专利名称：由头孢菌素乙酰水解酶基因编码的酶的制备方法
本申请是中国专利申请号为91103234.7申请日为1995年4月27日，发明名称为《由头孢菌素乙酰水解酶基因编码的蛋白质的制备方法》的中国专利申请案的分案申请。
本发明涉及头孢菌素乙酰水解酶基因、将所说的基因引入适用于大肠杆菌宿主-载体系统的载体中所制备的重组DNA分子、用所说的重组DNA分子转化的大肠杆菌细胞、具有由所说的基因编码之氨基酸序列的蛋白质、含有所说蛋白质之多聚体，最好是四聚体或多聚体的酶，以及制备所说的蛋白质或酶的方法。
头孢菌素类如头孢菌素C和7-氨基头孢烷酸(下称7-ACA)迄今是通过去掉连接到3位羟甲基上的乙酰基(下称脱乙酰化作用)而衍生的脱乙酰化合物，如脱乙酰头孢菌素C和脱乙酰7-ACA，这些化合物可用作起始材料，以合成各种头孢菌素抗生素，包括已在市场上销售的头孢菌素抗生素。
作为头孢素脱乙酰化的方法，可以有化学和酶学方法，两种方法中以后者更具优越性，这一方面是因为该方法可在大约中性pH和温和的温度下完成，另一方面是因为它伴有较少的付反应。已经公开了几种酶学方法(如日本专利公开108,790/1984、132,294/1974和67,489/1986号，以及美国专利3,304,236号)。
本发明人已发现从土壤中分离的一株枯草芽胞杆菌菌株可产生头孢菌素乙酰水解酶，并借助对头孢菌素的脱乙酰化作用而有效地产生脱乙酰头孢菌素。这一发现使本发明人产生这样一个设想，即用DNA重组技术构建一株能优先产生头孢菌素乙酰水解酶的微生物，对于工业上制备脱乙酰头孢菌素将是很有利的。到目前为止，还没有公开过这样一种能够只大量产生头孢菌素乙酰水解酶的微生物。
本发明人经过深入地研究，已经成功地从最近由土壤内分离的枯草芽胞杆菌中分离到携带头孢菌素乙酰水解酶基因的DNA片段，并将其克隆到大肠杆菌中。他们还发现，用其中已插入了所说之片段的质粒DNA载体转化的大肠杆菌，产生了大量的头孢菌素乙酰水解酶。已基于上述发现完成了本发明。
因此，本发明提供了头孢菌素乙酰水解酶基因、含有所说之基因的重组DNA分子、用所说之重组DNA分子转化的大肠杆菌细胞、具有由所说之基因编码之氨基酸序列的蛋白质、含有所说之蛋白质的多聚体酶，以及制备所说之蛋白质或酶的方法。
可按照本发明从中得到头孢菌素乙酰水解酶基因的新分离菌株，即枯草芽胞杆菌SHS0133根据布达佩斯条约保藏在FermentationResearch Institute,Agency of Industrial Science andTechnology,1-3,Higashi 1 Chome,Tsukuba-shi,Ibaraki-Ken,305,Japan，保藏登记号为FERM BP-2755(日期1990年2月15日)。该菌已于1991年4月26日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏号为CCTCC No.M91037。
图1显示头孢菌素乙酰水解酶的氨基酸序列。
图2显示头孢菌素乙酰水解酶基因的碱基序列(下排)和由之推测出的氨基酸序列(上排)。
图3显示头孢菌素乙酰水解酶的已部分确定的氨基酸序列(34个氨基酸残基)。
图4显示包括由图3中划下线之氨基序列推断的所有遗传上可能DNA碱基的四个合成寡核苷酸探针。
图5显示重组质粒pCAH01的限制性酶切图及其中DNA探针杂交的位置。
图6显示重组质粒pCAH03的限制性酶切图。
图7显示克隆之头孢菌素乙酰水解酶基因的DNA序列及侧翼区域。
图8显示小型化质粒pCAH10的构建，该质粒相当于pCAH03，但删去了头孢菌素乙酰水解酶基因的下游区域。
图9显示用于大肠杆菌中之表达质粒pCAH21的构建。
图10显示用于大肠杆菌中之表达质粒pCAH211和pCAH212的构建。
枯草芽孢杆菌SHS0133的特征1．染色体DNA的G+C摩尔百分比(％)43.4
2．形态学特征该菌株为革兰氏阳性、大小为0.7-0.8×1.8-2.6μm，有周毛。该菌株在有氧条件下生长良好，而在无氧条件下于含葡萄糖的中性培养基则生长较差。在细胞的中心部分形成大小0.8×1.3-1.7μm的孢子。
3．培养特征(1)肉汁琼脂平皿培养(30℃培养7天)菌落形成接种后24小时形状不规则表面有褶折边缘波纹状隆起凸状颜色乳白光泽浑浊光学特性不透明(2)肉汁琼脂斜面培养(30℃培养7天)生长良好形状丝状表面褶折颜色乳白光泽浑浊光学特性不透明稠度干酪祥(3)肉汁液体培养(30℃培养7天)表面生长形成厚膜混浊轻度气味稍带芳香味沉淀可见沉淀量很少(4)肉汁明胶穿剌培养(24℃下培养30天)生长沿穿剌线均匀生长穿剌线丝状液化形式24℃下第7天时液化形成0.5mm的液化层(层状)(5)石蕊牛乳培养石蕊被还原。没有凝固而快速消化酪蛋白。
4．生物化学特性(1)硝酸盐还原阳性(2)脱氮作用阳性(3)MR试验阴性(4)VP试验阳性(5)吲哚生成阴性(6)H2S生成醋酸铅纸阴性TSI阴性Krigler阴性(7)淀粉水解阳性(8)柠檬酸盐的利用Koser阳性Christensen阳性(9)无机氮源的利用硝酸盐阳性铵阳性(10)色素生成形成褐色色素(11)脲酶试验阳性(12)氧化酶试验阳性(13)过氧化氢酶试验阳性(14)pH生长范围1.5-8.8最适6.0-8.8(15)温度生长范围16.5-50.5℃最适26.0℃-36.0℃(16)OF试验D-葡萄糖发酵产酸不产气乳糖发酵产酸不产气(17)由糖生成酸和气体ⅰ)在L阿拉伯糖、D-木酮糖、D-葡萄糖、D-甘露糖、D-果糖、麦芽糖、蔗糖、海藻糖、D-甘露醇、甘油和淀粉中产酸不产气。
ⅱ)在D-半乳糖、乳糖、D-山梨醇和肌醇中既不产酸也不产气。
(18)营养要求无(19)果胶降解阳性(20)马尿酸降解阴性(21)果聚糖生成(由蔗糖、棉子糖)阳性(22)精氨酸水解酶阴性(23)卵磷脂酶阴性(24)厌氧条件下生长在含D-葡萄糖的中性培养基中生长较差。
根据上述结果，基于Bergey′s Manual of SystematicBacteriology,Vol.Ⅱ,1986将该菌株鉴定为枯草芽孢杆菌，并定名为枯草芽孢杆菌SHS0133。
本发明包括制备头孢菌素乙酰水解酶的方法，该方法是使用被重组DNA分子转化的重组微生物，所说的重组DNA分子是将编码图1所示氨基酸序列的分离的DNA碱基序列，最好是图2所示DNA碱基序列引入到适用于大肠杆菌宿主一载体系统的载体中制备的。该方法可按照代表本发明发展历史的七个步骤来实现，但由于本发明已揭示了编码头孢菌素乙酰水解酶的DNA碱基序列，所以可用简单的程序完成本方法。
(1)在适当的培养基中培养枯草芽孢杆菌(FERM BP-2755)使之产生头孢菌素乙酰水解酶，从培养基中分离所产生的头孢菌素乙酰水解酶并纯化之。用适于将蛋白质切成片段的蛋白酶消化已纯化的酶，分离所得到的肽片段，然后由氨基末端检测肽片段之一的氨基酸序列。
(2)推断与所确定的部分氨基酸序列相对应的可能的DNA碱基序列，并用化学方法合成一组具有推测之碱基序列的寡核苷酸，用32P标记该寡核苷酸的5′端。用该被标记的寡核苷酸作为基因克隆的探针。
(3)从枯草芽胞杆菌(CCTCC No.M91037)中提取并纯化染色体DNA，用各种限制性酶消化，在琼脂糖凝胶上电泳，并将分离出的DNA片段转移到硝酸纤维素膜上。使用硝酸纤维素膜和上述步骤(2)制备的32P标记的探针Southern杂交，以选择与探针有同源性的DNA片段。从这些DNA片段中选择比根据头孢菌素乙酰水解酶蛋白质分子推测之所需基因稍大的片段。在含有该DNA片段的琼脂糖凝胶上切下相关区域，并提取DNA。
(4)将上述步骤(3)中得到的DNA片段插入大肠杆菌克隆载体中，并将所得到的重组质粒转化到大肠杆菌细胞内。将转化体接种到琼脂培养基上以形成菌落，并与32P标记的探针进行菌落杂交。选择与探针有同源性的大肠杆菌菌落并分离之。
(5)由选择的大肠杆菌细胞中提取重组质粒DNA并构建限制性酶切图。然后除去与头孢菌素乙酰水解酶无关的区域，测定枯草芽孢杆菌衍生之编码头孢菌素乙酰水解酶的DNA片段之碱基序列。然后将根据已测定之DNA碱基序列推断的氨基酸序列与头孢菌素乙酰水解酶的部分氨基酸序列、分子量、末端氨基酸分析及氨基酸组成分析结果相比较，并确定头孢菌素乙酰水解酶的结构基因。
(6)对含有头孢素乙酰水解酶的DNA片段作适当修饰，然后引入到成大肠杆菌的基因表达载体中，以便使结构基因连接到得自大肠杆菌的启动子之后，以构建用于表达的重组质粒。
(7)将上面得到的重组表达质粒引入大肠杆菌宿主内，以制备可产生头孢菌素乙酰水解酶的新的大肠杆菌菌株。
用于上述步骤的方法是本领域技术人员已知的，且可按照标准教科书中已公开的实验程序完成之(如参见“MolecularCloning”,T.Maniatis et al.,Cold Spring Harbor Laboratory(1982))。所使用的材料，如酶和试剂均可从商业途径得到并可按照说明书使用之。
用作宿主的大肠杆菌可以是大肠杆菌的衍生株，如HB101、DH1、C600、JM103、JM105和JM109。作为克隆过程中使用的大肠杆菌载体，可使用质粒载体如pUC13、pBR322和pAT153以及噬菌体载体如入gt10。上述宿主和载体可从商业途径得到。
上述步骤(1)中，测定蛋白质之氨基酸序列的方法是已知的(如可使用可由商业途径购得的自动氨基酸序列测定仪)。上述步骤(2)中，可按照制造者推荐的使用方法，使用可购得的DNA合成仪合成寡核苷酸。上述步骤(5)中，在使用已知的M13载系统的情况下，可按照Sanger等人(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,74,5463-5467(1977))的方法进行DNA碱基序列测定。
上述步骤(6)中，为构建用于指导在大肠杆菌内有效地表达所需基因的质粒，可将含有所需头孢菌素乙酰水解酶结构基因的DNA片段插入一含有在宿主内有功能之适当启动子(Lac、Tac、Trc、Trp、PL等)和Shine-Dalgarno(SD)序列的表达载体(pKK223-3、pBS、pDR540、pPL-入等)内，或插入还另外含有转译起始密码子ATG的ATG载体(pKK233-2等)内。将表达质粒引入适当宿主(如大肠杆菌JM103、JM109、HB101和C600)内即可得到能有效地表达头孢菌素乙酰水解酶的微生物。
可按照常规的纯化方法，如组合离心法、柱层析法等纯化被表达的头孢菌素乙酰水解酶。
下列实施例旨在进一步举列说明而不是限制本发明。
实施例11．头孢菌素乙酰水解酶的分离和纯化以及部分氨基酸序列的测定(1)头孢菌素乙酰水解酶的分离和纯化将由2.5％葡萄糖、0.75％玉米浆、1.0％氨基酸混合物、0.3％KH2PO4和0.8ppm MnSo4·4H2O,(pH7.0)组成的培养基(20升)加入一个30升体积的罐式发酵器内。灭菌后，将预先在含0.5％葡萄糖、0.75％玉米浆、0.5％氨基酸混合物和0.02％KH2PO4(pH7.0)之培养基中培养过的枯草芽孢杆菌(FERM BP-2755)倒入培养基内达到6％的种菌体积。于28℃下保温48小时后，向培养液内加入活性炭至1％，并搅拌2小时。过滤后即得到作为滤液的粗酶溶液。向粗酶溶液内加入DEAE SephadexA-50(Pharmacia)至0.7％，用2N NaOH将混合物调到pH8.0并搅拌1小时。过滤后，用含有0.1MNaCl的50mM Tris-HCl缓冲液(pH8.0)(4升)洗巳吸附了头孢菌素乙酰水解酶活性的DEAE Sephadex A-50，然后用含有0.4M NaCl的同样缓冲液洗脱活性材料。用超滤装置(Tosoh)浓缩并脱盐后，使活性材料吸附到预先已用同样缓冲液平衡过和充满DEAE Sepharose Cl-6B(Pharmacia)的柱上。用同样缓冲液洗柱，再用含0.15M NaCl的相同缓冲液洗柱，然后用含有0.2M NaCl的相同缓冲液洗脱活性材料。经超滤浓缩并脱盐后，用高效液相层析法(下称HPLC)进行纯化。用DEAE Toyopearlpak 650 M(Tosoh)装柱。用渐增盐浓度的浓度梯度洗脱法洗脱活性材料。为此，由含有0.15MNaCl的相同缓冲液开始，其后使NaCl浓度逐渐增加到0.5M。收集含被洗脱之活性的部分、超滤浓缩、然后用分子筛柱以HPLC纯化。用TSK-G3000(Tosoh)作柱并用0.2M磷酸盐缓冲液(pH7.0)作流动相。收集被洗脱的活性部分、超滤浓缩，然后用反相柱经HPLC纯化。用Microbondapak C18(Waters)作柱，并用渐增乙腈浓度的浓度梯度洗脱法进行洗脱。为此，以含有0.1％三氟乙酸的水溶液系统开始，使乙腈浓度逐步升至98％(终浓度)。于50℃减压条件下浓缩含被洗脱之头孢菌素乙酰水解酶的部分，并将残留物溶解于含6M盐酸胍的0.5MTris-HCl缓冲液(pH8.0)中。向溶液内加入EDTA(乙二胺四乙酸)到浓度为2mM，再向溶液内加入相对于头孢菌素乙酰水解酶200倍摩尔量的2-巯基乙醇，并于氮气环境下于37℃还原4小时。然后，向溶液内加入相对于头孢菌素乙酰水解酶190倍摩尔量的碘乙酸钠，于37℃避光反应10分钟以完成还原性羧甲基化作用作。然后再按上述方法用反相柱经HPLC进行纯化。按照Laemmli(Neture,227,680-685(1970))所述的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS-PAGE)分析所得的头孢菌素乙酰水解酶部分。只在分子量为35KD的位置上检测到一条单一的带，此表明纯化达到均质程度。此外，基于对溶解于含7M尿素之0.1MTris-HCl缓冲液(pH8.0)中的纯化之头孢菌素乙酰水解酶用0.1M磷酸盐缓冲液(pH7.0)作10倍稀释后可使之再活化，以及使用上述HPLC经分子筛柱层析可在分子量为280KD的位置上洗脱该活性材料的事实，表明该以天然形式存在的头孢菌素乙酰水解酶是由同源亚单位组成的八聚体。
另一方面，使用Hedrick等人(Arch.Biochem.Biophys.,126,155-164(1968))的方法测知分子量约为150KD，且在相关位置上检测到该活性，提示四聚体也是有活性的。
用Edman降解法和肼水解法对纯化的头孢菌素乙酰水解酶作氨基酸末端分析，鉴定出其氨基末端是蛋氨酸，羧基末端是甘氨酸。
(2)头孢菌素乙酰水解酶的部分氨基酸序列测定将纯化的头孢菌素乙酰水解酶(1mg)溶解于含有2M尿素的0.1MTris-HCl缓冲液(pH8.8)(1.0ml)中，向溶液内加入赖氨酰肽链内切酶(0.01mg)并使混合物于37℃反应4小时。然后以HPLC分离反应混合物。用Microbondapak C18(Waters)作柱并用渐增乙腈浓度的浓度梯度洗脱进行洗脱。为此，以含0.1％三氟乙酸的水溶液系统开始，并使乙腈浓度增加到98％终浓度。于214nm处进行检测。在分离的峰值中，收集有长滞留时间的不同部分，再次使用同样的反相柱纯化，并使用气相自动氨基酸序列分析仪(Applied Biosystems)分析该肽的氨基酸序列以确定出如图3所示的从该肽片段之氨基末端到第34个氨基酸的氨基酸序列。
2．合成DNA探针并标记5′末端选择按上述步骤1制得的图3中划了下线的氨基酸序列，并合成相当于由该氨基酸序列推断之遗传上可能之DNA碱基序列的寡核苷酸池。如图4所示，合成了四组分别定名为探针CAH-RM1、CAHRM2、CAH-RM3和CAH-RM4的寡核苷酸。寡核苷酸的合成是使用自动DNA合成仪ZEON-GENETA-11(Nihon Zeon)进行的。
使用T4多核苷酸激酶和[γ-32P]ATP，按照Wallace等人(NucleicAcids Res.,6,3543-3557(1979))的方法标记所得DNA探针的5′末端。
3．由枯草芽胞杆菌中提取和纯化染色体DNA并进行Southern杂交先用溶菌酶，再用N-月桂酰肌氨酸钠处理枯草芽胞杆菌细胞(CCTCC No.M91037)，并按照Harris-Warrick等人(Proc.Natl.Acad.Sci.USA.,72,2207-2211(1975))的方法经CsCl-溴化乙锭平衡密度梯度超离心法由所得溶胞产物中提取和纯化染色体DNA。用各种限制酶(各约10单位)在适当条件下消化DNA(1μg)，在0.8％琼脂糖凝胶上电泳分离所得反应物。分析限制性酶切片段的电泳图形后，按Southern等人(J.Mol.Biol.,98.503-517(1975)的方法对凝胶作Southern杂交。室温下用含有0.5N NaOH的1.5M NaCl溶液处理该凝胶1小时，以使DNA变性，然后在含有1.5M NaCl的1MTris-HCl缓冲液(pH7.0)中室温下中和1小时。将一片硝酸纤维素膜放在凝胶上，以使DNA由凝胶中转移到膜上。使用转移了DNA的硝酸纤维素膜，用标记的探针进行杂交。使用4倍浓度的SSC(1X SSC:0.15M NaCl、0.015M柠檬酸钠，pH7.0)、10倍浓度的Denhardt′s溶液(1X Denhardt′s溶液0.02％Ficoll,0.02％聚乙烯吡咯烷酮、0.02％牛血清白蛋白)与大约1×106cpm/ml标记的探针于38℃下杂交过夜。室温下用4倍浓度的SSC将膜洗几次，然后进行放射自显影。另外，逐步升高洗膜的温度并于每次洗膜后重复进行放射自显影。发现尽管在较高洗膜温度如48℃和53℃下，仍有几条带显示出阳性信号，而且杂交带的大小依据所用限制酶而彼此不同。显示阳性信号的DNA片段中，2.5-3Kb Dral消化的和4-4.5Kb Hind Ⅲ消化的片段更适于进行基因克隆，因为它们比预期的基因更大些。
4．克隆头孢菌素乙酰水解酶基因(1)构建基因库向按上述步骤3提取并纯化的枯草芽胞杆菌染色体DNA中加入限制酶DraⅠ(约120单位)并于37℃保温90分钟。然后用等体积的苯酚提取反应物，并向所得水相内加入乙醇以沉淀DNA。将所得DNA溶解在TE缓冲液(10mM Tris-HCl,1mM EDTA,pH8.0)(60μl)，在琼脂糖凝胶上电泳分离所得溶液，并切下相当于2-4Kb大小的凝胶区域。使用可由市场上购得的试剂盒(Bio 101,GENECLEAN)由凝胶中洗脱并回收DNA片段，然后溶解于YE缓冲液(30μl)中。
另一方面，使用pUC13作为构建基因库的载体。将pUC13(10μg)与限制酶SmaⅠ(约100单位)混合，于37℃保温140分钟，然后于65℃下处理10分钟。向该混合物内加入碱性磷酸酶(BAP)(约20单位)并于65℃下继续反应80分钟。按上述方法用苯酚提取并用乙醇沉淀DNA，最后将DNA溶解于TE缓冲液(50μl)中。
将含有DraⅠ消化之枯草芽胞杆菌染色体DNA片段的溶液(7.5μl)与含有SmaⅠ-BAP处理之载体pUC13片段的溶液(2.5μl)合并，并将混合物与T4DNA连接酶于6℃下保温20小时，以连接各片段，得到重组DNA。按照Hanahan等人(J.Mol.Biol.,166,557-580(1983))的方法用所得重组DNA转化大肠杆菌HB101菌株。然后在置于含40μg/ml氨苄基青霉素之L-肉汁[1％bacto-胰蛋白胨、0.5％酵母浸膏、0.5％NaCl(pH7.3)]琼脂培养基上的硝酸纤维素膜上形成菌落。以这些菌落作为枯草芽胞杆菌的基因库。
(2)经菌落杂交选择头孢菌素乙酰水解酶阳性克隆将上述步骤(1)中在硝酸纤维素膜上形成的菌落复制到另一片硝酸纤维素膜上。将该复制膜置于含有40μg/ml苄基青霉素的L-肉汁琼脂培养基上并于37℃保温3小时。然后，将膜转移到含250μg/ml氯霉素的L-肉汁琼脂培养基上并于37℃保温过夜。然后基本上按照Grunstein等人(Proc.Natl.Acad.Sci.USA.,72.3961-3965(1975)的方法进行菌落杂交。为此，用0.5N NaOH处理该膜(10-15分钟)以溶解菌落并使DNA变性。然后，用1M Tris-HCl缓冲液(pH7.2)将膜中和5-10分钟并继续用含有1.5M NaCl的1M Tris-HCl缓冲液(pH8.0)处理10-15分钟。将膜于减压下80℃烘烤2小时以使DNA固定在膜上，之后使固定的DNA与标记的探针CAH-RM2杂交。该反应于38℃下在含有4倍浓度的SSC、10倍浓度的Denhardt溶液和大约2×106cpm/ml标记之探针的溶液中进行16小时。然后于室温下将该膜用4倍浓度的SSC洗3-4次，再于38℃下冼2分钟并进行放射自显影(曝光条件-80℃,3小时)。为了检测洗涤温度与放射自显影图谱上信号之强度的相关性，逐渐升高洗涤温度并在不同温度下记录放射自显影结果。分别在43℃、48℃和53℃下各洗2分钟。
结果发现，30,000个菌落中有3个即使在高洗涤温度下仍表现出阳性信号。将这些菌落在含40μg/ml氨苄青霉素的L-肉汁(5ml)培养液中37℃保温过夜并按照Birnboim等人(Nucleic AcidsRes.,7,1513-1523(1979))的方法制备重组质粒。用在载体DNA(pUC13)上有其切割位点的限制酶如EcoRⅠ、HindⅢ和PvuⅡ切割这些质粒。然后在琼脂凝胶上电泳分离被切割的各片段，并与标记的探针进行Southern杂交。结果发现，这三个重组质粒中的两个含有与DNA探针清晰杂交的限制酶消化的片段。两个阳性质粒间杂交片段的大小不同，因此被插入到载体DNA中的DNA片段也彼此不同。据此可区分这两个重组质粒并分别定名为pCAH01和pCAH02。
5．鉴定阳性克隆及检测碱基序列(1)鉴定阳性克隆在试图用各种限制酶裂解，以制备重组质粒pCAH01和pCAH02之限制性酶切图的过程中，发现质粒pCAH01具有两个不同的DraⅠ消化的片段，而质粒pCAH02至少有三个已插入到载体DNA之SmaⅠ位点中的不同DraⅠ消化的片段，并且DNA探针与三个DraⅠ片段中的一个杂交。因此，将重组质粒pCAH01用于下一步骤中。图5中显示了质粒pCAH01的限制性酶切图及DNA探针杂交的位置。
由于质粒pCAH01含有两个衍生于枯草芽胞杆菌染色体DNA的外源DraⅠ片段(1.8Kb和2.5Kb)，而且只有2.5Kb片段与DNA探针杂交，因此由质粒中删除1.8Kb DraⅠ片段。由质粒pCAH01中除去含有2.5Kb片段的DraⅠ-PstⅠ片段(2.6Kb)，并插入到载体质粒pUC13的SmaⅠ-PstⅠ位点上，以得到一小型化的重组质粒pCAH03(5.3Kb)。重组质粒pCAH03的限制性酶切图示于图6中。
(3)测定碱基序列由重组质粒pCAH03中除去已与DNA探针杂交的0.24Kb Eco RⅠ-Hind Ⅲ片段，并按照Sanger等人(Proc.Natl.Acad.Sci.USA.,74,5463-5467(1979))的方法测定其碱基序列。结果发现该Eco RⅠ-HindⅢ片段中有与上述步骤1中得到头孢菌素乙酰水解酶之部分氨基酸序列相对应的碱基序列，此表明该片段含有头孢菌素乙酰水解酶基因的一部分。基于质粒pCAH03的限制性酶切图谱进一步测定DraⅠ和Hind Ⅲ位点间(0.38Kb)及EcoRⅠ和EcoRⅠ位点间(1.45Kb)的碱基序列，而揭示出如图7所示的DraⅠ和Eco RⅠ位点间约2Kb的碱基序列。这一点证明了存在编码含318个氨基酸残基之蛋白质的碱基序列，且所说的氨基序列中含有由转译起始密码子ATG编码的蛋氨酸。另外，由上述碱基序列编码的假定蛋白质在分子量、氨基末端和羧基末端氨基酸、以及经赖氨酰肽链内切酶消化之片段的氨基酸组成上均与头孢菌素乙酰水解酶有良好的一致性，因此可以相信该蛋白质必定是头孢菌素乙酰水解酶。据此证明了头孢菌素乙酰水解酶的结构基因完全包含在质粒pCAH03上的枯草芽胞杆菌衍生的DNA片段中。
6．构建表达质粒已克隆的质粒pCAH03上的得自枯草芽胞杆菌的DNA片段含有一个头孢菌素乙酰水解酶以外的区域，因此按照图8中所示的方法删除被认为与基因之表达无关的区域。
为了驱动在大肠杆菌中有效地高表达外源性基因，一般是构建一个其中所需结构基因直接被连接在由具有高表达效率之启动子、SD序列和转译起始密码子ATG组成之序列后面的表达质粒。因此，为了在大肠杆菌内产生大量头孢菌素乙酰水解酶，可按照图9中图示的方法，使用含有启动子、SD序列和ATG的载体来构建表达质粒。构建过程中，可按下述方法制备头孢菌素乙酰水解酶结构基因。将含有整个所需基因的区域克隆到M13mp系列的载体中，以得到一单股DNA。按照所谓的引物扩展方法，使用指定编码头孢菌素乙酰水解酶之氨基末端序列上除蛋氨酸外之几个氨基酸的寡核苷酸作为引物，得到一个其中只有头孢菌素乙酰水解酶结构基因部分为双链的DNA片段。
图10显示构建经修饰之表达质粒的方法，所说的质粒与按图9所示方法制备的表达质粒相比，表现提高了拷贝数，且携带四环素(Tcr)抗性标志而不是氨苄青霉素(Apr)抗性标志。
下面对各步骤作更为详细地描述。
(1)构建小型化质粒为了缩短头孢菌素乙酰水解酶结构基因(图8中缩写为CAH)的下游区，用EcoRV和BamHⅠ切割质粒pCAH03，纯化所得到的约4.1KbDNA片段，然后使用DNA聚合酶Klenow片段填充因BamHⅠ消化所产生的3′短缩之末端(图8)。进一步纯化之后，用T4DNA连接酶连接，以构建含有头孢菌素乙酰水解酶基因的小型化质粒pCAH10。
(2)制备用于构建表达质粒的单股DNA。
用SacⅠ和SalⅠ切割上述步骤(1)中制得的小型化质粒pCAH10，纯化所得到的约1.5Kb片段并作为SacⅠ-SalⅠ片段回收之。另一方面，用SacⅠ和SalⅠ切割双股噬菌体M13mp11DNA。然后将上述Saci-SalⅠ片段加到后者中，用T4DNA连接酶连接，以构建含有完整头孢菌素乙酰水解酶基因的双股噬菌体M13-CAH DNA。继之，按Messing(Methods in Enzymology,101,20-78(1983))的方法制备其单股DNA。
(3)引物延伸基本上按照Goeddel等人(Nucleic Acids Res.,8,4057-4074(1980)的方法，除去位于头孢菌素乙酰水解酶起始位点(ATG)上游的、得自枯草芽胞杆菌的蛋白质非编码区，以制备一个含有头孢菌素乙酰水解酶结构基因的区域。合成一条具有相当于头孢菌素乙酰水解酶氨基末端第二个氨基酸谷氨酸至第7个氨基酸脯氨酸之碱基序列的寡核苷酸，以其作为用于引物延伸的引物并定名为CAH-P1。然后将引物CAH-P1(3pmole)加到上述步骤(2)中制备的噬菌体M13-CAH的单股DNA中，将此混合物加热到60℃保持20分钟，然后放置至室温。继之向混合物中加入dATP、dCTP、dGTP和dTTP(各0.25mM)和DNA聚合酶Klenow片段(2单位)，并在含7mM Tris-HCl缓冲液(pH7.5)、7mM MgCl2、0.1mM EDTA和20mM NaCl的反应混合物(20μl)中，于37℃使引物延伸进行2小时。反应后进行苯酚提取和乙醇沉淀。将DNA溶解于小量蒸馏水中，向其中加入S1核酸酶(4单位)，并在含有30mM乙酸钠(pH4.6)、100mM NaCl和1mM ZnSO4的反应混合物(40μl)中于37℃保温30分钟，以消化剩余的单股DNA。对含所得双股DNA片段的溶液进行苯酚提取，然后用乙醇沉淀，并按照上述方法用DNA聚合酶Klenow片段处理该DNA，以进行末端修复反应。
(4)构建表达质粒本实施例用于构建表达质粒的载体pKK233-2(氨苄青霉素抗性(购自Pharmacia公司。该载体是ATG载体的成员，它含有Trc启动子并可经限制酶NcoⅠ消化和充填3′短缺末端后直接在起始密码子ATG之后被切割。如图9所示，用PstⅠ切割上述步骤(3)中制得的含头孢菌素乙酰水解酶结构基因的DNA片段，并分离和纯化1.27Kb DNA片段。另一方面，用NcoⅠ切割含Trc启动子的pKK233-2并用DNA聚合酶Klenow片段处理。然后用PstⅠ切割所得片段，得到约4.6Kb的DNA片段。混合上述两片段并用T4DNA连接酶连接之，用所得混合物转化大肠杆菌JM103菌株，并选择在含40μg/ml氨苄青霉素之L-肉汁琼脂培养基上形成的菌落。将这些菌落在L-肉汁培养液中培养过夜，收集细胞，从细胞中提取质粒DNA，并测定ATG载体与含头孢菌素乙酰水解酶基因之片段的接合处附近的碱基序列。结果得到一个其中不包括氨基末端蛋氨酸之头孢菌素乙酰水解酶的结构基因已紧接ATG密码子后面被插入的表达质粒，并定名为pCAH21。并将携带该表达质粒的大肠杆菌定名为大肠杆菌JM103/pCAH21。
表达质粒pCAH21的复制系统得自pBR322。因此，为了增加该质粒的拷贝数以提高在大肠杆菌中的表达水平，将其复制区域(ori)换成得自pAT153的相应区域。同时将抗药标志由氨苄青霉素抗性(Apr)换成四环素抗性Tcr)。图10中图解显示了修饰该质粒的过程。首先用BamHⅠ切割质粒pCAH21并用DNA聚合酶Klenow片段处理。然后用ScoⅠ切割所得片段，得到含Trc启动子、头孢菌素乙酰水解酶基因和5S核糖体RNA之T1T2终止子(5SrrnBT1T2)的约2.4Kb DNA片段。用可从市场上购得的质粒pAT153作为载体质粒。用EcoRⅠ切割质粒pAT153,et DNA聚合酶Klenow片段处理，然后再用DraⅠ切割之，再者，为了防止载体的自身连接，可用碱性磷酸酶处理，并制备含有源于pAT153之复制区域和四环素抗性基因的约2.5Kb DNA片段，然后混合上述两个DNA片段并用T4DNA连接酶连接之，用所得混合物转化大肠杆菌JM103菌株，并选择在含20μg/ml四环素之L-肉汁琼脂培养基上形成的菌落。这些菌落在L-肉汁中培养过夜后收集细胞，由细胞中提取质粒DNA并经限制酶裂解法分析之。结果得到连接方向不同的两种重组质粒。将其中头孢菌素乙酰水解酶基因的方向与四环素乙酰水解酶基因的方向与四环素抗性基因方向相同的质粒定名为pCAH211，并将另一个其中两基因之插入方向相反的质粒定名为pCAH212。另外，将携带这些重组表达质粒的大肠杆菌菌株分别定名为大肠杆菌JM103/pCAH211和大肠杆菌JM103/pCAH212。
7．在大肠杆菌中表达头孢菌素乙酰水解酶基因(1)表达头孢菌素乙酰水解酶基因将大肠杆菌JM103/pCAH211或大肠杆菌JM103/pCAH212接种在含20μg/ml四环素的2倍浓度之L-肉汁培养液(50ml)(在0.5L体积的烧瓶中)上，并于37℃振荡培养24小时，取一等份培养液(0.5ml)离心收集细胞。将细胞悬浮于0.1M磷酸盐缓冲液(pH7.0)(0.5ml)中并用超声波发生器破碎之。离心该溶液得到的上清液被用作含所需酶的样品溶液。另一方面，将离心上述步骤1中制得的枯草芽胞杆菌(CCTCCNo.M91037)之培养液所得上清液用作进行比较所需的酶溶液。头孢菌素乙酰水解酶不仅作用于头孢菌素C和7-ACA，而且还可作用于醋酸对位硝基酚(下称pNPA)，以生成有色物质对硝苯酚(下称pNP)。可用分光光度法检测pNP，因而可采用以pNPA为底物的方法作为检测头孢菌素乙酰水解酶活性的简单的方法。反应于30℃下在含有0.02％pNPA、0.1M磷酸盐缓冲液(pH6.8)和上述酶溶液的混合物(3ml)中进行，并用分光光度计检测400nM吸光率以确定酶活性。在pH6.8、30℃温度条件下，每分钟产生1μM pNP所需的酶量被定义为1单位(U)。结果发现，每份大肠杆菌JM103/pCAH211和大肠杆菌JM103/pCAH212之培养液的酶活性分别为9.9U/ml和12.4U/ml。而枯草芽胞杆菌的酶活性为0.36U/ml。
此外，构建了一个其中以衍生于大肠杆菌色氨酸操纵子的Trp启动子和SD-ATG序列代替表达质粒pCAH211之Trc启动子和SD-ATG序列的质粒。经转化作用将该质粒插入大肠杆菌JM109中之后，按上相似方法培养所得到的转化体，测得每份培养液的酶活性为75.5U/ml。
使用大规模培养装置如发酵罐，在适当培养条件下，于适当培养其中培养携带这些表达质粒的大肠杆菌，可使头孢菌素乙酰水解酶的产量得以增加。
(2)头孢菌素C和7-ACA的脱乙酰化作用以头孢菌素C或7-ACA作为底物，用大肠杆菌JM103/pCAH212产生的酶溶液使之脱乙酰化。向含有10mM底物的0.1M磷酸盐缓冲液(pH7.0)(0.1ml)内加入酶溶液(0.2ml)后，使反应于37℃下进行40分钟，并加入0.2M醋酸盐缓冲液(pH4.0)(1.2ml)终止反应。所得溶液通过HPLC柱后，检测脱乙酰头孢菌素C或脱乙酰-7-ACA。用Cosmosil5C8(Nacalaitesque)作柱并用逐渐增加甲醇浓度的浓度梯度洗脱法洗脱。为此，使用含20mM NaH2PO4和5mM四正丁基氢氧化铵(TBAH)，甲醇浓度升高至20％的溶液。在254mM处检测脱乙酰化产物。头孢菌素乙酰水解酶的活性定义如下于37℃和pH7.0条件下，每分钟产生1微摩尔产物所需要的酶量定义为1个单位(U)。结果发现，对于头孢菌素C和7-ACA来说，每份大肠杆菌JM103/pCAH212之酶溶液的培养液酶活性为7.4U/ml。
(3)重组头孢菌素乙酰水解酶的结构经检测大肠杆菌中所产生之头孢菌素乙酰水解酶活性形式和亚单位的分子量，得到与上述步骤1中相同的结果，表明重组头孢菌素乙酰水解酶也以与天然形式相似的八聚体形式存在。
此外还用反相柱以HPLC纯化该重组头孢菌素乙酰水解酶。以Edman降解和肼水解法进行末端分析，揭示该酶的氨基和羧基末端分别是蛋氨酸和甘氨酸，此与其天然形式的末端氨基酸相同。另外用自动氨基酸序列分析仪检测氨基酸序列，表明直到第25个氨基酸的氨基酸序列与根据结构基因推断者(图2)完全相同。
如上面实施例中所详细描述的，本发明人已进一步证实，经克隆由枯草芽胞杆菌产生之编码头孢菌素乙酰水解酶的基因，并使用可在大肠杆菌内表达的载体构建含该基因的重组质粒，可以更为有效地产生头孢菌素乙酰水解酶。这就为该酶的的广泛应用提供了前提条件。另外，含有已克隆之头孢菌素乙酰水解酶基因的DNA片段为更有利地利用头孢菌素乙酰水解酶的功能提供了一个极为有力的工具。
权利要求
1．一种制备由含有在本申请的图1中所描述的氨基酸序列的蛋白质的多聚体组成的酶的方法，该方法的特征在于在一种培养基中培养用重组体DNA分子转化的大肠杆菌细胞并从培养液中回收所说的酶，其中所说的重组体DNA分子是通过将编码在该图1中描述的氨基酸序列的DNA碱基序列引入用于大肠杆菌宿主-载体系统的一种载体而制备成的重组体DNA分子。
全文摘要
本发明提供了头孢菌素乙酰水解酶基因、将所说的基因插入用于大肠杆菌宿主－载体系统之载体内而制得的重组DNA分子、用所说重组DNA分子转化的大肠杆菌细胞、具有由所说之基因编码的氨基酸序列的蛋白质、由所说之蛋白质的多聚体组成的酶、以及制备所说的酶的方法，所说的头孢菌素C和7－ACA转化为其脱乙酰化产物如脱乙酰头孢菌素C和脱乙酰7－ACA的酶，这些脱乙酰化产物可用作制备各种衍生之头孢菌素抗生素的中间体。
文档编号C12P35/00GK1227872SQ9810393
公开日1999年9月8日 申请日期1998年1月5日 优先权日1990年4月27日
发明者光岛健二, 泷本明生, 八木滋雄, 园山高康 申请人:盐野义制药株式会社