专利名称：：一种醛脱氢酶的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种新的酶，即醛脱氢酶(下称ADH)，也涉及生产这种酶的方法和利用所说的酶自L-山梨糖醛酮生产2-酮-L-古洛糖酸(下称2-KGA)的方法。2-KGA是生产维生素C的重要中间体。用微生物将L-山梨糖醛酮转变成2-KGA的反应是已知的。美国专利说明书No.3,907,639报道，蜡杆菌属、假单胞菌属、埃希氏菌属、沙雷氏菌属、芽孢杆菌属、葡萄球菌属、气杆菌属、青霉属、假丝酵母属、葡糖杆菌属微生物能够促进此反应。另外，Kitamura等人(Eur.J.Appl.Microbiol，2，1，1975)报道，在生黑葡糖杆菌IFO3293中发现的氧化L-山梨糖醛酮的酶发挥酶活性不要求有辅酶或电子接受体。Makover等人(Biotechnol.Bioeng.17，1485，1975)报道了恶臭假单胞菌ATCC21812和生黑葡糖杆菌IFO3293颗粒部分中L-山梨糖醛酮脱氢酶活性的存在。他们也指出，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)或烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸酯(NADP)不能作为该酶的辅酶。Hoshino等人(Agric.Biol.Chem.，55，665(1991))纯化并鉴定了在NAD或NADP存在下催化L-山梨糖醛酮氧化成2-KGA的酶。在本发明的构架中，对葡糖杆菌属的微生物进行了比较周密的研究，结果发现从所说的微生物中可以得到催化L-山梨糖醛酮氧化成2-KGA的新ADH。而且发现本发明提供的ADH是在诸如2，6-二氯苯酚靛酚(下称DCIP)、吩嗪甲氧基硫酸盐(下称PMS)、铁氰化物或细胞色素C之类的电子受体存在下将L-山梨糖醛酮氧化成2-KGA的，而NAD、NADP和氧不适合作电子受体。因此该ADH明显不同于已知L-山梨糖醛酮脱氢酶。本发明的目的之一是提供作用于L-山梨糖醛酮以生产2-KGA的新ADH，它有下列的物理化学性质a)分子量91,000±5,000(由两个均一的亚单位组成，每一亚单位的分子量为44,000±2,000)b)底物特异性对醛类化合物有活性c)抑制作用被Cu2+、Zn2+、Ni2+和乙二胺四乙酸(EDTA)所抑制d)最佳pH6.0-8.5e)最佳温度20-40℃f)刺激剂Ca2+和吡咯并喹啉苯醌(下称PQQ)本发明的另一目的是提供生产上所限定的新ADH的方法，该方法是在有氧条件下于含水营养基中培养能够产生有上述性质的ADH的葡糖杆菌属微生物，破裂该微生物细胞，并从微生物破裂细胞的无细胞提取物中分离和纯化ADH。本发明的又一目的是提供利用ADH从L-山梨糖醛酮生产2-KGA的方法，该方法包括(i)在电子受体存在下用上文所限定的ADH与L-山梨糖醛酮接触，或(ii)用在有氧条件下于含水营养基中能产生上文所限定的ADH的葡糖杆菌属微生物与L-山梨糖醛酮接触，或(iii)用所说微行物的无细胞提取物与L-山梨糖醛酮接触，然后对(i)、(ii)和(iii)的每种情形，从反应混合物中分离2-KGA。按下述实施例制备的纯化的ADH样品的物理化学性质如下1)酶的活性本发明的新ADH在电子受体存在下催化L-山梨糖醛酮至2-KGA的氧化作用是按以下的反应式进行的L-山梨糖醛酮+电子受体→2-KGA+还原的电子受体该酶不能以氧作为电子受体，这已被确证，即用氧作为可能的电子受体去进行L-山梨糖醛酮至2-KGA的转变时，该酶没有催化活性；而且用熔解氧探测器检测，在反应混合物中检测不到氧的消耗。但是能作为电子受体的任何常规化合物都能与本发明的酶一起使用。DCIP、PMS、铁氰化物或细胞色素C作为电子受体是优选的。酶的分析按下述方法进行分析ADH活性的基础反应混合物由0.1mMDCIP、1.0mMPMS、50mM磷酸钾缓冲溶液(pH7.0)、2.0mML-山梨糖醛酮、酶溶液和水组成，终体积为0.5ml，在临测定前准备。反应于25℃以L-山梨糖醛酮开始，酶活性以在600纳米处DCIP初始还原速率测定。1单位酶活性定义为每分钟催化1μMDCIP还原的酶量。pH7.0时DCIP的消光系数为14.5mM-1。参比池中含所有上述组成，但不含L-山梨糖醛酮。蛋白质浓度的测定用BCA蛋白质分析试剂(Pierce，Rockford，IL)2)底物特异性酶的底物特异性测定是用1)中所述的酶分析方法，但以各种不同的底物溶液代替L-山梨糖醛酮。已研究了纯化酶对各种底物的底物特异性(参见表1)。表1ADH的底物特异性<>得自氧化葡糖杆菌DSM4025(FERMBP-3812)的ADH对于D，L-甘油醛和D-葡萄糖的相对活性比对于L-山梨糖醛酮的分别高约8倍和2倍。3)最佳pHADH反应速率与反应混合物的pH之间的相关性测定是用1)中所述的酶分析方法，但使用各种不同的pH和缓冲溶液(参见表2)表2ADH活性的最佳pH<tablesid="table2"num="002"><tablewidth="759">pH值相对活性(％)a)缓冲液0.1MMcIlvain0.1M磷酸钾0.2MTris-HCl4.04.55.05.56.06.57.07.58.08.59.0---69.772.6-79.0-63.9------70.093.587.190.3---------93.5-10088.778.4</table></tables>a)表中数据以pH8.0Tris-HCl缓冲液中活性的百分数表示。4)pH稳定性将酶于0℃下在各种pH的缓冲液中保持6天，然后用1)中所述的酶分析方法测定残留活性。测定结果示于表3。在pH7.5左右纯化酶是相对稳定的。5)热稳定性酶的热稳定性试验是将其置于50mM的磷酸钾缓冲溶液(pH7.5)中于各种不同的温度下保温5分钟，然后将处理后的酶立刻在冰水中冷却。用1)中所述的酶分析方法测定残留活性。酶的稳定性可达35℃，在40℃和45℃下保温后活性分别损失约50％和60％(参见表4，A栏)。表4温度对ADH稳定性和活性的影响*未试验(A)酶稳定性试验(B)最佳温度评定试验数据以25℃时活性的百分数表示6)最佳温度测定了20℃至45℃温度范围内的酶活性。酶的最佳温度为25℃(参见表4，B栏)7)金属离子、酶抑制剂和PQQ对ADH活性的影响用1)中所述的分析方法测定活性，检验了金属离子、酶抑制剂和PQQ对ADH活性的影响。将各化合物溶液搅拌入基础反应混合物中，在加入酶时反应开始(参见表5和6)。表5各种金属对ADH活性的影响如表5中所示，在0.04-0.2mMCa2+存在下，酶反应被强烈刺激约3-4.5倍，而Cu2+、Fe3+、Mg2+、Mo6+、Ti4+、Zn2+和Ni2+抑制酶活性。表6酶抑制剂和PQQ对ADH活性的影响如表6所示，EDTA强烈抑制酶活性，1.87mM的N-乙基马来酰亚胺和一碘乙酸盐分别部分抑制活性24％和13％；在氟化钠(1.87mM)、奎宁(0.95-1.87mM)、氟代乙酸钠(0.95-1.87mM)和Na2HAsO4·7H2O(1.87mM)存在下，对酶反应有5-27％的微小刺激；加入0.01mMPQQ刺激活性50％左右。8)底物浓度对反应速率的影响测定了0.15-7.54mM的不同浓度的L-山梨糖醛酮的氧化反应速度以确定L-山梨糖醛酮的Km值。根据以DCIP作为电子受体时的反应速度从Lineweaver-Bruk曲线计算出表观米氏(Michaelis)常数为0.85mM。9)分子量用凝胶过滤柱(SephacrylS-400HR)测定了酶的分子量。与分子量标示蛋白质比较计算的酶表观分子量为91,000±5,000。SDS-聚丙烯酰胺电泳给出了分子量44,000±2,000的单带。以上提示该酶是由两个均一的亚单位组成。10)纯化步骤原则上ADH的纯化可用任何已知纯化方法的组合来进行，诸如用沉淀剂(例如硫酸铵、聚乙二醇等)分级分离、离子交换色谱法、吸附色谱法、凝胶过滤色谱法、凝胶电泳法、以及盐析和渗析法。如上所述，本发明提供的ADH可通过在有氧条件下于含水的营养基中培养适合的微生物、破裂微生物细胞、并从破裂的微生物细胞的无细胞提取物中分离并纯化ADH来制备。本发明所用的微生物是能产生如上所限定的ADH的葡糖杆菌属微生物。所说微生物的功能等同物、次培养物、突变体和变种也能用于本发明。优选的菌株是氧化葡糖杆菌。在本发明中使用的最优选的菌株是氧化葡糖杆菌DSM4025，它保存于德国哥廷根德意志微生物保藏中心(DeutscheSammlungvonMikroorganismeninGottingen)，保藏号DSMNo.4025，保藏日1987年3月17日。保藏人是中国北京三里河52号中国科学院微生物研究所东方科学仪器进出口公司。另外，根据布达佩斯条约的规定，该菌株的次培养物还保藏在日本工业科学和技术协会发酵研究所(现为全国生物科学和人类-技术研究所)，保藏号为氧化葡糖杆菌DSMNo.4025FERMBP-3812，保藏日1992年3月30日，保藏人是日本罗氏研究中心(Nip-ponRocheResearchCenter)，日本神奈川县(247)镰仓市KajiwaraAzaSotokochi200。另外，欧洲专利公开No.0278447公开了此菌株的特性。该微生物可在有氧条件下辅以适合的营养物在含水介质中培养。进行培养的pH为4.0-9.0，优选6.0-8.0。培养周期依pH、温度和所用的营养基而不同，但最好是约1-5天。进行培养的优选温度范围为13℃左右-36℃左右，更优选18℃-33℃。通常要求培养基含营养物作为可同化的碳源，诸如甘油、D-甘露糖醇、D-山梨醇、季戊四醇、核糖醇、木糖醇、阿拉伯糖醇、肌醇、卫矛醇、D-核糖、D-果糖、D-葡萄糖和蔗糖，优选D-山梨醇、D-甘露糖醇和甘油；以及诸如有机物质的可消化氮源，例如胨、酵母提取物、面包酵母、肉提取物、酪蛋白、尿素、氨基酸、玉米浸渍液等。各种无机物也可作为氮源，诸如硝酸盐、铵盐等。另外，培养基通常含无机盐，诸如硫酸镁、磷酸钾、氯化亚铁和氯化铁、碳酸钙等。现将从培养后的微生物中分离和纯化ADH的具体实施方案简要叙述于下(1)用离心或过滤法从液体培养物中收集细胞，(2)用水、生理食盐水或有适合pH的缓冲溶液洗涤收集的细胞，(3)将洗后的细胞悬浮于缓冲溶液中并用均化器、声裂器、法兰西压机或用溶菌酶处理等方法裂解细胞以产生裂解细胞的溶液，(4)从裂解细胞的无细胞提取物、最好是从微生物的胞液部分分离并纯化ADH。本发明提供的ADH可用作自醛生产羧酸的催化剂，特别是自L-山梨糖经L-山梨糖醛酮生产2-KGA。反应应在pH约6.0-约9.0下在电子受体(例如DCIP、PMS、沃尔斯特氏兰、铁氰化物、辅酶Q、细胞色素C等)存在下于溶剂(诸如Tris-HCl缓冲溶液、磷酸缓冲溶液等)中进行。进行反应的优选温度范围是约10℃-约50℃。当pH和温度设定在7.0-8.0和20-40℃时，反应通常会产生最好的结果。溶剂中L-山梨糖醛酮的浓度可根据其它反应条件而变化，但通常是约0.5-50g/l，最优选约1-约30g/l。在反应中，ADH也可以与适合的载体以固定化态使用。任何在本
技术领域：
中通常已知的固定酶的方法都可以使用。例如，将酶直接结合在有一个或多个官能基的树脂膜、颗粒或类似物上，或可通过有一个或多个官能基的桥连化合物(例如戊二醛)将其结合在树脂上。除上所述外，培养后的细胞也可用于从醛制备羧酸的生产，特别是从L-山梨糖醛酮制备2-KGA的生产。下面以实施例对本发明作进一步的说明。实施例1ADH的制备所有操作均在8℃下进行，缓冲溶液为0.05M磷酸钾(pH7.0)，除非另外指明。(1)氧化葡糖杆菌DSM4025(FERMBP-3812)的培养将氧化葡糖杆菌DSM4025(FERMBP-3812)在含5.0％D-甘露糖醇、0.25％MgSO4·7H2O、1.75％玉米浸渍液、5.0％面包酵母、0.5％尿素、0.5％碳酸钙和2％琼脂的琼脂斜面上27℃下生长4天。在一500ml三角烧瓶中将一环的细胞接种于含8％L-山梨糖、0.05％甘油、0.5％尿素、0.25％MgSO4·7H2O、1.75％玉米浸渍液、5.0％面包酵母和1.5％CaCO3的50ml种子培养基中，在旋转振摇器上(180rpm)于30℃下培养一天。将各10ml的培养液转移到含100ml相同种子培养基的两个500ml三角烧瓶中并按上述方法进行培养。将如此制备的种子培养液用于接种2升的培养基，该培养基含10％L-山梨糖、0.05％甘油、0.25％MgSO4·7H2O、30％玉米浸渍液、6.25％面包酵母和0.15％防泡剂，置于一3升的发酵罐中。其发酵参数为搅拌速度800rpm，通气速率0.5vvm(空气体积/培养基体积/分钟)，温度为30℃。培养过程中用氢氧化钠保持pH7.0。经培养40小时后，从4个发酵罐中收集8升含氧化葡糖杆菌DSM4025(FERMBP-3812)细胞的培养液。以800rpm(10,000xg)离心使微红色的细胞在已存在于培养基中的面包酵母顶上成层，然后用刮刀小心取下上层并将细胞用0.85％的NaCl溶液洗涤一次。最后，从8升的培养液中得到湿重46g的氧化葡糖杆菌DSM4025(FERMBP-3812)细胞。(2)胞液部分的制备将细胞浆(46g)悬浮于138ml缓冲溶液中，然后通过法兰西细胞压机。经离心除去未破裂的细胞后，上清液被称为无细胞提取物，然后无细胞提取物以100,000xg速度离心60分钟。所得到的上清液(150ml)称为氧化葡糖杆菌DSM(FERMBP-3812)的可溶部分。将此部分对缓冲溶液进行透析后，将100ml比活性为1.42单位/毫克蛋白质的部分用于下一纯化步骤。(3)二乙基氨基乙基(下称DEAE)-纤维素柱色谱法将透析液(100ml)加到用缓冲液平衡的DEAE-纤维素色谱柱(WhatmanDE-52，3×50cm)上，并用缓冲液洗涤至流出小量蛋白质。然后，在缓冲溶液中以线性梯度加入0.0-0.8MNaCl。主要的酶活性在0.45-0.55M浓度范围的NaCl溶液下被洗脱。然后将合并的活性部分对缓冲溶液进行透析。(4)DEAE-琼脂糖柱色谱法将上一步骤得到的透析活性部分(58ml)加入用缓冲溶液平衡的DEAE-琼脂糖(Pharmacia，1.5×50cm)柱上。经用含0.2MNa-Cl的缓冲液洗涤后，在缓冲液中以线性梯度加入0.2-0.8M的Na-Cl。酶活性于0.38-0.42MNaCl溶液浓度范围被洗脱。收集相应于ADH活性的部分。(5)Q-琼脂糖柱色谱法将上一步骤得到的合并的活性部分(15.8ml)对缓冲液进行透析，然后加到用缓冲液平衡的Q-琼脂糖(Pharmacia，1.0×20cm)色谱柱上。用缓冲液洗涤色谱柱，然后在缓冲液中以0.0-0.6M的线性梯度加入NaCl。相应于ADH的活性部分在0.34-0.37MNaCl浓度下被洗脱。现将酶的纯化步骤小结于表7中。表7得自氧化葡糖杆菌DSM4025的染料连接的ADH的纯化6)所分离酶的纯度将比活性为每毫克蛋白质98.2单位的纯化酶(0.2mg/ml)用于下面的分析天然ADH分子量的测定是用高效液相色谱法，使用尺寸排阻凝胶柱(TSK凝胶G3000SWXL柱，7.8×300mm)，以含0.3MNa-Cl的0.1M磷酸钾缓冲溶液(pH7.0)平衡，流速为每分钟1.0ml，在254nm处检测。用氰钻胺素(1.35K)、肌红蛋白(17K)、卵清蛋白(44K)、g-球蛋白(158K)和甲状腺球蛋白(670K)作为分子量标准物质。纯化的酶显示一单峰，测定的分子量为91,000±5,000左右。在十二烷基硫酸钠(SDS)存在下，该酶显示了分子量约为44,000±2,000的单带。由这些结果发现，纯化的ADH是由两个均一的亚单位组成的。(7)反应产物的鉴定将纯化酶(0.02mg)、L-山梨糖醛酮(2mg)和PMS(0.1mg)于0.5ml缓冲液中的反应混合物在30℃保温1.5小时。结果，产物与标准样品比较，鉴定为2-KGA。实施例2用纯化的ADH生产2-KGA将含纯化ADH(0.04mg蛋白质，按实施例1的方法制备)、L-山梨糖醛酮(4mg)和PMS(0.2mg)于1.0ml0.5M磷酸钾缓冲液(pH7.0)中的反应混合物于25℃保温1.0小时，同时轻轻振摇。结果，以约2.3mg/小时的速率形成了2-KGA。权利要求1.一种具有下列物理化学性质的醛脱氢酶a)分子量91,000±5,000(由两个均一的亚单位组成，每一亚单位的分子量为44,000±2,000)b)底物特异性对醛类化合物有活性c)抑制作用被Cu2+、Zn2+、Ni2+和EDTA所抑制d)最佳pH6.0-8.5e)最佳温度20-40℃f)刺激剂Ca2+和吡咯并喹啉苯醌。2.权利要求1的醛脱氢酶，该脱氢酶得自能够产生具有权利要求1所示性质的醛脱氢酶的葡糖杆菌属微生物。3.权利要求2的醛脱氢酶，其中微生物是具有氧化葡糖杆菌DSMNo.4025(FERMBP-3812)菌株鉴定特征的氧化葡糖杆菌。4.权利要求3的醛脱氢酶，其中微生物相应于氧化葡糖杆菌DSMNo.4025(FERMBP-3812)，其功能等同物、次培养物、突变体或变种。5.一种生产具有下列物理化学性质的醛脱氢酶的方法a)分子量91,000±5,000(由两个均一的亚单位组成，每一亚单位的分子量为44,000±2,000)b)底物特异性对醛类化合物有活性c)抑制作用被Cu2+、Zn2+、Ni2+和EDTA所抑制d)最佳pH6.0-8.5e)最佳温度20-40℃f)刺激剂Ca2+和吡咯并喹啉苯醌该方法包括在有氧条件下于含水的营养基中培养能够产生具有上述性质的醛脱氢酶的葡糖杆菌属微生物，破裂该微生物的细胞，以及从微生物破裂细胞的无细胞提取物中分离并纯化醛脱氢酶。6.权利要求5的方法，其中微生物是具有氧化葡糖杆菌DSMNo.4025(FERMBP-3812)菌株鉴定特征的氧化葡糖杆菌。7.权利要求6的方法，其中微生物相应于氧化葡糖杆菌DSMNo.4025(FERMBP-3812)，其功能等同物、次培养物、突变体或变种。8.一种从L-山梨糖醛酮生产2-酮-L-古洛糖酸的方法，该方法包括(i)在电子受体存在下用具有下列物理化学性质的醛脱氢酶与L-山梨糖醛酮接触a)分子量91,000±5,000(由两个均一的亚单位组成，每一亚单位的分子量为44,000±2,000)b)底物特异性对醛类化合物有活性c)抑制作用被Cu2+、Zn2+、Ni2+和EDTA所抑制d)最佳pH6.0-8.5e)最佳温度20-40℃f)刺激剂Ca2+和吡咯并喹啉苯醌，(ii)用在有氧条件下于含水营养基中能够产生具有上述(i)中性质的醛脱氢酶的葡糖杆菌属微生物与L-山梨糖醛酮接触，或(iii)用所说微生物的无细胞提取物与L-山梨糖醛酮接触，然后从反应混合物中分离所生成的2-酮-L-古洛糖酸。9.权利要求8的方法，其中微生物是具有氧化葡糖杆菌DSMNo.4025(FERMBP-3812)菌株鉴定特征的氧化葡糖杆菌。10.权利要求9的方法，其中微生物相应于氧化葡糖杆菌DSMNo.4025(FERMBP-3812)，其功能等同物、次培养物、突变体或变种。全文摘要本发明公开了葡糖杆菌属微生物的新醛脱氢酶,其物理化学性质是:分子量为91,000±5,000;对醛类化合物有活性;被Cu文档编号C12R1/01GK1171441SQ9710247公开日1998年1月28日申请日期1997年2月18日优先权日1996年2月19日发明者星野达雄,杉泽辉秀申请人:弗·哈夫曼-拉罗切有限公司