同的方式用液闪计数器测定掺入二甲基酪蛋白中的腐胺量。
表6pH 7891011腐胺掺入活性(dpm) 310 367 707 1460 7094从表6所示的结果很明显地看到即使不存在TG时随pH值的升高腐胺掺入活性增加。
在参考实施例3和4中获得的结果表明当检测样品的TG活性和特性时，重要的是在相同反应条件下进行检测。参考实施例5商品蛋白酶样品的腐胺掺入活性的测定胰蛋白酶(T-8253，Sigma有限公司的产品)，α-胰凝乳蛋白酶(C-7762；Sigma有限公司)，枯草杆菌蛋白酶(P-5380，Sigma有限公司)和木瓜蛋白酶(P-4762；Sigma有限公司)用作酶来源。
至于反应条件，反应在0.1M Tris-HCl(pH 7.5)，6.3mg/ml二甲基酪蛋白，0.2mM腐胺二氢氯化物1，4-14C，1mM CaCl2和2mM DTT存在下37℃进行30分钟。加入的酶量为0.1μg。
结果在图11中显示。从该结果了解到由此试验的所有商品蛋白酶样品具有腐胺掺入活性。由于蛋白酶本身具有微弱的腐胺掺入活性，由本试验表明除了TG活性外还应检测诸如蛋白酶活性的其它酶活性。
因此，经过使用来自微生物的普通TG，商品蛋白酶和本实验中使用的筛选样品详细检查了腐胺掺入活性和蛋白酶活性间的关系。实施例4蛋白酶抑制剂对腐胺掺入活性的影响来自轮链丝菌属(下文称为“BTG”)的TG酶制品，α-胰凝乳蛋白酶(C-7762，Sigma有限公司的产品)和从米曲霉培养物中获得的上清液用作酶来源。用作样品的米曲霉培养物上清液经过用超滤器浓缩从米曲霉ATCC11494培养物获得的上清液(用于筛选的样品，在表3中显示)来获得。
使用的蛋白酶抑制剂是大豆胰蛋白酶抑制剂(Sigma有限公司的T-9003，下文称为“STI”)，大豆Bowman-Birk抑制剂(Sigma有限公司的T-9777；下文称为“BBI”)，胰凝乳蛋白酶抑制剂(Sigma有限公司的C-7268；下文称为“CYM”)，卵类粘蛋白(Sigma有限公司的T-2011；下文称为“OVM”)和卵抑制剂(Sigma有限公司的T-1886；下文称为“OVI”)。
经过将酶来源与各蛋白酶抑制剂混合并在测定腐胺掺入活性前使获得的混合物在冰上静置30分钟来用蛋白酶抑制剂处理酶来源。在测定腐胺掺入活性时，将0.02μg的BTG，0.1μg的α-胰凝乳蛋白酶抑制剂或0.2μg培养米曲霉获得上清蛋白用于各样品。各蛋白酶抑制剂的量是每个样品20μg。
测定结果在图12中显示。由此测定的活性以相对值给出(未使用任何抑制剂获得的腐胺掺入活性为100)。当使用BTG时，以任何抑制剂未观察到抑制。，然而，α-胰凝乳蛋白酶受BBI和CYM的严重抑制。当培养米曲霉获得的上清液用作酶来源时，受CYM和OVI引起的严重抑制。
使用的抑制剂对蛋白酶具有高度特异性的事实表明α-胰凝乳蛋白酶和米曲霉培养物上清液的腐胺掺入活性由蛋白酶引起。实施例5蛋白酶抑制剂对α-胰凝乳蛋白酶和米曲霉培养物上清液的蛋白酶活性的影响经过使用α-胰凝乳蛋白酶和米曲霉ATCC11494培养物上清液按与上面所述对腐胺掺入活性的抑制试验相同的方式进行蛋白酶活性抑制试验如下按如下方式测定蛋白酶活性向0.25ml样品中加入0.2ml 5％(w/v)偶氮酪蛋白和0.05ml 1M Tris-HCl(pH 7.5)。37℃进行反应30分钟后，向反应混合物中加入0.5ml 5％(w/v)三氯乙酸以终止反应。离心溶液以去掉沉淀。经过在366nm下测吸光率测定上清液中偶氮染料的量，以此估计样品的蛋白酶活性。
向0.25ml样品中加入酶来源和抑制剂。酶的量为1μgα-胰凝乳蛋白酶和1.6μg米曲霉培养物上清液中的蛋白质。在所有情况下抑制剂的量为50μg。将抑制剂与酶混合后，获得的混合物在测定蛋白酶活性前在冰上静置30分钟。
蛋白酶活性的测定结果在图13中显示。以相对于无抑制剂时获得的蛋白酶活性(100)的相对值给出活性。为了与腐胺掺入活性进行比较，也显示了上述腐胺掺入活性的残留相对活性。
结果，α胰凝乳蛋白酶或米曲霉培养物上清液中的蛋白酶受到与抑制腐胺掺入活性的蛋白酶抑制剂相同的抑制剂的抑制。即，α-胰凝乳蛋白酶的蛋白酶活性受BBI和CYM的特异性抑制，米曲霉培养物上清液的蛋白酶活性受CYM和OVI的特异性抑制。
这些结果表明α-胰凝乳蛋白酶和米曲霉培养物上清液各自的腐胺掺入活性由其中各自含有的蛋白酶引起。
从这些发现认为经过按上面所述的对于α-胰凝乳蛋白酶或米曲霉培养物上清液一样测定各种蛋白酶抑制剂在腐胺掺入活性中的抑制情况可估计给定样品的腐胺掺入活性是否来自蛋白酶。即，在BTG的情况下，TG本身的腐胺掺入活性不受蛋白酶抑制剂的抑制。
认为经过结合蛋白酶抑制剂的抑制情况测定腐胺掺入活性的方法是一种新方法，以该方法可特异性地仅挑选出TG，它与仅测定腐胺掺入活性的常规方法不一样。
上述结果表明，在实施例1至3和参考实施例1和2中获得的腐胺掺入活性可能包括了诸如蛋白酶的其它因子的活性。根据这一观点，将用于实施例1至3和参考实施例1和2的实验中的所有样品，即在表1至5中所示的微生物用上述新形成的测定方法再进行测试。用该方法可仅选择出不包括蛋白酶或类似物的真正TG。实施例6用下述方法从上面表1至5中所示的所有样品中特异性地选择出仅产生TG的细菌。
用蛋白酶抑制剂测定腐胺掺入活性的方法如下所述。除非另有说明，采用实施例1的活性测定方法。
向10μl样品中加入7μl水和1μl50mM的DTT。将由此获得的混合物在冰上静置2小时。然后向其中加入5μl蛋白酶抑制剂溶液，混合物在冰上静置30分钟。本文使用的蛋白酶抑制剂溶液是0.2mg/ml的BBI，0.2mg/ml的CYM，0.2mg/ml的OVI，0.2mg/ml的STI或0.2mg/ml的OVM。静置后，加入试剂以获得100mM Tris(pH 7.5)，6.3mg/ml的二甲基酪蛋白和1.2μCi的10nm14C-腐胺的终浓度，反应液的量控制为50μl。反应液在37℃反应30分钟后，以与实施例1相同的方式测定TG活性。
一些测定的结果在表7和8中显示。
表7腐胺掺入活性(相对值)抑制剂菌株 -CYMBBIOVISTIOVM藤黄微球菌 10075 98104 97 82ATCC400丙酮丁醇梭状芽孢杆菌 100 102 95 90111 93tylicum ATCC4259易变球拟酵母 10096144113 95 92NRRL-Y6652紫色红曲霉 10064 91 77 88 95ATCC16360中国根霉 100 100131 86115 90JCM5596德列马根霉 10088 91 66 75 98JCM5564爪哇根霉 100 139112 89 94 89JCM5574米根霉(1)10080101 84121 93FERM BP-5549米根霉(2)100 107 92 89105 104FERM BP-5546
表8腐胺掺入活性(相对值)抑制剂菌株 -CYMOVI亚麻短杆菌ATCC917210045 34马克斯克鲁维氏酵母IFF0288 100 195 28戴尔凯氏有孢圆酵母CBS817 10067 30巴杨氏糖酵母CBS395100 0 98酱油曲霉RIB1045 10031 nt柑桔青霉ATCC9849 10021 33酪生青霉IF05849 10014 ntGrifola frondosa 10060 39nt未检测到表7显示了腐胺掺入活性未受蛋白酶抑制剂强烈抑制的样品的例子。腐胺掺入活性未受CYM，BBI和OVI中任一种的强烈抑制。从该事实判断表7所示的微生物活性是内在的TG活性。
表8显示了腐胺掺入活性受蛋白酶抑制剂强烈抑制的样品的例子。例如，从亚麻短杆菌，巴杨氏糖酵母，酱油曲霉，柑桔青霉，酪生青霉或Hypsizigus marmoreus制备的样品受CYM抑制的程度为至少50％。同样，例如从亚麻短杆菌，马克斯克鲁维氏酵母，戴尔凯氏有孢圆酵母，柑桔青霉或Grifola frondosa制备的样品受OVI抑制的程度为至少50％。从这些结果可判断表8中所示样品的腐胺掺入活性是由蛋白酶引起的。
在100℃下进行热处理15分钟后，以诸如耐热接合糖酵母CBS6340，Aspergillus saitoi JAM2190，黑色曲霉ATCC16404或Russula delica的微生物制备的样品具有与热处理前相等的腐胺掺入活性。由此判断这些样品中每一种的腐胺掺入活性是由样品中所含物质的作用引起的腐胺的非特异性吸附而产生。
经过在所有菌株中使用蛋白酶抑制剂的实验后，选择了微球菌属，梭状芽孢杆菌属，球拟酵母属，根霉属和红曲霉属的微生物作为不受蛋白酶抑制剂抑制且不含非特异性腐胺吸附的微生物。
因此，判断来自这些微生物的样品的腐胺掺入活性是内在的TG活性。
特别是判断下列微生物对于TG生产是有用的藤黄微球菌，丙酮丁醇梭状芽孢杆菌，易变球拟酵母，米根霉，中国根霉，德列马根霉，爪哇根霉和紫色红曲霉。实施例7在实施例6中判断为产TG的微生物的易变球拟酵母NRRL Y6652的101液体培养物在与实施例2相同的条件下进行培养。收集细胞，洗涤，再收集并用玻璃珠破碎。离心破碎细胞的悬液，用Q Sepharose(Pharmacia Aktiebolag)对上清液进行离子交换色谱。用0M至1MNaCl进行洗脱后接着分离，经超滤浓缩具有TG活性的级分。含20％的该级分的溶液在酪蛋白溶液(10％酪蛋白，25mM Tris，pH 7.5，5mM DTT)中37℃反应24小时后，可证实反应溶液的胶体化。
根据本发明，可从具有下列三点优势的微生物中生产TG(1)低花费，(2)高生长率和(3)从古代起就被用于食品。由于由此获得的TG能产生胶状蛋白质，所以它能用于生产各种食品，如酸乳酪，乳酪和煮沸的鱼糊。
在本说明书中描述的米根霉AJ6158于1995年7月3日以FERM NoP-15022的命名保存于通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所(日本茨城县筑波市东1丁目1番3号)，然后于1996年5月27日根据需要以命名为FERM BP-5549进行了保藏而转变成根据布达佩斯条约的保藏。米根霉AJ6168也于1996年5月23日以命名为FERM BP-5546保藏于通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所(日本茨城县筑波市东1丁目1番3号)。
权利要求
1.一种生产转谷氨酰胺酶的方法，它包括在培养基中培养微球菌属，梭状芽孢杆菌属，球拟酵母属，根霉属和红曲霉属中任意一种的微生物以便在培养基中或在微生物细胞中产生所需的转谷氨酰胺酶，然后分离转谷氨酰胺酶。
2.权利要求1的方法，其中微球菌属的微生物是藤黄微球菌，梭状芽孢杆菌属的微生物是丙酮丁醇梭状芽孢杆菌，球拟酵母属的微生物是易变球拟酵母，根霉属的微生物是米根霉，红曲霉属的微生物是紫色红曲霉。
3.权利要求1的方法，其中使用的微生物是藤黄微球菌或易变球拟酵母。
4.生产转谷氨酰胺酶的方法，包括在培养基中培养藤黄微球菌，丙酮丁醇梭状芽孢杆菌，易变球拟酵母，米根霉和紫色红曲霉中的任意一种以便在培养基或在细胞中产生所需的转谷氨酰胺酶，然后(1)从培养基中或(2)经破碎细胞或经裂解细胞后，如果需要进行溶解来分离转谷氨酰胺酶。
5.生产转谷氨酰胺酶的方法，包括在培养基中培养藤黄微球菌或易变球拟酵母以便在培养基或在细胞中产生所需的转谷氨酰胺酶，然后(1)从培养基中或(2)经破碎细胞或经裂解细胞后，如果需要进行溶解来分离转谷氨酰胺酶。
6.以权利要求1的方法可获得的转谷氨酰胺酶。
7.以权利要求4的方法可获得的转谷氨酰胺酶。
8.以权利要求5的方法可获得的转谷氨酰胺酶。
9.一种生产胶状蛋白质的方法，它包括使用以权利要求1的方法可获得的转谷氨酰胺酶。
10一种生产胶状蛋白质的方法，它包括使用以权利要求4的方法可获得的转谷氨酰胺酶。
11.一种生产胶状蛋白质的方法，它包括使用以权利要求5的方法可获得的转谷氨酰胺酶。
12.一种筛选产转谷氨酰胺酶的微生物的方法，它包括在不存在蛋白酶抑制剂的条件下将微生物样品与含14C-标记的腐胺和二甲基酪蛋白的底物反应以选择产生与腐胺键合的二甲基酪蛋白的微生物，然后在选自大豆Bawman-Birk抑制剂，胰凝乳蛋白酶抑制剂和卵抑制剂的蛋白酶抑制剂存在的条件下用含14C-标记的腐胺及二甲基酪蛋白的底物进行相同的反应，比较在蛋白酶抑制剂存在下进行的反应获得的产物量与在不存在蛋白酶抑制剂时进行的反应获得的与腐胺键合的二甲基酪蛋白的量，选择在各蛋白酶抑制剂存在时能产生产量基本上不减少的与腐胺键合的二甲基酪蛋白的微生物。
13.权利要求12的方法，其中选取的微生物是，当不存在蛋白酶抑制剂的条件下其反应产生的与腐胺键合的二甲基酪蛋白为100份时，在存在上述各蛋白酶抑制剂的条件下产生至少65份与腐胺键合的二甲基酪蛋白。
全文摘要
一种生产转谷氨酰胺酶的方法,它包含在培养基中培养微球菌属,梭状芽孢杆菌属,球拟酵母属,根霉属和红曲霉属中任一种的微生物以便在培养基中或在微生物细胞中产生所需的转谷氨酰胺酶,然后分离转谷氨酰胺酶,还提供了用由此获得的转谷氨酰胺酶生产胶状物质的方法。根据本发明的方法,可以较低的花费迅速生产转谷氨酰胺酶。
文档编号C12P21/04GK1192235SQ96195878
公开日1998年9月2日 申请日期1996年6月10日 优先权日1995年6月8日
发明者小林克德, 山中茂, 谷田有子, 津吉直子, 不藤亮介, 篠崎纯子, 横关健三, 铃木俊一 申请人:味之素株式会社 被以下专利引用 (2),