专利名称：用于生产单性果实和蔬菜的转基因方法和组合物的制作方法
技术领域：
总的来说，本发明涉及植物分子生物学领域，特别是涉及转基因植物，种子，和已经进行遗传修饰以产生越过受精的需要并且启动着果的植物的组织，其在各种各样生长条件下将会产生无籽果实和蔬菜。
背景技术：
对于被子植物，果实是从包围正在发育的种子的囊果皮发育的。果实的发育出现在授粉和受精之后，其结果产生胚。基于雄性配子与其他细胞在原卵中的融合，启动胚乳，随着原生质体胚的增殖同时发育。由于原卵发育为种子，子房扩展到果实。在非无性(nonapomicytic)种中通常果实的发育受原卵受精的激发，并且如果不出现授粉或受精，那么会发生花脱落并且不着果的情况。
着果也受外部因素例如温度的变动，水的可得性，光条件的抑制。例如胡椒对温度变动非常敏感。在夜间温度低于50°F或白天温度高于80°F将会导致在授粉之后不着果。较小的变化将会导致参差不齐的着果，导致产生异常形状的水果。在植物中控制着果启动的能力可以避免这些问题，因为着果可以受内部控制，而不管外部因素如何，从而提高了产量以及潜在的生长面积。这样的控制也使在没有授粉的情况下进行着果，即生产单性结实表现型。这可以使植物不管外部因素如何都可以发育果实，并且可以不管授粉与否可以发育果实。单性结实表现型常常不仅允许在没有授粉的条件下着果，而且由于没有授粉，使种子发育降低到最小或完全被抑制，提供了单性结实的第二个益处。
长期以来无籽果实和蔬菜是本领域内生产者追求的目标。所述植物的益处包括消费者对易于生产和消费所述产品的强力呼声。其他的益处包括由于没有种子腔或种子腔大大减少，果实或蔬菜更甜，肉质更厚，可食部分增加。通常由于局部使用激素或使用高度复杂的育种程序导致产生三倍体基因型，在本领域内已经显示了几个优点。
长期以来局部使用赤霉素用于诱导葡萄的无籽(单性结实)表现型。该方法通常需要喷涂程序，因此，该方法是麻烦的，依赖于气候的，并且必须正确地控制时间，以便在授粉之后立即出现。
另一种方法需要复杂的育种程序用于生产无籽西瓜。西瓜的无籽状态几乎总是每个细胞存在三种同源补体，而不是通常的两个的结果，已知为三倍体。这些西瓜在正常地发育为胚时出现了问题，并且导致在三倍体植物中不存在种子。异常胚的形成导致在早期阶段正常的原卵停止发育为种子。通常，无籽西瓜含有类似于未成熟黄瓜的、小的、可食用的白色原卵。
世界专利WO91/09957已公开了制备无籽果实的转基因方法。该方法涉及称之为“CRE-LOX”的高度复杂的重组切除系统，通常CRE的基因产物产生了蛋白质重组酶，该酶在特定的LOX DNA序列中起作用。公开了几种重组功能与被切除的LOX DNA序列最一致。在该申请中假设无籽西瓜出现在涉及用来自于解淀粉芽孢杆菌的芽孢杆菌RNA酶的基因转化的状态。通常，雌性植株具有种子外壳特异性启动子(SC).CRE.终止子，雄性植株具有SC启动子芽孢杆菌RNA酶基因::lox::芽孢杆菌RNA酶基因::终止子。当繁殖时两个亲本没有表现型的变化，并且在种子生产领域内雌性种子亲本基因正常的种子座，因为两个基因在同一时间不发挥功能(种子外壳仅是母本的组织)。但是，在F1代母本组织将会含有两个基因。在该构型中，种子外壳的构成(F1植株，F2种子)是SC启动子芽孢杆菌RNA酶基因::-::芽孢杆菌RNA酶基因::终止子，其中::-::表示lox基因被切除的点，产生了特异于种子外壳的功能性毒素基因。在理论上，如果种子外壳破碎了，种子的发育将被抑制，因为营养物不能流到胚中。
至今没有公开试验数据并且没有人证明所建议的方案成功地发育为实际的无籽西瓜。
因此，从以上可以看到本领域内需要用于生产单性果实和蔬菜的方案，该方法应该是简单的，易做的和易于重复的。
本发明的目的之一是提供了表达构建体，当在转基因植物中表达时，导致在没有授粉时产生着果并且也导致产生无籽果实和蔬菜。
本发明的另一个目的是提供了能够回交的自交亲本系，导致产生单性结实的F1植株杂交，并且将不会产生种子或大量种子显著降低。
本发明的又一目的是提供了含有本发明的表达构建体的植物，植物细胞和植物组织。
本发明的还有一个目的是提供了用于转化植物细胞的载体包括病毒或质粒载体，以及掺入了本发明的基因和启动子的表达盒。
本发明的再一个目的是提供了包括用于维持复制和植物转化的所述载体的细菌细胞。
根据下面的描述，本发明的其他目的是显而易见的。
发明概述本发明的一个实施方案包括对植物进行遗传操作以加强赤霉素或其他激素参与启动着果的作用。本发明包括编码植物激素例如(赤霉素，或细胞因子)或与启动着果的所述激素(即酶，生物合成中间体等)的生产相关的蛋白质的结构基因的暂时表达。将结构基因置于特异于花粉的小孢子或大孢子的启动子的控制下以便控制激素表达的时间使之在授粉之前出现，以便不需要受精而诱导果实的发育和成熟。
发明详述局部使用外源性激素或者帮助着果，或在某些情况下诱导单性结实已在果实和蔬菜生长领域内得到充分的证实。在现有技术中已经完成了在寒冷的条件下在温室中使用植物生长激素抑制剂Tomaset(N-间-甲苯基-邻氨甲酰苯甲酸，或4-CPA)诱导番茄的单性结实。在佛罗里达的胡椒组织生长季节使用GA以提高着果。常规方法用赤霉素处理葡萄以诱导着果，增加束的大小，并且使果实均匀生长，尤其是对于无籽种类。参见例子，Jankiewicz,L.S.,Flores,A.E.,Gorecki,R.,Staniaszek,M，“生长调节剂对辣椒单性着果的作用”。利用额外的赤霉素处理以确保随着老的果实成熟，新的果实着果并且收获。参见，SO:Folia-Horticulturae(波兰)，(1991),v.3(2)第3～16页。
在下面的说明书中广泛地使用了许多术语。提供下面的定义以便去除在说明书和权利要求书中使用该术语时不明确的目的和范围意义，并且有助于理解本发明。
本文使用的术语赤霉素应该包括具有赤霉素的生物学特性的任何产品并且包括类似于赤霉素的蛋白质，所述蛋白质与赤霉素产品同源，以致于通过下文中讨论的突变研究维持生物学活性。
本文使用的术语果实应该包括在其花中具有产生花粉和原卵的器官的被子植物；原卵包含于子房中，并且在受精之后，各个子房发育为种子，而子房扩展为果实。任何以单性果实方式产生的所需要的这样的果实包括在该定义中。此外，还计划包括传统认为的，但不是以该方式产生的食品来源的蔬菜例如番茄，胡椒等。
启动子是指导结构基因的转录的DNA序列。通常将启动子定位于基因的5’区域，靠近结构基因的转录起始位点。
花粉特异性启动子是指能够在授粉之前或之后不久调节暂时表达以致于诱导果实的发育和成熟，没有显著的种子发育的启动子。本文描述的启动子包括但不限于诱导性启动子，小孢子或大孢子启动子，花粉特异性启动子或母本组织启动子例如种子外壳启动子或与参与授粉或原卵成熟或发育的基因有关的任何其他启动子。
结构基因是被转录为信使RNA(mRNA)的DNA序列，然后转译为特定的多肽的氨基酸特性的序列。术语表达是指基因产物的生物合成。对于结构基因的情况，表达涉及结构基因转录为mRNA，然后mRNA转译为一个或多个多肽。
克隆载体是诸如质粒，粘粒或细菌噬菌体的一个DNA分子，该分子具有在宿主细胞中自主复制的能力。通常克隆载体含有一个或较小量的限制性核酸内切酶位点，在该位点可以用可确定的方式插入外源DNA序列，而不失去载体的基本的生物学功能，以及该载体含有适合在用克隆载体转化的细胞的鉴定和选择中使用的标记基因。
表达载体是包括在宿主细胞中表达的基因的一个DNA分子。通常基因表达置于一定的调节元件包括启动子，组织特异性调节元件和增强子的控制下。据说这样的基因是与调节元件“可操作连接的”。
重组宿主可以是原核或真核细胞，它含有克隆载体或表达载体。该术语也包括已经经过遗传工程改造的在染色体或宿主细胞的基因组含有克隆的基因的原核或真核细胞。
转基因植物是具有一个或多个植物细胞的植物，所述植物细胞含有表达载体。
植物组织包括分化的未分化的组织或植物，包括但不限于根、茎、苗、叶、花粉、种子，肿瘤组织和各种形式的细胞培养物例如单细胞、原生质体、胚和愈伤组织。植物组织可以是在植物或在器官、组织或细胞培养物中。
分子转化技术能够表达处于调节启动子控制下的遗传修饰的植物组织的生产将本发明公开的内容与本领域内技术人员已知的各种各样的技术和试验结合在一起。在大多数情况下，对于整个方法的早期阶段存在另一种可替代的方法。替代方法的选择取决于可变因素，例如取决于所选择的用于克隆和导入重组DNA分子的质粒载体、系统和取决于待修饰的植物种类、特定的基因结构、所使用的启动子元件和上游元件。本领域内技术人员能够选择和使用合适的替代方法以获得功能。用于表达所需结构基因的培养条件和所培养的细胞是本领域内技术人员已知的。本领域内技术人员还已知许多可转化和可再生的单子叶和双子叶植物种类以致于可以获得含有和表达处于本发明的启动子分子调节控制下的所需的基因的整个植株。如本领域内技术人员已知的，在转化的植物中表达是组织特异性的和/或特异于一定的发育阶段。如本领域内技术人员已知的和本文描述的，截断的启动子选择和激素结构基因的选择是其它参数，将这些参数最佳化可以获得所需的植物表达。
合适的表达载体的选择取决于将表达载体导入到宿主细胞的方法。通常表达载体含有(1)编码细菌复制原点的原核DNA元件和抗生素抗性标记物，以提供表达载体在细菌宿主中的生长和选择；(2)控制转录起始的DNA元件例如启动子；(3)控制转录物加工的DNA元件例如转录终止/聚腺苷序列；和(4)可操作连接到DNA元件以控制转录起始的报道基因。有用的报道基因包括β-糖苷酸酶，β-半乳糖苷酶，氯霉素乙酰转移酶，荧光素酶等。优选的是报道基因是β-糖苷酸酶(GUS)或荧光素酶。
植物表达载体和报道基因的一般描述参见Gruber等人，以及Glich等人(Eds，第89～119页，CRC出版社，1993)的“植物转化载体，植物分子生物学和生物技术的方法”。此外GUS表达载体和GUS基因盒可从加里福尼亚，Palo Alto，Clone Tech实验室公司获得的，而荧光素酶表达载体和荧光素酶基因盒可从Pro Mega公司(威斯康星，Madison)获得。
可以将含有基因组或合成的片段的表达载体导入到原生质体或导入到完整的组织或离体的细胞。优选的是将表达载体导入到完整的组织。例如由Maki等人提供的“将外源基因导入到植物的程序”，以及Glich等人(Eds，第89～119页，CRC出版社，1993)的“植物转化载体，植物分子生物学和生物技术的方法”；和由Philips等人的《玉米和玉米改良》中的“细胞组织培养和体外操作”；在AmericanSociety of Agronomy Inc.的3rd Edition Sprague(Eds.第345～387页)等人，于1988提供了培养植物组织的一般方法。
将表达载体导入到植物组织的方法包括直接感染和用根癌农杆菌共培养植物细胞，Horsch等人的《科学》，227:1229(1985)。由Gruber等人，见上文提供了农杆菌载体系统和农杆菌介导的基因转移的方法的描述。
优选的是，利用直接的基因转移方法例如微颗粒介导的释放、DNA注射、电穿孔等可以将表达载体导入到植物组织。更优选的是利用具有biolistic装置的表达载体微发射物介导的释放将表达载体导入到植物组织。
本发明包括将这些类型的转化程序用于产生植物，所述植物在授粉之前被诱导着果从而导致产生单性结实的植物，该植物含有极少或不含有种子。这对于植物是特别有价值的，该植物的着果易于被外部因素例如位点变化、降雨等因素的抑制。将可操作连接到花粉特异性启动子的包括刺激着果和发育的或包括编码启动所述激素产生的蛋白质(一种前体分子或酶)的基因的激素的构建体导入到所述植物。
在优选的实施方案中，本发明包括启动赤霉素家族的或类似赤霉素的植物激素的合成或编码赤霉素家族或类似赤霉素的植物激素的结构基因的使用。
本文描述的本发明的方法可用于任何种类的被子植物，在各种各样的条件下该植物产生的果实或蔬菜是令人满意的，而对着果和发育没有负面影响，并且在该植物内可以令人满意地产生无籽的。根据本发明方法产生无籽的果实和蔬菜植物包括但不限于瓜类例如西瓜和香瓜，浆果例如草莓，乌饭树的紫黑浆果，胡椒例如绿胡椒、红铃胡椒、黄胡椒、蕃茄、橘子、梅子、苜蓿、南瓜、茄子、甜玉米(sweetcorn)、豌豆、棉花、鳄梨、芒果、香木瓜、油桃、苹果、葡萄柚、柠檬、酸橙、柑橘、梨子和桃子。在优选的实施方案中，本发明与果实例如胡椒一起使用，所述果实的着果对外部条件非常敏感。在下文中将参照特定的实施方案描述本发明的方法。
对着果和发育起关键作用的植物激素包括对花粉、小孢子、大孢子或胚的形成和/或功能起关键作用的激素，并且包括是果实的发育的器具的蛋白质或酶，其中所述果实包括细胞和/或来自于果实发育的组织，形成子房部分、胚乳、果皮或胚或其它雌性结构的细胞和/或组织，其中所述雌性结构在授粉之后发育果实。
DNA序列可以是可鉴别的DNA序列，它编码能够诱导细胞或植物的着果和发育的基因产物。所述DNA序列的例子包括激素例如赤霉素、植物生长激素等，包括植物激素的前体或参与所述激素的合成的酶。
赤霉素(GAs)是一族二萜化合物植物生长激素，其中某些是生物活性生长调节剂。GAs是控制如种子繁殖、细胞拉长和分裂、叶扩展、茎拉长、开花、和着果所必需的。GAs已经是许多生理学和生物活性研究的主体，和已经对具有改变的GA生物合成或应答的各种各样的植物突变体进行研究[Graebe,J.E.，《植物生理学年度综述》38:419～465(1987)]。
在GA应答的矮状突变体中对内源性GA中间体的广泛的生物化学研究已经允许对GA生物合成途径和参与GA生物合成的几个遗传位点进行测定[由Graebe,J.E.，《植物生理学年度综述》38:419～465(1987)综述]。已经从各种植物种类例如玉米、豌豆、和鼠耳芥属中分离了许多GA应答性矮状突变体[Phinney,B.O.等人，植物生长物质，在玉米中“化学遗传学和赤霉素途径”，P.F.Waering，纽约《Academic》(1982)第101～110页；Ingram,T.J.等人，《Planta》160:455～463(1984)；Koornneef,M.，《鼠耳芥属信息服务》15:17～20(1987)]。通过测定导致产生生物合成重要代谢物的特异性步骤已经将玉米的矮状突变体(矮状-1，矮状-2，矮状-3，矮状-5)用于对玉米GA生物合成途径进行定性[Phinney,B.O.等人，植物生长物质，在玉米中“化学遗传学和赤霉素途径”，P.F.Waering，纽约《Academic》(1982)第101～110页；Fujioka,S.等人，《植物生理学》88:1367～1372(1988)]。用来自于豌豆的矮状突变体进行了类似的研究[Ingram,T.J.等人，《Planta》160:455～463(1984)]。已经从鼠耳芥属分离了GA缺陷型突变体(ga1,ga2,ga3,ga4,ga5)[Koornneef,M.，等人，《应用遗传学理论》58:257～263(1980)；由Koornneef等人，在十字花科，鼠耳芥中已经实施了最广泛的GA突变体遗传研究《遗传学研究手册》41:57～68(1983)]。Koornneef等人已经分离了对鼠耳芥的GA1位点的九个等位基因图谱[Koornneef,M.，等人，《应用遗传学理论》58:257～263(1980)；Koornneef等人，《遗传学研究手册》41:57～68(1983)]。
用于本发明方法的结构基因包括编码赤霉素或生物合成赤霉素中间体例如酶或前体的基因，所述前体最后被转变为赤霉素。
在另一个实施方案中，可以将赤霉素受体突变，使之对赤霉素更敏感。
用于实施本发明的基因的一个例子包括描述于由Tai-Ping Sun等人的欧洲专利申请EPO692537中的“重组赤霉素DNA和及其使用”，其公开的内容引入并且作为参考。该申请公开了对应于鼠耳芥的GA1座位的cDNA和基因组DNA，其编码内-贝壳杉烯合成酶。
由GA1基因编码的酶参与GGPP转变为内-贝壳杉烯[Barendse和Koornneef，《鼠耳芥属信息服务》19:25～28(1982)；Barendse等人，《植物生理学》67:315～319(1986)；Zeenvaart,J.A.D.，《植物研究》86,MSU-DOE植物研究实验室年度报告，130～131[East Lansing,MI,(1986)],GAs生物合成的一种关键中间体[Graebe,J.E.，《植物生理学年度报告》38:419～465(1987)]。仅从各种各样的植物部分纯化内一贝壳杉烯合成酶[Duncan，《植物生理学》68:1128～1134(1981)]。
在萜烯类中普遍存在从甲羟戊酸盐合成GGPP。GGPP不但是GAs前体，而且是其它二萜化合物的前体的分枝点代谢物，例如叶绿素的叶绿醇链，和四萜烯类，例如类胡萝卜素。GA途径的第一个指定的步骤是GGPP转变为第二环化反应中的内-贝壳杉烯。由内-贝壳杉烯合成酶A将GGPP部分环化为中间体，古巴树脂基焦磷酸盐(CPP)，由内-贝壳杉烯合成酶B立即将CPP转变为内-贝壳杉烯。由于内-贝壳杉烯是GA途径的关键中间体，其合成似乎是GA生物合成的调节点。的确，已经证明内-贝壳杉烯的产生由光期、温度、一定种类组织的生长潜力的变化而改变(Chung和Coolbaugh,1986；Moore和Moore,1991；Zeevaart和Gage,1993)。
通过检查几个GA1等位基因的分子损伤，确定GA1的遗传和物理的直接相关性和测定鼠耳芥基因组的该区域的重组率为10.5cM/核苷酸[Koornneef等人，《遗传学研究手册》41:57～68(1983)]。
用于实施本发明的基因的另一个例子包括由Theodor Lange等人的PCT公开WO94/28141“植物生长调节”公开的，其公开内容引入本文作为参考。该申请公开编码赤霉素(GA)20-氧化酶的基因的分子克隆和其使用。(GA)20-氧化酶是调节酶并且GA的生产对其活性特别敏感。该酶的表达增加了生物学活性赤霉素的水平。
用于本发明的其它结构基因包括由Benson,R.J.等人公开于WO95/35383“编码环化酶的植物花药穗状花序基因影响赤霉酸的生物合成-用于改变单子叶植物的高度和繁殖力”的AN1或AN2基因，其公开内容引入本文作为参考。该公开文本公开了从玉米克隆的花药穗状花序1(AN1)和花药穗状花序(AN2)基因的克隆和表达。该基因产物影响在赤霉酸生物合成中GGPP转变为内-贝壳杉烯。
蕃茄GA缺陷型突变体是异常的，并且结果产生畸形果实。通过应用生物活性GAs可以克服该表现型。蕃茄突变体包括gib1、gib2、gib3，其中没有任何一个被克隆。蕃茄突变体gib1是玉米的AN1的代谢等同物。在gib1、gib2和gib3的正在发育的果实中加入生物活性GA的结果表明产生生物活性GA的结构基因的表达将抵销胡椒和其它果实的异常着果和异常形状。在鼠耳芥中获得了类似的结果。在鼠耳芥中，基因GA1是玉米的AN1的代谢等同物，并且已经被克隆和测序。在鳄梨中，在早期阶段去除种子导致异常荚果的发育，因为GA生物活性的来源是种子。
因此，在优选的实施方案中本发明包括AN1或AN2基因，该基因具有类似于赤霉酸的活性以获得单性结实表现型。AN1的减少将单性产物的量降低为总产量的80％。剩余的20％的AN2的作用还没有测定。AN2是一个与AN1具有高度同源性(70％等同性)的被表达的基因。WO95/35283公开了两个基因，其以前公开的内容引入本文作为参考。
AN1和GA1之间其氨基酸水平有约50～60％的等同性。已经将AN1序列用于回收水稻的类似序列。将玉米和鼠耳芥序列进行比较可用于启动一个同感序列，该序列可用于分离胡椒或其它用于实施本发明的种类的类似基因的一致序列。
另一个潜在的基因包括来自于鼠耳芥的GA4基因。这些基因产物催化赤霉酸生物合成过程的最后步骤，该步骤产生了生物活性GA1。
赤霉酸是从类异戊二烯GGPP合成的，是从GGPP环化为CPP开始的，然后从CPP到内-贝壳杉烯，这两个步骤分别由贝壳杉烯合成酶A和B催化的(Dncan等人，1981)。最高等的植物被认为与玉米相似，对于玉米，将内-贝壳杉烯逐步氧化为7-羟基-贝壳杉酸，它被转变为第一个真正的赤霉酸；GA12-醛(Suzuki等人，1992)。然后由三个平行的途径之一将后一化合物进一步氧化为活性GA。对于玉米，重要的途径似乎是早期的13-羟基途径(Hedden等人，1982),GA1是倒数第二位的活性产物，通常以低于1μg/100gfwt存在(Fujioka等人，1988)。
玉米AN1和鼠耳芥GA1的预测的氨基酸序列的同源性显示这些基因具有共同的功能。发现它们的总的等同性是47％(68％相似性)，但是在内部的300个氨基酸片段等同性更强为68％(94％相似性)。至于该片段内的推测的聚异戊二烯基焦磷酸结合区域，AN1和GA1享有100％的相似性。利用聚异戊二烯基焦磷酸化的底物[香叶基焦磷酸，焦磷酸法呢酯，香叶基香叶基焦磷酸(geranylgeranyl-pyrophosphate)]的其它经测序的植物基因与AN1在该区域也享有显著的同源性(Facchini等人，1992)，但是比AN1总的同源性低得多(20～25％等同性)。这些序列的同源性明显地可说明AN1编码作用于GGPP转变为内-贝壳杉烯的环化酶。
用于本发明方法的启动子可以是花粉特异性启动子，母本组织启动子，一种诱导性启动子或组成型启动子。将会认识到用于本文的和在说明书或权利要求书中描述的特别参照诱导性启动子的术语花粉包括发育为花粉的细胞和/或组织(例如，前成熟分裂的和单核的微孢子细胞)，形成发育为花粉的雄性结构的细胞和/或组织(例如花药，绒毡层或花丝)和花粉本身。也包括将使表达与植物再生的早期启动相关的任何启动子，因为植物在营养状态之外前进。这可以包括与授粉相关的或与可育性之外包括的所有性器官相关的启动子，以及早期种子发育启动子。
所使用的花粉特异性启动子可以选自于下列组已知在花药，绒毡层，花丝，花粉本身或相应的子房，胚乳果皮或胚结构中指导表达的启动子。
花粉特异性启动子的例子包括由Mascarenhas的美国专利5,086,169公开的从玉米分离的花粉特异性启动子；Allen等人的美国专利5,412,085公开的来自于玉米的另一个花粉特异性启动子；由Tuttie等人的美国专利5,477,002公开的花药特异性启动子；由Huffman等人的美国专利5,470,359公开的绒毡层特异性启动子；由Draper等人的WO92/11379公开的从芸苔分离的绒毡层特异性启动子，《植物》，1995 8(1)，第55～63页，该文献公开了来自于烟草的花粉特异性启动子，和《植物分子生物学》，1992 18(2)，第211～8页，公开了来自于玉米的另一个花粉特异性启动子。这仅仅是可以使用的启动子的一些例子，本发明不限于这些。其它这样的启动子是本领域内技术人员已知的，并且是在本发明的范围内。前面公开的所有文献引入本文作为参考。
其它有用的启动子包括来源于其表达与胚或胚乳或早期花粉形成在母本中相关的基因。
优选的启动子可以是与种子特异性基因的天然存在的侧面编码或转录的序列结合或与对种子形成，和/或功能起关键作用的其它编码或被转录的序列结合的启动子。
在启动子结构中包括一些内含子序列也是令人满意的，因为编码序列中包含内含子序列可以导致表达增强和具有特异性。因此，将待表达的DNA序列连接到含有多肽的第一内含子和外显子的启动子序列是优选的，其中所述多肽对作用种子形成和/或功能关键的作为细胞和/或组织是特定的。
另外可以将启动子连接到来自于不同的启动子的区域，以便获得所需的启动子活性，导致产生嵌合启动子。也可以使用调节基因表达到种子发育的合成的启动子。
用于本发明的启动子也可以是诱导性启动子。诱导性启动子是能够应答诱导剂直接地或间接地激活DNA序列转录的启动子。在没有诱导剂的情况下，DNA序列不被转录。通常特异性地与诱导性启动子激活以激活转录的蛋白质因子以非活性状态存在，然后由诱导剂直接或间接地转变为活性状态。诱导剂可以是化学试剂例如蛋白质、代谢产物(糖，醇等)、生长调节剂、除草剂或萜类化合物或直接受热、盐、毒性元素等影响的生理应激反应，或间接通过病原菌或疾病因子例如病毒的作用的生理应激反应。通过给细胞外部施用诱导剂例如喷洒、降水、加热或类似的方法可以将含有诱导性启动子的植物细胞与诱导剂接触。诱导性启动子的例子包括D.melano gaster的诱导性70kd热休克启动子(Freeling,M.,Bennet,D.C.，玉米的ADN1，《遗传学年度综述》19:297～323)和由乙醇诱导的醇脱氢酶启动子(Nagao,R.T.，等人，Miflin,B.J.,Ed.Oxford《植物分子和细胞生物学眺望》，vol.3,p.384-438,Oxford大学出版社，Oxford,1986)或受化学处理激活的Lex A启动子并且可以从Ligandpharmaceuticals获得。诱导性启动子可以是在种子形成整个期间或至少在对应于重组DNA分子的DNA序列的转录期间处于被诱导的状态。
在优选的实施方案中，启动子是对其母本组织例如种子被膜特异性的启动子，该启动子仅仅在母本组织中表达的例如大豆的β-conglycinin的a’-亚单位(a’-β-C6)，它在胚乳和胚的早期种子发育阶段强烈表达，也描述于《生物化学杂志》261:9228(1986)，引入本文作为参考。
诱导性启动子的另一个例子是从玉米谷胱甘肽-S-转移酶(GSTII)基因的27Kd亚单位分离的化学诱导性基因启动子序列。用于该启动子的两个诱导剂是N,N-二烯丙基-2,2-二氯乙酰胺(普通的名称二氯乙酰胺)或苯甲基-2-氯-4-(三氟甲基)-5-噻唑羧酸盐(通用名称flurazole)。另外，许多其它潜在的诱导剂可以与该启动子一起使用，如由ICI公开的PCT申请号为PCT/GB90/00110描述的。
诱导性启动子的其它例子是光诱导性叶绿素a/b结合蛋白质(CAB)启动子，也描述于由ICI公开的PCT申请号为PCT/GB90/00110。
在Ciba-Geigy公开的申请号为EP89/103888.7中也已经描述了诱导性启动子。在该申请中，鉴别了许多诱导性启动子，包括PR蛋白质基因，尤其是烟草PR蛋白质基因，例如PR-1a、PR-1b、PR-1c、PR-1、PR-A、PR-S，黄瓜几丁质酶基因、和酸性的和碱性的烟草β-1,3-葡聚糖酶基因。正如申请号为EP89/103888.7的申请所描述的，对于这些启动子有许多潜在的诱导剂。
启动子可以是组成型启动子。组成型启动子是在所有、许多或各种各样的细胞类型包括对花粉形成和/或功能以关键作用的细胞/组织中起作用的启动子。这样的组成型启动子的例子是CaMV35S或优选的从欧洲油菜分离的HP101。
另外含有本文描述的任何DNA序列和启动子的重组DNA分子可以含有选择性标记基因，该基因编码选择性基因产物，该产物授予植物细胞对化学试剂或生理学压力有抗性，或授予细胞不可区别的表现型特性，以便利用选择性试剂易于选择重组的DNA分子。一个这样的选择性标记基因是新霉素磷酸转移酶(NPTII)，该基因授予对卡那霉素和抗生素G-418的抗性。用描述于文献的技术通过体外测试卡那霉素的磷酸化或通过将来自于转化植物的组织的RNA进行Northern印迹分析而测试NPTII基因编码的mRNA的存在可以选择用该选择性标记基因转化的细胞。对由此选择的转化的植物细胞进行诱导以分化为植物结构，该结构最后产生完整植株。将会明白选择性标记基因的植物也是天然存在的。
采用各种各样的已知方法的任何一种而首先将重组DNA分子导入到植物细胞可以将含有任何DNA序列和本文描述的启动子的重组DNA分子整合到雄性不育植株或第二代植株的基因组。优选的是，将重组DNA分子掺入到合适的载体，利用该载体将重组DNA分子导入到植物细胞。
已经有人建议将花椰菜花叶病毒(CaMV)(Howell,S.H.，等人，1980，《科学》208:1265)和Gemini病毒(Goodman,R.M.,1981，《病毒遗传学杂志》54:9)可用作为载体，但是至今报道的最成功的情况是与农杆菌一起使用的(Horsch,R.B.，等人，1985,《科学》227:1229～1231)。现在已经描述了许多不同种类的使用基于农杆菌的转化系统的方法。通常使用细菌菌株，该菌株携带修饰形式的天然存在的Ti质粒以致于将DNA转移到宿主植物而没有随后形成肿瘤。这些方法涉及将待掺入到植物基因组的DNA掺入到Ti质粒的边界，所述DNA与选择性边界基于连接以便有助于转化细胞的选择。将细菌和植物组织培养在一起以使外源DNA转移到植物细胞，然后在选择性培养基上再生转化植物。许多不同的器官和组织可以用作为农杆菌介导的转化的靶，如特别描述的用于芸苔科的成员。这些包括细胞薄层(Charest,P.J.，等人，1988，《应用遗传学理论》75:438～444)，下胚轴(DeBlock,M.，等人，1989，《植物生理学》91:694～701)，叶盘(Feldman,K.A.，和Marks,M.D.,1986，植物科学47:63～69)，茎(Fry J.，等人，1987，《植物细胞报告》6:321～325)，子叶(Moloney M.M.，等人，1989，《植物细胞报告》8:238～242)和胚状体(Neuhaus,G.，等人，1987，《应用遗传学理论》75:30～36)。但是将会明白在某些作物选择不同的组织或转化方法是合乎需要的。
也可用于产生许多具有任何重组结构的单个的转化植物以便获得没有任何位置作用的植物。选择含有一个以上的拷贝的导入的重组DNA分子的植物以致于获得重组分子的高水平表达也是优选的。
已经用于重组分子导入到植物细胞的其他方法包括机械手段例如直接的DNA摄取、脂质体、电穿孔(Guerche,P.等人，1987，《植物科学》52:111～116)和微注射(Neuhaus,G.，等人，1987，《应用遗传学理论》75:30～36)。利用微发射物和枪或其他装置以迫使包被了DNA的小的金属颗粒进入细胞的可能性也引起了极大的关注(Klein,T.M.，等人，1987，《自然》327:70～73)。
在有关本发明方法的一些实施方案中，用含有至少两个DNA序列的重组DNA分子转化植物细胞或用一个以上的重组DNA分子转化。在这样的实施方案中通过在相同的载体上物理连接DNA序列或重组DNA分子，或在不同的载体上物理分离。同时用一个以上的转化一个细胞，条件是各个载体具有特定的选择性标记基因。另一种可选的方法，用一个以上的载体按顺序转化一个细胞，以允许在用第一载体转化之后有中间再生步骤。此外在含有不同的DNA序列或重组分子的单个植株或植物品系之间进行有性杂交是可能的，优选的是，将该DNA序列或重组分子DNA连接到或定位于一些染色体，然后从杂交的子代，含有DNA序列或重组DNA分子的植物中选择。
利用本领域内技术人员已知的Northern印迹技术和，或Southern印迹技术可以监测含有DNA序列和本文描述的启动子的重组DNA分子的表达。
如上所述，生产对于特定的基因是纯合的植物品系。在一些种类中，通过使用花药培养物或分离的微孢子培养物相当易于完成。尤其是对于欧洲油菜是真实的(Keller和Armstrong Z,flanzenzucht 80:100～108,1978)。通过利用这些技术，也可以生产携带插入的基因的单倍体品系，然后自发地或借助于秋水仙素使染色体加倍。这产生了具有纯合的插入基因的植物，如果插入的基因携带合适的选择性标记基因，则通过检测携带该基因的植物易于分析这种情况。另一种可选的方法，植物可以是自我受精的，导致产生在最简单的情况下对于插入的基因由三种类型的纯合的(25％)，杂合的(50％)和无效的(25％)组成的种子的混合物。虽然根据含有该基因的那些植物对无效植物进行评分相对容易，但是通过Southern印迹分析根据杂合植物对纯合植物进行评分实际上是可行的，其中注意力集中在将来自于混合的群体的精确等量的DNA上样，和根据来自于DNA特异于插入的基因的探针的信号强度对杂合子进行评分。通过各个独立的植物进行自我受精，验证Southern印迹分析的结果是可取的，因为根据简单的事实如果对于特定的插入基因植物是纯合的，那么所有来自于自交的种子的随后的植物含有该基因，而如果对于特定的插入基因植物是杂合的，那么从自交的种子再生的后代含有无效的植物，可以获得纯合性的其他证据。因此，通过简单的自交，易于选择纯合植物品系，这也可以通过Southern印迹分析证实。
可以预想生产激素分子的许多不同的途径与花粉、或受精发育有时间上的特异性。在所有途径中，生产激素分子的至少一个步骤仅仅在授粉和受精之前在参与授粉和受精的组织内特异性地发生，以诱导植物进行着果。
许多基因可用于实施本发明的过程和方法，条件是特异性地在植物中同时生产两种或两种以上的酶促或合成的活性导致在受精和种子发育之前选择加强赤霉素的时间。这暗示着可以使用赤霉素生物合成的中间体以及催化这些反应的酶或受体可以被赤霉素的存在而激活。还在另一个实施方案中，该基因可以是反义寡聚核苷酸，它干扰和抑制降解或抑制赤霉素的酶的转录。
正如所看到的，本发明范围涉及结构基因和花粉发育特异性启动子的几个结合。
令人满意的高度无籽的系统是其中能够发育完全可育的F种子，然后生长为仅产生无籽果实的植物。从经济角度考虑，该系统是有利的，其中对于各个杂交授粉，大量的无籽果实的比分=一个杂交的F1种子数目×在F1植株上产生的果实的数目。在该计划中也掺入了杂种作物的优点，包括更多有价值的特性和杂种优势的结合。该计划以类似于上面描述的方式完成，所不同的是激素基因是从诱导型或阻遏型启动子表达的。这允许产生携带但是不表达该基因的亲本品系。因此两个之间的F1杂种也将具有该基因，在应用一种诱导表达的试剂后，该F1杂种变成单性结实。由于具有阻遏型启动子，F1亲本将表达该基因但是在用于产生种子的雌性植株中受到抑制。温度特异性启动子或可抑制性启动子的应用也可用于产生F1种子。
单性结实表现型的本质是在邻近授粉或在授粉时表达赤霉素，此时诱导一个信号，显示种子的生产已经开始了。种子下种和早期种子生长对着果起作用并且在胡椒和其他果实和蔬菜中果实正常成熟。
另一个途径是将受体修饰为GA以增加对内源性GA水平的敏感性。SPY1基因产物参与GA信号的转导，即GA的受体。修饰的GA受体和果实特异性启动子的结合可用于将果实表现型类似物修饰为导致产生高水平的生物活性GA的基因的使用。
权利要求
1．用于产生转基因的单性结实植物的表达构建体，它包括一个重组基因和可操作连接到所述基因的花粉特异性启动子，基于表达所述重组基因编码植物激素，其前体或参与其生物合成的酶，其中所述的激素启动着果和/或发育。
2．根据权利要求1所述的表达构建体，其中所述的植物激素是赤霉素。
3．根据权利要求2所述的表达构建体，其中所述的植物激素是赤霉素20氧化酶。
4．根据权利要求1所述的基因构建体，其中所述基因是AntherEar1。
5．根据权利要求1所述的基因构建体，其中所述基因是AntherEar2。
6．根据权利要求1所述的方法，其中所述的植物是胡椒植物。
7．根据权利要求1所述的表达构建体，其中所述的启动子是可诱导型启动子。
8．核酸载体包括权利要求1所述的表达构建体。
9．根据权利要求8所述的载体，其中所述的载体是克隆载体。
10．根据权利要求8所述的载体，其中所述的载体是表达载体。
11．根据权利要求8所述的载体，进一步包括用于选择转化细胞的标记基因。
12．根据权利要求11所述的载体，其中所述的标记基因选自于由青霉素抗性基因，四环素抗性基因和潮霉素抗性基因组成的组。
13．根据权利要求8所述的载体，进一步包括多聚腺苷酸信号。
14．用权利要求7的核酸载体转化的原核或真核宿主细胞。
15．转基因植物，它包括植物细胞或其祖先细胞，它已经用权利要求8所述的载体转化。
16．单性果实，它是由含有编码重组基因的DNA序列的植物产生的，该重组基因编码启动着果或发育的植物激素，或其前体，或参与所述激素合成的酶，所述基因可操作连接到花粉特异性启动子以便在授粉早期出现表达。
17．产生单性果实的方法，包括用DNA序列转化被子植物细胞，所述DNA序列编码参与启动着果的植物激素，或其前体，或参与其合成的酶，所述DNA序列可操作连接到花粉特异性启动子；并且从所述转化细胞产生植株；其中所述植株是单性结实并且在没有授粉时启动着果。
18．根据权利要求17所述的方法，其中所述的植物选自于由瓜类植物，胡椒植物和番茄植物组成的组。
19．根据权利要求17所述的方法，其中所述的DNA序列编码赤霉素。
20．根据权利要求19所述的方法，其中所述的启动子选自于由组成型启动子，诱导型启动子，或母本组织启动子组成的组。
21．生产杂种单性结实植物的方法，该方法包括将一个亲本于第二个亲本授粉，所述第一个亲本或其祖先细胞已经用编码植物激素的DNA序列转化，所述植物激素基因可操作连接到一个诱导型启动子；所述第二个亲本植物或其祖先细胞已经用一个类似的基因转化，所述DNA序列可操作连接到诱导型启动子，以便基于诱导剂的应用，植物将变成单性结实。
22．生产单性果实和蔬菜的方法，包括用加强赤霉素表达的DNA序列转化植物细胞或其祖先细胞，所述序列受花粉特异性启动子的调节，并且从所述细胞产生单性结实植物。
23．根据权利要求22所述的方法，其中所述的DNA序列是结构基因。
24．根据权利要求23所述的方法，其中所述的基因是赤霉素受体。
25．根据权利要求23所述的方法，其中基因表达所述的基因编码赤霉素。
全文摘要
本发明公开了用于生产单性果实或具有减少的种子数目的果实的转基因方法,它涉及暂时表达植物激素或其前体或其他这样的基因以便加强参与启动着果活性的赤霉素或其他类似的激素活性。该具有可操作连接到调节启动子以便选择在花粉发育或授粉之前进行表达。激素的表达导致在没有受精的情况下果实发育。该方法也导致产生具有减少的或非常少的种子的果实。本发明也包括转基因构建体,载体,和用于生产单性结实植物的方法。
文档编号C12N15/29GK1217026SQ97194240
公开日1999年5月19日 申请日期1997年5月1日 优先权日1996年5月1日
发明者德怀特·T·托姆斯, 保罗·大卫·米勒, 罗伯特·J·本森 申请人:先锋高级育种国际股份有限公司