专利名称：嗜酸乳杆菌致死平衡基因表达系统的构建的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种为外源性基因的表达提供可靠工具的益生菌基因表达系统的构建。
目前，重组的细菌性保护性抗原的表达受体主要是活的、减毒的病原菌，其免疫效果有赖于所用受体菌株的繁殖能力、侵袭能力、存活时间、及相应抗原基因的表达水平。细菌疫苗的免疫保护力往往和菌株的残余毒力成正比。所以人们一直在试图寻找能良好地表达外源性抗原、且安全的菌株。乳杆菌(Lactobacilus)为人及动物肠道正常菌群的重要成员。近百年来，人们对其生理调节功能，营养促进作用和非特异性抗感染作用等方面作了大量的基础和应用方面的研究。以乳杆菌作为表达保护性抗原基因的受体，就是将乳杆菌的非特异性抗感染能力和疫苗抗原的特异性免疫相结合，同时乳杆菌作为正常生理性细菌，又符合新型疫苗的口服安全、方便、廉价、不依赖冷链等特点。如果以乳杆菌为受体菌，表达对人及动物有益的或有某些治疗作用的基因，可从分子水平上改善和增强现有益生制剂的性能，使之更为安全和有效。但已报道的有关乳杆菌的疫苗表达载体系统，均以抗生素抗性作为外源性基因稳定表达的压力。以抗生素抗性为选择压力的基因表达系统存在着以下缺陷1.在生产中需加入抗生素，以确保外源性基因的稳定表达，使生产成本增加；2.在缺乏抗生素的环境下，质粒容易丢失；3.临床上，尤其是用于农业、食品和工业生产的菌株，如果含有位于质粒上的耐药性基因，有可能造成耐药性基因的扩散，增加了其向环境传播的可能性。所以，致死平衡基因表达系统的构建，已非常必要，且具有重要的理论意义和实用价值。以非抗生素抗性为选择压力的致死平衡基因表达系统，自1988年Nakayama(Nakayama，et al.Biotechnology 1988；6603-697)构建以来，在疫苗的发展中很受青睐。这类系统就是以细菌的管家基因缺陷菌株为受体菌，在质粒上克隆入同源或异源的、完整的受体菌缺陷的基因，作为使外源性基因稳定表达的压力。目前比较成熟的系统包括Asd系统(Nakayama，et al.Biotechnology 1988；6603-697)、thyA系统(Morona，R.，et al.Gene 1991；107139-144)、Ssb系统(Porter，R.D.，et al.Biotechnology 1990；847-5 1)、和β-半乳糖苷酶系统(Hashiba，H-onoo，Takignchi R，et al.Biochem 1992；56190-194)等；系统的受体菌主要是革兰氏阴性的大肠杆菌、痢疾杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、霍乱弧菌、革兰氏阳性的乳球菌和植物乳杆菌，植物乳杆菌为奶制品发酵生产菌株，应用非常局限。嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)为人体肠道中优势的乳杆菌，其致死平衡基因表达系统在国内外尚未见报道。
胸苷酸合成酶(Thymidylate synthetase，thyA)在体内DNA合成中起关键作用，它催化dUMP(脱氧尿嘧啶单核苷酸)转变为dTMP(脱氧胸腺嘧啶单核苷酸)的甲基化，同时使5，10-甲基四氢叶酸转变为7，8-二氢叶酸。胸苷酸合成酶缺陷的突变株依靠外源性胸苷酸成胸嘧啶核苷进行DNA的生物合成，如果突变株生存的环境不能提供足够浓度的胸苷酸或胸嘧啶核苷，突变株就会死亡。在许多情况下，thyA突变株可以直接从抗叶酸药物的菌株中筛选出来，已经筛选出来的菌株包括大肠杆菌(Okada，T.，et al.Nature 1960；188340-341；Okada，T.，et al.Genetics 1966；541329-1336；Okada，T.，et al.J.Bacteriol.1962；84602-603)、鼠伤寒沙门氏菌(Okada，T.，ct al.J.Bactcriol.1962；84602-603)、乳球菌(Paul Ross，ct al.Appl.Environ.Microbiol.1990；562164-2169)、肠球菌(Addrew，M.H. E.J.Gen.Microbiol.1973；74195-199)、噬酸假单胞菌(Pseudomanas acidovorans)(Kelln，R.A.and R.A.Warren.J.Bacteriol.1973；113510-511)、嗜麦芽黄单胞菌(Xanthomonas maltophilia)(L.Blomberg，et al.Appl. Environ.Mierobiol.1993；5934-39)、蜡样芽胞杆菌(Farmer，J.L.，et al.J Bacteriol.1965；89262-263)、苜蓿根瘤菌(Rhizobium meliloti)(L.Blomberg，et al.Appl.Environ.Microbiol.1993；5934-39)和福氏志贺氏菌(余秀军，等中华流行病学杂志1994；15(6A)3745)。以thyA基因为选择压力的致死平衡基因表达系统在鼠伤寒沙门氏菌(专利号AU8941023)和福氏志贺氏菌(日本，特开平6-30766，1994年2月8日)已有专利，但有关嗜酸乳杆菌thyA基因突变菌株的筛选和以thyA基因为选择压力的致死平衡基因表达系统在国内外尚未见报道。
本发明的目的是首先选育出thyA基因突变的嗜酸乳杆菌菌株，然后构建以thyA基因为选择压力的穿梭质粒pFXL03，将pFXL03转化入thyA基因突变的嗜酸乳杆菌菌株，完成该系统的构建。
本发明的内容与要点1、thyA基因缺陷嗜酸乳杆菌菌株的选育将DOM La(微生物室保藏的嗜酸乳杆菌菌株)单个菌落转种，活化，涂于含有三甲氧苄氨嘧啶(Trimethoprim，TMP)20μg/ml、胸腺嘧啶(Thymine)50μg/ml的MRS(Medium ofRogasa’s)改良培养基上(多价蛋白胨[日本制药株氏会社]10g；牛肉膏10；酵母粉5g葡萄糖20g；吐温-80lml；K2HPO420g；醋酸钠5g；枸橼酸三氨2.0g；MgSO47H2O200mg；MnSO44H2O50mg；琼脂18g；蒸馏水加至1,000ml；pH 6.0)上，37℃静止培养48-72小时。挑取培养基上生长良好的TMP抗性菌株，分别接种于MRS培养基、MRS改良培养基和含有胸腺嘧啶(50μg/ml)的MRS改良培养基上。抗性菌株在MRS培养基上菌落形态为乳白色、凸起、饱满、光滑、边界整齐，与野生型菌落的形态一致；在MRS改良培养基上，抗性菌株菌落形态变为灰白色、扁平、中央凸起、边界不整而在含有胸腺嘧啶(50μg/ml)的MRS改良培养基上，缺陷型菌株的生长状态恢复正常，菌落形态与野生型一致。抗性菌株在显微镜下的菌体形态，也相应的随着发生改变，即由野生型的短杆状变为MRS改良培养基上弯曲的长丝状，在含有胸腺嘧啶(50μg/ml)的MRS改良培养基上，菌体形体也恢复正常。将这样的TMP抗性的、thyA基因突变的嗜酸乳杆菌菌株DOMLaF1、DOMLaF2、DOMLaF3、DOMLaF4等100株菌，在MRS培养基上反复传代，最后确定一株生长良好，生物学性状稳定的菌株DOM LaF84菌株(该菌株已送到中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏日期1997年11月7日保藏号CGMCC NO.0329)，作为下一步实验的受体菌株。
2、DOM LaF84菌株稳定性实验将DOM LaF84菌株在MRS培养基和MRS改良培养基肉汤中传代，每转种5次，取200μl培养物涂于MRS改良培养基上，计算每100个DOM LaF84菌落中，发生恢复突变的比例，结果传40次，8次涂平板，在两种培养基上均未发现有DOM LaF84菌株的回复突变株。认为DOM LaF84菌株在胸腺嘧啶或胸苷酸丰富和贫乏的环境下均能保持性状的稳定，这对基因表达受体菌株来讲非常重要。
3、嗜酸乳杆菌一大肠杆菌穿梭质粒pFXL03的构建用引物primer 3和primer 4以PCR(聚合酶链反应)方法扩增pUC19(中国预防医学科学院流行病学微生物学研究所保存)质粒的复制子区(LacG区)，包括LacZ(含多克隆位点)基因、LacI基因，PCR产物为837bps。将PCR产物以Gene cleaningkit(基因纯化试剂合)纯化，用T4多聚核苷酸激酶处理，使PCR产物末端磷酸化。再以NsiI酶切消化，与干酪乳杆菌(Lactobacillus casei，L.casei)34103菌株的thyA基因的PCR产物的Pst I酶切片段连接，转化thyA基因缺陷的大肠杆菌E.coli X51(中国预防医学科学院流行病学微生物学研究所微生物学实验室保存)。在基本培养基上选择转化子。将转化子提取质粒、经酶切电泳和PCR证实为预期的转化子，该质粒定名为pFXL02。其大小为1.9kb。
pGK12质粒(中国科学院微生物学研究所郭兴华教授惠赠)(4.4Kb)为芽胞杆菌和大肠杆菌的穿梭质粒，含有乳球菌质粒pWV01的复制子区，和来源于pE194质粒的红霉素抗性(Emr)基因和pC194质粒的氯霉素抗性(Cmr)基因。将pGK12以Sau3AI酶切消化、用低熔点琼脂糖回收1.9kb的、含有pWV01革兰氏阳性乳球菌复制子区的片段，以绿豆芽核酸酶削平后与pFXL02质粒的引物2和引物4的PCR(聚合酶链反应)产物连接，转化E.coli X51，在基本培养基上挑选转化子。转化子提质粒酶切电泳和PCR证实为预期的转化子，命名为pFXL03，质粒大小约为3.8kb。该质粒即为以thyA基因为选择压力，并含有革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌复制子的穿梭质粒。
经酶切鉴定，质粒pFXL03可用于克隆的单酶切位点有PstI、HindIII、SphI、SalI、AccI、XbaI、KpnI和SacI。
4、穿梭质粒pFXL03对thyA基因突变的嗜酸乳杆菌DOM LaF84菌株的转化及互补作用用电穿孔法(J.B.Luchansky，et al.，Molecular Microbiology 1988；2637-646)将质粒pFXL03转入DOM LaF84菌株，在MRS改良培养基上选择转化子。转化子提质粒可见有与转化质粒pFXL03大小一致的质粒带，而出发菌株无此带。以pFXL03全质粒标探针，与转化子转膜杂交，结果3个转化子均出现与pFXL03一致的反应带，而未转化的对照为阴性。
pFXL03质粒可以对thyA缺陷嗜酸乳杆菌进行良好的功能互补，使后者在基本培养基上的生长恢复为野生菌的状态，镜下菌体形态也由长丝状转变为野生菌株的短杆状。
质粒pFXL03对DOM LaF84菌株的转化效率可达5×103/μg DNA与pGK12的7.5×103/μg DNA的转化效率相当。
在MRS培养基和MRS改良培养基上传转化有pFXL03质粒的DOM LaF84菌株，在液体培养基和琼脂平板上各传40次，每代培养48小时，液体培养基中的传代产物，每传5次涂一次平板，观察转化子在MRS改良培养基上的菌落形态，显微镜下菌体形体，并提质粒证实。计算转化菌株中pFXL03质粒的丢失率。结果经40次传代，仍未检出pFXL03质粒的丢失菌株。而转化了pGK12的DOM LaF84菌株，在无抗生素选择压力的条件下传代，传到第30次质粒的丢失率可达到50％。由结果可见，pFXL03质粒在DOM LaF84菌株中能够稳定存在，该系统可望成为稳定、有效的疫苗表达载体系统，为外源性基因的克隆和表达提供可靠的工具。
我们发明的以thyA基因为选择性压力的、嗜酸乳杆菌致死平衡基因表达系统，其穿梭质粒pFXL03为3.8kb，含有8个位于LacZ基因中的、可以用于基因克隆的单酶切位点。这使首先在大肠杆菌中进行的基因克隆，在X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚半乳糖苷)平板上进行的筛选非常方便。质粒所含的thyA基因为干酪乳杆菌thyA基因，可以对thyA基因突变的嗜酸乳杆菌进行良好的功能互补，由于两者基因的同源性较低，所以在体内发生同源重组的机率大为降低，使得系统更为稳定。
图1 pGK12 Sau3AI酶切片段其中1 λDNA/HindIII+EcoRI2 pGK12质粒Sau3AI酶切片段3 pGK12质粒(超螺旋型)图2.pFXL03质粒不同引物的PCR产物其中1 引物1和引物3 PCR产物(全质粒扩增产物，3.8kb)2 引物2和引物4PCR产物(thyA基因+LacG区，1.9kb)3 λDNA/HindIII+EcoRI4 引物1和引物2PCR产物(thyA基因，1.1kb)5 引物3和引物4PCR产物(LacG区，0.8kb)图3 pFXL03质粒单个酶切位点分析其中1 λDNA/HindIII 2 SacI 3 KpnI4 XbaI 5 5aII 6 AccI7 PstI 8 SphI 9 HindIII10 pFXL03质粒(超螺旋型)图4 DOM LaF84菌株菌株的pFXL03转化子的质粒DNA电泳图其中1未转化的DOM LaF84菌株(阴性对照)2-4 DOM LaF84菌株(含有pFXL03质粒)5 pFXL03质粒(阳性对照)图5 DOM LaF84菌株的转化子与pFXL03质粒的杂交结果其中1 DOM LaF84菌株(阴性对照)2-4 DOM LaF84菌株(含有pFXL03)
5 pFXL03质粒(阳性对照)图6 pFXL03质粒构建示意图其中1 限制性内切酶NsiI2 T4多聚核苷酸激酶3 限制性内切酶PstI4 限制性内切酶SmaI5 thyA基因6 LacZ基因7 LacI基因8 pUC19质粒的复制启始区9 限制性内切酶MboI10限制性内切酶ClaI11限制性内切酶HpaI12氯霉素抗性基因13红霉素抗性基因14pWV01质粒的复制启始区15限制性内切酶Sau3AI16限制性内切酶SacI17限制性内切酶KpnI18限制性内切酶XbaI19限制性内切酶SalI20限制性内切酶AccI21限制性内切酶SphI22限制性内切酶HindIII
权利要求
1.嗜酸乳杆菌致死平衡基因表达系统的构建，其特征在于首先选育出thyA基因突变的嗜酸乳杆菌受体菌株，然后构建以thyA基因为选择压力的穿梭质粒pFXL03，并将pFXL03质粒转化入thyA基因突变的嗜酸乳杆菌受体菌株。
2.按照权利要求1所述的嗜酸乳杆菌致死平衡基因表达系统的构建，其特征是在含有TMP(20μg/ml)和胸腺嘧啶(50μg/ml)的MRS改良培养基上，筛选出thyA基因突变的嗜酸乳杆菌菌株。
3.按照权利要求1所述的嗜酸乳杆菌致死平衡基因表达系统的构建，其特征是用PCR方法获得pUC19质粒复制区，包括多克隆位点、LacZ和LacI基因。
4.按照权利要求1所述的嗜酸乳杆菌致死平衡基因表达系统的构建，其特征是用PCR方法，从干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)34103菌株得到干酪乳杆菌的thyA基因。
5.按照权利要求3，4所述的嗜酸乳杆菌致死平衡基因表达系统的构建，其特征是将上述两个PCR产物连接，再转化thyA基因突变的大肠杆菌，获得含有pFXL02质粒的转化子。
6.按照权利要求5所述的嗜酸乳杆菌致死平衡基因表达系统的构建，其特征是用pFXL02质粒与含有乳球菌质粒pWV01复制子区连接，转化thyA基因缺陷的大肠杆菌，获得含有pFXL03质粒的转化子。
全文摘要
本发明为嗜酸乳杆菌致死平衡基因表达系统的构建,该系统为在益生菌中表达外源性基因提供可靠的工具,其特征在于首先选育出thyA基因突变的嗜酸乳杆菌受体菌株,然后构建以干酪乳杆菌thyA基因为选择压力的穿梭质粒pFXL03,将pFXL03质粒转化入thyA基因突变的嗜酸乳杆菌受体菌株,由于干酪乳杆菌和嗜酸乳杆菌thyA基因的同源性较低,使两者发生同源重组的几率大为下降,使得系统更为稳定。
文档编号C12NGK1182134SQ97120298
公开日1998年5月20日 申请日期1997年11月14日 优先权日1997年11月14日
发明者徐建国, 付晓丽 申请人:中国预防医学科学院流行病学微生物学研究所