专利名称：抗α/β干扰素受体的抗体的制作方法
技术领域：
本发明涉及抗α/β干扰素受体上配体结合部分的抗体，它们能选择性地减弱多种Ⅰ型干扰素的活性。
欧洲专利(EP)出版物No.588,177描述了一种分子量约40,000的可溶性IFN-α受体，是通过与125Ⅰ-IFN-α2的交叉连接和与抗IFN-α单克隆抗体的免疫沉淀来鉴定的。当从血清中获取这类受体时，其分子量为50K。该专利还对从均质状态尿液中制取的有着不同于任何已知蛋白序列的上述40,000 IFN-α结合蛋白(本文下面称为“IFNAB-BP”或“IFNAB-BPⅡ”)进行了说明。IFNAB-BP与多种IFN-α亚型以及一种IFN-β结合并封闭其活性。
EP出版物No.676,413描述了编码IFNAB-BP前体的两种cDNA分子的克隆和测序，这两种DNA分子可能来自同一基因通过不同拼接而产生。该专利还描述了在哺乳动物或其它宿主细胞中生产被称为IFNAB-BPⅠ和IFNAB-BPⅡ的两种重组蛋白质。该专利还揭示了可用于封闭IFN受体、及用于IFNAB-BPⅠ和IFNAB-BPⅡ的免疫分析和免疫沉淀的抗IFNAB-BP多克隆和单克隆抗体。
本发明说明的是两组抗IFNAB-BPⅡ的中和抗体的制备，这些中和抗体能结合人细胞上的Ⅰ型干扰素的受体。其中一组抗体能够封闭IFN-α各亚型和IFN-β的活性。而另一组抗体能够选择性地封闭人细胞中α-干扰素各种亚型的活性但不影响β-干扰素的活性。这样，一组上述抗体能够抑制IFN-α的不良作用而几乎不影响IFN-β的活性。
背景技术：
Ⅰ型干扰素(IFNs)(IFN-α、IFN-β和ω)构成一族结构上相关的细胞因子，通常以其提供抗病毒感染的能力而定义为干扰素。有关Ⅰ型IFN的许多其它生物活性已经有所报道，其中包括抑制细胞增殖、诱导Ⅰ型MHC抗原和其它几种免疫调节活性(1)。IFN-α和IFN-β可以用于治疗数种病毒疾病，包括丙型肝炎(2,3)和病毒性疣，以及某些恶性肿瘤例如毛细胞白血病(6)、慢性髓性白血病(7)和卡波济(Kaposis’s)肉瘤(8)。
在各种患有诸如系统性红斑狼疮(9)等自身免疫疾病的病人和AIDS(10)病人的血清中发现有IFN-α。IFN-α与青少年性糖尿病的发展有关(11)。而且，IFN-α治疗在某些病例中导致了不良副作用，包括发热和神经紊乱等(12)。所以，在某些病理状态下，中和掉IFN-α的活性对病人也许是有利的。
和其它细胞因子一样，IFN-α通过结合细胞表面受体发挥其生物活性，该受体对IFN-α所有亚型和IFN-β具有特异性(13)。从Daudi细胞鉴定出并克隆得到了人IFN-α受体(IFNAR)(14)。克隆得到的这种受体具有一个单一的跨膜区，一个胞外区和一个胞内区。当在鼠细胞中表达时，该受体对人IFN-αB具有应答反应，但对其它种类IFN-α和IFN-β没有明显的应答反应，这表明在对IFN-β和IFN-α各亚型的应答反应中，还涉及其它组分。
其它一些研究显示，还有其它组分或受体亚基参与与IFN-α和IFN-β的结合(15-17)。然而，据报道，上述受体(14)涉及到与所有IFN-α和IFN-β种类的结合(18)。的确，最近鉴定和克隆了第二受体组分，命名为IFN-α/β受体(EP出版物No.676,413和参考文献19)。我们证实，胞外区序列与IFNAB-BPⅠ相同的IFN-α/β受体是Ⅰ型干扰素受体的主要配体结合组分；而且，干扰素-α/β受体和IFNAR在配体结合中进行合作，并在细胞表面与Ⅰ型干扰素形成三元复合物(20)。
针对IFNAR并能够非选择性地封闭Ⅰ型干扰素的许多单克隆抗体已有所报道(21)。针对尚未鉴定受体组分的另一些单克隆抗体也有描述，这种抗体非选择性地封闭Ⅰ型干扰素的活性。
发明概述本发明提供了抗IFN-α/β受体的单克隆抗体，此受体是IFN-α和IFN-β的通用受体。这些抗体可与受体的多种形式结合，而受体可以表达在人细胞上或者是可溶性的IFNAF-BPⅠ和IFNAF-BPⅠ。本发明开发了两类中和性单克隆抗体。一类用于封闭IFN-α和IFN-β的抗病毒活性时表现出很高的效价。另一类意外地发现只对IFN-α的抗病毒活性表现出很高的封闭效价，而对封闭IFN-β的活性只有很低的效价。这样，令人惊奇的第二类单克隆抗体也许可在一定的浓度范围内用于选择性地封闭IFN-α的活性而不影响IFN-β的活性。
本发明还提供抗人细胞表达的IFN-α/β受体(IFNAB-BPⅠ和IFNAB-BPⅡ)的人源化单克隆抗体，人源化单克隆抗体是鼠-人杂交抗体分子，其中可变区来自小鼠抗体而恒定区来自人抗体。
本发明还提供编码抗IFN-α/β受体(IFNAB-BPⅠ和IFNAB-BPⅡ)的单克隆抗体和人源化单克隆抗体的DNA分子。
本发明还提供含有上述DNA分子的可复制表达载体，用该载体转化的宿主细胞和由该转化宿主细胞产生的蛋白质。“DNA分子”一词包括基因组DNA、cDNA、人工合成DNA和它们的组合物。
本发明还涉及这样的DNA分子，它们可以在严谨条件下与上述DNA分子杂交，并编码具有与抗IFN-α/β受体(即IFNAB-BPⅠ和IFNAB-BPⅡ)的单克隆抗体和人源化单克隆抗体相同生物活性的蛋白质。
本发明还提供能够产生抗IFN-α/β受体(即IFNAB-BPⅠ和IFNAB-BPⅡ)的功能性单克隆抗体和人源化单克隆抗体的宿主细胞的制备方法。
本发明的单克隆抗体抑制人细胞内α干扰素的生物活性但不影响人β干扰素的生物活性。采用人WISH细胞和水泡性口炎病毒进行细胞病变抑制试验定量评价抗体的抑制作用来测定这种生物活性。
发明详细说明根据以色列(Israeli)专利申请No.106591，通过两步色谱从正常尿液中分离出分子量40,000的IFN-α/β结合蛋白(IFNAB-BP)。将粗制尿蛋白上样于IFN-α2连接的琼脂糖色谱柱上。洗去柱上的无关蛋白，然后在低pH下洗脱结合蛋白。用体积排斥性HPLC分析洗脱的蛋白质，得到几个蛋白质峰，一个蛋白峰的特性是能特异性地与125Ⅰ-IFN-α2反应并封闭IFN-α和IFN-β的抗病毒活性。对该蛋白进一步通过N末端微测序分析进行鉴定。将得到的序列与已知的IFNAR受体序列(14)比较，发现与之不同。而且，用FastA程序(23)将其与Swissport和Genebank数据库比较发现，它与任何已知蛋白质都不同，而且不是由任何已知的DNA序列所编码。
用尿IFNAB-BP的均一制品作为制备抗体的免疫原。
“抗体”一词意味包括多克隆抗体、单克隆抗体(Mab)、嵌合抗体、抗独特型抗体(抗-Ⅰd抗体)和能以可溶性或结合形式标记的抗体，还包括采用各种已知技术(例如酶切、肽合成或重组技术)产生的它们的活性片段。
多克隆抗体是来自抗原免疫动物血清的异质性抗体分子群。单克隆抗体是含有基本上均一的抗原特异性抗体分子群，该分子群含有基本上相同的表位结合位点。Mab可由该领域技术人员已知的方法来获得。例如，可参见Kohler和Milstein,Nature 256:495-497(1975)；美国专利No.4,376,110；Ausubel等编辑的CurrentProtocols in Molecular Biology,Greene Publishing Assoc.and Wiley Interscience,N.Y.,(1987-1996)；Harlow和Lane,ANTIBODIES:A LABORATORY MANUAL,Cold Spring Harbor Laboratory(1988)；和Colligan等编辑的Current Protocols inImmunology,Greene Publishing Assoc.and Wiley Interscience,N.Y.,(1992-1996)，本文全面参考了上述文献的内容。这类抗体可以是各类免疫球蛋白包括IgG、IgM、IgE、IgA、GILD和它们的各种亚类。产生本发明Mab的杂交瘤可以体外培养、原位培养或体内培养。体内或原位产生高效价Mab是目前优选的生产方法。
嵌合抗体是其不同部分来自不同种动物的分子，例如来自小鼠Mab的可变区和人免疫球蛋白恒定区的抗体分子。嵌合抗体主要用于降低免疫原性和提高生产得率。例如，由杂交瘤生产的鼠Mab产量较高，但在人体内免疫原性较高，故使用人/鼠嵌合抗体。嵌合抗体及其制备方法在该领域中是众所周知的(Cabilly等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:3273-3277(1984)；Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:6851-6855(1984)；Boulianne等，Nature 321:643-646(1984)；Cabilly等，欧洲专利申请125023(公开于1984年11月14日)；Neuberger等，Nature314:268-270(1985)；Taniguchi等，欧洲专利申请171496(公开于1985年2月19日)；Morrison等，欧洲专利申请173494(公开于1986年3月5日)；Neuberger等，PCT申请WO8601533(公开于1986年3月13日)；Kudo等，欧洲专利申请184187(公开于1986年6月11日)；Morrison等，欧洲专利申请173494(公开于1986年3月5日)；Sahagan等，J.Immunol.137:1066-1074(1986)；Robinson等，国际专利申请WO9702671(公开于1987年5月7日)；Liu等Proc.Natl.Acad Sci.USA 84:3439-3443(1987),Sun等Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:214-218(1987)；Better等，Science 240:1041-1043(1988)；和Harlow和Lane,ANTIBODIES:ALABORATORY MANUAL supra。本文全面参考了上述文献中的内容。
抗独特型(抗-Ⅰd)抗体是这样一种抗体，它识别与抗体的抗原结合位点通常有关的独特性决定基。Ⅰd抗体可以用与待制备抗Ⅰd对应的Mab免疫与Mab来源同种且同基因型的动物(例如小鼠系)来制备。经免疫的动物将产生针对独特型决定基的抗体(抗Ⅰd抗体)来识别免疫用抗体的独特型决定基，并对其反应。例如参见美国专利No.4,699,880，本文全面参考了其中的内容。
抗-Ⅰd抗体还可用作“免疫原”，在其它动物中诱导免疫应答，产生所谓的抗-抗-Ⅰd抗体。抗-抗-Ⅰd可能与诱导抗-Ⅰd的原先Mab具有相同的表位。这样，使用抗Mab的独特型决定基的抗体，可鉴定相同特异性的其它克隆表达抗体。
所以，本发明产生的抗IFNAB-BPⅠ、IFNAB-BPⅡ和相关蛋白的Mab，可用来在合适动物(如BLAB/c小鼠)中诱导抗-Ⅰd抗体。用如此免疫的小鼠的脾细胞来生产分泌抗-Ⅰd Mab的抗-Ⅰd杂交瘤。而且，可将抗-Ⅰd单抗与钥孔蝛蓝蛋白之类载体偶联用于免疫其它BLAB/c小鼠。这些鼠的血清将含有抗-抗-Ⅰd抗体，此种抗体具有原先Mab(对IFNAB-BPⅠ或IFNAB-BPⅡ表位特异的)的结合特性。
这样，抗-Ⅰd Mab具有自己的独特型表位，或具有结构上与被评价表位(如IFNAB-BPⅠ或IFNAB-BPⅡ)相似的“表位”。
“抗体”一词还意味着包括完整抗体分子，和它们的能够结合抗原的活性片段，如Fab和F(ab’)2。Fab和F(ab’)2没有完整抗体的Fc片段，从循环中清除速度较快，而且比全抗体有较少的非特异性组织结合(Wahl等，J.Nucl.Med.24:316-325(1983))。
可以理解的是，按照本发明就完整抗体分子所述的方法，本发明所用抗体的Fab和F(ab’)2以及其它片段，可用来选择性封闭IFN-α的生物活性。这些片段一般是用蛋白酶裂解产生的，如用木瓜蛋白酶产生Fab片段或用胃蛋白酶产生F(ab’)2片段。
一种抗体如果它能特异性地与分子反应从而使分子与抗体结合，我们就说该抗体“能够结合”该分子。“表位”一词意指任何分子上能被某抗体结合并能被该抗体识别的部分。表位或“抗原决定基”一般由分子的化学活性表面基团(如氨基酸或糖侧链)构成，而且具有特殊的三维结构特性和特殊的电荷特性。
“抗原”是一个分子或分子的一个部分，它能被某抗体结合，并能诱导动物产生能与该抗原某表位结合的抗体。抗原可能具有一个或多个表位。上述特异性反应指抗原以高度的选择性方式与其相对应的抗体反应，而不与其它抗原激发的许多其它抗体反应。
本发明所用的抗体，包括抗体的片段，可用来封闭IFN-α各亚型的生物活性而对IFN-β活性几乎没有影响。
本发明还提供编码上述本发明任何一种抗体的DNA分子、含有这种DNA分子的可复制表达载体及用这类表达载体转化的宿主细胞(包括原核和真核宿主细胞)。
本发明还包括生产本发明各种抗体的方法，即培养本发明的杂交瘤，回收其分泌的单克隆抗体。
本发明还包括生产本发明各种抗体的方法，即培养本发明的转化细胞，并回收其分泌出来的由上述转化宿主细胞内DNA分子和表达载体编码的抗体。
本发明还涉及上述抗体的活性突变蛋白和活性片段，并涉及下述融合蛋白，它由野生型抗体、或其活性突变蛋白、或其活性片段，与另一种多肽或蛋白质融合而成，并表现出相似的封闭Ⅰ型IFN生物活性的能力。
将编码上述抗体、其活性片段、突变蛋白或融合蛋白的DNA，和操作性连锁的转录和翻译调节信号，插入到能够将所需基因序列整合到宿主细胞染色体中的真核载体内。为了能够选择出染色体内稳定整合了引入DNA的细胞，采用了一个或多个标记以使含有表达载体的宿主细胞被选出。标记可能为营养缺陷型宿主提供原养性，提供对抗微生物剂(如抗生素)的抗药性，或者对重金属(如铜)的抗性等。可选择的标记基因可直接连到待表达的DNA基因序列上，或通过共同转染引入同一细胞。为了以最佳方式合成单链结合蛋白的mRNA，可能还需要其它元件，这些元件可能包括拼接信号、转录启动子、加强子和终止信号(24)。
为了表达上述抗体、其活性片段或衍生物，宜将待引入所选细胞的DNA分子掺入到在受体宿主内能自主复制的质粒或病毒载体中。
选择具体的质粒或病毒载体时需考虑的重要因素包括从不含载体的接受细胞中识别和选出含载体的接受细胞是否容易；所需载体在具体宿主内的拷贝数是否理想；是否需要令载体能够在不同种系宿主细胞之间“穿梭”。较好的原核载体包括那些能够在大肠杆菌中复制的质粒，例如pBR322、ColEl、pSC101、pACYC184等(25)；芽孢杆菌质粒，例如pC194、pC221、pT127等(26)；链霉菌质粒，包括pIJ101(27)，链霉菌噬菌体例如IC31(28)和假单孢菌质粒(29,30)。
较好的真核质粒包括BPV、牛痘、SV40、2-微米环(2-micron circle)等，或它们的衍生物。这些质粒是该领域所熟知的(31-35)。
一旦含有上述结构的载体或DNA序列为了表达而制备出来，就可以利用各种合适方法将表达载体引入合适的宿主细胞，这些方法有转化、转染、脂质转染、偶联、原生质融合、电穿孔、磷酸钙沉淀、直接微注射等。
本发明所用宿主细胞可以是原核或真核细胞。较好的原核宿主细胞有大肠杆菌、芽孢杆菌、链霉菌、假单孢菌、沙门氏菌、沙雷氏菌等属的细菌。最好的原核宿主菌是大肠杆菌。细菌宿主具体包括大肠杆菌K12菌株294(ATCC 31446)，大肠杆菌X1776(ATCC 31537)，大肠杆菌W3110(F-,λ-，光养型(ATCC 27325))，以及其它肠杆菌如鼠伤寒沙门氏菌或粘质沙雷氏菌和假单孢菌属下的各菌种。在这种情况下，蛋白质将不会糖基化。原核宿主细胞必须是与表达质粒中的复制子和调控序列相容的。
较好的真核宿主是哺乳动物细胞，例如人、猴子、小鼠的细胞和中国仓鼠卵细胞(CHO)，因为它们能够对蛋白质分子进行翻译后修饰，包括正确地折叠、正确的二硫键形成、以及在正确位置的糖基化。此外，酵母细胞和昆虫细胞也能够进行翻译后的肽修饰，包括高甘露糖糖基化。有许多采用强启动子序列和质粒高拷贝数的重组DNA方法，它们可以用来在酵母和昆虫细胞中生产所需的蛋白质。酵母细胞能够识别克隆的哺乳动物基因产物上的引导序列，并分泌带引导序列的肽。在引入载体后，宿主细胞在选择培养基上培养使含载体的细胞得以生长。克隆基因序列的表达导致产生上述抗体、融合蛋白或突变蛋白或其活性片段。然后用萃取、沉淀、色谱、电泳等常规技术或亲和性色谱分离纯化表达的抗体。
这儿用的“突变蛋白”一词指上述抗体的类似物，即上述抗体或其活性片段的一个或几个氨基酸残基被不同的氨基酸残基取代、或缺失、或在述抗体的原序列中增加了一个或几个氨基酸残基，但与野生型抗体或其活性片段相比，所得产物的活性并没有明显改变。这些突变蛋白是用已知的合成方法和/或用定点突变技术，或任何其它已知的合适技术制备的。
任何此类突变蛋白都宜具有与上述抗体足够相似的氨基酸序列，以致具有与上述抗体或其活性片段基本相同的活性。一组上述抗体能够封闭人INF-α2和人INF-β的抗病毒活性。另一组上述抗体能够封闭人INF-α2的抗病毒活性，同时人INF-β的抗病毒活性则基本保留完好。这样，就可以用常规实验确定任何给定的突变蛋白是否具有与上述抗体基本相同的活性，这些实验包括对上述突变蛋白进行简单的抗病毒测定，因为能封闭任何一种Ⅰ型干扰素的突变蛋白保留了上述抗体的足够活性，至少具有上述抗体的一种用途，因而具有基本相同的活性。
在一个优选实施方案中，任何上述突变蛋白至少有着与上述一种抗体的序列40％的一致性或同源性。更好的是，至少有50％、60％、70％、80％，或者，最好至少有90％的一致性或同源性。
本发明使用的上述抗体或其活性片段的突变蛋白、或其编码核酸、包括一套有限的基本对应的序列作为置换肽或聚核苷酸，根据在此给出的说明和指导，运用该领域普通技术无需过多的试验就可常规获得。有关蛋白质化学和结构的详细说明可参见Schulz,G.E.等，Principles of Protein Structure,Springer-Verlag,NewYork,1978；和Greighton,T.E.,Proteins:Structure and Molecular Properties,W.H.Freeman&Co.,San Francisco,1983，本文参考了其中的内容。有关核苷酸序列转换的说明，例如密码子的偏向性，参见Ausubel等在§§A.1.1-A.1.24中所述和Sambrook等在前述文献的附录C和D中所述。
根据本发明，突变蛋白变化较好的是所谓的“保守性”转换。上述抗体、多肽或蛋白质或其活性片段的保守性氨基酸转换包括使用理化性质足够相似(以致于组内成员间的取代将保留分子的生物功能)的同组内的同义氨基酸，Grantham,Science,Vol.185,pp.862-864(1)。显然，在以上定义出的序列中还可以进行氨基酸的插入和缺失而不改变其功能，特别是在插入或缺失只涉及少数(例如30个以下，10个以下更好)氨基酸，而不要去除或取代对功能性构象来说至为关键的氨基酸(例如半胱氨酸残基)，Anfinsen,“Principle That Goven The Folding of ProteinChains”,Science,Vol.181,pp.223-230(1973)。因上述缺失和/或插入产生的蛋白质和突变蛋白也属于本发明范围之内。
同义氨基酸分组较好的是表Ⅰ中的那些。更好的是表Ⅱ中的那些；最好的是表Ⅲ中的那些。
表Ⅰ较优的同义氨基酸分组氨基酸同义氨基酸Ser Ser,Thr,Gly,AsnArg Arg,Gln,Lys,Glu,HisLeu Ile,Phe,Tyr,Met,Val,LeuPro Gly,Ala,Thr,ProThr Pro,Ser,Ala,Gly,His,Gln,ThrAla Gly,Thr,Pro,AlaVal Met,Tyr,Phe,Ile,Leu,ValGly Ala,Thr,Pro,Ser,GlyIle Met,Tyr,Phe,Val,Leu,IlePhe Trp,Met,Tyr,Ile,Val,Leu,PheTyr Trp,Met,Phe,Ile,Val,Leu,TyrCys Ser,Thr,CysHis Glu,Lys,Gln,Thr,Arg,HisGln Glu,Lys,Asn,His,Thr,Arg,GlnAsn Gln,Asp,Ser,AsnLys Glu,Gln,His,Arg,LysAsp Glu,Asn,AspGlu Asp,Lys,Asn,Gln,His,Arg,GluMet Phe,Ile,Val,Leu,MetTrp Trp
表Ⅱ更优的同义氨基酸分组氨基酸 同义氨基酸SerSerArgHis,Lys,ArgLeuLeu,Ile,Phe,MetProAla,ProThrThrAlaPro,AlaValVal,Met,IleGlyGlyIleIle,Met,Phe,Val,LeuPheMet,Tyr,Ile,Leu,PheTyrPhe,TyrCysCys,SerHisHis,Gln,ArgGlnGlu,Gln,HisAsnAsp,AsnLysLys,ArgAspAsp,AsnGluGlu,GlnMetMet,Phe,Ile,Val,LeuTrpTrp
表Ⅲ最优的同义氨基酸分组氨基酸同义氨基酸Ser SerArg ArgLeu Leu,Ile,MetPro ProThr ThrAla AlaVal ValGly GlyIle Ile,Met,LeuPhe PheTyr TyrCys Cys,SerHis HisGln GlnAsn AsnLys LysAsp AspGlu GluMet Met,Ile,LeuTrp Met用于获得本发明所用上述抗体或其活性片段的突变蛋白，而在蛋白质中进行氨基酸转换的实例，包括下述专利所提供的已知方法步骤，如Mark等的美国专利RE33,653、4,959,314、4,588,585和4,737,462；Koths等的5,116,943，Namen等的4,965,195；Chong等的4,879,111；和Lee等的5,017,691；和美国专利4,904,584(Shaw等)所述的赖氨酸被转换蛋白质的制备方法。
在本发明另一个较优实施方案中，上述抗体或其活性片段的各种突变蛋白都具有与上述抗体基本对应的氨基酸序列。“基本对应”一词意指对天然蛋白的序列作微小改变而不影响其基本特性(尤其指其完全或选择性封闭IFN-α和IFN-β活性的能力)的蛋白质。通常认为，落在“基本对应”一词范围以内的变化类型是指对编码上述抗体的DNA进行常规突变技术所获得的那些变化，这些变化导致抗体有几处微小的修饰，并按上述方式作所需活性的筛选工作。
本发明的突变蛋白包括在严谨条件下与编码本发明所述抗体的DNA或RNA进行杂交的DNA或RNA类核酸编码的蛋白。本发明还包括也可用作探针的核酸来鉴定和纯化所需核酸。而且，这类核酸将作为首要候选核酸以确定它是否编码保留本发明所述抗体功能活性的多肽。“严谨条件”一词指杂交和随后的洗涤条件。这些普通技术在该领域被常规称为“严谨”。参见Ausubel等，Current Protocolsin Molecular Biology,supra,Interscience,NY,§§6.3和6.4(1987,1992)，和Sambrook等，supra。除此之外，严谨条件的例子还包括如下洗涤条件在实验计算的杂交温度Tm以下12至20℃，在2*SSC和0.5％SDS中洗涤5分钟，在2*SSC和0.1％SDS中洗涤15分钟；在0.1*SSC和0.5％SDS中37℃洗涤30至60分钟；然后在0.1*SSC和0.5％SDS中68℃洗涤30至60分钟。该领域普通技术人员知道，严谨条件还取决于DNA序列、寡核苷酸探针(如10至40个碱基)或混合寡核苷酸探针的长度。如果使用的是混合探针，最好用氯化四甲基铵(TMAC)代替SSC。参见Ausubel,supra。
“融合蛋白”一词指一种多肽，它含有与另一蛋白质融合的上述抗体或其活性片段或其突变蛋白，而这个“另一蛋白”在体液内有更长的滞留时间。这样，上述抗体或其活性片段可能与另一蛋白质、多肽等融合。
本文中的“盐”一词指上述抗体、其活性片段、突变蛋白、或其融合蛋白的羧基盐和氨基的酸加成盐。羧基盐可用该领域的已知方法形成，包括无机盐例如钠、钙、铵、正铁或锌盐等，以及与有机碱形成的盐，例如与三乙醇胺为例的胺、精氨酸或赖氨酸、哌啶、普鲁卡因等所成的盐。酸加成盐包括例如与盐酸或硫酸为例的无机酸所形成的盐，以及与乙酸或草酸为例的有机酸所成的盐。当然，任何所述盐都必须具有与上述抗体或其活性片段基本相同的活性。
“功能性衍生物”在此包括上述抗体或其活性片段及它们的突变蛋白和融合蛋白的衍生物，它们可用该领域的已知方法由作为残基侧链的功能性基团或N端或C端基团制得，而且，只要它们仍然是药学上可接受的，即不破坏蛋白质的与上述抗体基本相同的活性，且不使得含有它们的组合物具有毒性，它们也属于本发明范围之内。例如这类衍生物包括可以遮蔽抗原位点并延长上述抗体或其活性片段体液滞留时间的聚乙二醇侧链。其它衍生物包括羧基的脂族酯、与氨气或伯胺或仲胺反应生成的羧基的酰胺，与酰基(例如链烷酰基或碳环芳酰基)形成的氨基酸残基的游离氨基的N-酰基衍生物，或是与酰基形成的游离羟基(例如丝氨酰或苏氨酰残基的羟基)的O-酰基衍生物。
在本发明中，上述抗体、突变蛋白和融合蛋白的“活性片段”包括(单纯的或者氨基酸残基上联有糖或磷酸基之类分子。)上述抗体多肽链的片段或前体，或含有上述抗体此类片段的融合蛋白或任何上述抗体的凝聚物，条件是这些片段具有与上述抗体基本相同的活性。
本发明还涉及药物组合物，它含有药学上可接受的载体和本发明的抗体或其突变蛋白、融合蛋白和它们的盐，它们的功能性衍生物或活性片段。
将上述抗体或其衍生物与生理学可接受的载体和/或稳定剂和/或赋形剂混合，并通过(例如在装药瓶中低温干燥制备成)剂量形式来制备本发明供使用的药物组合物。使用方法可以用类似药物被认可的各种给药方式，并由治疗情况而定，如经静脉、肌内、皮下给药，局部注射或局部使用，或连续输注等等。所给的活性成份的量视给药途径、所治疾病和病人情况而定。例如，局部注射所需蛋白质的量按体重计低于静脉输注所需。
例如，上述抗体可用于Ⅰ型糖尿病、各种自身免疫病、移植排斥、AIDS和类似疾病以减弱或封闭各种IFN-α亚型的生物活性，这些疾病都存在IFN-α的异常表达。即，上述抗体可用于内源产生或外源给药而致IFN-α过量的各种情况。
所以，上述抗体、人源化抗体、它们的活性片段、突变蛋白、融合蛋白和它们的盐、功能性衍生物、和上述分子的活性片段，被指明用于治疗自身免疫疾病、哺乳动物的其它炎症、因使用α或β干扰素引起的中毒、青少年性糖尿病、红斑狼疮和AIDS。
现在通过非限制性实施例来对本发明进行说明实施例1用IFNA-BP免疫小鼠并与骨髓瘤细胞融合雌性Balb/C小鼠(3月龄)首次注射2微克纯化IFNA-BP费氏完全佐剂乳液，三周后皮下注射费氏不完全佐剂抗原乳液。每隔10天皮下注射以PBS配的抗原溶液五次。这些小鼠血清的结合效价经IsRIA(见下)测定为1∶100,000。按以下方法测定抗血清封闭IFN-α和IFN-β的抗病毒活性在96孔测试板上预先形成人WISH细胞单层，37℃与两倍稀释的抗血清(或单克隆抗体)培养2小时。然后所有孔中加入IFN-α或IFN-β(10单位/毫升(U/mi)最终浓度按NIH标准标定)，测试板再培养4小时。用水泡性口炎病毒(VSV)攻击细胞，培养过夜，直到未加IFN的对照孔出现完全细胞病变。呈现50％CPE的孔的抗体中和效价定为9单位/毫升。因此，1个封闭单位/毫升即为在上述测试条件下封闭每毫升1单位IFN所需的抗体浓度。免疫小鼠血清对IFN-α2和IFN-β的中和效价都是120,000单位/毫升。
在融合前4天和3天，腹腔注射纯化IFNAB-BP作最后的加强免疫。用NSO/l骨髓瘤细胞系和免疫小鼠脾和淋巴结制得的淋巴细胞作为融合亲本进行融合。将融合后的细胞分种在96孔培养板中，并在添加HAT和15％马血清的DMEM培养液中选择培养杂交瘤。
实施例2杂交瘤的筛选和单克隆抗体的鉴定筛选产生抗-IFNAB-BP单克隆抗体的杂交瘤按以下方法进行，并通过反向固相放射免疫试验(sRIA)检测试杂交瘤上清液中是否存在抗-IFNAB-BP抗体PVC微滴板(Dynatech Laboratories,Alexandria,VA)以亲和纯化的山羊抗小鼠血清F(ab)2抗体(Jackson Labs,USA)(10微克/毫升，100微升/孔)包被。在4℃培养过夜，微滴板用含BSA(0.5％)和Tween20(0.05％)的PBS洗涤两次，并用洗涤液37℃封闭至少2小时。加入杂交瘤培养上清液(100微升/孔)。微滴板再在37℃培养4小时。然后用洗涤液洗涤3次，加入125I-IFNAB-BP(100微升，105cpm)4℃再培养16小时。微滴板洗涤3次，切下各孔在γ计数器中计数。计数值高出阴性对照值至少5倍的样品被认为阳性(表Ⅳ)。挑选出所有的阳性克隆进行亚克隆。将各亚克隆细胞注入用降植烷预处理过的Balb/C小鼠生产腹水。用硫酸铵(50％饱和度)沉淀从腹水中分离出免疫球蛋白。用市售ELISA试剂盒(Amersham,UK)鉴定抗体的类型。
按以上免疫小鼠血清活性测定所述，对各种单克隆抗体，即杂交瘤上清液、浓缩杂交瘤上清液、腹水或自腹水分离的免疫球蛋白，进一步测试其封闭受体和抑制IFN-α2和IFN-β抗病毒活性的能力。结果列于表Ⅳ中。由此发现，单克隆抗体16.3,35.2和392.1以相当高的效价封闭了IFN-α2和IFN-β的抗病毒活性，但是单克隆抗体35.9、51.44和234.14抗IFN-α2的效价意外地明显高于它们抗IFN-β的效价。这样，单克隆抗体35.9、51.44和234.14在某浓度范围内可用来选择性封闭IFN-α的活性而不影响IFN-的活性。
表Ⅳ抗IFN-α/β受体(IFNAB-BP)单克隆抗体的特性鉴定抗体IsIRA(cpm) 中和效价(U/ml) 中和效价(U/ml) Ig类型IFN-α2 IFN-β16.3杂交瘤上清液 39,103 ＞5,120ND IgG116.3腹水1ND260,000 60,000 IgG135.9杂交瘤上清液 33,100 1,280 150 IgG135.9腹水 ND 60,000 15,000 IgG151.44杂交瘤上清液 6,345 1,000 ＜75IgG2a51.44 Ig(5毫克/毫升) ND 15,000 ＜2500 IgG2a53.2杂交瘤上清液 26,737 2,000 ND IgG153.2腹水 ND 120,00070,000 IgG1117.7杂交瘤上清液 38,945 2,000 ND IgG1117.7 Ig(10毫克/毫升) ND 28,800,000 2,000,000 IgG1234.14杂交瘤上清液 21,812 ＞5,120＜200 IgG2a234.14 Ig(10毫克/毫升) ND 1,440,000 23,000 IgG2a392.1杂交瘤上清液 34,390 2,400 ND IgG1392.1腹水 ND 160,00 70,000 IgG11约5毫克/毫升Ig2没测试实施例3用单克隆抗体作IFNAB-BPⅡ的ELISA测定将微滴板(Dynatech or Maxisorb,bNunc)以抗-IFNAB-BP单克隆抗体包被，4℃过夜。该第一层包被可以用单克隆抗体No.46.10(Ig片段，120微升/孔，10微克/毫升，以PBS溶液配制)。单克隆抗体No.46.10可参见EP出版物No.676,413。
或者，可用单克隆抗体No.117.7作该第一层包被。微滴板用含BSA(0.5％)、Tween20和NaN3(0.02％)的PBS(封闭溶液)洗涤，并用该溶液37℃封闭过夜。测试样品以含0.1％NP40和0.65M NaCl的封闭溶液作两倍系列稀释(从1∶4开始)，加入孔中(100微升)，37℃培养4小时。微滴板然后用含0.05％Tween20的PBS(PBS/Tween)洗涤3次，接着加入生物素化单克隆抗体No.234.14(1∶1000以封闭液配制，但不含NaN3，100微升/孔)，4℃再培养过夜。微滴板以PBS/Tween(100微升/孔)洗涤3次，加入链霉亲和素-辣根过氧化物酶交联物(Jackson Labs,1∶10,000以PBS/Tween溶液配制，100微升/孔)后室温孵育2小时。微滴板以PBS/Tween洗涤3次，每孔加入100微升新鲜制备的ABTS底物溶液(2,2’-偶氮-二(3-乙基苯并噻唑啉磺酸，Sigma,10毫克；6.4毫升H2O；2.2毫升0.2M的Na2HPO4；1.4毫升0.2M柠檬酸；1微升H2O2)以显色。30分钟后显色，加100微升/孔0.2M柠檬酸终止反应。微滴板用自动ELISA读数仪在405纳米处读数，在630纳米处作非特异性读数进行校正。此试验的检测下限是30皮克/毫升。
以上对具体实施方案的说明揭示了本发明的总特征，所以，根据各种应用所需，其它人可利用现有技术在不背离总的构思下方便地对上述具体实施方案进行修改和/或适应性修改。因而，应该而且希望将这些修改理解为属于在此公开的实施方案等价的意义和范围内。应该将本文所用的词语和术语理解成是为了说明而不是为了限制本发明的范围。
杂交瘤46.10、117.7和234.14已于1996年4月23日在巴斯德研究所[PasteurInstiture(CNCM)]保藏，保藏号分别为I-1697、I-1698和I-1699。
参考文献1．Taylor,J.L.等，“干扰素研究的最新进展调节、作用和病毒防御的分子机制”“Recent progress in interferon research:molecular mechanisms of regulation.action and virus circumvention”，病毒研究(Virus Research)，15:1-26(1990)。
2．Bisceglie,A.M.等，“慢性丙型肝炎的重组α干扰素疗法。随机、双盲、安慰剂对照试验”“Recombinant interferon alpha therapy for chronic hepatitis C.Arandomized,double-bind,placebo-controlledtrial”，新英格兰医学杂志(New EnglandJ.Med.),321:1506-1510,1989。
3．McDonnell,W.M.等，“急性丙型肝炎感染干扰素最终获得成功”“Acuteheptitis C infection:interferon finally secceeds”，胃肠学(Gastroenterology)(US),130:1359-1360,1992。
4．Friedman-Kien,A.E.等，“用于治疗尖锐湿疣的天然α干扰素”“Naturalinterferon alpha for treatment ofcondylomata acuminata”，美国医学协会杂志(J.Am.Med.Assn.),259:533-538,1988。
5．Mains,J.等，“干扰素目前和将来在传染病治疗中的临床应用”“Interferon:current and future clinical uses in infectious disease practice”，世界AIDS研究杂志(Int.J.Stud.AIDS),3:4-9,1992。
6．Bernam,E等，“接受重组α-2a干扰素治疗的毛细胞白血病患者的反应率和长期随访”“Incidence of reponse and longterm follow up in patients with hairy cellleukemia treated with recombinant interferon Alpha-2a”，血液(Blood),75:839-845,1990。
7．Talpaz,M.等，“人α干扰素在慢性髓性白血病的临床研究”“Clinicalinvestigation of human alpha interferon in chronic myelogenous leukemia”，血液(Blood),69:1280-1288,1987。
8．De Wit,R.等，“高剂量重组α干扰素在治疗播散型AIDS相关卡波济肉瘤中的临床和病毒学效果”“Clinical and virological effects of high-doserecombinant-interferon-a in disseminated AIDS-related Kaposi’s sarcoma”，柳叶刀(Lancet),2:1214-1222,1988。
9．Klippel,J.H.等，“系统性红斑狼疮中的血清α干扰素和淋巴细胞包涵体”“Serum alpha interferon and lymphocyte inclusions in systemic lupuserythematosus”，类风湿性疾病年报(Annals ofRheumatic Diseases),44:104-108,1985。
10．Lau,A.S.等，“来自AIDS血清的酸不稳定性α干扰素对肿瘤坏死因子受体表达的调节”“Regulation of tumor necrosis factor receptor expression by acid-labile interferon from AIDS sera”,AIDS研究人逆转录病毒(AIDS Res.Hum.Retroviruses),7:545-552,1991。
11.Stewart TA.,“α干扰素在转基因小鼠中诱导Ⅰ型糖尿病”“Induction oftypeⅠdiabetes in transgenic mice”，科学(Science),260:1942-1946,1993。
12．Tsavaris,N.等，“用逐步加量的α干扰素来治疗肾细胞癌”“Treatment ofrenal cell carcinoma with escalating doses of alpha-interferon”，化学治疗(Chemotherapy)(瑞士)，39:361-366,1993。
13．Branka,A.A.等，“Ⅰ型和Ⅱ型干扰素具有不同的受体的证据”“EvidencethattypeⅠandⅡinterferons have differnt receptors”，自然(Nature)，294:768-770，1981。
14．Uze,G.等，“功能性人α干扰素受体向小鼠细胞的基因转移其cDNA的克隆和表达”“Genetic transfer of a functional human interferon a receptor intomouse cells:cloning and expression of its eDNA”，细胞(CelI),60:225-234,1990。
15．Colamonici,O.R.等，“识别α2干扰素受体的三种单克隆抗体的特性鉴定”“Characterization of three monoclonal antibodies that recognize the interferon-a2receptor”，美国科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA),87:7230-7234,1990。
16．Platanias,L.C.等，“毛发细胞白血病中的干扰素受体表达”“Expression ofthe IFN-receptor in hairy cell leukemia”，英国血液学杂志(Brit.J.Haematology),82:541-546,1992。
17．Colaminici,O.R.等，“人21号染色体上Ⅰ型干扰素受体新亚基的鉴定”“Identification of a novel subunite of the typeⅠinterferon receptor localized to humanchromasome 21”，生物化学杂志(J.Biol.Chem.),268:10895-10899,1993。
18．Benoit,P.等，“抗重组人IFN-a受体的单克隆抗体抑制几种人IFN-α、IFN-β和IFN-Ω的生物活性”“A monoclonal antibody to recombinant human IFN-a receptor inhibits biologic activity of several species of human IFN-α、IFN-βandIFN-omega”，免疫学杂志(J.Immunol.),150:707-716,1993。
19．Novick,D.等，“人干扰素/wbw受体特性鉴定与分子克隆”“The humanInterferon/wbw receptor:Characterization and molecular cloning”，细胞(Cell),77:391-400,1994。
20．Cohen,B.等，“配体诱导的Ⅰ型干扰素受体组份的整联”“Ligand-inducedassociation of the typeⅠinterferon receptor components”，分子细胞生物学(Molec.Cell.Biol.),15:4208-4214,1995。
21．Benoit,P.等，“抗重组人IFN-a受体的单克隆抗体抑制几种人IFN-α、IFN-β和IFN-Ω的生物活性-细胞Ⅰ型IFN受体的异质性检测”“A monoclonalantibody to recombinant human IFN-a receptor inhibits biologic activity of severalspecies of human IFN-α、IFN-β and IFN-omega-Detection of Heteogeneity of theCellular Type-ⅠIFN Receptor”，免疫学杂志(J.Immunol.),150(3):707-716,1993。
22．Colamonici,O.R.等，“人21号染色体上Ⅰ型干扰素受体新亚基的鉴定”“Identification of a novel subunite ofthe type Ⅰ interferon receptor localizedto humanchromasome 21”，生物化学杂志(J.Biol.Chem.),268:10895-10899,1993。
23．Pearson,W.R.等，“用于生物序列比较的改良工具”“Improved tools forbiological sequence comparison，美国科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA),85:2444-2448,1988。
24．Okayama,H.等，“一种允许插入cDNA在哺乳动物细胞内表达的cDNA克隆载体”“A cDNA cloning vector that permits expression of cDNA inserts inmammalian cells”，分子细胞生物学(Mol.Cell.Biol.),3:280-289,1983。
25．Maniatis,等，分子克隆实验室手册(Molecullar Cloning:A LaboratoryMannual)，冷泉港实验室，纽约，1982。
26．Gryczan,T.，芽孢杆菌的分子生物学(The Molecular Biology of theBacilli),Academic Press,NY(1982),pp.307-329。
27．Kendall,K.J.等，细菌学杂志(J.Bacteriol.),169:4177-4183,1987。
28．Chater,K.F.等，“放线菌目生物学第六届国际学会”“Sixth InternationalSymposium on Actinomycetales Biology”,Akademiai Kaido,Budapest,Hungary(1986),pp.45-54。
29．John,J.F.等，(1986)传染病评论(Rev.Infect.Dis.),8:693-704。
30．Izaki,K.,(1978)日本细菌学杂志(Jpn.J.Bacteriol.),33:729-742,31．Botstein,D.等，(1982)迈阿密冬季学会(Miami Wint.Symp.),19:265-274。
32．Broach,J.R.,“酿酒酵母的分子生物学生命周期和遗传”“The MolecularBiology of Yeast Saccharomyces:Life Cycle and Inheritance”，冷泉港实验室，纽约，pp.445-470,1981。
33．Broach,J.R.，细胞(Cell),28:203-204。
34．Bollon,D.P.等，(1980)临床血液学肿瘤学杂志(J.Clin.Hematol.Oncol.),10:39-48。
35．Maniatis,T.,“细胞生物学综合条约，第3卷基因的表达”“AComprehensive Treaties,Vol.3:Gene Expression”,Academic Press,NY.pp.563-608,1980。
36．Mizushima,S.等，“pEF-BOS，一种强哺乳动物表达载体”“pEF-BOS,apowerful mammalian expression vector”，核酸研究(Nucleic Acid Res.),18:5322-5328,1990。
37．Byrn,R.A.等，自然(Nature)(伦敦)，344:667-670,1990。
38．Frohman,M.A.等，美国科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.)(USA),85:8998-9002,1988。
39．Graham,F.L.等，病毒学(Virology),52:456-467,1973。
40．Munson,P.L.等，生物化学年报(Anal.Biochem),107:220-239,1980。
权利要求
1．一种抗体，所述抗体与IFN-α/β受体或其IFNAB-BPⅠ和IFNAB-BPⅡ的可溶形式结合，而且所述抗体封闭IFN-α的生物活性。
2．根据权利要求1所述的抗体，所述抗体封闭IFN-α和IFN-β的生物活性。
3．根据权利要求1所述的抗体，所述抗体选择性封闭IFN-α的生物活性。
4．根据权利要求1所述的抗体，所述抗体是单克隆抗体。
5．根据权利要求1所述的抗体，所述抗体是多克隆抗体。
6．根据权利要求1所述的抗体，所述抗体是嵌合抗体。
7．根据权利要求1所述的抗体，所述抗体是人源化的。
8．根据权利要求3所述的抗体，所述抗体是单克隆抗体
9．根据权利要求3所述的抗体，所述抗体是多克隆抗体。
10．根据权利要求3所述的抗体，所述抗体是嵌合抗体。
11．根据权利要求3所述的抗体，所述抗体是人源化的。
12．一种DNA分子，其中包含编码权利要求1所述抗体的DNA片段。
13．根据权利要求12所述的DNA分子，所述DNA是重组DNA分子。
14．根据权利要求12所述的DNA分子，所述编码抗体的DNA片段与转录和翻译调控信号操作性连锁。
15．一种表达载体，其中包含权利要求13所述的DNA分子。
16．一种能够表达抗体的宿主细胞，所述宿主细胞携带有权利要求15所述的表达载体。
17．一种产生抗体的方法，它是通过培养权利要求16所述的宿主细胞和表达抗体。
18．一种用于减弱或封闭IFN-α生物活性的药物组合物，它包含权利要求1所述的抗体和药学上可接受的载体。
19．一种减弱或封闭IFN-α生物活性的方法，包括给有需要的主体使用有效量的权利要求18所述的药物组合物。
20．一种表达权利要求1所述抗体的杂交瘤，名称为NUR2 117.7，并于1996年4月23日在巴斯德研究所(Pasteur Institut)保藏，保藏号为I-1698。
21．一种表达权利要求1所述抗体的杂交瘤，名称为NUR2 234.14，并于1996年4月23日在巴斯德研究所保藏，保藏号为I-1699。
22．一种测试IFNAB-BPⅠ和IFNAB-BPⅡ的ELISA方法，包括涂有单克隆抗体46.10或117.7第一涂层和单克隆抗体234.14第二涂层的市售微滴板。
全文摘要
本发明提供了抗α/β干扰素受体上配体结合部分的抗体,所述抗体能够选择性减弱各种Ⅰ型干扰素的活性。
文档编号C12P21/08GK1220699SQ97195186
公开日1999年6月23日 申请日期1997年4月29日 优先权日1996年5月1日
发明者D·诺维克, M·鲁宾斯坦 申请人:依达研究发展有限公司