专利名称：检测端粒酶活性的方法
技术领域：
本发明涉及一种用于检测端粒酶活性的方法以及适用于此方法的试剂。
端粒是在染色体末端的特定结构，而且在真核生物中它们由重复的例如在人类中含有TTAGGG序列的特定核苷酸序列(重复序列)堆积而成。在体细胞中细胞的每次复制都不可避免地导致端粒末端的缩短而且一旦端粒降至一特定长度以下时，将最终导致细胞的死亡。
相反，病毒转化的或永生化的细胞未表现出它们端粒长度的缩短。这是由于这些细胞内被称为端粒酶并能够在一与逆转录酶相似的反应中对抗端粒缩短的一种内源性核糖核蛋白的活性。
由于根据以前的发现，端粒酶的表达被局限于肿瘤细胞、精子细胞和永生化的细胞，所以这种蛋白是一种用于肿瘤诊断非常有意义的参数，而且也是肿瘤治疗的一个标靶(参考例如Greider的综述文章，1994，《发育遗传学当前见解》(Curr.Oppin.Gen.Dev.)4，203-211；Counter等，1994，《美国科学院进展》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)91，2900-2904和Hiyama等，1995，《自然医学》(Nature Med.)1，249-255)。
在用于检测端粒酶活性的文献中所描述的方法都是以一种体外酶活性检测为基础。目前免疫学检测人的这种酶是不可能的，因为其蛋白序列还是未知的。最近只描述了来自四膜虫的端粒酶的序列(Collins等，1995，《细胞》(Cell)81，677-686)。
在文献所描述的检测方法中，有两种不同的基本方法。第一种方法以用作引物的一个来自端粒序列的合成寡核苷酸为基础。将引物同未标记的双脱氧核苷酸和一种放射性标记的脱氧核苷酸一起加入一种样品，如含有端粒酶的一种细胞提取物中，其中通过端粒酶特异性地延伸引物且在这个过程中合成的产物被放射性标记。随后通过凝胶电泳分离反应混合物并通过X线胶片的曝光及随后的处理使带型可见(Morin，1989，《细胞》59，521-529；Nilsson等，1993，《癌基因》(Oncogene)9，3043-3048)。
在另一检测方法中也首先制备一种端粒酶特异性的延伸产物。然而，在一随后的聚合酶链式反应(PCR)中其被扩增；同时通过加入放射性脱氧核苷酸而被标记。通过凝胶电泳检测标记的PCR产物(Kim等，1994，《科学》(Science)266，2011-2015)。
WO 95/13381描述了一个用于端粒酶活性检测的方法，其中将一种待测的细胞提取物与以不含有端粒重复序列的引物相接触，其中端粒酶通过结合端粒重复序列能够催化这种引物的延伸。随后通过所获扩增产物的凝胶电泳分离来检测端粒酶活性。
然而，本领域的这些检测方法具有一些缺点。因此对于常规的用途一种没有扩增步骤的检测方法的灵敏度是极低的，因为必须用含有106到107个细胞的提取物。因此这种方法不能被用来检测仅能获得少量的原代肿瘤材料。另外，凝胶的曝光时间在2到7天之间，这也是由于其低的灵敏度。包括一个扩增步骤的检测方法则没有这个不足，因为每次检测常规地只需要用105细胞当量，而且103细胞当量能被可重复地检测到。然而，对于此方法凝胶的曝光时间也仍需至少1天(Kim等，1994，同上；Chadeneau等，1995，《癌症研究》(Cancer Res.)55，2533-2536)。
文献中所描述的两种检测方法都具有为了获得满意的结果必须通过放射性标记物来达到延伸产物或PCR产物的标记这样的缺点。这导致长的曝光时间和不需要的放射性废物形成。另外，反应混合物的凝胶电泳分离及随后X线胶片的曝光和处理是很费力的。
加之所说的方法中没有一种允许高的样品流通量。它们不适于自动化，而这对于如常规分析或一种效应物筛选是必需的。
因此，本发明的一个目的是至少部分克服本领域现有方法的缺点。通过一个用于端粒酶活性检测的方法来达到这个目的，这种方法的特征在于(a)提供一种待测样品(b)加入适合作为端粒酶底物的第一个引物和核苷三磷酸，并在能够发生端粒酶介导的引物延伸的条件下孵育反应混合物，(c)进行端粒酶延伸产物的扩增，(d)将在步骤(c)中产生的扩增产物固定于一固相上，并(e)定性或/和定量检测固定的扩增产物。
令人惊奇地发现，通过固定扩增产物保留了端粒酶反应的特异性，即能够可重复地获得归因于端粒酶活性的阳性信号。因此，由本领域现有技术所需的反应混合物的凝胶电泳分离是多余的。另外，还达到了一个非常高的灵敏度。在某些检测模式中，与本领域现有技术的方法相比通过根据本发明的方法在灵敏度上甚至可能提高。另外在根据本发明的方法中可能且优选使用非放射性标记，这避免在处理放射性物质时出现的困难。这些优点使根据本发明的方法非常适宜在自动化检测仪器中的常规使用。
根据本发明的方法能够不需分离反应产物而特异性检测扩增的端粒酶延伸产物。由于所有的扩增混合物还含有非特异的副产物如引物二聚体、除了端粒酶延伸产物的重复序列，所以不能简单地期望它。因此，必然预期在利用一个针对重复序列的捕获或检测探针的检测中这些非特异产物也将被检测到。另外，必然预期在加入一内部标准时，其总要被同时检测。然而，令人惊奇的是，通过选择合适的杂交条件和选择性地通过加入与引物序列互补的寡核苷酸实现了不经过分离步骤而高度特异性地检测端粒酶延伸产物。
优选通过利用标记的基团，特别是非放射性标记的基团来检测端粒酶活性。所有已知的标记基团都可被用作非放射性标记基团，例如免疫学反应基团，如核苷酸类似物或能够与一检测抗体反应的半抗原；酶，如过氧化物酶、半乳糖苷酶或碱性磷酸酶；荧光或发光基团，例如电化学发光基团或其它检测基团，如NMR活性标记基团或电子致密基团。免疫学反应基团优选如核苷酸类似物，例如半抗原衍生化的核苷酸如Br-dUTP或由含有至少一个C原子的有机残基衍生的核苷酸如CH3-dCTP或半抗原如洋地黄毒苷、地高辛、荧光素等；发光基团，如发光金属复合物例如钌复合物和荧光基团如荧光素。
一方面，可将非放射性标记的基团直接掺入扩增产物，例如这种掺入可以通过利用标记的核苷酸或/和标记的引物来实现。另一方面也可间接地标记扩增产物，例如通过利用一种合适的标记探针即一种其本身含有一个或几个标记基团并同扩增产物特异性地杂交的探针，例如可将寡核苷酸或/和核酸类似物用作标记探针。这种探针在固定步骤之前或/和之后可同扩增产物杂交。
根据本发明方法的步骤(a)包括待测样品的制备。这种样品优选为一种细胞提取物，特别是一种来自人细胞的提取物。然而细胞提取物也可以来自其它真核生物，如酵母或四膜虫。优选通过在一含有0.01-5％重量非离子或/和两性离子去污剂的缓冲液中裂解细胞来制备细胞提取物。在另一方面也可以通过选择性地反复融冻来裂解样品。随后优选通过离心或/和过滤除去如细胞残余物等不溶成分并收集上清。用与102到105细胞当量相应的提取物量可获得好的结果。即使仅利用1-10个细胞当量仍可获得特异性信号。如果待测样品是组织如肿瘤组织，对于一次检测优选利用10-1000ng组织。
根据本发明方法的步骤(b)包括将一种适于作为端粒酶底物的单链引物加入样品并在能够进行端粒酶介导的引物延伸的条件下孵育所得的反应混合物。引物优选为一种寡脱氧核糖核苷酸。引物的长度优选为10-50个核苷酸，特别优选12-30个核苷酸。在本方法中，一方面可以利用无端粒重复序列的第一个引物。这样一种引物的优选实例为一个由Morin等(1991)，《自然》(Nature)353，454-456所描述的具有在序列号1中所示核苷酸序列的引物P1。另外，令人惊奇地发现来自逆转录病毒LTR序列5′区域例如HIV的LTR序列的5′区域的引物也是合适的。这样一种引物的一个实例列于序列号2中。除了单链引物，也可利用带有3′突出端的双链引物。
另一方面，还可利用含有端粒重复序列的第一个引物，例如带有在序列号3中所示核苷酸序列的引物P1-Telo。
如果使用非放射性的标记基团，优选实行延伸步骤(b)以便仅有那些未被标记的核苷三磷酸能够被连接于第一个引物。其原因是当在可作为端粒酶底物的反应混合物中存在非放射性标记的核苷三磷酸时，可以发现部分地阻断端粒酶活性，这可以导致引物延伸效率的部分下降。然而，在本发明的特定的实施方案中，也可能在引物延伸过程中掺入非放射性标记基团。
然而，优选直到随后的扩增步骤(c)时才将非放射性标记的基团引入产物。例如这可以通过使用非放射性标记的CTP(不是端粒重复序列的成分)来实现。在这个情况下，整个反应就能够以一个无须分室的“单管反应”来进行。另一方面，可使非放射性标记的核苷三磷酸稍后与反应混合物接触。例如这可以通过在延伸反应(b)中由可移动阻碍物如在较高温度下可熔化的蜡层而将非放射性标记的核苷三磷酸与反应混合物分离的分室作用来实现。另一方面，当然也可以顺序地加入反应物。
此外，在延伸步骤(b)后，优选进行端粒酶所产生延伸产物的额外的模板非依赖性的延伸。这个延伸优选通过一种酶促反应的方式实行，如通过使用末端转移酶的多聚腺苷酸化或通过利用DNA连接酶的短DNA片段的连接。
根据本发明方法的步骤(c)包括端粒酶产生的延伸产物的扩增。对于根据本发明的方法，扩增步骤的类型并不是十分严格的。典型地通过加入一种能聚合核苷酸的适宜的酶，如一种核苷酸聚合酶或一种核苷酸连接酶来进行扩增反应。优选使用一种热稳定的酶并在多个循环中进行扩增反应。
优选将两个引物用于扩增，其中端粒酶的底物可作为第一个引物而一个适当的互补引物可用作第二个引物。扩增产物是通过酶的催化形成的，如通过在模板依赖的DNA聚合酶作用下，将核苷酸附加于第一及第二个引物。第二个引物，如序列号4中所示的引物P2，优选可与端粒重复序列杂交。对此优选使用一种所谓的锚定引物，其5’末端包含有一个不与端粒重复序列互补的区域。这类锚定引物具有不能形成比原始模板长的扩增产物以及当使用一个含有重复序列的引物时一定也含有重复序列的引物二聚体不被延伸的优点。特别优选使用在其5’末端至少有4个，特别是至少5个nt长的没有重复序列的延伸的锚定引物。这个序列区的长度优选为4-20个核苷酸。在其5’末端具有GC富集序列的锚定引物是最优选的。在测定端粒酶活性的方法中，具有一种与端粒重复序列互补的序列并且在其5’侧具有一无重复序列的延伸的优选长度为10-50nt的寡核苷酸或核苷酸类似物一般适合于作为引物。一个在其5’侧有一6nt长的锚定序列的适当的锚定引物的例子是在序列号5中所示的引物TE-ACT。一个特别优选的锚定引物是在序列号13中所示的引物TE-3.2。使用此引物和同引物TE-3.2相比在其3’末端缺少最多3个核苷酸的类似引物可获得极佳的测试结果。
酶优选为一种可被用于多个扩增循环而无聚合酶失活的热稳定DNA聚合酶。特别优选的扩增方法是聚合酶链式反应(PCR)方法。
如果在延伸后进行一个附加的延伸如通过末端转移酶，一个与通过延长而附于延伸产物的序列片段互补的第二个引物可用于随后的扩增步骤(c)。这样的一个例子为序列号6中所示的引物P3。
另外可通过本领域技术人员所知的其它方法进行扩增。因此反应也可被一个模板依赖性的DNA连接酶所催化，在这种情况下，通过利用DNA连接酶将寡脱氧核苷酸附于引物而形成扩增产物。DNA连接酶优选为一种热稳定的DNA连接酶，而且这种方法特别优选通过连接酶链式反应(LCR)技术来进行。
根据本发明方法的步骤(d)包括扩增产物在一固相上的固定化。例如一个反应管的管壁可作为一种固相。另外也可使用颗粒固相。固相优选选自微滴定板、微反应管、膜、微片、生物核心系统及选择性的磁性微珠。同本领域的现有技术方法相比固定化步骤可节省大量的时间且较为省力。此外，它能获得较高的样品流通量以及过程自动化，如对于常规分析或筛选效应物。
原则上，可以利用任何已知的方法将扩增产物固定于固相上，例如通过吸附结合。然而，优选通过特异性相互作用实现固定化，如通过锚定基团。适当的锚定基团的例子是能同固相结合抗体反应的免疫学反应基团或能够以高亲和力结合固定化的配体的其它基团。一种锚定基团的一个优选的例子是生物素，其能够以高的亲和力结合于亲和素或链亲和素包被的固相。例如由Savoysky等描述的固定化方法(《核酸研究》24(1996)，1175-1176)可被用于高样品数，其中使用了生物素化的端粒酶延伸引物以便在扩增反应过程中形成含有生物素作为一种固定化基团的产物。在扩增反应中同时掺入[Me-3H]TTP。这样生物素化的和3H标记的扩增产物被固定在链亲和素包被的荧光微粒上。基于3H释放的β量子与荧光微粒的相互作用通过液闪测定来检测这种固定化。
根据本发明的方法，可在各个阶段将锚定基团引入扩增产物。这样例如可以使用一个或多个已含有锚定基团的引物，如生物素基团。另一方面生物素化的核苷酸也可通过如使用末端转移酶或DNA连接酶或在扩增步骤(c)中的初级延伸产物的延伸而被引入。
然而，在本发明的一个优选的实施方案中，扩增产物本身根本不必含有一个锚定基团。例如也可以通过加入一个携带一个或多个锚定基团并能够在反应条件下同扩增产物稳定杂交的捕获探针实现锚定于固相上。适当的捕获探针的例子是含有端粒重复序列或与之互补的序列以及一个或多个锚定基团如生物素基团的寡核苷酸。特别优选在其5’末端含有一个锚定基团的捕获探针。例如在序列号7中所示的含有一个5’生物素基团的寡核苷酸P4可被用作一个捕获探针。
另一方面，核酸类似物也能用作捕获探针，例如肽核酸(Nielsen等，(1991)，《科学》254，1497-1500和Dueholm等(1994)，《有机化学杂志》(J.Org.Chem.)59，5767-5773)。肽核酸具有一个含有核碱基作为侧基的由酰胺键连接的骨架。使用肽核酸作为捕获探针和标记探针是根据本发明方法的特别的实施方案中所优选的。
根据本发明方法的步骤(e)包括扩增产物的定性或/和定量检测。利用在扩增产物中所包含的标记基团或通过结合于扩增产物的标记探针以一个众所周知的方法进行检测。优选在自动化的检测装置中利用非放射性标记的基团实施检测。优选的检测装置是通过比色法或/和分光光度法检测标记基团的，如通过底物的酶促转化或通过化学发光或荧光。
优选在那些即便有非特异性的副产物存在的情况下还能特异地检测扩增的端粒酶延伸产物的条件下进行检测。为此可选择这样的杂交条件，其允许这样一种特异性检测或/和将非标记的的寡核苷酸或与引物序列互补的核酸类似物(竞争物)加入混合物中使得这些序列区被掩蔽而捕获探针或检测探针能特异地与扩增产物的内部序列杂交。
适当杂交条件的例子是37℃以及一个无甲酰胺或含甲酰胺的缓冲液(如5×SSC、10％甲酰胺、0.1％肌酰酸、0.02％SDS、1％马来酸缓冲液中的阻断剂)。适当的非标记竞争物的例子是在序列号14和15中所示的寡核苷酸。
检测过程中的一些优选的实施方案陈述如下模式1将一个无端粒特异性重复序列的引物用作一个端粒酶底物，如具有在序列号1或2中所示序列的引物。另外可使用含有一重复序列的引物如P1-Telo(序列号3)。这个引物和非标记的核苷三磷酸dATP、dGTP和dTTP一起用于延伸步骤(b)。随后将由端粒酶产生的延伸产物于步骤(c)进行扩增。扩增反应所需的成分只要它们不影响延伸反应，也可以存在于步骤(b)的混合物中。其它成分是以一种分室的形式存在于同一反应管中，如在一个可溶性的蜡层下。
除了已经存在于步骤(b)中的成分外，步骤(c)的反应混合物中还含有一个含有与人端粒重复序列互补的序列的第二引物，如具有在序列号4中所示序列的引物P2或具有在序列号5中所示序列的引物TE-ACT，至少一个和锚定基团一起提供的核苷三磷酸如生物素基化的dUTP，至少一个非放射性标记的核苷三磷酸，如溴-dUTP、溴-dCTP、CH3-dUTP、DIG-dUTP、DIG-dCTP及热稳定的DNA聚合酶如Taq聚合酶。
在一由链亲和素和牛血清白蛋白联合包被的微量滴定板中进行根据步骤(d)的扩增产物的固定。随后在一种由针对标记基团如Br-dU，Br-dC，CH3-dC或DIG的一种抗体或抗体片段与酶如过氧化物酶所组成的结合物的协助下检测扩增产物。
模式2除模式1外，在步骤(b)中产生的端粒酶延伸产物在末端转移酶和一个或多个的核苷酸如dATP的协助下延伸。在这种情况下，可通过加入一个寡聚脱氧胸苷引物如具有在序列号6中所示序列的引物P3以及标记或非标记的核苷酸(见模式1)进行扩增。如上所述检测扩增产物。
这种模式具有敏感性的优点，因其可能额外地引入标记基团(大约每个扩增产物有50-100个标记基团)。这对于短的端粒产物特别重要。另外，端粒酶催化的全长延伸产物在此实验过程中被特异性地扩增，因为通过引物的选择排除了与延伸产物内的重复序列的杂交。这也导致了标记基团的密度增高。
另外在模式1或模式2中可以通过利用一个生物素化的第一或第二个引物而不是掺入生物素化的核苷三磷酸来固定扩增产物。例如引物可在它们的5’末端被生物素化。
模式3与模式1及模式2不同，可产生仅有标记基团而无固相锚定基团的扩增产物。因此在这个模式中仅通过在PCR过程中加入非放射性标记的核苷酸来进行DNA的单标记。通过将扩增产物变性并随后将之与生物素化的捕获探针如一种含有在序列号7中所示核苷酸序列的寡核苷酸杂交来实现固定。
另外在所有的变体中无需使用蜡来分室的连续的测试过程也是可能的。所有测试过程的最长持续时间大约是10个小时，并优选最大为6到8小时。根据本发明的方法的模式1-3的概要的描述示于
图1中。
模式4类似于模式1进行端粒酶底物如引物P1或生物素化引物P1的端粒酶催化的延伸。随后通过加入第二个引物如引物TE-ACT来扩增延伸产物。这个扩增是在缺乏标记核苷酸的情况下进行的。因此在步骤(b)中是无需分室的。在扩增后类似于模式3将扩增产物变性并将之(i)在用一生物素化的引物时，与一标记的探针如一个含有DIG基团的寡核苷酸进行杂交或者(ii)在用非生物素化的引物时，与一个标记探针和一个生物素化的捕获探针杂交。检测的实施如模式1所描述。
此外，在根据本发明的一个优选的实施方案中，可通过加入一预先定量的一种扩增标准物来标化扩增反应。
例如这种扩增标准物可在将端粒酶延伸产物克隆到一个克隆载体中后，通过重组技术插入一在端粒酶延伸产物与第一个引物相应的序列3’侧中不包含的任意DNA序列而制备。然后在扩增反应过程中将一定量的这种结构加入混合物中并在第一个和第二个引物的协助下同端粒酶延伸产物一起扩增。然后将扩增混合物的一份在第一个捕获探针的协助下进行分析，另一份在第二个捕获探针的协助下进行分析。第一条捕获探针能使扩增产物从端粒酶延伸产物中及加入的标准物中被检测出来，而第二条捕获探针则仅能检测来自标准物的扩增产物。然后一个基于标准值的标准化使得可以定量检测被测样品中的端粒酶活性。
如果使用了选择的以至于它们可被平行检测出来的2个或者多个不同的标记基团，就有可能在同一个反应管中顺序进行多个检测，如检测端粒酶延伸产物和标准物，即无需分别检测两个等分的样品。
根据本发明方法的另一优势在于，当在检测端粒酶延伸产物时如琼脂糖电泳后进行免疫印迹，可使用标准物，其产生一条位于端粒酶延伸产物的带以外的带。这能够改善定量检测。
另外，如果相应地选择捕获探针，可能通过使用第一条捕获探针仅固定源于标准物的扩增产物，而通过使用第二条捕获探针仅固定源于端粒酶延伸产物的扩增产物。
适当的扩增标准物示于序列号8及图5中。一个特别适用于序列号8中所示的扩增标准物检测的捕获探针的例子是在序列号9中所示的寡核苷酸P5。例如在图5中所示的标准物的检测可利用在序列号9中所示的寡核苷酸TE-CAT来进行。
此外本发明的另一主题物是一种用于检测端粒酶活性的试剂盒，包含有(a)一个适于作为端粒酶底物的引物，(b)核苷三磷酸，(c)扩增端粒酶延伸产物的试剂，(d)标记基团，(e)固相锚定基团，以及(f)一个固相。
标记基团优选为非放射性标记基团并可以适当标记的核苷三磷酸或/和标记引物的形式存在。另一方面，标记基团也可存在于在测试条件下与扩增产物杂交的一个或多个标记探针上。
固相锚定基团优选为生物素而固相由链亲和素或/和亲和素包被。固相优选选自微量滴定板、微量反应管、膜、微片、生物核心系统以及选择性地磁性微球。
一方面固相锚定基团可以适当修饰的核苷三磷酸的形式或在引物上存在。另一方面，固相锚定基团也存在于同扩增产物杂交的捕获探针上。
用于端粒酶延伸产物扩增的试剂优选包含有第二个引物和一个适合于扩增核酸的酶，优选为一种热稳定DNA聚合酶。
在一个特别优选的实施方案中，试剂盒包括有一个或多个标记或/和捕获探针，它们具有标记或/和固相锚定基团并能和扩增产物杂交。标记和捕获探针优选选自寡核苷酸和核酸类似物，特别是肽核酸。
如果需要，试剂盒中还含有端粒酶延伸产物进一步延伸的试剂，如象末端转移酶或DNA连接酶那样的酶。
而且，试剂盒中还可含有一个用于定量检测反应的内标准物以及用于分别检测标准物和扩增产物的合适的试剂。
另外本发明的另一主题物是一个源于逆转录病毒LTR序列5’区域的作为端粒酶底物寡核苷酸的使用。这个寡核苷酸优选源于HIV病毒LTR序列的5’区域，且此寡核苷酸特别优选具有10-50核苷酸的长度，并在其3’端包含有(a)在序列号2中所示的序列，(b)一个至少80％，特别是至少90％同源的序列，(c)根据(a)或(b)的序列的至少最后10个核苷酸。
通过以下的实施例、序列表及图进一步阐明本发明。
序列号1显示适用于作为端粒酶底物的引物(P1)；序列号2显示适用于作为端粒酶底物的另一引物(P-LTR)；序列号3显示适用于作为端粒酶底物的另一引物(P1-Telo)；序列号4显示一条扩增引物(P2)；
序列号5显示一适用于扩增的锚定引物(TE-ACT)；序列号6显示一适用于的扩增寡聚脱氧胸苷酸引物(P3)；序列号7显示一捕获探针(P4)；序列号8显示一条通过PCR定量检测端粒酶活性的扩增标准物；序列号9显示一用于标化PCR混合物的捕获探针(P5)；序列号10显示一用于标化PCR混合物的另一捕获探针(TE-CAT)；序列号11和12显示用于产生一个扩增标准物的两条引物(P1ST和TE-ACT-ST)；序列号13显示一适用于扩增的锚定引物(TE-3.2)；序列号14和15显示两个竞争性寡核苷酸。
图1显示本发明方法的三个优选实施方案的示意图；图2显示在一个微量滴定管中非放射性方法检测端粒酶的结果；图3显示本发明的不同测试变体的图解；图4显示与使用不同的提取物量相关的端粒酶检测；图5显示一扩增标准物；图6显示在细胞系及组织样品中端粒酶检测的特异性，和图7显示在细胞系及组织样品中端粒酶检测的敏感性。
实施例1.根据本发明方法模式1的检测端粒酶的反应混合物48μl端粒酶/PCR缓冲液(20mM Tris-HCL，PH 8.3；1.5mM MgCl2，63mM KCl，0.05％Tween-20(w/v)；1mM EGTA，40μM dNTP(N＝A，G，C，U各10μM)，300nM的引物P1可P-LTR(序列号1或2)或P1-Telo(序列号3)，20μg/ml T4g 32蛋白，0.1mg/ml的牛血清白蛋白(BSA)(w/v)，2U Taq DNA聚合酶)被放置于一个预先包被的PCR反应管中。然后2μl的样品(如从105细胞当量中提取出的S100)被加入并在25℃下孵育10-30分钟。
预先包被好的PCR反应管中含有以下已冻干于管底部的组分，其上灌有一层蜡(如AmliWax，Perkin Elmer)100ng的引物P2或TE-ACT(序列号4或5，223nM于50μl中)，30ng的DIG-dUTP(0.5μM于50μl中)和370ng的生物素化的dUTP(7.5μM于50μl中)。
继而进行25个循环的PCR(94℃ 30秒；50℃ 30秒；72℃ 90秒)。当加热至94℃时蜡层熔化，冻存的组分与已存在的反应混合物相接触。
PCR后将等分的混合物转移入包被有链亲和素-热-BSA的微量滴定板中，在37℃下孵育30分钟。随后每次用200μl的冲洗液洗涤三次(150mM NaCl，15mM柠檬酸钠，PH 7.0)。
然后加入抗地高辛过氧化物酶缀合物(或使用其他的标记基团时用其他适宜的过氧化物酶缀合物)并在37℃下孵育60分钟。随后再用每次200μl的冲洗液洗涤三次。
为进行检测，加入200μl TMB的底物试剂(100μg/ml 3，3′，5，5′-四甲基联苯胺，1mM柠檬酸，100mM醋酸钠，0.01％H2O2)。在多道光度计上以450nM的波长进行检测。
2.根据本发明方法模式2的检测端粒酶的反应混合物按以上第一点中直至端粒酶延伸步骤的描述进行反应。然后将2.5U/μl的末端转移酶加入于200mM二甲胂酸钾，5mM CoCl2中并在37℃下孵育60分钟。
随后实施如第一点中所描述的PCR扩增。使用序列号6中的引物P3来代替引物P2。
扩增产物的检测如第一点中所描述。
作为以上描述的方法的一种选择，扩增产物也可被生物素化的端粒酶/PCR引物(P1-Bio或P1.TeloBio)代替掺入生物素化的dUTP所固定。
3.根据本发明方法模式3的检测端粒酶的反应混合物端粒酶延伸的实施如第一点所描述。预先包被好的PCR反应管包含有如第一点所描述的相同的组分，但不含有生物素化的核苷三磷酸。
PCR的实施如第一点所描述。PCR扩增后10μl的混合物被加入于40μl的变性缓冲液(125mM NaOH，0.2mM EDTA)中并在室温下孵育10分钟。
随后450μl的杂交缓冲液(62.5mM磷酸钠，PH 6.5，630mMNaCl，0.0625％BSA(W/V)和1μM生物素化捕获探针，如寡核苷酸P1-Bio或P4)被加入，且200μl的混合物被转入一个包被有SA-热-BSA的微量滴点板中。然后在37℃下孵育60分钟，随后每次用200μl的冲洗液洗涤三次。
扩增产物的检测如第一点中所描述。
根据本发明方法的所有变体也可通过使用一个后续的没用蜡来分隔的测试过程选择性地实施。整个测试过程的总时间不超过6小时。
4.根据本发明方法模式2的检测端粒酶的反应混合物端粒酶延伸的实施如第一点所描述。非生物素化以及生物素化的引物作为端粒酶的底物。与模式1不同的是无须使用预先包被的反应管。
随后实施的PCR扩增如第一点中所描述的，但没有标记的核苷酸。
扩增反应后实施一个如第三点所描述的变性过程。当使用一个生物素化的引物时就使用一个地高辛标记的标记探针，而当使用非生物素化的引物时则使用一个地高辛标记的探针和生物素化的捕获探针。
扩增产物的检测如第一点中所描述。
5.标化的反应混合物细菌酶氯霉素乙酰基转移酶的编码区域中的一个序列区域在引物P1-ST(序列号11)和TE-ACT-ST(序列号12)的协助下被扩增。得到一202Bp长的PCR片段(图5)，其中含有来自氯霉素乙酰基转移酶基因的序列，这些序列侧翼是两个端粒酶引物P1(序列号1)和TE-ACT(序列号5)的序列。
当使用适宜的引物时，在端粒酶延伸步骤中加入定量的这种PCR产物(1-20attomol)，它也能象端粒酶延伸产物一样被扩增。
对于标准物的检测和定量，若在扩增中加入生物素化的引物则通过与地高辛标记的CAT特异的引物TE-CAT(序列号为10)杂交来进行，而若扩增中结合有标记基团则与生物素化的CAT特异的捕获探针相杂交来进行。
6.PCR-ELISA反应混合物端粒酶延伸步骤和扩增在同一个非预包被的反应管中进行。
为此，将样品(1-3μl的细胞提取物，相当于1×103至3×103的细胞或1-50μg的总蛋白)或一个阳性对照(具有已知端粒酶活性的细胞提取物)或一个阴性对照(RNA酶或热处理过的细胞提取物)加入到一个含有一生物素化的端粒酶引物(如P1，t-LTR或P1-Telo)、一个锚定引物(TE-ACT或TE-3.2)、未标记的dNTP和温度稳定的DNA聚合酶的反应混合物中。
将反应混合物置于一热循环仪中以实施引物的延伸/扩增的组合。在25℃下先进行引物的延伸10-30分钟，随后94℃加热5分钟从而灭活端粒酶。接着进行如第一点所描述的30个循环的PCR，然后72℃加热10分钟。
等分的扩增混合物随后被变性并与地高辛标记的捕获探针在存在未标记的竞争性寡核苷酸的情况下进行杂交。形成的产物通过生物素基团被固定于一个包被有链亲和素的微量滴定板上。
被固定的扩增产物以第一点中所描述的方法进行检测。可选择的，反应混合物可用凝胶电泳所分离(如非变性的聚丙烯酰胺凝胶)并将电泳带转印到一个膜上并显现。
7.结果第1-3点所描述的测试模式例示于图1中。
图2显示了在固定于微量滴定板后非放射性检测端粒酶。每50μl的混合物(引物P1-Bio)使用相当于1×105的细胞(HeLa细胞提取物)。A用每例中说明的核苷酸(地高辛-dUTP，荧光素-dUTP，溴-dUTP)在PCR步骤中引入标记基团，于一个包被有链亲和素的微量滴定板中进行固定，在存在适宜的抗体缀合物的情况下实施检测。B反应的特异性当能够阻断端粒酶活性的RNA酶加入后，就不可能检测出任何扩增产物。
图3显示了不同测试模式的结果。A根据模式1的双标记实验的结果(地高辛-dUTP/Bio-dUTP)；B根据模式1的使用生物素化引物P1(P1-Bio)的单标记实验(地高辛-dUTP)；C根据模式3的使用P1作为端粒酶底物和引物P1-Bio作为捕获探针的单标记实验(地高辛-dUTP)。
图4显示与提取物的用量相关的端粒酶检测。使用生物素化引物P1-Bio进行模式1的单标记实验(地高辛-dUTP)。A测试的特异性。在使用了RNA酶及加热处理后扩增产物不再被检测出来。B敏感性从使用1×104细胞当量的提取物(经或不经RNA酶处理)开始是log10滴度。随后在一个包被有链亲和素的微量滴定板中使用5％的PCR混合物进行检测。可从图4中见1-10的细胞当量仍能得到高出背景(无)的清晰信号。
图6显示在细胞株和组织样品中特异性检测端粒酶活性。A人的端粒酶阳性的胚肾细胞系293和人的端粒酶阴性的肺成纤维细胞系EMR90通过本发明的端粒酶PCR-ELISA(第六点)方法进行分析。一个不含提取物的裂解试剂、经RNA酶处理过的(+Rnase)或热处理过的(+ΔT)293细胞作为阴性对照。所有的对照均获得阴性结果。对照P1是一个不被端粒酶接受为底物的合成的寡核苷酸。如第六点所描述的进行测试，在每例中使用相当于1×103细胞当量的提取物。B在通过活检获得的正常组织和原发的癌组织中进行端粒酶活性的检测。在这个实例中，前列腺癌和膀胱癌分别与正常的前列腺及膀胱组织相比较。测试的实施如A部分中所描述的，使用20μg的总蛋白。
图7显示本发明的端粒酶PCR-ELISA法的敏感性。A端粒酶阳性的胚肾细胞系293的提取物用裂解试剂进行系列稀释。用第六点所描述的方法分析所示的细胞当量。显示了经RNA酶处理过的(+Rnase)或未经RNA酶处理过的(-Rnase)的提取物的结果。B293细胞在裂解前在培养介质中进行系列稀释，继而如以上所描述的用裂解试剂进行处理。所示细胞数使用端粒酶PCR-ELISA法进行分析。测试的实施如以上所描述。同时显示经RNA酶处理过的(+Rnase)或未经RNA酶处理过的(-Rnase)的样品的结果。C将从膀胱癌组织及膀胱正常组织中获得的系列稀释的提取物进行端粒酶活性的检测。用上述方法检测所示量的组织材料。
序列表(1)一般信息(i)申请人(A)姓名Boehringer Mannheim GmbH(B)街Sandhofer Str.116(C)城市曼海姆(E)国家德国(F)邮政编码68298(ii)发明题目端粒酶检测(iii)序列数15(iv)计算机可读形式(A)资料载体软盘(B)计算机IBM PC兼容(C)操作系统PC-DOS/MS-DOS(D)软件PatentIn Release #1.0，版本#1.30(EPA)(2)序列号1的资料(i)序列特征(A)长度18个碱基对(B)类型核苷酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(xi)序列描述序列号1AATCCGTCGA GCAGAGTT 18(2)序列号2的资料(i)序列特征(A)长度32个碱基对(B)类型核苷酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(xi)序列描述序列号2ACCCTTTTAG TCAGTGTGGA AAATCTCTAG CA32(2)序列号3的资料(i)序列特征(A)长度18个碱基对(B)类型核苷酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(xi)序列描述序列号3TTAGGGTTAG GGTTAGGG 18(2)序列号4的资料(i)序列特征(A)长度24个碱基对(B)类型核苷酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(xi)序列描述序列号4CCCTTACCCT TACCCTTACC CTAA 24(2)序列号5的资料(i)序列特征(A)长度24个碱基对
(B)类型核苷酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(xi)序列描述序列号5GCGCGGCTAA CCCTAACCCT AACC 24(2)序列号6的资料(i)序列特征(A)长度19个碱基对(B)类型核苷酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(xi)序列描述序列号6HW
19(2)序列号7的资料(i)序列特征(A)长度24个碱基对(B)类型核苷酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(xi)序列描述序列号7CCCTAACCCT AACCCTAACC CTAA 24(2)序列号8的资料(i)序列特征(A)长度64个碱基对(B)类型核苷酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性
(xi)序列描述序列号8GATCCAATCC GTCGAGCAGA GTTAACTACC TTCAACTCCA TCATGAGGGT 50TAGGGTTAGG GATC64(2)序列号9的资料(i)序列特征(A)长度22个碱基对(B)类型核苷酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(xi)序列描述序列号9CATGATGGAG TTGAAGGTAG TT 22(2)序列号10的资料(i)序列特征(A)长度21个碱基对(B)类型核苷酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(xi)序列描述序列号10AAGACGGGTG AGCTGGTGAT A21(2)序列号11的资料(i)序列特征(A)长度36个碱基对(B)类型核苷酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(xi)序列描述序列号11AATCCGTCGA GCAGAGTTCC CGCCTGATGA ATGCTC36(2)序列号12的资料(i)序列特征(A)长度44个碱基对(B)类型核苷酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(xi)序列描述序列号12GCGCGGCTAA CCCTAACCCT AACCAGAAAC TGCCGGAAAT CGTC 44(2)序列号13的资料(i)序列特征(A)长度30个碱基对(B)类型核苷酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(xi)序列描述序列号13GGGCGGCCCT TACCCTTACC CTTACCCTAA 30(2)序列号14的资料(i)序列特征(A)长度18个碱基对(B)类型核苷酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(xi)序列描述序列号14CCTAACCCTA ACTCTGCT 18(2)序列号15的资料(i)序列特征(A)长度18个碱基对
(B)类型核苷酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(xi)序列描述序列号15GGGCGGCCCT TACCCTTA 18
权利要求
1.检测端粒酶活性的方法，其中(a)提供一种待测样品，(b)加入适于用作端粒酶底物的第一引物和核苷三磷酸，并在能够进行端粒酶介导的引物延伸的条件下孵育反应混合物，(c)进行由端粒酶产生的延伸产物的扩增，(d)将在步骤(c)中制备的扩增产物固定于一固相上，并(e)定性或/和定量地检测固定的扩增产物。
2.权利要求1中所要求的方法，其中通过非放射性标记基团来检测扩增产物。
3.权利要求1或2中所要求的方法，其中非放射性标记基团选自免疫学反应基团、发光基团和荧光基团。
4.权利要求1-3的任何一个中所要求的方法，其中通过标记基团的掺入直接标记扩增产物。
5.权利要求1-3的任何一个中所要求的方法，其中通过与标记探针杂交来间接标记扩增产物。
6.权利要求1-5的任何一个中所要求的方法，其中通过吸附作用将扩增产物固定在固相上。
7.权利要求1-5的任何一个中所要求的方法，其中通过锚定基团实现在固相上的固定化。
8.权利要求7中所要求的方法，其中生物素用作锚定基团并利用一种亲和素或链亲和素包被的固相。
9.权利要求1-8的任何一个中所要求的方法，其中固相选自微滴定板、微反应管、膜、微片、生物核心系统以及选择性地磁性微珠。
10.权利要求1-9的任何一个中所要求的方法，其中通过加入一种酶进行扩增。
11.权利要求10中所要求的方法，其中使用了一种热稳定性酶。
12.权利要求10或11中所要求的方法，其中将一种核酸聚合酶或一种核酸连接酶用作所述酶。
13.权利要求10-12的任何一个中所要求的方法，其中将两种引物用于扩增。
14.权利要求10-13的任何一个中所要求的方法，其中通过PCR或LCR实现扩增。
15.权利要求1-14的任何一个中所要求的方法，其中利用没有端粒重复序列的第一引物。
16.权利要求15中所要求的方法，其中利用来自一种逆转录病毒LTR序列5′区的第一引物。
17.权利要求16中所要求的方法，其中利用来自HIV LTR序列5′区的第一引物。
18.权利要求1-17的任何一个中所要求的方法，其中利用含有端粒重复序列的第一引物。
19.权利要求15-18的任何一个中所要求的方法，其中将在其5′末端含有一个不与端粒重复序列互补的区域的第二引物用于扩增中。
20.权利要求19中所要求的方法，其中第二引物在其5′末端具有一个至少4个核苷酸长度的延伸。
21.权利要求20中所要求的方法，其中第二引物在其5′末端具有一个富含GC的延伸。
22.权利要求1-21的任何一个中所要求的方法，其中在延伸步骤(b)后进一步进行延伸产物的非模板依赖性延伸。
23.权利要求22中所要求的方法，其中延伸产物被酶促延长。
24.权利要求23中所要求的方法，其中以末端转移酶进行延伸。
25.权利要求22-24的任何一个中所要求的方法，其中在扩增步骤中利用第二引物，其能与通过延长而连接于延伸产物的序列段杂交。
26.权利要求1-25的任何一个中所要求的方法，其中以一种能够仅仅将未标记的核苷三磷酸连接于第一引物的方式进行延伸步骤(b)。
27.权利要求1-26的任何一个中所要求的方法，其中在固相上的固定化是通过锚定基团实现的，后者是通过利用含有锚定基团的引物或/和通过利用含有锚定基团的核苷三磷酸特别是在扩增步骤(c)中被引入扩增产物中的。
28.权利要求1-27的任何一个中所要求的方法，其中在固相上的固定化是通过锚定基团实现的，后者包含于一种与扩增产物杂交的捕获探针中。
29.权利要求1-28的任何一个中所要求的方法，其中在扩增中加入一内部标准物，其使得能够定量检测扩增产物。
30.权利要求1-29的任何一个中所要求的方法，其中以一“单管反应”进行反应。
31.权利要求1-30的任何一个中所要求的方法，其中在能够不经分离扩增副产物而进行一种端粒酶延伸产物的特异性检测的条件下进行扩增产物的固定化或/和检测。
32.权利要求31中所要求的方法，其中通过选择适宜的杂交条件实现特异性检测。
33.权利要求31或32中所要求的方法，其中通过加入与引物序列互补的未标记的寡核苷酸或核酸类似物实现特异性检测。
34.用于检测端粒酶活性的试剂盒，其包括(a)一种适于作为端粒酶底物的引物，(b)核苷三磷酸，(c)用于端粒酶延伸产物扩增的试剂，(d)标记基团，(e)固相锚定基团，和(f)一种固相。
35.权利要求34中所要求的试剂盒，其中标记基团为非放射性标记基团。
36.权利要求34或35中所要求的试剂盒，其中固相锚定基团为生物素而固相由链亲和素或/和亲和素包被。
37.权利要求34-36的任何一个中所要求的试剂盒，其中固相选自微滴定板、微反应管、膜、微片、生物核心系统以及选择性地为磁性微珠。
38.权利要求34-37的任何一个中所要求的试剂盒，其中标记基团存在于核苷三磷酸上。
39.权利要求34-38的任何一个中所要求的试剂盒，其中标记基团存在于一种引物上。
40.权利要求34-39的任何一个中所要求的试剂盒，其中标记基团存在于一种与扩增产物杂交的标记探针上。
41.权利要求34-40的任何一个中所要求的试剂盒，其中固相锚定基团存在于核苷三磷酸上。
42.权利要求34-41的任何一个中所要求的试剂盒，其中固相锚定基团存在于一种引物上。
43.权利要求34-42的任何一个中所要求的试剂盒，其中固相锚定基团存在于一种与扩增产物杂交的捕获探针上。
44.权利要求40或43中所要求的试剂盒，其中标记或捕获探针选自寡核苷酸和核酸类似物。
45.权利要求41中所要求的试剂盒，其中标记或捕获探针为一种肽核酸。
46.权利要求34-45的任何一个中所要求的试剂盒，其另外还包括用于一种端粒酶延伸产物进一步延长的试剂。
47.权利要求34-46的任何一个中所要求的试剂盒，其另外还包括一种对检测反应定量的内部标准物。
48.来自逆转录病毒LTR-2序列5′区的一种寡核苷酸的应用，其作为端粒酶的底物。
49.权利要求47中所要求的应用，其中寡核苷酸来自HIV LTR序列的5′区。
50.10-50个核苷酸长度的寡核苷酸，其在3′末端包括(a)在序列号2中所示的序列，(b)一种与其至少80％同源的序列或(c)根据(a)或(b)的序列的至少最后10个核苷酸。
51.一种寡核苷酸或核酸类似物在检测端粒酶活性的方法中作为引物的应用，其含有与端粒重复序列互补的序列及在其5′侧具有至少4个特别是4-10个核苷酸长度的一个延伸序列。
全文摘要
本发明涉及一种用于检测端粒酶活性的方法,其中包括以下步骤:(a)提供一种待测样品,(b)加入适于用作端粒酶底物的第一引物和核苷三磷酸,并在能够进行端粒酶介导的引物延伸的条件下孵育反应混合物,(c)进行由端粒酶产生的延伸产物的扩增,(d)将在步骤(c)中制备的扩增产物固定于一固相上,和(e)定性或/和定量地检测固定的扩增产物。本发明还涉及一种用于进行本方法的试剂盒。
文档编号C12N15/09GK1202935SQ96198617
公开日1998年12月23日 申请日期1996年11月27日 优先权日1995年11月28日
发明者T·艾姆里施, H·莱英, M·希茨比特, G·卡尔 申请人:伯伦格曼海姆有限公司