专利名称：来源于无枝酸菌属的蛋白酶的制作方法
技术领域：
本发明涉及新的蛋白酶。更具体地说，本发明涉及可从无枝酸菌属和拟无枝酸菌属的菌株获得的蛋白酶。此外本发明涉及制备本发明的蛋白酶的方法，以及该蛋白酶在制备乳酪的方法中和在去垢添加剂和去垢组合物中的用途。
背景技术：
蛋白酶具有广泛的商业用途，并且已成功地在很不相同的工业领域(如去垢剂、皮革、化学、农业、制药、食品和奶制品)中发挥作用。
为了向工业上提供更多的可选择的完善的酶促方法，和为了给出改善的成本/性能比，进行了发现新酶的广泛研究。
1986年，描述了称为无枝酸菌属和拟无枝酸菌属的两个新诺卡氏菌状放线菌的属[Lechevalier M P，Prauser H，Labeda D P和Ruan J S；Int，J.Sys.Bacteriol.1986 36(1)29-37]。然而，从无枝酸菌属或拟无枝酸菌属获得的蛋白酶还没有被分离或确定特征。
发明概要本发明的目的是提供在工业应用中有用的新的蛋白酶。本发明的一个特殊目的是提供胰蛋白酶的微生物替代物。
因此本发明提供了一种新的来源于无枝酸菌属的菌株或拟无枝酸菌属的菌株的蛋白酶。
另一方面，本发明提供了一种制备本发明的蛋白酶的方法，该方法包括在包含碳和氮源以及其它无机盐的合适的营养培养基中培养无枝酸菌属的蛋白酶产生菌株或拟无枝酸菌属的蛋白酶产生菌株，接着回收所说的蛋白酶。
第三方面，本发明提供了一种制备本发明的蛋白酶的方法，该方法包括分离编码蛋白酶的DNA片段；在适当的质粒载体中组合所说的DNA片段与适当的表达信号；将所说的质粒载体引入到适当的宿主中，其中质粒作为自主复制质粒或整合到宿主染色体中；在导致蛋白酶表达的条件下培养所说的宿主有机体；并且从培养基回收所说的蛋白酶。
还一方面，本发明提供了制造乳酪的方法、包含本发明的蛋白酶的去垢组合物以及去垢添加剂。
附图简要描述参照附图进一步说明本发明，在附图中
图1显示人类胰岛素的结构，箭头表示胰岛素被本发明的酶切开的位置；图2显示胰高血糖素的结构，箭头表明胰岛素被本发明的酶切开的位置；图3显示在人类胰岛素分别受到胰蛋白酶(图3A)和本发明的酶(ProtA，图3B)的作用时获得的色谱图(在温育120分钟后获得)；图4显示在胰高血糖素受到胰蛋白酶的作用时获得的色谱图(分别在温育15、60和120分钟后获得)；图5显示在胰高血糖素受到本发明的酶(ProtA)的作用时获得的色谱图(分别在温育15、60和120分钟后获得)。
发明详述本发明提供了新的来源于无枝酸菌属的菌株或拟无枝酸菌属的菌株的蛋白酶。
在本发明中，来源于无枝酸菌属的菌株或拟无枝酸菌属的菌株的酶包括由这样的菌株天然产生的(从这些菌株回收的或者由从这样的菌株分离的DNA序列编码的)和在用所说的DNA序列转化的宿主有机体中产生的酶。本发明的酶可以以不同的方式表征为无枝酸菌属的菌株或拟无枝酸菌属的菌株的内源酶。术语“内源”被认为是限定酶的基因组来源(不能是何种用于产生酶的有机体，天然的或重组的)的技术术语。
在一个优选的实施方案中，本发明的蛋白酶是来源于拟无枝酸菌属的菌株的一种蛋白酶。更优选地，所说的蛋白酶来源于地中海拟无枝酸菌的菌株、嗜甲基拟无枝酸菌的菌株、苛求拟无枝酸菌的菌株、东方拟无枝酸菌的菌株、粗糙拟无枝酸菌的菌株、或硫磺拟无枝酸菌的菌株。
优选地，本发明的蛋白酶来源于地中海拟无枝酸菌的菌株。更优选地，所说的蛋白酶来源于菌株地中海拟无枝酸菌ATCC 13685、菌株地中海拟无枝酸菌ATCC 21271、菌株地中海拟无枝酸菌ATCC 21411、菌株地中海拟无枝酸菌ATCC 21789、菌株地中海拟无枝酸菌ATCC 27642、菌株地中海拟无枝酸菌ATCC 31064、菌株地中海拟无枝酸菌ATCC 31065、菌株地中海拟无枝酸菌ATCC 31066，或者它们的突变体或变异体。
在更优选的实施方案中，本发明的蛋白酶来源于菌株地中海拟无枝酸菌ATCC 13685，或其突变体或者变异体。
在另一个优选的实施方案中，本发明的蛋白酶是来源于无枝酸菌属的菌株的一种蛋白酶。更优选地，所说的蛋白酶来源于Amycolata autotrophica的菌株、氧化烃无枝酸菌的菌株、或土星无枝酸菌的菌株。物理-化学特征在更特定的具体例中，本发明的蛋白酶可以进一步用一种或多种下列物理-化学特征来表征。
所说的蛋白酶是一种能够切开肽链的赖氨酰和/或精氨酰键的内-肽酶。这一特异性活性是胰蛋白酶的特征，具有这种胰蛋白酶特征性活性的酶称为类胰蛋白酶的酶。类胰蛋白酶的蛋白酶是对工业特别有益的蛋白酶的一个亚组。胰蛋白酶是动物来源的，通过从屠宰的动物(通常是猪)的胰腺提取获得。极少存在微生物来源的替代物。这样，本发明提供了胰蛋白酶的另一种微生物替代物。
当在pH 9.5下在酪蛋白底物上测定时，所说的蛋白酶在低于15℃到高于70℃的温度范围内具有活性，最适温度在从30到45℃的范围内，约40℃。
当在25℃下在酪蛋白底物上测定时，所说的蛋白酶在低于6到高于11的pH范围内具有活性，最适pH在约7到约11的范围内，在从约8到约11的范围内显示高于90％的活性。
通过SDS-PAGE测定时，所说的蛋白酶具有大约33kDa的分子量。
当用在LKB AmpholineFAG平板上(pH3.5-9.5)的等电聚焦测定时，所说的蛋白酶具有大约9.1的等电点(pI)。
所说的蛋白酶显示对Z-Arg-pNA(ZAPA)底物的强的活性，但在Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA底物上没有活性。
在标准液态和粉剂去垢组合物中40℃下，本发明的蛋白酶稳定1小时。免疫-化学性质本发明的蛋白酶与来源于菌株地中海拟无枝酸菌ATCC 13685的那些蛋白酶具有相同的或部分相同的(即至少部分相同的)免疫化学性质。
可以通过免疫学交叉反应等同性试验测定免疫化学性质。等同性试验可以通过公知的0uchterlony双免疫扩散法进行，或者通过按照I.M.Roitt；Immunology，Gower医学出版社，1985，或者按照N.H.Axelsen；免疫沉淀和凝胶技术手册；Blackwell科学出版社，1983，第5和14章的串联交叉免疫电泳进行。术语″免疫化学等同性″(抗原等同性)和″部分免疫化学等同性″(部分抗原等同性)在Axelsen，同上，第5，19和20章和在Roitt，同上，第6章中有描述。
用于在免疫学试验中的单特异性抗血清能够在兔中针对本发明的纯化酶产生，例如，如在Axelsen等，同上，或Axelsen等，定量免疫电泳手册，Blackwell科学出版社(1973)第23章中所述。制备方法本发明的蛋白酶可以通过培养无枝酸菌属的菌株或拟无枝酸菌属的菌株获得。
因此，在另一个方面，本发明提供了制备蛋白酶的方法，该方法包括在包含碳和氮源以及其它无机盐的合适的营养培养基中培养无枝酸菌属的蛋白酶产生菌株或拟无枝酸菌属的蛋白酶产生菌株，接着回收所说的蛋白酶。
在一个优选的实施方案中，蛋白酶产生菌株是地中海拟无枝酸菌的菌株，嗜甲基拟无枝酸的菌株，苛求拟无枝酸菌的菌株，东方拟无枝酸菌的菌株，粗糙拟无枝酸菌的菌株或硫磺拟无枝酸菌的菌株。
优选地，所说的蛋白酶产生菌株是地中海拟无枝酸菌的菌株。更优选地，所说的蛋白酶产生菌株是菌株地中海拟无枝酸菌ATCC 13685、菌株地中海拟无枝酸菌ATCC 21271、菌株地中海拟无枝酸菌ATCC 21411、菌株地中海拟无枝酸菌ATCC 21789、菌株地中海拟无枝酸菌ATCC27642、菌株地中海拟无枝酸菌ATCC 31064、菌株地中海拟无枝酸菌ATCC 31065、菌株地中海拟无枝酸菌ATCC 31066，或者它们的突变体或变异体。最优选地，所说的蛋白酶产生菌株是菌株地中海拟无枝酸菌ATCC 13685或其突变体或者变异体。
在另一个优选的实施方案中，所说的蛋白酶产生菌株是Amycolataautotrophica的菌株、氧化烃无枝酸菌的菌株或土星无枝酸菌的菌株。
如本文所限定的，突变体或者变异体菌株是保持所说菌株产生相同的各自的蛋白酶能力的菌株。
所说的蛋白酶产生菌株可以在需气条件下在营养培养基中培养，所说的培养基包含可同化的碳和氮源以及其它必需营养物，并且可以按照现有技术中的原理组成。
适合的碳源是碳水化合物，如蔗糖、葡萄糖和淀粉或包含诸如大豆渣、棉子粉、谷粒、麦芽、稻米和高粱之类的物质的碳水化合物。在培养基中所掺入的碳水化合物浓度可以广泛地变化，例如多达25％和低至1-5％，但是通常8-10％是合适的，百分比以葡萄糖的当量计算。
在营养培养基中的氮源可以是无机和/或有机物。合适的无机氮源是硝酸盐和铵盐。在有机氮源中，大量的常规用于发酵过程。说明性例子是大豆粉、棉子粉、花生粉、酪蛋白、玉米、玉米浆、酵母膏、尿素和清蛋白。此外，营养培养基也应该包含通常的微量物质。
在培养之后，蛋白酶可以用用于从培养液中分离和纯化多肽的常规方法回收。熟知的纯化方法包括通过离心或过滤从培养基分离细胞，借助盐(如硫酸铵)沉淀培养基的蛋白质组分，和色谱方法如离子交换色谱法、凝胶过滤色谱法、亲合色谱法等等。
然而，本发明的蛋白酶也可以并且更优选地经本领域已知的方法用重组DNA技术获得。就此而言，可以参考Sambrook等；分子克隆实验室手册；冷泉港，纽约，1989。一般来说，该方法包括下列步骤分离编码蛋白酶的DNA片段；在适当的质粒载体中组合所说的DNA片段与适当的表达信号；将所说的质粒载体引入到适当的宿主(特别是大肠杆菌菌株、芽孢杆菌属的菌株、曲霉属的菌株或链霉菌属的菌株)中，其中质粒作为自主复制质粒或整合到宿主染色体中；在导致蛋白酶表达的条件下培养所说的宿主有机体；并且从培养基回收所说的蛋白酶。工业应用本发明的蛋白酶可以在十分不同的工业应用中有用。特别是本发明的蛋白酶作为胰蛋白酶的微生物替代物可以找到其用途。这样，主要在食品和奶制品工业中，在去垢剂工业，在皮革工业和在制药工业中可以找到其用途。
在一个优选的实施方案中，本发明的蛋白酶可以用于制造乳酪的方法中，在这一方法中，所说的蛋白酶在该方法的过程中加入到奶组分和其任何部分中。尤其是，在这样一种乳酪制造方法中，本发明的酶作为粗制凝乳酶、作为乳酪成熟酶或作为组合的粗制凝乳酶和乳酪成熟酶可以找到其用途。
实验发现，当在乳酪制造方法的过程中添加到奶中时，本发明的蛋白酶在乳酪中增加可溶性氮的量，进而加速乳酪的天然成熟而实际上不腐坏乳酪。
在另一个优选的实施方案中，本发明的蛋白酶可以用于去垢组合物中。去垢组合物本发明的蛋白酶可以典型地是去垢组合物的组分。就此而言，其可以包含在非粉末颗粒、稳定化液体或保护酶形式的去垢组合物中。非粉末颗粒可以如在美国专利4,106,991和4,661,452(均属于Novo Industri A/S)中公开的方法产生，并可有可无地按照本领域已知的方法包衣。蜡状包衣物质的例子是具有1000至20000的平均分子量的聚(环氧乙烷)产物(聚乙二醇，PEG)；具有16至50个环氧乙烷单位的乙氧基化壬酚；乙氧基化脂肪醇(其中所说的醇包含12至20个碳原子，并且其中具有15至80个环氧乙烷单位)；脂肪醇；脂肪酸；脂肪酸的单、双和三甘油酯。适合于用于流化床技术中的形成薄膜的包衣物质的例子在GB 1483591中给出。液态酶制剂可以按照成熟的方法通过添加例如，多羟基化合物来稳定，所说的多羟基化合物如丙二醇，糖或糖醇，乳酸或硼酸。其它酶稳定剂是本领域公知的。可以按照EP238,216中公开的方法制备保护酶。
本发明的去垢组合物可以是任何方便的形式，例如为粉剂、颗粒、糊状物或液体。液体去垢剂可以是含水的，其典型地包含高达70％的水，并且典型地包含0-30％的有机溶剂，或者可以是不含水的。
去垢组合物包含一种或多种表面活性剂，这些表面活性剂各种可以是阴离子的，非离子的，阳离子的或两性离子的。去垢剂通常包含0-50％的阴离子表面活性剂，如线性的烷基苯磺酸盐(LAS)、α-烯烃磺酸盐(AOS)、烷基硫酸盐(脂肪醇硫酸酯)(AS)、脂肪醇乙氧基硫酸盐(AEOS或AES)、仲烷烃磺酸盐(SAS)、α-硫代脂肪酸甲酯、烷基-或链烯基琥珀酸或肥皂。它也可以包含0-40％的非离子表面活性剂，如脂肪醇乙氧基化物(AEO或AE)、羧化脂肪醇乙氧基化物、壬基苯酚乙氧基化物、烷基多糖苷、烷基二甲基胺氧化物、乙氧基化脂肪酸单乙醇酰胺、脂肪酸的单乙醇酰胺或多羟基烷基脂肪酸酰胺(例如在WO92/06154中描述的)。
去垢组合物还可以包含一种或多种其它酶，如淀粉酶、脂酶、角质酶、蛋白酶、纤维素酶、过氧化物酶和/或氧化酶，如漆酶。
去垢剂可以包含1-65％的去垢助剂或络合剂，如沸石、二磷酸盐、三磷酸盐、膦酸酯、柠檬酸盐、次氮基三乙酸(NTA)、乙二胺四乙酸(EDTA)、二亚乙基三胺五乙酸(DTMPA)、烷基-或链烯基琥珀酸、可溶性硅酸盐或层状硅酸盐(例如，来源于Hoechst的SKS-6)。去垢剂也可以是非助剂化的，即基本上不含有去垢助剂。
去垢剂可以包含一种或多种聚合物。例子是羧甲基纤维素(CMC)、聚(乙烯吡咯烷酮)(PVP)、聚乙二醇(PEG)、聚(乙烯醇)(PVA)、聚羧化物，如聚丙烯酸酯、马来酸/丙烯酸共聚物和异丁烯酸月桂基酯/丙烯酸共聚物。
去垢剂可以包含含有过氧化氢源的漂白系统，如能够与过酸-形成漂白激活剂组合的过硼酸盐或过碳酸盐，所说的激活剂如四乙酰乙二胺(TAED)或壬酰羟苯磺酸盐(NOBS)。另外，漂白系统可以含有过氧酸，例如，酰胺、酰亚胺或砜型的。
本发明的去垢组合物的酶可以用常规稳定剂稳定，所述稳定剂例如多羟基化合物，如丙二醇或甘油、糖或糖醇、乳酸、硼酸或硼酸衍生物(如，芳族硼酸酯)，组合物可以如WO92/19709和WO92/19708中的描述配制。
去垢剂也可以包含其它常规的去垢剂组分，例如，织物调理剂，包括粘土、泡沫促进剂、抑泡剂、抗腐蚀剂、污物-悬浮剂、抗污物-再沉积剂、染料、杀菌剂、荧光增白剂或香味剂。
pH值(在使用浓度下在水溶液中测量)通常是中性的或碱性的，例如，在pH 7-11的范围内。
在本发明的范围内的去垢组合物的特殊形式包括1)具有至少600g/l的堆积密度的制成颗粒的去垢组合物，该组合物包含
<p>2)具有至少600g/l的堆积密度的制成颗粒的去垢组合物，该组合物包含
3)具有至少600g/l的堆积密度的制成颗粒的去垢组合物，该组合物包含
4)具有至少600g/l的堆积密度的制成颗粒的去垢组合物，该组合物包含
5)一种含水液体去垢组合物，该组合物包含
6)一种含水液体去垢组合物，该组合物包含
7)具有至少600g/l的堆积密度的制成颗粒的去垢组合物，该组合物包含
8)制成颗粒的去垢组合物，该组合物包含
9)制成颗粒的去垢组合物
10)含水液态去垢组合物，该组合物包含
11)含水液态去垢组合物，该组合物包含
12)具有至少600g/l的堆积密度的制成颗粒的去垢组合物，该组合物包含
13)如1)-12)所描述的去垢剂配方，其中所有的线性烷基苯磺酸盐被(C12-C18)烷基硫酸盐代替。
14)具有至少600g/l的堆积密度的制成颗粒的去垢组合物，该组合物包含
15)具有至少600g/l的堆积密度的制成颗粒的去垢组合物，该组合物包含
<p>16)如1)-15)中描述的去垢剂配方，其含有稳定的或包胶的过酸，该组分作为额外的组分或者作为已具体限定的漂白系统的替换物。
17)如1)，3)，7)，9)和12)中所描述的去垢剂配方，其中过硼酸盐由过碳酸盐代替。
18)如1)，3)，7)，9)，12)，14)和15)中所描述的去垢剂配方，其还包含锰催化剂。锰催化剂可以是″低温漂白的有效的锰催化剂″，自然369，1994，第637～639页中所描述的一种或多种化合物。
19)配制成非水的去垢剂液体的去垢组合物，其包含液态非离子表面活性剂如，例如，线性的烷氧基化伯醇，助剂系统(例如磷酸盐)，酶和碱。去垢剂也可以包含阴离子表面活性剂和/或漂白系统。
本发明的蛋白酶可以以常规使用的浓度掺入到去垢剂中，预期在本发明的去垢组合物中，本发明的蛋白酶可以以相应于每升洗涤液0.00001-1mg(以纯酶蛋白计算)的量添加。
实施例参照下列实施例进一步说明本发明，这些实施例无意于用来以任何方式限制所要求的本发明的范围。实施例1培养实施例在具有以下组成的培养基中培养菌株地中海拟无枝酸菌ATCC13685大豆粉 20g/lNa2HPO4·12H2O 10g/lK2HPO42g/lPluronicTM3g/l蔗糖 30g/lpH调节至6.7在30℃培养7天后，经离心分离上清液。实施例2纯化实施例对按照实施例1所获得的上清液采用标准的纯化技术，包括以硫酸铵沉淀，其后为阴离子交换和阳离子交换色谱分离。
在室温搅拌30分钟下进行硫酸铵沉淀(80％饱和)。分离沉淀，再悬浮，经0.45mm滤器过滤。将溶液对包含50mM硼酸、10mM 3，3-二甲基戊二酸(DMG)、2mM CaCl2，pH 6.5的缓冲液(缓冲液A)透析。
阴离子交换色谱在pH 7.5下利用DEAE SephadexTMA50(Pharmacia)进行。获得存在于流出物中的解蛋白活性，将其用于阳离子交换色谱。将样品调整到pH 6，然后以5ml/分钟用于2.6cm(内径)×10cm SSepharoseTMHP柱(Pharmacia)，该柱已用以上缓冲液A平衡过。以5倍柱床体积的缓冲液A洗涤该柱，用超过10倍柱床体积的在缓冲液A中的0到0.3M NaCl线性梯度液洗脱蛋白酶。
收集5ml组分并试验类胰蛋白酶的蛋白酶活性。将10ml蛋白酶溶液添加到190ml在100mM TRIS-HCl(pH9)中的Benz-Arg-pNA(ZAPA)底物中。在室温3分钟内测定405nm的吸收率增加。实施例3确定酶特征测定解蛋白活性可以以酪蛋白为底物测定解蛋白活性。
一个酪蛋白蛋白酶单位(CPU)被定义为在标准条件(即在25℃和pH9.5下温育30分钟)下每分钟释放1mM伯氨基(通过与丝氨酸标准品比较测定)的酶量。
更详细地描述这种分析方法的一份材料AF 228/1基于要求可以从丹麦的Novo Nordisk A/S获得，因此，这份材料包括在参考文献中。温度和pH依赖性活性以酪蛋白为底物测定温度活性关系。采用改进之处在于温育温度在15到70℃之间变化的以上描述的解蛋白活性测定法。结果示于表1中。
所述酶在低于15℃到高于70℃的温度范围内具有解蛋白活性，最适温度在30到45℃的范围内，约40℃(在pH 9.5下测定)。表1温度依赖性活性温度(℃) 活性(CPU)159304540100507602703用相同的方法测定活性对pH的依赖性，采用调节到在6至11pH范围内的预定pH值的缓冲液。结果示于表2中。
所说的蛋白酶在低于6到高于11的pH范围内具有解蛋白活性，最适pH在约7到约11的范围内，在从约8到约11的pH范围内显示高于90％的活性(在25℃下测定)。表2pH依赖性活性pH活性(CPU)643782810099510 9111 99SDS-PAGE采用4-25％梯度凝胶(Novex)进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。凝胶以考马斯蓝染色。标准分子量标记来源于Pharmacia。测得约33kDa的分子量(MW)。等电点在LKB AmpholineFAG平板(pH3.5-9.5)上进行等电聚焦，其后将包含1％脱脂奶的琼脂糖覆盖凝胶(pH 9.3)覆盖到等电聚焦凝胶上，温育一段合适的时间，在pH 9.3周围显示出一个清晰的带。底物特异性通过以上所述的等电聚焦获得的清晰带在Z-Arg-pNA(ZAPA)底物上显示强的活性，但在Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA底物上没有活性。去垢剂稳定性将从实施例1获得的10ml上清液加到硝基纤维素滤纸(Schleicher &Schüell BA 85)上。将硝基纤维素滤纸分别在40℃下在两种美国标准去垢剂(一种标准的液体去垢剂和一种标准的粉末去垢剂)中，和在20℃下在对照硼酸盐缓冲液中温育1小时。
通过将硝基纤维素滤纸放到脱脂奶-琼脂糖平板上，接着在室温下温育一夜使解蛋白活性可视化。通过比较暴露在去垢剂下的蛋白酶的清晰带和对照制剂的清晰带估价去垢剂稳定性。
当暴露在去垢剂下时，本发明的蛋白酶显示出基本上没有活性降低。实施例4类胰蛋白酶活性已知具有对相同的氨基酸的特异性的蛋白酶不必以相同的方式水解蛋白质或肽，参见例如胰蛋白酶和纤维蛋白溶酶，两者都是赖氨酸和精氨酸键特异性的。当在小的pNA-肽上试验时，本发明的蛋白酶已显示出对赖氨酸和精氨酸的特异性。由于针对pNA-肽的活性是外-活性，待水解的C-N键不是肽键，因此其明显着重水解更多的类蛋白质底物。
为此目的，选择人类胰岛素。尽管在大小上，人类胰岛素类似具有带硫键的折叠结构的蛋白质，然而其确实着重水解较少结构多肽(胰高血糖素)中的肽键。
在这一实施例中，将本发明的蛋白酶(指定的蛋白酶A，由按照实施例1-2的方法获得)的活性与猪胰蛋白酶(可从丹麦的Novo Nordisk A/S获得)的活性比较。用反相HPLC分离降解产物。色谱图显示出不同蛋白酶的作用之间的明显的区别。因此决定跟踪降解的时间进程，以确定各蛋白酶的优先次序。对分离的胰高血糖素的片段进行N-末端氨基酸分析，从而使得能够准确地确定水解的肽键。pNA-肽将小肽(3-4个氨基酸)与对-硝基酰苯胺(pNA)在C-末端连接。当水解时，pNA基团被释放，产生能够在405nm经分光光度法测定的黄色。
反应条件是30℃，pH9.5，采用0.05M硼酸盐/KCl缓冲液，底物浓度是2.5mM pNA-肽。
用自动系统<Cobas>FARA测定在405nm的吸收率随时间的变化，1单位活性(1U)被定义为每分钟能够水解1mM pNA-肽的酶的量。
使用了下列pNA-肽N-suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA(AAPF；Sigma S-7388)MeO-suc-Ala-Ala-Pro-Met-pNA(AAPM；Protogen 03-32-0048)N-suc-Ala-Ala-Pro-Leu-pNA(AAPL；Sigma S-3513)N-tos-Gly-Pro-Lys-pNA(GPK；Sigma T-6140)N-tos-Gly-Pro-Arg-pNA(GPR；Sigma T-1637)胰岛素和胰高血糖素水解产物底物是分别溶解在Britton & Robinson缓冲液(pH 9.5)中的人类胰岛素(图1，可从丹麦的Novo Nordisk A/S获得)和胰高血糖素(图2，可从丹麦的Novo Nordisk A/S获得)。温度是37℃，反应时间分别是15，30，60和120分钟。酶浓度是1CPU/l，该CPU单位已在以上实施例3中所描述的解蛋白活性的测定中定义过。
向1ml底物中加入0.150ml酶溶液。在所需时间的培养后，通过添加0.100ml1M HCl终止反应。通过0.45mm滤器(Sartorius，德国)过滤反应混合物，准备用于HPLC分析。HPLC分析HPLC系统来源于Shimadzu2个LC-8A泵，SCL-6B控制器，SPD-6AV检测器，C-R4A积分仪和SIL-6B注射器。柱置于恒温水浴中。
柱是Hibar LiChrosorb RP-8，5m颗粒，25cm(Merck)。溶剂A是0.2M硫酸钠、0.2M磷酸，pH 2.5，溶剂B是在水中的50％乙腈(HPLC级)。从Milli-Q-水制备溶剂，通过0.45mM滤器过滤并脱气。
洗脱和平衡柱60分钟，其采用0-5分钟从10％B至20％B的线性梯度液，5-45分钟从20％B至80％B的线性梯度液，45-46分钟从80％B至10％B的线性梯度液，平衡46-60分钟。
注射体积是50l，检测在214nm进行，柱温是40℃。
经手动或者用Gibson Model 201组分收集器控制峰。结果pNA-肽的水解pNA-肽水解的结果显示在以下表3中。表3pNA-肽水解酶剂量 U/mlCPU/ml AAPF AAPM AAPL GPK GPR胰蛋白酶 0.0220 0 087339蛋白酶A 0.0270 0 0455 2010从表3可明显看出两种蛋白酶都是赖氨酸和精氨酸特异性的，而在C-末端具有疏水氨基酸的肽不被水解。同时，就这种类型的底物而言，精氨酸是优选的氨基酸。胰岛素的水解胰岛素的水解结果在图3中给出。从用胰蛋白酶获得的色谱图(图3A)显示出相应于Lys29-Thr30键水解(第一选择)和Arg22-Gly23键水解(第二选择)的两个峰。从用本发明的酶获得的色谱图(ProtA，图3B)可见，胰岛素是一种差的底物。胰高血糖素的水解胰高血糖素的水解结果在图4和5中给出。从用胰蛋白酶获得的色谱图(图4)可见，Arg-Arg和Lys-Tyr键可接近程度相等。峰4的降低和峰3的增加是由针对Arg-Ala键的第二活性引起的。
从用本发明的蛋白酶获得的色谱图(ProtA，图5)可见，对Arg-Arg和Trp-Leu键是优先的(峰5和6)，这一点与胰蛋白酶相反。针对Lys-Tyr键的一种较弱的第二活性由峰2指示。
权利要求
1.一种来源于无枝酸菌属的菌株或拟无枝酸菌属的菌株的蛋白酶。
2.按照权利要求1的蛋白酶，其来源于Amycolata autotrophica的菌株、氧化烃无枝酸菌的菌株、或土星无枝酸菌的菌株。
3.按照权利要求1的蛋白酶，其来源于地中海拟无枝酸菌的菌株、嗜甲基拟无枝酸菌的菌株、苛求拟无枝酸菌的菌株、东方拟无枝酸菌的菌株、粗糙拟无枝酸菌的菌株、或硫磺拟无枝酸菌的菌株。
4.按照权利要求1的蛋白酶，其来源于地中海拟无枝酸菌的菌株。
5.按照权利要求4的蛋白酶，其来源于菌株地中海拟无枝酸菌ATCC13685、菌株地中海拟无枝酸菌ATCC 21271、菌株地中海拟无枝酸菌ATCC 21411、菌株地中海拟无枝酸菌ATCC 21789、菌株地中海拟无枝酸菌ATCC 27642、菌株地中海拟无枝酸菌ATCC 31064、菌株地中海拟无枝酸菌ATCC 31065、菌株地中海拟无枝酸菌ATCC 31066，或者它们的突变体或变异体。
6.按照权利要求5的蛋白酶，其来源于菌株地中海拟无枝酸菌ATCC13685，或者其突变体或变异体。
7.按照权利要求1-6之任一的蛋白酶，这种酶具有针对赖氨酸和/或精氨酸键的活性。
8.按照权利要求1-6之任一的蛋白酶，这种酶在25℃下在酪蛋白底物上测定时，在从约pH8到约pH11的范围内具有超过90％的活性。
9.按照权利要求1-6之任一的蛋白酶，这种酶在pH9.5下在酪蛋白底物上测定时，具有在从30到45℃的范围内的最适温度。
10.按照权利要求1-6之任一的蛋白酶，这种酶在通过SDS-PAGE测定时具有约33kDa的分子量。
11.按照权利要求1-6之任一的蛋白酶，这种酶具有约9.1的等电点。
12.按照权利要求1-6之任一的蛋白酶，这种酶在Z-Arg-pNA(ZAPA)底物上具有活性，但是在Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA底物上没有活性。
13.一种制备按照权利要求1-12之任一的蛋白酶的方法，该方法包括在包含碳和氮源以及其它无机盐的合适的营养培养基中培养无枝酸菌属的蛋白酶产生菌株或拟无枝酸菌属的蛋白酶产生菌株，接着回收所说的蛋白酶。
14.按照权利要求13的方法，其中所说的蛋白酶产生菌株是地中海拟无枝酸菌的菌株、嗜甲基拟无枝酸的菌株、苛求拟无枝酸菌的菌株、东方拟无枝酸菌的菌株、粗糙拟无枝酸菌的菌株或硫磺拟无枝酸菌的菌株。
15.按照权利要求14的方法，其中所说的蛋白酶产生菌株是地中海拟无枝酸菌的菌株。
16.按照权利要求15的方法，其中所说的蛋白酶产生菌株是菌株地中海拟无枝酸菌ATCC 13685、菌株地中海拟无枝酸菌ATCC 21271、菌株地中海拟无枝酸菌ATCC 21411、菌株地中海拟无枝酸菌ATCC 21789、菌株地中海拟无枝酸菌ATCC 27642、菌株地中海拟无枝酸菌ATCC31064、菌株地中海拟无枝酸菌ATCC 31065、菌株地中海拟无枝酸菌ATCC 31066，或者它们的突变体或变异体。
17.按照权利要求13的方法，其中所说的蛋白酶产生菌株是Amycolataautotrophica的菌株、氧化烃无枝酸菌的菌株或土星无枝酸菌的菌株。
18.一种制备按照权利要求1-12之任一的蛋白酶的方法，该方法包括分离编码蛋白酶的DNA片段；在适当的质粒载体中组合所说的DNA片段与适当的表达信号；将所说的质粒载体引入到适当的宿主中，其中质粒作为自主复制质粒或整合到宿主染色体中；在导致蛋白酶表达的条件下培养所说的宿主有机体；并且从培养基回收所说的蛋白酶。
19.按照权利要求18的方法，其中所说的宿主有机体是大肠杆菌菌株、芽孢杆菌属的菌株、曲霉属的菌株或链霉菌属的菌株。
20.一种生产乳酪的方法，该方法包括将按照权利要求1-12之任一的蛋白酶添加到奶组分或者其任何部分中。
21.一种包含按照权利要求1-12之任一的蛋白酶的去垢组合物。
22.按照权利要求21的去垢组合物，该组合物包含选自淀粉酶，脂酶，角质酶，蛋白酶，纤维素酶，过氧化物酶和氧化酶的一种或多种附加的酶。
23.一种包含按照权利要求1-12之任一的蛋白酶的去垢添加剂。
24.按照权利要求23的去垢添加剂，其以非粉末颗粒、稳定液体或保护酶的形式提供。
全文摘要
本发明涉及新的蛋白酶。更具体地说,本发明涉及可从无枝酸菌属和拟无枝酸菌属的菌株获得的蛋白酶。此外本发明涉及制备本发明的蛋白酶的方法,以及包含所说的蛋白酶的去垢添加剂和去垢组合物。
文档编号C12N9/52GK1193996SQ96196439
公开日1998年9月23日 申请日期1996年7月2日 优先权日1995年7月19日
发明者C·索何姆, B·R·尼尔森, C·达伯曼 申请人:诺沃挪第克公司