专利名称：用于同胎生下的猪崽数目的dna标记物的制作方法
技术领域：
本发明涉及筛选猪以确定是否存在与一胎生下的猪崽数目的增加有关的促滤泡激素β亚单位基因的等位基因的方法，本发明还涉及上述方法在预测一胎生下的猪崽数目方面的用途以及用于实施上述方法的试剂盒。
如果可能提高动物一胎生下的幼崽的数目的话，那么就可以提高肉的生产以及饲养动物的效率。于是可以从更少的亲代动物中得到相同的家畜的产量，从而降低了生产成本。此外，动物饲养组织也可以为了得到那些具有改进的遗传学特性的子代而从筛选更多的子代的资源中受益。但是，由于一胎生下的幼崽的数目受到其性别的限制并且在很大程度上受到非遗传学因素的影响(遗传率，即测量由于遗传学差异引起的表型变异的分数，对一胎生下的猪崽的数目而言遗传率约为0.1)，所以按照惯例一胎幼崽的数目非常难于选择。
一种提高一胎生下的幼崽数目的方法为可以把有益的基因从一胎幼崽的数目明显较高的品种引入生产品系中。但是，定量遗传学表明如一胎幼崽的多少这样的复杂的性状受到许多基因的控制，而每个基因对上述性状的影响很小。如果这种说法正确的话，那么通过选择复杂的性状来带动遗传学的进步可能会非常缓慢。另一种观点认为尽管有许多基因与复杂的性状有关，但是有关的一些基因(主要基因)对上述性状的影响很大。如果上述的另一种观点正确的话，那么只要可以鉴定并选择有关主要基因的有益的等位基因，上述性状的遗传学进步就可能会很迅速。由于基因组图谱的出现，就有可能通过寻找性状与分子标记物之间的关系来鉴定影响定量性状的基因(定量性状的基因座，QTL)，其中的分子标记物平均地分配给可以得到图谱的动物的基因组。重要的是为了达到选择的目的，上述标记物的表型的遗传率为1.0。
已知按照每个猪崽计算，中国眉山(Meishan)品种的猪比最多产的欧洲品种的猪要多生产出大约4头小猪。在目标在于提高商品化的西方猪品种的一胎幼崽的数目的计划中，从上述品种中用于多产(一胎生下的幼崽的数目)的基因是很有价值的。的确，已经表明与眉山猪的雌激素受体基因(ESR)有关的遗传标记物对一胎生下的幼崽的数目具有有益的影响并且在WO92/18651中有所描述。此外，在WO96/41892中公开了用于测试猪的与其一胎具有较多幼崽有关的骨桥蛋白基因的等位基因的方法。
现在，我们已经鉴定了在猪的FSHβ-亚单位基因中的多态现象并且已经确认该多态现象与一胎生下的猪崽的数目有关。
哺乳动物的促滤泡激素(FSH)为一种由两个亚单位、即α-亚单位和特有的β-亚单位组成的糖蛋白，其中α-亚单位对其它的糖蛋白激素(如LH和TSH)来说是共有的。一般说来，FSH是在GnRH的刺激下从垂体前叶中分泌出来的并且通过血液到达性腺中的靶组织中。FSH与其在颗粒细胞中的受体相互作用并促进卵泡的突变和分化。在受精前，FSH和LH在卵母细胞的发育中起到了重要的作用。
我们已经测定出由于插入逆转录子而引起的在某些猪的品种中FSHβ-亚单位基因存在着突变，其中上述逆转录子含有一个RNA聚合酶Ⅱ的完整的启动子以及其它可能的转录区。在携带有突变的猪中，其一胎生下的猪崽的数目明显地有别于那些没有突变的猪的幼崽。
上述逆转录子的序列为GGAGTTCCCCGTCGTGGCGCAGTGGTTAACGAATCCGATTAGGAACCATGAGGTTGCGGGTTCGGTCCCTGCCCTTGCTCAGTGGGTTAATGATCCGGCGTTGCATGAGCTGTGGTGTAGGTTGCAGACGAGGCTCGGATCCCCGCGTTGCTGTGGTTTCTGGCGTAGGCGGGTGGCTACAGTTTTGATTCGACCCCTAGCCTGGGAACCTCCATATGCCGCGGGAGCGCCCAAAGAAATGGCAAAAGACGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAACGTTT如果经PCR扩增的DNA片段为516bp，那么上述逆转录子就存在于该DNA中，如果DNA片段为224bp，那么上述逆转录子就不存在于该DNA中。因此，可以把FSHβ-亚单位基因的等位基因表示为A，存在上述逆转录子；以及B，不存在上述逆转录子。所以，AA纯合子提供了两条516bp的扩增条带，AB纯合子提供了一条516bp的条带和一条224bp的条带，而BB纯合子则提供了两条224bp的条带。
因此，本发明第一方面提供了一种用于筛选猪以确定更有可能一胎生产出较多的猪崽的猪和/或不太可能一胎生产出较多猪崽的猪的方法，该方法包括以下步骤(ⅰ)从猪中获得基因组DNA的样品；以及(ⅱ)分析在(ⅰ)中得到的基因组DNA以确定是否存在FSHβ-亚单位等位基因。
步骤(ⅱ)、即确定FSHβ-亚单位等位基因可以适当地通过寻找直接或间接地连接到FSHβ-亚单位基因上的具体的DNA标记物来实现。
通过遗传重组可以破坏遗传标记物和决定着具体性状的基因之间的关系。因此，在所述的标记物与基因之间的实际距离越近，重组就越不可能分离出它们。也有可能在对另一种DNA的标记物具有特异性的等位基因和已知与具体的基因有关的DNA标记物的等位基因(例如本文所讨论的FSHβ-亚单位基因)之间建立联系，而事先已经表明上述具体的基因与具体的性状有关。在本发明进一步的具体实施方案中，使用了许多这样的标记物。例如，可以利用许多对的标记物来划分主要的基因以减少任何可能的重组作用。材料和方法血液和耳组织样品从猪静脉caravanterior中收集血液。采用ACD作抗凝集剂(antiagglutinator)，在-20℃下储存血液。在-20℃下用70％的乙醇储存耳组织。PCR引物根据已出版的FSHβ基因序列(T.Hirai等人，1990)设计引物。Southem印迹根据分子克隆(J.Sambrook等人，1989)来分离基因组DNA，即用BamHⅠ消化5ug的DNA样品，在电泳后将DNA从凝胶中转移到尼龙膜上。在42℃下使DNA与5XSSC、0.02％SDS、1％封闭剂、0.1％N月桂酰肌氨酸预杂交3小时，然后在68℃下再与5XSSC、0.02％SDS、1％封闭剂、0.1％N月桂酰肌氨酸杂交1624小时，并用洋地黄毒苷标记FSHβ亚单位cDNA探针。在杂交之后，根据DIG方法来处理膜。聚合酶链式反应以100ng的基因组DNA作模板。对每5个单位的TaqDNA聚合酶来说，使用5ul 10XPCR缓冲液、200uM dNTP、1pM的引物。总体积为50ul。PCR的条件在94℃下保持2分钟，然后开始进行30次循环。在94℃下保持30秒钟、在55℃下保持30秒钟、在72℃下保持1分钟、然后在72℃下延伸8分钟、在4℃下保持。通过电泳进行检测。测定序列克隆到pGEM-3Zf(+)中的PCR产物制备出用于通过ABI370A测序仪进行测序的质粒模板。确定基因型根据PCR的多态现象来确定动物的基因型。三种基因型AA,AB,BB分别代表着具有0.5kb PCR条带、具有0.5kb和0.2kb的条带以及具有0.2kbPCR条带的动物。结果和讨论在猪的品种中FSHβ亚单位基因的5’侧翼区的变异对5’调节区的分析对于理解基因的表达来说是很有帮助的。正如我们所知的那样，高浓度的FSH和LH可以诱导动情期的同步以及超数排卵。一些实验结果表明在眉山母猪和公猪(Jiao1992,Wise1996)的循环血液中FSH的浓度要高于欧洲品种的猪。我们想证实FSH浓度的变化是否是由品种间的5’侧翼区的多样性造成的。我们的发现表明在可能的CRE,AP1,AP2效应元件与CAT盒、TATA盒中没有差别。另一方面，在中国的猪品种与西方的猪品种之间在-439碱基位置上出现了C→A的颠换。在大约-360碱基位置处发现(AT)n重复片段的微卫星位点具有两个等位基因(AT)7,(AT)11(Zhao等人，1995)。没有发生变异可能是造成在眉山或Erhualian与其它品种之间FSH浓度不同的主要原因。FSHβ亚单位基因的RFLPs分析我们使用猪的FSHβ亚单位cDNA来检测FSHβ亚单位基因组基因的多态现象。内切核酸酶包括BamHⅠ,EcoRⅠ,HindⅢ。当使用BamHⅠ时，多产的太湖猪(眉山，Erhualian)具有始终如一的3.0kb的杂交带，便可以获得明显的多态现象。反之，其它的猪品种(兰德瑞斯猪，约克夏猪，中国小猪)具有3.0kb和3.2kb或3.5kb的杂交带(Zhao等人，1997)。这种现象是由在FSHβ基因的结构区插入了一个BamHⅠ识别位点引起的(Zhao等人，未出版)。可以把这种多态现象当作一种DNA标记物来分析FSHβ基因是否对眉山猪的多产作出了贡献。通过PCR确定动物的基因型在1995年，我们发现了由插入引起的FSHβ结构基因的PCR长度的多态现象(Zhao等人，1995)。而且在我们的小组中已经实现了对上述插入片段的精确定位(Zhao等人，未出版)。该插入片段含有292个碱基，在这些碱基中有一个在出版的FSHβ基因序列中没有发现的polyA。但是，插入或缺失的意义仍是不清楚的。根据上述结果，设计引物来确定动物的基因型并且通过PCR产物把基因型分成三种，即各具有0.5kb或0.2kb的条带的两种纯合子AA,BB和具有0.5kb和0.2kb的条带的AB杂合子。在基因的平衡中，采用所有品种的结果已经进行了大规模的分析。对于中国的猪的品种而言为100％AA的动物。反之，在约克夏猪、兰德瑞斯猪和杜洛克猪的品种中大多数为BB基因型。表1在FSHβ基因座中在猪的品种中确定基因型的结果
猪的FSHβ亚单位的基因型和一胎生下的猪崽的数目收集了289头兰德瑞斯母猪、约克夏母猪一胎生下的猪崽数目的记录并采用该记录来预测基因对生殖的影响。统计数据表明对于第一宇称(parity)的总出生数(TNB)而言BB纯合子母猪比AA母猪平均多产出2.53头小猪，而对出生的存活数而言前者比后者多产出2.12头小猪。对所有宇称而言，BB母猪比AA母猪每窝多生产1.5头小猪。对BB母猪来说，没有总结出BB母猪对小猪出生时和20天的体重有不利的影响。FSHβ基因可能与这些群体中生殖的主要基因有关。结论已经采用了候选基因的方法来对用于QTL的主要基因进行定位。通过这种方法，Rothschild及其同事提出在大的白色群体中雌激素受体基因与一胎生下的幼崽数目的主要基因密切相关(Rothschild等人，1996)。在我们的小组中，我们选用FSHβ基因作为候选基因来分析其对一胎生下的猪崽数目的影响。在太胡猪和其它的品种之间发现了明显的变异。对具有一胎生下的猪崽数目记录的基因型母猪实施PCR计划。进一步的结果表明FSHβ亚单位基因座可以连锁到约克夏猪、兰德瑞斯猪中一胎生下的猪崽数目的主要基因上。
权利要求
1．一种用于筛选猪以确定更有可能一胎生产出较多的猪崽的猪和/或不太可能一胎生产出较多猪崽的猪的方法，该方法包括以下步骤ⅰ)从猪中获得基因组DNA的样品；以及ⅱ)分析在ⅰ)中得到的基因组DNA以确定是否存在FSHβ-亚单位等位基因。
全文摘要
本发明提供了一种用于分析猪的基因组DNA以确定所说的猪是否携带了一个或多个与一胎生产出较多的猪崽有关的FSHβ－亚单位基因的等位基因。
文档编号C12Q1/68GK1238388SQ9811528
公开日1999年12月15日 申请日期1998年6月10日 优先权日1998年6月10日
发明者李宁, 吴常信, 赵要风 申请人:Pic国际集团公开有限公司