水解聚酰胺的具有酰胺酶活性的酶和微生物的制作方法

专利名称：水解聚酰胺的具有酰胺酶活性的酶和微生物的制作方法
技术领域：
本发明总体上涉及酰胺特别是仲酰胺的酶水解。
更准确地讲，本发明首先涉及聚酰胺6.6型底物酶水解产生该底物的两个共聚单体A和B的方法。本发明还涉及能用于酰胺基团的酶水解的酶和/或微生物，优选对含有至少一个酰胺基团的底物，如聚酰胺(PA)。本发明还涉及用于这些酶的生产的遗传工具。
在此领域中，Smith R.等在载于“生物医学材料研究(Journal ofBiomedical Material Research)(1987)，vol.21，p.991-1003”的文章中披露将14C标记的聚酰胺66样品与木瓜蛋白酶、胰蛋白酶和α-胰凝乳蛋白酶类的酶接触。这些已知的多肽轻微地降解聚酰胺66，但水解不够强，不能用于工业规模。
从Kinoshita等I欧洲生物化学杂志(Eur.J.Biochem)116，547-551，1981]还已知，产黄菌属菌株KI72能够产生一种催化6-氨基己酸环状二聚体水解成为线性二聚体的酶(E1)和能够将该线性二聚体转变成2分子6-氨基己酸或氨基己酸的第二种酶(E2)。所述酶途径总结如下。
(6-氨基己酸的 (6-氨基己酸的 (6-氨基己酸)环状二聚体 线性二聚体线性酰胺酶E2的活性对二聚体最佳，随着聚合度增加而降低，对聚合度(DPn)为7以上的低聚物活性不明显。
已知对DPn≥3(PA6)的环状或线性6-氨基己酸低聚物有活性的E3酶。E3酶在发表在“细菌学杂志(Journal of Bacteriology)，1992年12月，vol.174，no.24，p.7948-7953”中的Negoro等的文章中有描述。E3酶还源于产黄菌属菌株KI72。
在发表在“细菌学杂志，1989年6月，p.3187-3191，vol.171 no.6”中的文章中，Tsuchiya等指出来自产黄菌属菌株KI72的酶E1和来自假单胞菌属菌株NK87的一种酶之间存在高度同源性。据称酶E1和其类似物和酶E2(特别是后者)对下式的低聚物或聚酰胺有活性(PA6)
其中2≤n≤20。
这些来自产黄菌属或假单胞菌属的酶的缺点是它们对低聚物的比活性较低，对三聚体底物的比活性最高仅为1.05μmol氨基己酸/分钟/mg蛋白。而且，这些酶对均聚低聚体特异。
显然，现有技术中并没有可用于特别包括仲酰胺的各种类型的酰胺(特别是共聚低聚物和/或均聚低聚物)的高效酶水解酰胺基团的方法。
因此，在长期艰苦研究后，本申请人成功地分离和鉴定了一种酰胺酶型新酶，它由一种或多种多肽形成，尤其可从分离自小生境的新微生物和/或获自这些天然微生物的新重组微生物中衍生得到。
因而本发明首先涉及一种酶水解方法，其次涉及一种酶。
本发明水解(聚)酰胺的方法的特征在于- 对含有下式(I)(聚)酰胺的底物进行酶水解
其中·A和B为单体单元，·R1和R3为相同或不同(优选不同)的二价基团，代表取代或未取代、直链或支链的(环)亚烷基、亚芳基或亚芳烷基，其中芳香基团任选为缩聚物，亚烷基的碳原子数大于或等于4，优选在4和12之间，·R2为选自氢和/或最好具有1-6个碳原子的烷基的相同或不同(优选相同)的基团，·X为*X1＝OH、OM或OR4，其中M选自金属，优选碱金属和碱土金属，R4为含1-6个碳原子的直链或支链烷基，*或X2＝
其中R2和R3如上所定义，R5和R6相同或不同，与上述R2的定义相同，·Y为*Y1＝氢，*或Y2＝
其中R1如上所定义，Z为氢，定义同M的M1，或R4，条件是-a- 如果X＝X1，则Y＝Y1或Y2，-b- 如果X＝X2，则Y＝Y2，·最后，p为1-4，优选1-3；且- 这能够将上述底物(I)转化成单体A和单体B。
本发明还涉及(特别)可用于上述方法的一族酰胺酶型酶。
属于本发明这一族的酶是特征如下的酰胺酶- ①→它对特别是下式(I)(聚)酰胺的底物有活性
其中·A和B为单体单元，·R1和R3为相同或不同(优选不同)的二价基团，代表取代或未取代、直链或支链的(环)亚烷基、亚芳基或亚芳烷基，其中芳香基团任选为缩聚物，亚烷基的碳原子数大于或等于4，优选在4和12之间，·R2为选自氢和/或最好具有1-6个碳原子的烷基的相同或不同(优选相同)的基团，·X为*X1＝OH、OM或OR4，其中M选自金属，优选碱金属和碱土金属，R4为含1-6个碳原子的直链或支链烷基，*或X2＝
其中R2和R3如上所定义，R5和R6相同或不同，与上述R2的定义相同，·Y为*Y1＝氢，*或Y2＝
其中R1如上所定义，Z为氢，定义同M的M1，或R4，条件是-a- 如果X＝X1，则Y＝Y1或Y2，-b- 如果X＝X2，则Y＝Y2，·最后，p为1-4，优选1-3；- ②→它能够将上述底物(I)转化成单体A和单体B。
本发明的该族酶中，分离到具有酰胺酶活性并包含所附SEQ ID NO1所示的肽序列或与SEQ ID NO1具有至少80％、优选至少90％、特别优选至少95％同源性的同源肽序列的酶是有利的。
根据本发明的一个有利的特征，该酶特别对下式(II)的(聚)酰胺型底物具有酰胺酶活性
其中R2和R3如上所定义，·U和V分别与权利要求1中式(I)下X1和Y1的定义相同，·q＝1-8。
本发明起源于产生这种酶的野生菌株的分离，即食酸丛毛单胞菌N12。
该野生株的鉴定是长期曲折筛选操作的结果。这种鉴定是在参照微生物分类学的官方国际标准可确定的形态学的、培养的、生物化学的和抗原的特征基础上进行的。
本申请人的贡献不限于分离这一野生菌株，还扩展至如上定义的酰胺酶的分离。微生物食酸丛毛单胞菌N12不是这种酰胺酶的唯一生物前体。实际上，还需要考虑具有相似生物活性的重组微生物和野生菌株。
重组微生物是那些在其基因组中具有编码本发明酰胺酶的DNA序列的微生物。
本发明的另一方面还涉及一种酶水解方法，其中使用上述酶和/或上述野生型微生物和/或至少一种其上述重组微生物。
根据本发明，酶和/或其生物学前体(微生物/重组微生物)的底物是聚酰胺，更准确地讲是重复聚合基团为仲酰胺基团-CO-NH-的低聚物。
这些低聚物具有式(I)和/或(II)的重复单元。重复单元(I)最好由两个单体单元A和B形成，它们分别为二羰基和二胺单元并由仲胺基团连接在一起。
在本发明的一个优选实施方案中·单体A为以下残基
其中r＝4-12，优选等于4，<p>以与实施例6所描述的类似的方式，在共转化步骤使用质粒pToC202和使用米曲酶JAL125作为宿主细胞产生酶变体。HLvl2s中存在C-末端序列的检验使用标准方法，含有C-末端序列Arg-Arg-Pro的A 1mg HLvl2s样品在降解之前用赖氨酰-特异性的蛋白酶进行S-卡波克斯合金酰胺甲基化作用。使用反相HPLC分离生成的肽，对收集的组分进行辅助基质的激光解吸电离time-of-flight质谱法分析。发现了包含带有3906.7Da试验质量的肽的A组分。在实验误差范围内，此质量与含有RRP序列的HLvl2s的C-末端肽的理论质量(为3906.4 Da)相同。
在此组分中确定了此肽的氨基酸序列为HLvl2s的C-末端肽的正确氨基酸序列，并且其含有C-末端序列Arg-Arg-ProIle-Glu-Gly-Ile-Asp-Ala-Thr-Gly-Gly-Asn-Asn-Arg-Pro-Asn-Ile-Pro-Asp-Ile-Pro-Ala-His-Leu-Trp-Tyr-Phe-Gly-Leu-Ile-Gly-Thr-Cys-Leu-Arg-Arg-ProC-末端序列洗涤结果5g/l灭活的Ariel Futur，20分钟，1个周期TOM，30℃，18°dH。以每升洗涤液中酶蛋白的毫克数计量所说的酶。
HLvl3sSPIRPR+D57G，N94K，D96L，Q249R，270R，271R，272RHLvl4sSPIRPR+D57G，N94K，D96L，Q249R，270R，271R
实施例18通过与Clostripain(EC3.4.22.8；Sigma产品号C-0888)一起延长培养，来切除部分HLvl5s(含有N-末端肽添加物SPIRPR，并在H.lanuginosa脂解酶的成熟部分包含下列突变的HLvl5sEP，D57G，N94K，D96L，L97M，Q249R)的N-末端序列。
下面举出共聚聚酰胺的说明性实例- 聚氨基酸6，6/6，10(六亚甲二胺、己二酸和癸二酸的共聚物)，- 聚酰胺6，6/6(六亚甲二胺、己二酸和己内酰胺的共聚物)。
无任何限制意义下，本发明的优选底物是通过二元酸A和二胺B缩聚而获得的聚酰胺低聚物，特别是PA6.6低聚物。
本发明底物(I)和(II)中单体A和B或
--
的数目在3-8之间为好，优选在2-6之间。
应该指出，低聚物或聚合物分子中的这种单体残基数目在本申请以下内容中也称为DPn。
特征性底物(I)例如为水溶性低聚物时有利，如AB，ABA和ABAB。
应该指出，低聚物或聚合物分子中的单体A和B的数目在本发明中也称为DPn。
这些特别底物属于可被本发明的酶和/或其生物学前体水解的底物(I)和(II)，因为它们具有至少一个羧基末端基团。
当酶底物是含有单体A和B的低聚物时，最终水解产物可以是单体A和B。
当底物是低聚物(II)(单体
--
时，最终水解产物可以是单体
--
本发明的酶还可以通过其对一些上述底物的活性和/或亲和性来表征。
因此，根据第一个有利特征，所述酰胺酶- 首先对A和B的四聚体(DPn＝4，即p＝2，X＝X1，Y＝Y1)形成的底物(I)有活性，- 其次能够以大于或等于1000的比活性(Us)将该底物转变成DPn＝3的低聚物和单体A，比活性以在给定条件下测定的所水解的ABAB的μmol×h-1×mg-1蛋白表示。
该酰胺酶的第二个有利特征是它对三聚体ABA形成的底物(I)有活性，能够以大于或等于1000的比活性将该三聚体转变为二聚体AB和单体A，比活性以所水解底物的μmol×h-1×mg-1蛋白表示。
该酰胺酶的第三个有利特征是它对AB型二聚体形成的底物(I)有活性，能够以大于1500的比活性将该二聚体转变两个成单体A和B，比活性以所水解底物的μmol×h-1×mg-1蛋白表示。
纯酰胺酶的酶活性在下列条件下测定磷酸盐缓冲液，pH＝6-8，温度＝30℃。
本发明的酰胺酶具有这三种非限定性特征中的至少一种。
如上文已提到的那样，本发明的酶用于酰胺的酶水解时，可仅用酶本身或仅用产生所述酶的生物学前体(野生型或重组的微生物)或两者的混合物。
对于酶的生产菌，应强调，形成本发明主题的酶的特征还在于它由食酸丛毛单胞菌(N12)型微生物，优选由以编号I1522于1995年1月4日保藏并注册在Collection Nationale de Cultures de Microorganismes-InstitutPasteur PARIS的同样类型菌株，和/或由上述重组微生物产生。
本发明还涉及能产生上述本发明酰胺酶的新微生物。由于这种能力，这些微生物的特征是能够水解含至少一个酰胺基团的聚酰胺化合物特别是低聚物的酰胺基团。更准确地讲，这些微生物对上述定义的底物(I)和(II)具有特异选择性和水解活性。对于底物(I)的情形，低聚物例如为以上提及的水溶性低聚物ABAB和/或ABA和/或AB。
更准确地讲，这些微生物优选由上述食酸丛毛单胞菌组成，优选以编号I1522于1995年1月4日保藏并注册在Collection Nationale de Culturesde Microorganismes的菌株或其上述重组微生物。
最好，本发明的微生物能够水解由聚酰胺低聚物形成的至少一种底物，尤其是由二聚体AB形成的底物，这些微生物能够将其转变为单体A和B。
除本发明酰胺酶的生物学前体外，本发明还涉及控制重组的或非重组的微生物合成所述酰胺酶的遗传材料。因此，本发明涉及编码具酰胺酶活性的酶的DNA序列，其特征在于它选自下列序列-所附序列表中SEQ ID NO2所示并编码具酰胺酶活性的至少一种酶的DNA序列，-由于遗传密码的简并性造成的该序列的类似物，和-与上述序列或与其至少一个片段杂交并编码具酰胺酶活性的酶的DNA序列。
如上定义的DNA序列表达产生的酶也包括在本发明的范围内。
本发明人分离的野生型微生物(如I 1522)和重组微生物均含有一个表达盒，包括上述DNA序列SEQ ID NO2和视需要可选择的位于其上游的至少一个启动子序列和至少一个核糖体结合位点。
本发明还涉及水解由如上所定义的底物(I)和/或(II)至少部分形成的底物的方法，其特征在于包括使用如上所定义的至少一种酶和/或至少一种微生物。
根据本发明，具有几种(水解)谱互补的酶可能是有利的。因此，上述方法的变异方案之一是使用至少一种其他类型的酶和/或一种其野生型和/或重组生物学前体。在此变异方案中，底物至少部分由DPn小于40(优选20，特别优选12)的低聚物组成，该低聚物衍生自至少由二元酸单体(A)和二胺单体(B)缩聚而成的聚酰胺。
该变异方案的水解方法的特征是-产生聚合度(DPn)小于或等于3的低聚物，优选产生单体A和B，-并使用·如上所定义的至少一种酶和/或至少一种微生物，和至少一种其他类型的酶和/或至少一种其野生型/或重组的生物学前体，所述酶优选为*产黄菌株KI72的nyl-c基因控制下产生的E3酶，*和/或由所附肽序列SEQ ID NO3定义的称为PAM I的酶，这种酶尤其可由以编号I1495于1994年11月29日保藏并注册在CollectionNationale de Cultures de Microorganismes-Institut Pasteur PARIS的微生物产生。
可被上述酶水解的低聚物可通过酰胺型基团的热裂解和/或化学(酸)裂解获得。
本发明方法的其他有利的实施方案中使用酶(或多种酶)的生物学前体和含有下述物质的培养基，例如- 优选含有含至少一个酰胺基团的至少一种化合物的碳源，所述碳源必要时含有最好选自糖的补充物(特别优选蔗糖)，- 和必要时的能够诱导酶的产生而不被生物学前体所消耗的化合物，所述化合物优选选自酰胺。
本发明的酰胺酶水解方法具有广泛的应用，例如从酰胺化合物制备化合物的有机合成中或处理含聚酰胺材料的处理中。
特别是在产生聚酰胺聚合物起始材料的领域中有价值。
以下实施例用于说明本发明的特征、变异方案和优点，但不限制其范围。
附图描述- 序列表，按WIPO标准ST23而建，包括以下序列*SEQ ID NO1本发明酶PAM II的氨基酸序列；*SEQ ID NO2编码酰胺酶PAM II的DNA(pam II)。
*SEQ ID NO3PAM I的氨基酸序列；*SEQ ID NO2编码酶PAM I的DNA。
-

图1表示含有酰胺酶PAM I的编码基因(pam I)的质粒pXL2297的限制性酶切图谱。
- 图2表示含有PAM I的编码基因(pam I)的质粒pXL2564的限制性酶切图谱。
实施例实施例1野生菌株食酸丛毛单胞菌N12的分离和鉴定1.1 微生物筛选经过大量的微生物筛选操作从各种小生境中选择了菌株食酸丛毛单胞菌N12。1.2 该微生物的选择-鉴定借助于对PA6.6低聚物的酰胺酶活性试验来选择该微生物。这种活性的评价将在下文详细描述。
所选择的微生物然后由巴斯德研究所(Institut Pasteur)的细菌学实验室在其形态、生理、生化和可能的抗原特征基础上按完全传统的方式进行鉴定。
在这些结果和对低聚物AB、ABA、BAB和ABAB混合物的水解活性的基础上，对选择的该天然菌株进行更深入的鉴定。
实施例2食酸丛毛单胞菌N12的深入鉴定2.1 培养条件的最优化最佳培养基是具有如下组成的M9YE3- KH2PO4......................................... 0.75 g/l- K2HPO4.3H2O .................................. 1.00 g/l- Na2HPO4.12H2O ................................ 1.00 g/l- (NH4)2SO4..................................... 2.50 g/l- 酵母提取物 ......................................... 3.00 g/l- MgSO4.7H2O .................................... 1.00 mg/l- FeSO4.7H2O .................................... 2.30 mg/l- MnSO4.7H2O .................................... 2.70 mg/l- CoCl2.2H2O .................................... 2.30 mg/l- CaCl2.2H2O .................................... 1.50 mg/l- CuSO4.5H2O .................................... 0.25 mg/l- pH ................................................. 7.2并补充10g/l的己二酸盐。
在锥形烧瓶中准备培养基，装至其容积的1/5。
预培养基由10毫升LB培养基组成- 胰蛋白酶解胨 10g/l- 酵母提取物 5g/l- NaCl 10g/l用来自含M9YE3琼脂培养基和5g/l含酰胺基团化合物(如PA6.6的5- 10聚低聚物)的培养皿的菌落接种。
该培养物然后以1％接种在最佳培养基中(v/v)。培养结束后，离心(12000g，10分钟)获得的残余物在105℃干燥过夜，按所获得的干提取物确定细胞产量。
为了获得最大水解效率，含有至少一个酰胺基团的化合物最好加入在该培养基中。
根据本发明的另一优选特征，碳源除可溶成分外最好含有选自糖类的补充成分，特别优选蔗糖。
为了获得最大水解效率，含有至少一个酰胺基团的化合物最好加入在该培养基中。2.2 酶水解-野生型微生物活性的测定在pH 7.5的10.5mmol/l磷酸盐缓冲液中以1ml的终体积于28℃测定该活性。
表1给出了所获得的结果。
表1
实施例3本发明食酸丛毛单胞菌N12聚酰胺水解酶的纯化标准方法通过测定ABAB到BAB+A的水解活性监视该酶(PAM II)的活性。
3.1 术语DTE＝1，4-二硫赤藓糖醇EDTA酸＝乙二胺四乙酸CHAPS＝3-[(3-胆酰胺丙基)二甲铵]丙烷-1-磺酸盐SDS＝十二烷基硫酸钠
3.2 酶提取物的分离起始材料是来自在含有500毫升实施例2中所述的M9YE3培养基并补有10g/l己二酸盐的2.5升烧瓶中的20小时培养物的细胞。
利用超声处理的第一次提取25g食酸丛毛单胞菌细胞重悬于含有1mM DTE、5mM EDTA、100mM KCl和15％v/v甘油的100mM pH7.5 Tris-HCl缓冲液中。
该悬液在正在熔化的冰中进行不连续的超声处理(10％处理，90％静止)70分钟。
该悬液在50000g离心(Beckman超速离心机)1小时30分钟。
最后产生- 含有21mg/ml蛋白的90ml上清液(S1)，即含有1890mg比活性为6μmol/h/mg(11340单位)的蛋白；和- 残余物(C1)，将其重悬在含有2mM DTE、8mM CHAPS和15％v/v甘油的30ml 25mM pH8 Tris-HCl缓冲液中。
该残余物还含有聚酰胺酶II活性，随后进行处理。应该指出，在不含甘油的相同缓冲液中从90ml上清液除去盐后，可能纯化并再浓缩出新的非常细的酰胺酶II残余物，它显然在第一次离心中是可溶的。事实上，降低缓冲液的密度(通过除去甘油)加速非常细小颗粒的沉淀。这一信息与第一上清液不能(例如)在MonoQ柱上纯化的事实相一致，在整个梯度中都发现活性。
第一次离心残余物的补充处理重悬的残余物(C1)在4000g离心30分钟，以便沉淀在第一次超声处理中没有裂解的细胞。
然后收集上清液(S2)，在正在熔化的冰中进行不连续的超声处理(10％处理，90％静止)20分钟。然后再在50000g下离心2小时，收集上清液(S3)。
层析纯化步骤第一步上清液(S3)在用含有2mM DTE、8mM CHAPS和15％ v/v甘油的25mM pH8 Tris-HCl缓冲液平衡的MonoQ HR10/10柱上分三部分进行层析。用0-0.6M NaCl的60分钟线性梯度以3ml/分钟进行洗脱。聚酰胺酶II活性在约0.2M NaCl时以一个相当宽的峰被洗脱。合并活性部分，在Centriprep 10(Amicon)上浓缩至5毫升。
第二步向上述收集的5毫升中加入5ml含有1mM DTE、8mMCHAPS、1.5M硫酸铵和15％v/v甘油的25mM pH8 Tris-HCl缓冲液。这10毫升然后分两部分在用含有2mM DTE、8mM CHAPS、1M硫酸铵和15％ v/v甘油的25mM pH8 Tris-HCl缓冲液平衡的PhenylsuperoseHR10/10柱(Pharmacia)上进行层析。用1-0M硫酸铵的70分钟线性梯度以1.25毫升/分钟的速率洗脱。聚酰胺酶活性在约0.8M硫酸铵时被洗脱。合并活性部分，在Centriprep 10(Amicon)上浓缩至400微升。
第三步上述400微升分两部分在用含有2mM DTE、8mMCHAPS、150mM氯化钠和15％v/v甘油的100mM pH7.5 Tris-HCl缓冲液平衡的TSK G3000 SW柱(Supelco)上进行层析，以0.5ml/分钟洗脱。发现在分子量约30kDa以下没有活性。合并活性最高的流份，共5毫升，在用含有2mM DTE、8mM CHAPS和15％v/v甘油的25mM pH8 Tris-HCl缓冲液平衡并洗脱的PD10 Sephadex G25柱上脱盐。
第四步在PD10上脱盐得到的7毫升在用含有2mM DTE、8mMCHAPS和15％ v/v甘油的25mM pH8 Tris-HCl缓冲液平衡的MonoQHR5/5柱(Pharmacia)上进行层析。用0-0.6M NaCl的30分钟线性梯度以1ml/分钟进行洗脱。聚酰胺酶活性在约0.15M NaCl时以一个相当宽的峰被洗脱。合并活性部分，加入0.05％SDS后在Centriprep 10(Amicon)上浓缩至200微升。
第五步所收集的200微升在用含0.25％w/v SDS的pH6.8的40mM硫酸钠、20mM磷酸钠缓冲液平衡的TSK G3000 SW柱上进行层析。用电泳监视，聚酰胺酶以一个窄峰出现。该材料用于测序。
用电泳测定分子量聚丙烯酰胺凝胶电泳测定的分子量根据聚酰胺酶II样品的制备方法不同而不同。
存在2.5％SDS和5％巯基乙醇时，发现带在36-40kDa之间，但如果在90℃加热5分钟，同样的样品仅迁移至分子量约150kDa。根据其纯化方法，这一现象是一些膜相关蛋白的特征。
测序用第二个MonoQ HR10/10步骤代替Phenylsuperose步骤按标准方法从60克细胞制备的60微克聚酰胺酶，在0.25％ w/v SDS存在下用5微克LysC酶直接消化。所获得的片段在Vydac柱上纯化。
用传统的核苷酸测序技术得到序列SEQ ID NO1。
实施例4单体A和B通过仲酰胺键连接形成的低聚物在本发明的酶和PAM I水解酶的混合物作用下的酶水解本实施例不用纯的酶而用它们的生物学前体，即本发明的食酸丛毛单胞菌N12菌株和含有pam I基因(所附的SEQ ID NO4)并产生PAM I酶的菌株，所述菌株按以下方法构建。
这一构建的目的是获得pam I基因(编码PAM I酶)，该基因之前是λ噬菌体的核糖体结合位点，并在大肠杆菌色氨酸操纵子启动子下表达。为此，通过PCR技术用1994年12月29日保藏在CNCM的I1495菌株中的质粒pXL2297(图1)为模板在pam I起始密码子处造-Nde I限制位点。PCR扩增含pam I基因5’末端的208bp Nde I-Apa I片段，通过核苷酸引物对(5’-AGCAAGCTTGGAGGCCATATGAATACGAC-3’)和(5’-CACCGGTGGGCCCCTC-3’)小心地在Nde I位点上游引入Hind III位点。将扩增的Hind III-Apa I片段克隆到用Hind III和Apa I消化的pUC29(Benes等(1993)，基因(Gene)130151-152)中，通过在Apa I位点引入pXL2297的867bp Apa I片段重建pam I基因。这样，一个Nco I位点位于pam I终止密码子下游约30个核苷酸处。将该质粒临近的500bp NdeI-EcoR I和600bp EcoR I-NcoI片段插入在Nde I位点(位于色氨酸启动子紧下游)消化的pXL2158(专利FR 92-09882)中。
这样，质粒pXL2564(图2所示)是含有氨苄青霉素抗性基因和Ptrp-RBSc II表达盒控制下的pam I基因的pBR322(Sucliffe(1987)，核酸研究(Nucleic Acid Res.)52721)的衍生物。
将质粒pXL2564引入大肠杆菌株TG1中，并在氨苄青霉素LB上选择微生物。将含pXL2564的克隆(称为PAM I株)两次转移在琼脂平皿上，在含100μl/ml氨苄青霉素的M9葡萄糖培养基中按专利FR2 694571中所述方法于37℃培养。
食酸丛毛单胞菌N12菌株在上文2.1节中描述的相同条件下培养19小时。
使用了由单体A＝己二酸和B＝六亚甲基二胺(HMD)组成平均聚合度为4的低聚物。
将25.25g平均聚合度为8的低聚物重悬在300ml水中，加入含细胞(共3.1g)的200ml水。在氮气流下搅拌18小时。
将此溶液离心收集上清液(400ml)。测得上清液的干重为14g/l。取样用于分析己二酸和HMD的低聚物。
分析结果列在下表2中。
表2
所形成的己二酸单体的摩尔收率为66％，HMD的摩尔收率为58％。
单体和聚合度低于4的低聚物的摩尔收率以单体的摩尔百分数表示为72％。
序列表(1)一般信息(i)申请人(A)名称RHONE-POULENC FIBRES ET POLYMERES SA(B)街道25 Quai Paul Doumer(C)城市COURBEVOIE(E)国家法国(F)邮编92400(G)电话(33-1)47681234(H)传真(33-1)47681656(ii)发明名称酰胺的酶水解方法，具有酰胺酶活性的酶、和能产生这种酶的遗传前体(DNA)和微生物学前体(微生物)(iii)序列数目4(iv)计算机可读形式(A)媒介类型软盘(B)计算机IBM PC兼容(C)操作系统PC-DOS/MS-DOS(D)软件Patent In Release #1.0，Version #1.30(EPO)(vi)优先申请资料(A)申请号FR 95 08917(B)申请日1995年7月18日(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)长度421氨基酸(B)类型氨基酸
(D)拓扑结构线性(ii)分子类型蛋白质(xi)序列描述SEQ ID NO1Met Asn Arg Thr Tyr His Arg Arg Asp Val Leu Arg Ile Leu Gly Val1 5 10 15Gly Thr Ala Leu Gly Gly Ala Ala Leu Leu Gly Ala Cys Gly Gly Ser20 25 30Gly Gly Asn Glu Ala Pro Arg Glu Gln Ile Ala Ser Ser Leu Phe Ser35 40 45Thr Thr Pro Glu Asn Arg Ala Ala Thr Phe Arg Asn Ala Asp Arg Ile50 55 60Val Tyr Ser Arg Thr Ile Lys Arg Gly Ala Thr Thr Met Pro Leu Lys65 70 75 80Pro His His Val Ser Leu Ala Ser Leu Thr Tyr Asp Tyr Ala Gly Lys85 90 95Thr Thr Asn Val Asp Asp Tyr Met Gln Arg Asn Arg Thr Ala Gly Leu100 105 110Leu Ile Leu Lys Gly Gly Ala Val Ala Leu Glu Arg Tyr Gly Met Gly115 120 125Asn Thr Glu Thr Ser Arg Trp Thr Ser Trp Ser Val Ala Lys Ser Val130 135 140Thr Ser Thr Leu Val Gly Ala Ala Leu Lys Asp Gly His Ile Ala Ser145 150 155 160Leu Asp Asp Pro Val Thr Arg Tyr Val Thr Ala Leu Lys Gly Ser Ala165 170 175Tyr Glu Gln Asn Thr Ile Arg Glu Leu Leu Arg Met Thr Ser Gly Val180 185 190Arg Trp Ile Glu Ala Tyr Ser Glu Thr Gly Asn Ser Asp Ile Ala Arg195 200 205Leu Arg Glu Ala Tyr Ser Ser Gly Lys Ser Gly Ser Val Met Glu Leu210 215 220Met Arg Thr Arg Pro Arg Ala Ala Ala Pro Gly Ser Val Phe Asn Tyr225 230 235 240Ser Thr Gly Glu Ser Tyr Val Leu Gly Ala Val Val Ala Ala Ala Thr245 250 255Gly Thr Thr Leu Ser Asp Tyr Phe Ser Arg Lys Val Trp Ala Pro Phe260 265 270Gly Met Glu Ala Asp Gly Tyr Trp Gln Leu Asp Ser Glu Gly Gly Leu275 280 285Glu Met Gly Gly Ala Asn Phe Ser Ala Thr Leu Arg Asp Tyr Gly Arg290 295 300Phe Gly Leu Phe Phe Ser Arg Glu Gly Val Val Asn Gly Thr Ala Val305 310 315 320Leu Pro Leu Gly Trp Arg Ala Leu Ala Ser His Pro Asp Ser Pro Val325 330 335Thr Asn Tyr Gly Ala Leu Tyr Lys Asp Tyr Pro Leu Gly Tyr Gly Tyr340 345 350Gln Trp Trp Ala Leu Pro Gly Lys Asp Thr Thr Ile Pro Ala Gln Asp355 360 365Arg Pro Phe Thr Ala Gln Gly Ile Tyr Gly Gln Phe Ile Tyr Ile Asp370 375 380Pro Lys Glu Asp Val Val Ala Val Val Trp Ser Ala Trp Asn Asn Ser385 390 395 400Trp Val Asp Ser Ala Glu Phe Glu Thr Phe Ala Leu Leu Ser Lys Ala405 410 415Val Glu Met Leu Lys420(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)长度1263bp(B)类型核苷酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(基因组的)(iii)假拟无(iv)反义无(xi)序列描述SEQ ID NO2ATGAACAGGA CATACCACCG TCGCGATGTG CTGAGAATTT TGGGTGTTGG AACTGCACTT60GGAGGCGCGG CGCTTCTCGG CGCCTGTGGC GGCAGTGGAG GCAACGAAGC GCCTCGGGAA 120CAAATTGCAT CGAGCCTATT CAGCACAACT CCCGAAAACC GGGCGGCAAC TTTCCGGAAT 180GCCGACCGAA TTGTTTACTC ACGCACCATC AAGCGTGGCG CCACGACCAT GCCTCTGAAG 240CCGCACCATG TCTCGCTGGC GTCCCTCACA TATGACTATG CGGGGAAAAC CACTAACGTG 300GATGACTACA TGCAGCGCAA TCGCACAGCT GGATTGCTTA TCTTGAAAGG CGGAGCAGTC 360GCGCTGGAGC GCTATGGCAT GGGCAACACC GAAACGTCCC GGTGGACTTC ATGGTCAGTC 420GCCAAATCTG TCACCTCCAC CTTGGTTGGC GCAGCGCTGA AGGATGGGCA CATTGCCAGC 480CTAGACGACC CTGTGACGAG GTATGTGACG GCTTTAAAAG GCAGCGCGTA TGAACAGAAC 540ACAATACGTG AGCTGCTACG GATGACTTCC GGCGTACGTT GGATTGAAGC CTACAGCGAG 600ACGGGCAACT CCGACATTGC CCGACTGAGA GAGGCGTATA GTTCCGGGAA AAGCGGCAGC 660GTGATGGAGC TGATGCGCAC ACGCCCGCGT GCGGCAGCCC CTGGCAGTGT GTTTAACTAC 720AGCACAGGGG AGAGTTACGT GCTAGGCGCA GTAGTTGCAG CGGCCACTGG CACAACTTTG 780AGTGATTATT TCTCCCGGAA AGTATGGGCA CCGTTCGGCA TGGAGGCCGA TGGCTATTGG 840CAGCTGGATT CCGAAGGAGG ACTGGAAATG GGGGGCGCAA ATTTCAGCGC GACCTTGCGA 900GACTACGGGA GGTTCGGCTT GTTCTTCTCG CGCGAAGGCG TCGTCAATGG CACTGCTGTT 960CTGCCGCTTG GGTGGCGGGC TCTTGCTAGC CATCCCGATT CGCCAGTAAC CAACTACGGA 1020GCTCTTTACA AAGACTACCC GCTTGGCTAT GGATACCAAT GGTGGGCACT CCCGGGCAAA 1080GATACAACAA TTCCAGCTCA AGACCGCCCC TTCACCGCTC AAGGCATCTA CGGTCAGTTC 1140ATTTACATCG ATCCCAAGGA GGATGTTGTT GCCGTAGTGT GGAGTGCGTG GAACAACTCA 1200TGGGTCGACA GCGCCGAGTT TGAAACGTTT GCACTTCTCT CGAAGGCCGT AGAAATGTTG 1260AAA1263(2)SEQ ID NO3的信息(i)序列特征(A)长度355个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ii)分子类型蛋白质(xi)序列描述SEQ ID NO3Met Asn Thr Thr Pro Val His Ala Leu Thr Asp Ile Asp Gly Gly Ile1 5 10 15Ala Val Asp Pro Ala Pro Arg Leu Ala Gly Pro Pro val Phe Gly Gly20 25 30Pro Gly Asn Asp Ala Phe Asp Leu Ala Pro Val Arg Ser Thr Gly Arg35 40 45Glu Met Leu Arg Phe Asp Phe Pro Gly Val Ser Ile Gly Ala Ala His50 55 60Tyr Glu Glu Gly Pro Thr Gly Ala Thr Val Ile His Ile Pro Ala Gly65 70 75 80Ala Arg Thr Ala Val Asp Ala Arg Gly Gly Ala Val Gly Leu Ser Gly85 90 95Gly Tyr Asp Phe Asn His Ala Ile Cys Leu Ala Gly Gly Ala Cys Tyr100 105 110Gly Leu Glu Ala Gly Ala Gly Val Ser Asp Ala Leu Leu Glu Arg Leu115120 125Glu His Arg Thr Gly Phe Ala Glu Leu Gln Leu Val Ser Ser Ala Val130 135 140Ile Tyr Asp Phe Ser Ala Arg Ser Thr Ala Val Tyr Pro Asp Lys Ala145 150 155 160Leu Gly Arg Ala Ala Leu Glu Phe Ala Val Pro Gly Glu Phe Pro Gln165 170 175Gly Arg Ala Gly Ala Gly Met Ser Ala Ser Ala Gly Lys Val Asp Trp180 185 190Asp Arg Thr Glu Ile Thr Gly Gln Gly Ala Ala Phe Arg Arg Leu Gly195 200 205Asp Val Arg Ile Leu Ala Val Val Val Pro Asn Pro Val Gly Val Ile210 215 220Val Asp Arg Ala Gly Thr Val Val Arg Gly Asn Tyr Asp Ala Gln Thr225 230 235 240Gly Val Arg Arg His Pro Val Phe Asp Tyr Gln Glu Ala Phe Ala Glu245 250 255Gln Val Pro Pro Val Thr Glu Ala Gly Asn Thr Thr Ile Ser Ala Ile260 265 270Val Thr Asn Val Arg Met Sar Pro Val Glu Leu Asn Gln Phe Ala Lys275 280 285Gln Val His Ser Ser Met His Arg Gly Ile Gln Pro Phe His Thr Asp290 295 300Met Asp Gly Asp Thr Leu Phe Ala Val Thr Thr Asp Glu Ile Asp Leu305 310 315 320Pro Thr Thr Pro Gly Ser Ser Arg Gly Arg Leu Ser Val Asn Ala Thr325330 335Ala Leu Gly Ala Ile Ala Ser Glu Val Met Trp Asp Ala Val Leu Glu340 345 350Ala Gly Lys355(2)SEQ ID NO4的信息(i)序列特征(A)长度1068bp(B)类型核苷酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(基因组的)(iii)假拟无(iv)反义无(xi)序列描述SEQ ID NO4ATGAATACGA CACCGGTCCA CGCACTCACC GACATCGACG GCGGGATCGC CGTCGATCCC 60GCACCCCGGC TGGCCGGCCC TCCGGTCTTC GGGGGTCCGG GCAACGACGC CTTCGATCTC 120GCGCCGGTCA GGAGCACGGG CCGCGAGATG CTGCGGTTCG ACTTCCCCGG GGTCAGCATC 180GGCGCGGCGC ACTACGAGGA GGGGCCCACC GGTGCGACCG TGATCCACAT CCCCGCCGGC 240GCCCGCACCG CGGTGGACGC GCGGGGCGGG GCGGTGGGGC TCTCCGGCGG CTACGACTTC 300AACCACGCCA TCTGCCTGGC CGGCGGAGCC TGCTACGGGC TCGAGGCGGG CGCCGGGGTG 360AGCGACGCGC TCCTGGAACG CCTCGAGCAT CGCACCGGCT TCGCCGAGCT CCAGCTGGTG 420TCGTCGGCGG TCATCTACGA CTTCTCGGCG CGCTCCACCG CGGTCTACCC CGACAAGGCG 480CTCGGCCGCG CGGCGCTCGA ATTCGCCGTT CCCGGTGAGT TCCCGCAGGG GCGGGCGGGC 540GCGGGCATGA GCGCGTCCGC GGGCAAGGTG GACTGGGACC GCACCGAGAT CACCGGGCAG 600GGCGCGGCGT TCCGTCGTCT CGGCGACGTG CGCATCCTCG CCGTCGTCGT GCCGAACCCG 660GTCGGTGTGA TCGTGGACCG CGCGGGCACG GTGGTGCGCG GCAACTACGA CGCGCAGACC 720GGGGTCCGGC GCCACCCGGT GTTCGACTAC CAGGAGGCGT TCGCCGAGCA GGTCCCGCCC 780GTCACCGAGG CCGGCAACAC CACGATCAGC GCGATCGTCA CGAACGTGCG GATGAGCCCC 840GTCGAGCTGA ACCAGTTCGC CAAGCAGGTG CACAGTTCGA TGCACCGCGG CATCCAGCCG 900TTCCACACCG ACATGGACGG CGACACGCTC TTCGCCGTCA CCACCGACGA GATCGATCTG 960CCGACGACCC CGGGGTCGTC GCGCGGGCGG CTGTCGGTGA ACGCGACCGC GCTCGGCGCG 1020ATCGCCTCCG AGGTGATGTG GGACGCCGTC CTCGAGGCCG GCAAGTAG 1068
权利要求
1.水解(聚)酰胺的方法，其特征在于→对含有下式(I)(聚)酰胺的底物进行酶水解
其中·A和B为单体单元，·R1和R3为相同或不同(优选不同)的二价基团，代表取代或未取代、直链或支链的(环)亚烷基、亚芳基或亚芳烷基，其中芳香基团任选为缩聚物，亚烷基的碳原子数大于或等于4，优选在4和12之间，·R2为选自氢和/或最好具有1-6个碳原子的烷基的相同或不同(优选相同)的基团，·X为*X1＝OH、OM或OR4，其中M选自金属，优选碱金属和碱土金属，R4为含1-6个碳原子的直链或支链烷基，*或X2＝
其中R2和R3如上所定义，R5和R6相同或不同，与上述R2的定义相同，·Y为*Y1＝氢，*或Y2＝
其中R1如上所定义，Z为氢，定义同M的M1，或R4，条件是-a- 如果X＝X1，则Y＝Y1或Y2，-b- 如果X＝X2，则Y＝Y2，·最后，p为1-4，优选1-3；且→获得单体A和单体B。
2.具有酰胺酶活性的酶，其特征在于- ①→它对特别是下式(I)(聚)酰胺底物有活性
其中A和B为单体单元，·R1和R3为相同或不同(优选不同)的二价基团，代表取代或未取代、直链或支链的(环)亚烷基、亚芳基或亚芳烷基，其中芳香基团任选为缩聚物，亚烷基的碳原子数大于或等于4，优选在4和12之间，·R2为选自氢和/或最好具有1-6个碳原子的烷基的相同或不同(优选相同)的基团，·X为*X1＝OH、OM或OR4，其中M选自金属，优选碱金属和碱土金属，R4为含1-6个碳原子的直链或支链烷基，*或X2＝
其中R2和R3如上所定义，R5和R6相同或不同，与上述R2的定义相同，·Y为*Y1＝氢，*或Y2＝
其中R1如上所定义，Z为氢，定义同M的M1，或R4，条件是-a- 如果X＝X1，则Y＝Y1或Y2，-b- 如果X＝X2，则Y＝Y2，·最后，p为1-4，优选1-3；-②→它能够将上述底物(I)转化成单体A和单体B。
3.特别根据权利要求2的具酰胺酶活性的酶，其特征在于它包含所附SEQ ID NO1所示的肽序列或与SEQ ID NO1具有至少80％、优选至少90％、特别优选至少95％同源性的同源肽序列。
4.根据权利要求2或3的酶，它特别对下式(II)的(聚)酰胺型底物具有酰胺酶活性
其中·R2和R3如上所定义，·U和V分别与权利要求1中式(I)下X1和Y1的定义相同，·q＝1-8。
5.根据权利要求1-4任一项的酶，其特征在于它能水解含有至少一个羧基末端基团的底物(I)和(II)。
6.根据权利要求1-5任一项的酶，其特征在于它-对ABAB型四聚体形成的底物(I)有活性，-能够以大于或等于1000的比活性(US)将该底物转变成三聚体ABA+A，比活性以在给定条件下测定的被水解ABAB的μmol×h-1×mg-1表示。
7.根据权利要求1-6任一项的酶，其特征在于它- 对三聚体ABA形成的底物(I)有活性，- 能够以大于或等于1000的比活性(US)将该三聚体转变为二聚体AB和单体B，比活性以在给定条件下测定的水解的AB的μmol/h.mg酶表示。
8.根据权利要求1-7任一项的酶，其特征在于它-对AB型二聚体形成的底物(I)有活性，-能够以大于或等于1500的比活性(US)将该二聚体转变为单体A和B，比活性以在给定条件下测定的水解的AB的μmol/h.mg酶表示。
9.根据权利要求1-8任一项的酶，其特征在于它由食酸丛毛单胞菌(N12)型微生物，优选由以编号I1522于1995年1月4日保藏并注册在CollectionNationale de Cultures de Microorganismes的同样类型菌株，和/或由它们的重组微生物产生。
10.微生物，其特征在于它能够产生根据权利要求1-9任一项的酶。
11.根据权利要求10的微生物，其特征在于它由食酸丛毛单胞菌，优选由以编号I1522于1995年1月4日保藏并注册在Collection Nationale deCultures de Microorganismes-InstitutPasteur PARIS的菌株，和/或由其重组微生物组成。
12.编码具有酰胺酶活性的酶的DNA序列，其特征在于它选自下列序列- 如所附序列表中SEQ ID NO2所示并编码至少一种具酰胺酶活性的酶的DNA序列，- 由于遗传密码的简并性造成的该序列的类似物，和- 与上述序列或与其至少一个片段杂交并编码具酰胺酶活性的酶的DNA序列。
13.从权利要求12的上述DNA序列表达产生的酶。
14.微生物，其特征在于它含有一个表达盒，包括权利要求12的DNA序列和视需要可选择的位于其上游的至少一个启动子序列和至少一个核糖体结合位点。
15.水解由如权利要求1-2和权利要求3中分别定义的底物(I)和/或(II)至少部分形成的底物的方法，其特征在于它包括使用权利要求2-9和13任一项的至少一种酶和/或权利要求10、11或14任一项的至少一种微生物。
16.水解至少部分由DPn小于40，优选20，特别优选12的低聚物组成的底物的方法，所述低聚物衍生自至少由如权利要求1和2所定义的二元酸单体(A)和二胺单体(B)缩聚而成的聚酰胺，其特征在于- 它产生聚合度(DPn)小于或等于3的低聚物，优选产生单体A和B，- 并使用·权利要求2-9和13任一项所定义的的至少一种酶和/或权利要求10、11或14任一项的至少一种微生物，·至少一种其他类型的酶和/或至少一种其野生型和/或重组的生物学前体，所述酶为*产黄菌株KI72的nyl-c基因控制下产生的E3酶，*和/或由所附序列SEQ ID NO3定义的称为PAMI的酶，这种酶尤其可由以编号I1495于1994年11月29日保藏并注册在CollectionNationale de Cultures de Microorganismes-Institut Pasteur PARIS的微生物控制下产生。
全文摘要
本发明涉及酶水解6.6聚酰胺成为己二酸单体和六亚甲基二胺的方法。还涉及特别对衍生自6.6聚酰胺和/或6聚酰胺的低聚物底物有酰胺酶活性的酶,其特征在于它由所附序列表中SEQIDNO∶2相应的肽序列组成。本发明还涉及编码这种酶的DNA及其生物学前体;能够产生该酶的微生物和利用这种酶和/或微生物的水解方法。
文档编号C12N15/09GK1193348SQ9619638
公开日1998年9月16日 申请日期1996年7月17日 优先权日1995年7月18日
发明者J·克罗泽特, D·法切尔, O·法里－布勒, C·朱达特, D·佩特里, J·皮尔拉德, D·蒂巴特, C·吉顿 申请人:罗纳普朗克纤维和聚合物股份有限公司