抗氧化功能的生物化学分析方法

专利名称：抗氧化功能的生物化学分析方法
背景技术：
发明领域本发明总地涉及营养和生理化学领域。更具体地，本发明涉及一种抗氧化功能生化分析的新方法。
相关技术描述个体的细胞经常受到高反应性且不稳定分子的作用，这些分子称为自由基，它们会产生氧化应力(oxidative stress)。这些有害分子是生命中的正常副产物，它们是由氧代谢(即细胞呼吸)、免疫系统的细胞(杀死外来物)和代谢所必需的许多酶反应产生的。自由基的环境来源包括吸烟、离子辐射、空气污染、化学物质(致癌物、许多石油化学产品、杀生物剂、染料、溶剂、细胞抑制药物等)、有毒重金属和氧化(腐败)的脂肪。一些最常见的自由基是超氧化物、羟基、单线态氧和过氧化物。某些价态的铁和铜能够催化自由基形成，尽管这些自由基的寿命很短，但是它们会加速自由基形成的链反应，随后会改变和损伤生物分子。
自由基对活生物有毒性，它会破坏所有生物分子的结构。分子损伤会导致遗传密码改变、细胞膜完整性破坏、神经学疾病、内分泌失调、过敏反应增加、血管内皮破坏和关节退化及发炎。
在称为抗氧化剂的各类分子中发现它们可防止自由基的有害作用。抗氧化剂可中和自由基及其链反应的副产物，并将其转变成害处较小的产物。抗氧化剂可以是酶(如超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶)、必需的营养物(如β胡萝卜素、维生素C和E、硒和半胱氨酸)或各类内源化合物(如谷胱甘肽)或来自饮食的化合物(如生物类黄酮)。因此，人体有不同的自由基淬灭剂。
人体研究表明，抗氧化剂营养物的摄入不足与发生癌症、心血管疾病、关节炎、白内障等较高危险性相关。另外，摄入较高量的营养物抗氧化剂与退行性疾病的发病率较低相关。令人鼓舞的研究表明，给予抗氧化剂营养补充进行干涉，对人体有治疗效益。
由于各种原因，抗氧化剂状况的实验室分析还没有成为常规。自由基的存在非常短暂，通常不容易进行直接测定。可对自由基破坏产生的副产物丙二醛(MDA)、硫代巴比妥酸反应性物质(TBARS)或血清或尿液中的脂质过氧化物进行测定。这些试验是氧化应力的指标，但是只能反映某些类型的生物分子(大多数是多聚不饱和脂质和核酸)的破坏情况。测定血清或细胞的抗氧化营养物水平以及细胞中抗氧化酶活性，可以明确特定组分的缺乏水平，但是关于抗氧化剂相互作用和净功能能提供的信息非常少。还有其它一些测定氧化应力的方法是在研究环境下得到的，由于这些方法复杂而且昂贵，因此它们不适合常规临床实验室使用。
现有技术不足处在于缺乏简单而廉价的人体抗氧化功能的生化分析方法。本发明满足了这一领域长期以来的需求。
发明概述在本发明的一个实施例中，提供了一种用于人淋巴细胞抗氧化功能生化分析的细胞培养基，所述培养基包含无血清缓冲液，该缓冲液含有下列组分一种选自葡萄糖和生物学上能在细胞中产生葡萄糖的化合物的糖类，一种生物可用形式的泛酸，胆碱或可在细胞中产生胆碱的生物可利用形式的物质，无机离子，这些无机离子包括氯离子、磷酸根、钙离子、镁离子、钾离子、钠离子和生物学上可利用形式的铁离子，氢过氧化枯烯、去离子水和刺激待测淋巴细胞的有效量的促细胞分裂剂；所述无血清缓冲液的pH值为6.8-7.6，所述的细胞培养基的特征是它可有效地用来测定营养缺乏、不足和失调，并可用来对淋巴细胞的抗氧化功能进行生化分析。
在本发明的另一个实施例中，提供了一种对个体的细胞抗氧化功能进行生化分析的方法，该方法包括下列步骤将所述个体的淋巴细胞接种入本发明的细胞培养基中；培育接种了细胞的培养基；将该淋巴细胞的反应与对照组个体淋巴细胞的平均反应进行比较。
在本发明还有一个实施例中，提供了一种测定个体所需特定营养物的异常营养需求量的方法，该方法包括下列步骤将所述个体的淋巴细胞接种入本发明的细胞培养基中，所述培养基含有有限浓度的待测营养物；培育接种了细胞的培养基；将该淋巴细胞的反应与对照组个体淋巴细胞的平均反应进行比较。
在本发明另一个实施例中，提供了一种在对有害作用敏感的个体中，鉴定营养因素或生化中间产物的方法，该营养因素或生化中间产物能克服营养物、生化中间产物或其产物、以及包括药物在内的其它血液组分的有害作用，该方法包括下列步骤对本发明的细胞培养基进行接种，该细胞培养基含有至少一种营养物、生化中间产物或产物、或包括药物在内的其它血液组分，它们的浓度对细胞反应有有害作用；培育接种了细胞的培养基；将其反应与添加了某物质的相同培养基中的反应进行比较，该物质怀疑能影响待测营养物、生化中间产物或其产物、或包括药物在内的其他血液组分的有害作用。
本发明的其它方面、特征和优点可以从下面公开的本发明较佳实施例的描述中明显看出。
附图简述为了能获得并详细了解本发明上述的特征、优点和目的，以及将变得清晰的其它特征，本发明简要归纳如上，更具体的描述需参考一些实施例，这些实施例在附图中有所说明。这些附图组成了说明书的一部分。然而，应当注意，附图只是说明本发明的较佳实施例，因此不应认为本发明局限在它们的范围内。


图1显示在参照范围总体内的氢过氧化枯烯的剂量反应曲线。
发明详述本发明涉及评估细胞内维生素缺乏和总的抗氧化功能的血液测试方法，该方法提供了一种对个体细胞进行生化分析的新方法。这种分析反映了营养物和抗氧化剂系统在个体的周围淋巴细胞中实际起作用的程度。以前，测定细胞内维生素状况是不可能的，而本发明的方法可以在维生素缺乏导致临床问题前就准确地检测到维生素缺乏。
直到发展了本发明以前，维生素的测定根据的是临床观察和血清、尿液或头发中的静态水平以及某些酶或蛋白质标记物的测定。这些测定只表明其短期的静态水平，不能评估这些化合物作为酶的辅因子参与的许多复杂的代谢途径。因此，其它方法经常报告的结果在功能上是不准确的，这些方法不能用于临床。
本发明方法分析了维生素、矿物质、氨基酸和抗氧化剂系统怎样在个体白细胞中发挥实际功能，而不是测定静态水平。与其它方法(甚至那些声称是功能性的方法)不同，本发明方法采用了代谢活跃的周围淋巴细胞，测定其DNA合成(细胞生长)来确定限制了细胞分裂反应的胞内功能性缺陷。因此，本发明方法提供的测试结果反映总代谢功能，而不是血清水平的测试结果，或采用分离的生化途径的测试结果。
淋巴细胞提供了显著的优点，因为它们(1)是细胞介导的免疫系统的宿主，并且很容易刺激生长(细胞分裂)；(2)能反映长期的时间-平均营养物状况(淋巴细胞的寿命约为6个月)；(3)具有其它细胞常见的代谢途径，含有能使DNA迅速合成和细胞迅速生长的细胞核，并且容易用标准静脉穿刺法收集。
本发明方法是通过使用化学组成明确的无血清或无蛋白培养基，测定每位患者淋巴细胞的DNA合成(细胞生长)，来确定胞内功能性缺陷的唯一血液试验。对照培养基中含有支持淋巴细胞最优生长或有丝分裂反应所需的最小量的各种必需营养物。通过控制培养基中使淋巴细胞生长所依赖的单种营养物，并测定所引起的DNA合成，就可直接确定参与细胞代谢的19种不同的维生素、矿物质和氨基酸的功能状态。更重要的是，本发明方法提供了一种抗氧化功能的总体测试方法，该方法可评价细胞对抗自由基和其它形式氧化应激所致损伤的总能力。由于有相当数量的细胞抗氧化剂(它们有广泛的相互作用、多余性、修补和负荷(recharge)能力存在)，因此测定总功能是评价抗氧化剂总体状况的最准确、临床上最有用的方法。通过采用每位患者代谢活跃的活淋巴细胞，本发明方法比已有技术中所有实验室试验提供了一个更准确、临床上更有用的维生素和矿物质状况的分析方法。
通过测定淋巴细胞的生长来评价功能充分程度(functional adequacy)，本发明方法反映了每位患者单独的需求(这些需求各人大不相同)。因此，可根据各人具体的生化需求，而不是按所谓标准确定的“平均”患者需求，来调整充实(repletion)。
根据已发表的研究，美国人口中有70％处于长期缺乏维生素和矿物质危险中。这些缺乏给身体的有效机能及抗病能力带来不利影响。科学证据显示，纠正维生素缺乏会增强免疫能力，并有助于防止或纠正健康慢性衰退状态。研究也表明，在已经服用维生素的患者中，40％以上有明显的细胞内功能性缺陷。另外，饮食许可量推荐(Recommended Dietary Allowance,RDA)并不是评价个体对维生素和矿物质需求的合适指南。
许多人可以受益于本发明。维生素缺乏的纠正是健康者保持健康必需的。对于这些人进行基准测试是很重要的。越来越多的医学研究不断地报道了与维生素缺乏有关的各种疾病。这些研究证明了维生素、矿物质、氨基酸和抗氧化剂的最优状况有预防和治疗的效果(从防止心脏病和各种形式的癌症到刺激免疫系统功能，减缓生理机能随着年龄而衰退)。另外，维生素和矿物质的缺乏会直接或间接地影响健康状态如酒精中毒和饮食过渡(substance abuse)、关节炎、慢性疲劳、糖尿病、HIV/AIDS和其它免疫疾病、黄斑部变性、身体不适和疲劳、多发性硬化、神经管缺陷、肥胖病、骨质疏松症和怀孕，而维生素矿物质充足则有助于防止这些慢性疾病。
尽管下面详细地描述了本发明的较佳的实施例，但是本发明测定方法中的各种基本组分如溶液、培养基、盐和其它组分在美国专利No.4,499,064中有所描述。
本发明涉及一种用于生化分析人淋巴细胞抗氧化功能的细胞培养基，所述培养基包含无血清的缓冲液，该缓冲液含有下列组分选自葡萄糖的和在生物学上能在细胞中产生葡萄糖的化合物的糖类，生物可利用形式的泛酸，胆碱或可在细胞中生产胆碱的生物可利用形式的物质，无机离子，这些无机离子包含氯离子、磷酸根、钙离子、镁离子、钾离子、钠离子和生物可利用形式的铁离子，氢过氧化枯烯、去离子水和刺激待测淋巴细胞的有效量的促细胞分裂剂；所述无血清缓冲液的pH值为6.8-7.6，所述细胞培养基的特征是它可有效地用于测定营养缺乏、不足和失调，并可用于对淋巴细胞的抗氧化功能进行生化分析。
在一个实施例中，细胞培养基中添加了营养补充物，该营养补充物选自生物可利用形式的氨基酸和维生素，营养补充物中没有或只有限定或抑制量的待测营养物。在本例中，维生素选自生物素、甲酰四氢叶酸或叶酸的生物可利用形式、烟酰胺或烟酸、核黄素、硫胺素、维生素B6和维生素B12，以及可在细胞中产生这些物质的化合物；其中所述氨基酸或生物学上可产生氨基酸的化合物，包括L-精氨酸、L-半胱氨酸、L-谷氨酰胺、甘氨酸、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸和L-缬胺酸，氨基酸以基团形式存在，每种的量均不超过抑制浓度。
通常，本发明的细胞培养基含有一定浓度的氢过氧化枯烯，它允许对抗氧化功能进行准确的生化分析。较佳的是细胞培养基中氢过氧化枯烯的浓度约为50-500μM。
在另一个实施例中，本发明的细胞培养基中添加一种或多种选自丙酮酸盐、腺嘌呤、环己六醇或能在细胞中产生这些物质的化合物的刺激性营养物，这些刺激性营养物的浓度可引起几乎是最大的反应。通常，氨基酸补充物中除待测试氨基酸外，每种氨基酸的含量为使细胞产生最大反应的最低有效浓度。而且，当培养基不含丝氨酸和甘氨酸或不含其中之一时，培养基中应含有能引起细胞反应的有效浓度的维生素B6和可利用形式叶酸的一种或二者。在另一个实施例中，当培养基不含泛酸或不含胆碱时，在补充了限制反应量的培养基中所没有的泛酸和胆碱后，在所述培养基中进行细胞培养可有效地测定营养缺乏和异常需求。
本发明还涉及一种确定个体特别需要营养物的异常营养需求量的方法，该方法包括下列步骤将所述个体的淋巴细胞接种入权利要求1所述的细胞培养基中，所述培养基中有浓度限制的待测营养物；培育接种了细胞的培养基；将该淋巴细胞的反应与对照组个体的淋巴细胞的平均反应进行比较。
本发明还涉及一种在对有害作用敏感的个体中鉴定营养因素或生化中间产物的方法，该营养因素或生化中间产物能克服营养物、生化中间产物或其产物、以及包括药物在内的其它血液组分的有害作用，该方法包括下列步骤对权利要求1所述的细胞培养基进行接种，该细胞培养基含有至少一种营养物、生化中间产物或产物、或包括药物在内的其它血液组分，它们的浓度对细胞反应有有害作用；培育接种了细胞的培养基；将其反应与添加了某物质的相同培养基中的反应进行比较，该物质怀疑能影响待测营养物、生化中间产物或其产物、或包括药物在内的其他血液组分的有害作用。
本发明还提供一种对个体细胞抗氧化功能的生化分析方法，该方法包括下列步骤将所述个体的淋巴细胞接种入权利要求1所述的细胞培养基中；培育接种了细胞的培养基；将该淋巴细胞的反应与对照组个体的淋巴细胞的平均反应进行比较。下面将详细描述该实例的各个方面。
给予下列例子描述本发明的不同实施例，并不意味着本发明在任何方式上局限于下列例子。
实验1抽取患者血液本发明方法需要两份用酸-枸橼酸盐-葡萄糖保藏的10ml全血样品。无需禁食。需要的就是取血。即可进行本发明测定。或者，患者的血液应当在室温下送到合适的实验室。不要对血液进行离心。全面测试结果提供了对患者(营养)缺乏情况的合理而有科学依据的分析。
实验2样品的加工细胞分离所有的步骤在层流超净台上采用无菌技术进行，以确保样品无菌。实验室收到每位患者的血样时给予登录号。该登录号用作样品号，以便在整个操作、数据收集和数据分析步骤中进行跟踪。用该样品号(登录号)对操作患者样品时的每个试管、离心管、微量滴定板和打印出的数据作标记。
每份患者样品包括2个酸-枸橼酸盐-葡萄糖(黄色顶部)真空(Vaccutainer)试管，每个试管中含有8毫升全血。在编好了登录号(样品号)后，颠倒6次使全血混合。将两试管的全血合并到一个50毫升一次性离心试管中。
从每份样品中无菌取出500μl等份，放在12×17mm试管中。用该等份试样在Coulter T450型细胞计数器上进行全血细胞计数。Coulter打印出的全血细胞计数结果标记上登录号上，并附在那位患者的工作记录表上。
将5.0ml Histopaque 1077(Ficoll/3,5-双[乙酰氨基]-2,4,6-三碘苯甲酸钠，Sigma,St.Louis,Missouri)加入到15ml圆锥形离心试管中，准备2个这样的Ficoll梯度试管。用10ml移液管和电子移液器将8ml全血缓缓地铺在各个Ficoll梯度试管上。给Ficoll梯度试管加盖，并在2160RPM(转/分)下离心20分钟。
在离心结束后，小心地将梯度试管从离心机中取出避免破坏梯度。用5ml移液管将Ficoll中间层界面处的白细胞层(含有淋巴细胞)转移到15ml一次性圆锥形离心试管中。将白细胞层与磷酸盐缓冲盐-0.72％葡萄糖溶液(PBS-G)合并至最终体积为12ml。试管加盖并颠倒6次，使白细胞层和PBS-G混合。
离心含有白细胞层和PBS-G的试管，2160RPM 5分钟。离心后，吸弃上清液留下细胞沉淀。将细胞沉淀重悬于12ml PBS-G中，颠倒6次以确保细胞沉淀充分分散。然后如上所述再次离心样品。
第二次离心后，吸弃上清液。细胞沉淀重悬于6.0ml PBS-G中。用联接电子移液器的5ml移液管使细胞沉淀分散并与PBS-G混合。获得均质细胞悬液后，将200μl悬液等份转移到12×75mm试管中。用Coulter T450型细胞计数器对该等份进行初始细胞悬液(ICS)计数。
该等份计数的打印结果标上样品号并附在工作记录表中。如果淋巴细胞数目在3.9-1.2×103细胞/立方厘米(THSD/mm3)之间，则该样品可作微量滴定板接种。需加入的细胞悬液体积列在表Ⅲ中。如果淋巴细胞数目大于3.9THSD/mm3，则该样品必需再次稀释。然而，如果淋巴细胞数目少于1.2THSD/mm3，则此样品拒绝测试。
用下列计算式确定适当地再稀释所需的PBS-G加入量C1V1=C2V2C=淋巴细胞浓度(THSD/mm3)V=体积数其中C2=3.0THSD/mm3，这是最终细胞悬浮液所需的淋巴细胞浓度。例如，当6.0ml初始细胞悬液计数为LY#5.6THSD/mm3时，C1V1=C2V2(5.6)(6.0m1)=(3.0)(X)X=11.2ml(最终体积)在重悬细胞中加入合适体积的PBS-G使最终体积为11.2ml。在本例中，初始的6.0ml中应加入5.2ml使最终体积为11.2ml。将所需体积的PBS-G加入初始细胞悬浮液(ICS)中形成最终细胞悬液(FCS)。将LY#计数值和PBS-G体积数记录在Spectrox试验工作记录表中。
再稀释后，将200μl等份再稀释细胞悬液转移到新的12×75mm试管中，并如上所述进行细胞计数。将再稀释细胞悬液的打印数据(最终细胞悬液LY#)附在工作记录表中，并记录接种体积。
实验3微量滴定板接种最终细胞悬液置入无菌水槽中。将含有培养基的微量滴定板放在层流超净台内。用装有0-50μl无菌阻栏吸头(barrier tip)的12-通道手动微量移液器，将指定量(根据表Ⅰ)的最终细胞悬液分种到板上“H”排的每个孔中。
表Ⅰ下列体积根据所示的最终细胞悬液淋巴细胞数(LY#)用于微滴板接种。
最终细胞悬浮液LY#为接种而调整后的体积3.9-3.7 8.0μl3.6 8.5μl2.5-3.5 10.0μl2.4 12.5μl2.3 13.0μl2.2 14.0μl2.1 14.5μl2.0 15.0μl1.9 16.0μl1.8 17.0μl1.7 18.0μl1.6 19.0μl1.5 20.0μl1.4 21.5μl1.3 23.0μl小于等于1.2 25.0μl
将细胞加入培养孔后，以下列方式将氢过氧化枯烯(CuOOH)溶液加入“H”排中(1)1、2、3行中加入10μl 100μM CuOOH；(2)4、5、6行中加入10μl 200μM CuOOH；(3)7、8、9行中加入10μl 300μM CuOOH；(4)10、11、12行中加入10μl 400μM CuOOH。
将CuOOH加入微量滴定板后，给板加盖，将板放入CO2培养箱，37℃保温96小时。
实验4标记所有的标记步骤在放射性同位素室中进行。从冰箱中取出含氘胸苷(H3-TdR)工作溶液，并在水浴中温热至37℃。96小时后，从培养箱中取出微量滴定板。将H3-TdR工作溶液放在无菌水槽中，用装有0-50μl无菌阻栏吸嘴的12-通道手动微量移液器将10μl H3-TdR工作溶液分别加入微量滴定板中“H”形排列的每个孔中，板再放回37℃培养箱中保温24小时。将日期和作标记的技术人员姓名首字母记录在样品记录表中。
实验5收获所有收获步骤在放射性同位素室中进行。用2号笔将样品号标记在单个玻璃纤维滤板(Pachard Part No.6005416)上。打开真空泵，将干燥箱设定在100℃。注满与收集仪相连的蒸馏水瓶。在微量滴定板加H3-TdR24小时后，将其从培养箱中取出。将日期和进行收获的技术人员的姓名首字母记录在样品记录表中。
使细胞收集仪(Packard Model No.C9619)处于打开位置，O环暴露，将玻璃纤维滤板放在收集仪上，粗面与O环接触。关闭细胞收集仪，用来自淋洗盘(tray)的蒸馏水润湿滤板。置收集仪于抽真空循环(VAC)。取去微量滴定板盖，将板放在收集仪探头吸嘴下。将板缓缓抬高至收集仪探头，直至探头吸嘴触及板底。吸出培养基，以圆周运动方式缓缓移动微量滴定板，用探头吸嘴擦吸孔底部。擦吸维持10秒钟。在微量滴定板与收集仪探头吸嘴接触时，继续擦吸，压住“清洗”按钮10秒种。将液体从孔中吸出，并重复上述步骤。移开此板。将淋洗盘装满甲醇，抬高淋洗盘，吸出甲醇，然后降低淋洗盘。
打开收集仪，滤板粘在收集仪上面部分，继续抽真空操作5秒钟。5秒后，关闭抽真空并同时将滤板从收集仪表面上取下。滤板粗面朝上放在干燥箱中10分钟。从干燥箱中取出滤板并冷却至室温。
实验6放射活性计数所有的计数步骤在放射性同位素室中进行。将滤板粗面朝上放在计数装置中。在滤板上放置准直仪(固定滤板的不锈钢薄板)。将该装置装在Packard Matrix9600β粒子放射活性计数器上。Q-气体(1.3％正丁烷，在氦气中)开始流入Mtris9600。按下“开始”按钮，开始计数程序，对每个孔的总放射活性计数3分钟。每个样品的计数结果储存在Matrix 9600的硬盘中。另外将初始放射活性计数结果打印出来。
实验7数据转换将Matrix 9600硬盘上的数据下载到3.5英寸软盘中。用Microsoft Excel的宏程序用原始数据转换成可报告格式。该宏程序减去每个数据点的板本底值，产生三孔一组的平均值，并将该平均值用微滴板对照值(设定为100％)的百分数表示。
实验8数据分析(标准化)本发明方法测定了总的抗氧化功能。采用促细胞分裂剂刺激生长的淋巴细胞，以在有和没有几种剂量的CuOOH时，所测量的淋巴细胞生长反应表示抗氧化功能。CuOOH是用于测定各个体淋巴细胞的抗氧化功能的氧化应力。已建立了初步参照范围。然而，由于CuOOH本身性质不稳定，它的保藏期相对短暂，而且活性随时间而衰退，因此，在第一次生产后必须定期采用不同效力(的CuOOH)。在其保藏期内不同时间获得的每批料，要求每次实验当天与原参照范围数值相符。CuOOH的用量(100μM、200μM、300μM、400μM)根据1993/1994的CuOOH原份额数值建立。
对每天的样品批须进行这种数值标准化。每次测试需制作CuOOH的四个点剂量反应曲线，因此，可以使每天批料的数据与原参照范围相符，并用新的数值来报告测试结果。标准化是通过寻找每天各CuOOH剂量的平均值、中值、范围和方差来实现的。将与原参照范围(处于50％对照生长)最接近的数值用t-检验进行统计学比较。然后将最接近匹配参照范围的CuOOH剂量作为该检验结果。同样，可采用CuOOH剂量的中间值(如200+300/2)。标准化可用Microsoft Excel的Spreadsheet程序来完成。
实验9综述对患者样品的每天批号进行标准化。用Execl中的描述统计(DescriptiveStatistics)功能进行统计分析。确定每个CuOOH剂量的平均值、中值、范围和方差，选择与参照范围最接近的剂量，用Execl进行t-检验，以确定CuOOH剂量与参照范围相同或不同。用最接近1.0(并大于0.05)的两尾P值(two-tailed P value)剂量来报告该数值。打印出结果，并放在该批文件夹中。
实验10装置、试剂和溶液在本发明的试验中采用下列装置层流超净台、离心机(Beckman GS-6)、细胞计数器(Counter Model T540)、12通道移液器(5-500μl)、电子移液泵(Drummond)、灭菌50ml带盖圆锥形塑料管、12×75mm聚丙烯试管、灭菌的15ml带盖圆锥形离心管、移液器(范围为0-20、0-200、0-100μl)、灭菌的一次性玻璃移液管(5.0ml、10.0ml)、试管架和气溶胶阻栏式移液吸嘴(Aerosol Barrier PipetTip)(0-50μl)。表Ⅱ显示了本发明方法中采用的各种试剂及其来源。
表Ⅱ试剂腺嘌呤盐酸盐 SigmaA 8751抗生素溶液(PSF) GIBCO15245-012精氨酸盐酸盐 SigmaA 5131d-生物素 SigmaB 4501无水氯化钙 SigmaC 4901氯化胆碱 SigmaC 1879氢过氧化枯烯 SigmaC 0524氰钴胺素(维生素B12) SigmaV 2876半胱氨酸盐酸盐，无水SigmaC 1276EDTA纳 SigmaE 4884硫酸亚铁七水合物SigmaF 8633叶酸，钙盐 SigmaF 7878葡萄糖 SigmaG 5767葡萄糖溶液(10％)SigmaG 3126L-谷氨酰胺 SigmaG 3126甘氨酸 SigmaG 7126HEPES，无酸 SigmaH 3375L-组氨酸(HCl-水合物)SigmaH 8125Histopaque(Ficoll/3,5-双[乙酰氨基]-2,4,6-三 Sigma1077-1碘苯甲酸钠)羟钴胺素(HCI B12) SigmaH 7126肌醇SigmaI 5125L-异亮氨酸 SigmaI 2752L-亮氨酸SigmaL 8000L-赖氨酸SigmaL 5626无水硫酸镁 SigmaM 7506无水甲醇VWR VWR4300-7L-甲硫氨酸 SigmaM 9625烟酰胺(维生素B3) SigmaN 3376D-泛酸钙SigmaP 0290酚红溶液，0.5％PBS SigmaP 0290L-苯丙氨酸 SigmaP 2126磷酸盐缓冲液，pH 7.4SigmaP 3813植物凝集素PHA-P SigmaL 8754磷酸钾，二取代 SigmaP 3786吡哆醇HCI(维生素B6)SigmaP 9755核黄素(维生素B2) SigmaR 4500L-丝氨酸SigmaS 4500氯化钠 SigmaS 9625氢氧化钠，5.0N溶液 VWR RS 4151丙酮酸钠 SigmaP 2256丙酮酸钠溶液(100mM)SigmaS 8636硫胺素(维生素B1) SigmaT 4625L-苏氨酸 SigmaT 8625胸苷 SigmaT 9250[3H]-胸苷 ICN 24066L-色氨酸 SigmaT 0254L-酪氨酸 SigmaT 3754L-缬胺酸 SigmaV 0500实验11溶液所有溶液均用组织培育级去离子水(tcd H2O)制备。
在制备磷酸盐缓冲液(PBS)+0.72％葡萄糖(PBS-G)溶液时，用tcd H2O根据试剂包装说明制备PBS。加入足量的10％葡萄糖溶液，使最终葡萄糖浓度为0.72％。将溶液过滤除菌并储藏在2-8℃冰箱中。
在制备浓缩(2X)贮备培养基时，1升2X贮备培养基含有(1)23.80gHEPES；(2)14.02g氯化钠；(3)1.05g磷酸氢二钾；(4)0.241g硫酸镁；(5)1.0ml(10μM)腺嘌呤盐酸盐；(6)30.0ml(100mM)丙酮酸钠；(7)0.5ml 0.5％酚红溶液；(8)5.0ml抗生素混合物；(9)8.0ml 5N氢氧化钠；(10)20.0ml Fe/EDTA(1.0 mM FeSO4/0.4 mMNa2EDTA)。所有材料充分混合后，用5N氢氧化钠将pH调节至7.60。加入tcd H2O使最终体积为1.0升。使溶液通过0.2μ滤器过滤除菌，储藏在4℃冰箱内。在这些条件下，溶液稳定性约为4周。
基础培养基用于100％微量滴定板对照，本发明新方法如下。过滤后应无菌操作。基础培养基在层流超净台中制备。混合所有组分，并用tcd H2O加到所需最终体积。将溶液真空过滤到无菌瓶中进行灭菌。加入合适体积的PHA贮备液。
表Ⅲ<
实验12氢过氧化枯烯(CuOOH)贮备溶液氢过氧化枯烯(Sigma C 0524)的保藏期有限。该材料的有效期为从Sigma收到起3个月。当从瓶中吸取CuOOH时，应当意识到CuOOH的粘度增加。因此必须确保液体完全被吸入移液器吸嘴中。这需要足够的时间和注意保证充分充满移液器吸嘴。也必须擦干吸嘴以除去吸嘴外壁上多余的CuOOH。同样，必须使CuOOH完全分散。在这一步骤后，将该溶液储藏在2-8℃的冷藏条件下，并有所需的3个月稳定性。
为制备第一CuOOH贮备液(1.0M CuOOH，在PBS-G中)，使9.5μl氢过氧化枯烯(CuOOH)与990.5μl PBS-G混合。在这一步后，将该溶液储藏在2-8℃的冷藏条件下，并有所需的3个月稳定性。
第二CuOOH贮备液(100mM，在PBS-G中)必须在细胞分离前当天制备。它不应储藏过夜。将200μl第一贮备溶液与1800μl PBS-G混合，以制得第二CuOOH贮备液。
对于氢过氧化枯烯工作溶液，须在细胞分离前当天制备4种工作溶液。将溶液加入用来装载患者(细胞)板的CuOOH转移板(分开的二个微量滴定板)中。工作液不应储藏过夜。4种工作液是(1)100μM CuOOH使110μl第二CuOOH贮备液与4890μl PBS-G混合；(2)200μM CuOOH使220μl第二CuOOH贮备液与4780μl PBS-G混合；(3)300μM CuOOH使330μl第二CuOOH贮备液与4670μl PBS-G混合；(4)400μM CuOOH使440μl第二CuOOH贮备液与4560μl PBS-G混合；实验13胸苷(ThY)贮备液胸苷(ThY)贮备液(冷)(1.33mM ThY，0.322g/L)的制备如下称取0.16lgThY(Sigma T 9250)，溶于tcd H2O中至最终体积为500ml。无菌操作将该溶液真空过滤入无菌瓶中进行除菌，溶液等份分入50ml离心管中。为短期保藏，该溶液可4℃冷藏，稳定期1个月。为长期保藏，该溶液应-70℃冷冻，稳定期6个月。标记细胞用的放射性胸苷(H3TdR)应当用胸苷工作溶液来稀释。
为了制备胸苷工作溶液(ThY+3H-TdR)，在300ml无菌除气tcd H2O中加入下列物质1.33mM冷的ThY1.15ml、1.70ml3H-TdR(ICN Part No.24066)，和300μCi/mmol比活。在该步骤后，溶液就可在冷藏条件下(4℃)稳定保藏1周。
本说明书提及的任何专利或出版物表明了本发明所属领域技术人员的水平。这些专利和出版物以同样的程度纳入本文作参考，正如将每个单独的出版物具体而单独引为参考那样。
本领域技术人员将会容易理解，本发明很适于实现所述的目的，并获得所述结果和利益，以及其本来具有的那些收益。本文描述的实验以及方法、步骤、处理过程、分子和具体化合物是目前较佳实施例的典型代表是范例，不能视为对本发明范围的限制。本领域技术人员对其所作的变化或其它应用，均包括在权利要求范围确定的本发明的精神内。
权利要求
1．一种用于人淋巴细胞抗氧化功能生化分析的细胞培养基，所述培养基包含，无血清的缓冲溶液，该缓冲液含有下列组分选自葡萄糖和生物学上能在细胞中产生葡萄糖的化合物的糖类，生物可利用形式的泛酸，胆碱，或可在细胞中产生胆碱的生物可利用形式的物质，无机离子，这些无机离子包括氯离子、磷酸根、钙离子、镁离子、钾离子、钠离子和生物学上可利用形式的铁离子，氢过氧化枯烯，去离子水和刺激待测淋巴细胞的有效量的促细胞分裂剂；所述无血清缓冲液的pH值为6.8-7.6，所述细胞培养基的特征是它可有效地用来测定营养缺乏、不足和失调，并可用来对淋巴细胞的抗氧化功能进行生化分析。
2．根据权利要求1所述的细胞培养基，其中所述培养基中添加有选自氨基酸和维生素的生物可利用形式的营养补充物，该营养补充物中没有或只有限定量或抑制量的待测营养物。
3．根据权利要求1所述的细胞培养基，其中所述维生素选自生物素、甲酰四氢叶酸或叶酸的生物可利用形式、烟酰胺或烟酸、核黄素、硫胺素、维生素B6和维生素B12，以及可在细胞中产生这些物质的化合物；其中所述的氨基酸或在生物学上可产生氨基酸的化合物包括L-精氨酸、L-半胱氨酸、L-谷氨酰胺、甘氨酸、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸和L-缬胺酸，氨基酸以基团形式存在，每种的量均不超过抑制浓度。
4．根据权利要求1所述的细胞培养基，其中所述氢过氧化枯烯的浓度为50-500μM。
5．根据权利要求1所述的细胞培养基，其中细胞培养基添加有一种或多种选自丙酮酸盐、腺嘌呤、环己六醇或能在细胞中产生这些物质的化合物的刺激性营养物，刺激性营养物的浓度可引起几乎是最大的反应。
6．根据权利要求3所述的细胞培养基，其中氨基酸补充物中除待测氨基酸外每种氨基酸的含量是使细胞产生最大反应的最低有效浓度。
7．根据权利要求3所述的细胞培养基，其中培养基不含丝氨酸和甘氨酸或不含其中之一，而且培养基中含有细胞反应所需有效浓度的维生素B6和叶酸的可利用形式，或含有其中之一。
8．根据权利要求3所述的细胞培养基，其中培养基不含泛酸或不含胆碱，当补充了限制反应量的培养基中所没有的泛酸和胆碱后，在所述培养基中进行细胞培养可有效地确定营养缺乏和异常需求。
9．一种确定个体特别需要营养物的异常营养需求量的方法，该方法包括下列步骤将所述个体的淋巴细胞接种入权利要求1所述的细胞培养基中，所述培养基含有有限浓度的待测营养物；培育接种了细胞的培养物；和将该淋巴细胞的反应与对照组个体的淋巴细胞的平均反应进行比较。
10．一种在对有害作用敏感的个体中，鉴定营养因素或生化中间产物的方法，其中该营养因素或生化中间产物能克服营养物、生化中间产物或其产物、以及包括药物在内的其它血液组分的有害作用，该方法包括下列步骤对权利要求1所述的细胞培养基进行接种，该细胞培养基含有至少一种营养物、生化中间产物或产物、或包括药物在内的其它血液组分，它们的浓度对细胞反应有有害作用；培育接种了细胞的培养基；将其反应与添加了某物质的相同培养基中的反应进行比较，该物质怀疑能影响待测营养物、生化中间产物或其产物、或包括药物在内的其他血液组分的有害作用。
11．一种生化分析个体的细胞抗氧化功能的方法，该方法包括下列步骤将所述个体的淋巴细胞接种入权利要求1所述的细胞培养基中；培育接种了细胞的培养基；和将该淋巴细胞的反应与对照组个体的淋巴细胞的平均反应进行比较。
全文摘要
本发明提供一种用于人淋巴细胞抗氧化功能生化分析的细胞培养基,所述培养基包含无血清缓冲液,该缓冲液含有下列组分:选自葡萄糖和生物学上能在细胞中产生葡萄糖的化合物的糖类;生物可利用形式的泛酸,胆碱,或可在细胞中产生胆碱的生物可利用形式的物质;无机离子,这些无机离子包括氯离子、磷酸根、钙离子、镁离子、钾离子、钠离子和生物学上可利用形式的铁离子;氢过氧化枯烯、去离子水和刺激待测淋巴细胞的有效量的促细胞分裂剂;所述无血清缓冲液的pH值为6.8—7.6,所述细胞培养基的特征是它可有效地用来测定营养缺乏、不足和失调,并可用来对淋巴细胞的抗氧化功能进行生化分析。另外还提供对个体的细胞抗氧化功能进行生化分析的方法,该方法包括下列步骤:将所述个体的淋巴细胞接种入本发明的细胞培养基中;培育接种了细胞的培养基;将该淋巴细胞的反应与对照组个体淋巴细胞的平均反应进行比较。
文档编号C12Q1/06GK1222940SQ97195713
公开日1999年7月14日 申请日期1997年6月18日 优先权日1996年6月19日
发明者J·F·克劳福德, L·布奇 申请人:研究发展基金会