专利名称：治疗肿瘤抑制基因p53缺陷肿瘤的重组毒素腺病毒突变体的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程中一种新型的具特异性治疗肿瘤抑制基因p53缺陷肿瘤的重组毒素腺病毒突变体。
肿瘤是严重危害人类健康与人们生命的常见多发病，我国每年癌症新发病人数超过160万(癌症患者总人数超过1000万)。癌症正超过心脑血管病而成为人类致死的第一位原因。
人的大多数类型的肿瘤常常发生肿瘤抑制基因p53的突变与缺失，如70％肿癌、60％的皮肤癌、65％的结肠癌等都具有p53的改变。而糟糕的是，在大多数情况下，具有肿瘤抑制基因p53功能缺陷的肿瘤常常对放疗或化疗不敏感，也就是说，有肿瘤抑制基因p53功能缺陷的肿瘤患者基本上丧失了进一步治疗的可能性，因而发展针对肿瘤抑制基因p53缺陷的肿瘤的治疗方法就显得特别重要。
应用现代基因工程技术构建的一种新型腺病毒突变体(dk1520，亦称ONYX-015)，缺失了腺病毒基因组中编码55KD蛋白(Elb 55K)的Elb区，正是由于这一缺失，使得该腺病毒突变体能在p53功能缺陷的细胞中进行自我复制，而在正常细胞中却不能进行自我复制。也就是说，把该腺病毒突变体注射人p53功能缺陷的肿瘤内后，该腺病毒突变体能在肿瘤细胞内进行复制、繁殖，从而最终导致肿瘤细胞裂解或凋亡而死，而正常细胞与组织并不受影响。
但是，人体是一个十分复杂的有机体，而癌症又是一种尤其错综复杂的疾病。任何一种单纯的药物不管其功能如何强大，其作用依然有限。癌症的治疗正在进入一个综合治疗的时代，肿瘤的单基因治疗方案正被多基因治疗方案所取代。用单纯的腺病毒突变体dL1520去治疗p53缺陷肿瘤固然有一定疗效，但其疗效依然会受到一定程度的限制。
“以毒攻霉”自古以来就是治疗包括癌症在内的各种顽症的首选原则。在现代癌症治疗方案中，毒素(包括绿脓杆菌外毒素[Pesudomonasexotoxin，PE]、白喉毒素基因[Diphtheria toxin，DT]、葡萄球菌内毒素A[Staphylococcal enterotoxin A，SEA]和蓖麻毒素[Ricin]等)亦是常用的有效药物。然而由于霉素本身缺乏靶向性，其毒副作用较大，因此其应用受到了相当程度的限制。
本发明的目的为了克服毒素治疗癌症缺乏靶向性，毒副作用大的缺点和改善单基因治疗方案中疗效不佳的现状，本发明把腺病毒突变体dL1520和毒素基因二者的优势有机结合起来，构建成一种新型的具有特异性治疗肿瘤抑制基因p53缺陷肿瘤的重组毒素腺病毒突变体。命名为CBC-015。
主要技术内容由于用单纯的腺病毒突变体dL1520治疗p53功能缺陷肿瘤的疗效不佳，本发明设计了把毒素基因插人腺病毒突变体dL1520的E3区(缺失腺病毒的E3区不影响腺病毒的复制功能)，这样，不仅保留了腺病毒突变体dL1520特异地在p53功能缺陷的肿瘤细胞中自我复制的功能，而且使毒素基因的表达产物仅特异地作用于p53功能缺陷的肿瘤细胞，从而有效地提高了毒素作用的靶向性，降低了毒素的毒副作用。
这种把腺病毒突变体dL1520和毒素基因二者的优势有机结合起来而构建成的新型重组毒素腺病毒突变体(命名为CBC～015)，可进一步开发为一种效率更为强大的抗肿瘤新药，用于p53缺陷肿瘤的基因治疗。
特异性治疗肿瘤抑制基因p53缺陷肿瘤的重组毒素腺病毒突变体的主要特点是(见下面构建过程)质粒pVC45F(A)经限制性内切核酸酶双酶切，回收包含PE基因的片段(a)；同时，质粒pGL3-control(B)经限制性内切核酸酶双酶切后得到载体pGL3-ΔLuc(b)；将(b)与(a)连接起来，从而构建成PE基因表达质粒pGL3-PE(c)；该表达质粒经限制性内切核酸酶双酶切，得到PE基因表达单元(d)；质粒pABS.4(C)经双酶切，得到载体pABS.4(e)，再将(e)与(d)连接，连接产物为PE基因表达中间载体pABS-PE(f)，将(f)经限制性内切核酸酶酶切，得到PE基因与卡那霉素基因融合片段(g)；腺病毒质粒pB-HG11(D)经酶切后得到载体pBHG11(h)；将(h)与(g)连接，从连接产物中筛选出重组质粒，命名为腺病毒中间质粒pBHG-PE(i)；腺病毒突变体dL1520(F)，经限制性内切核酸酶酶切，回收缺失E1b的腺病素DNA片段(j)；质粒pUC18(E)，经双酶切后得到的载体pUC18(k)；将(k)与(j)连接，从连接后产物筛选出重组质粒，命名为腺病毒质粒pAdΔElb(l)，将(l)与(i)共转染293细胞(13)，从形成的空斑中筛选出含有重组毒素基因的腺病毒突变体(14)，用PCR鉴定重组毒素腺病毒突变体(Z)。
上述质粒pVC45F(A)可以包含绿浓杆菌毒素基因或白喉毒素基因或葡萄球菌内毒素A或蓖麻毒素基因。
质粒pGL3-control(B)含报告基因——荧光素酶基因，真核基因表达调控序列猿猴病毒40(即SV40)基因启动子，SV40增强子和SV40加poly(A)(即多聚腺苷酸)信号。
新型腺病毒突变体CBC-015的结构示意图见附图5，该图为附图2的注释。有关英文缩写说明如下
1)Ad5adenovirus type 5，5型腺病毒。
2)I mu≈360 bP；bp(base pairs)碱基对。
3)ITRinverted terminal repeat，末端重复序列；Elaearlyregion l a，早期转录区la；Elbearly region lb，早期转录区lb；E3early region 3，早期转录区为3。
4)SV40simian virus 40，猿猴病毒40；poly(A)polyadenylicacid，多聚腺苷酸。
5)ATG；转录起始密码子。
新型腺病毒突变体CBC-015的构建过程(以PE基因为例)示意图参见附图6，该图为附
图1的注释把含有绿脓杆菌外毒素[Pesudomonas exotoxin，PE]基因的质粒pVC45F(A)，用限制性内切核酸酶Nco I和Spe I进行双酶切(1)，回收1.8kb(kbkilobase，干碱基)的包含PE基因的片段(a)；同时，把质粒pGL3-control(B)[该质粒含有报告基因——荧光素酶(lu-ciferase，luc)基因，真核基因表达调控序列SV40(见注)基因启动子、SV40增强子和SV40加poly(A)信号]用核酸限制性内切酶Nco I和Xba I进行双酶切(2)回收3.6kb的缺失luc基因的载体片段PGL3-Δluc(b)，然后把载体片段pGL3-Δluc和PE基因片段用T4 DNA连接酶进行连接(3)，连接产物转化大肠杆菌后，筛选出重组质粒，即PE基因表达质粒，命名为pGL3-PE(e)。PE基因表达质粒pGL3-PE用限制性内切核酸酶Sma I和BamH I进行双酶切(4)，回收2.6kb的PE基因表达单元(d)；同时，质粒pABS.4(c)用Ec1136 II和BamH I进行双酶切(5)，所得到的载体pABS.4(e)与PE基因表达单元(d)用T4 DNA连接酶进行连接(6)，连接产物转化大肠杆菌后，筛选出重组质粒，命名为中间载体pABS-PE(f)。中间载体pABS-PE(f)经限制性内切核酸酶Pdc I酶切(7)后，回收3.9kb的PE基因与卡那霉素基因融合体片段(g)，同时，腺病毒质粒pBHG11(D)经限制性内切核酸酶Pac I酶切(8)后所得到的载体pBHG11(h)与PE基因与卡那霉素基因融合体片段(g)，用T4 DNA连接酶进行连接(9)，连接产物转化大肠杆酶后，筛选出重组质粒，命名为腺病毒中间质粒pBHG-PE(I)；腺病毒突变体dL1520(F)用限制性内切核酸酶Sph I酶切(II)后，回收2.8kb的缺失Elb的泉病毒DNA片段(j)，该片段包含有腺病毒中在p53缺陷肿瘤中特异性复制的各种元件。同时，质粒pUC18(E)经限制性内切核酸酶Sma I和Sph I双酶切(10)后所得到的载体pUC18(k)与2.8kb的片段(j)用T4 DNA连接酶进行连接(12)，连接产物转化大肠杆菌后，筛选出重组质粒，命名为腺病毒质粒pAd/Elb(1)。
用腺病毒质粒pAdΔE1b(I)和腺病毒中间质粒pBHG-PE(i)共转染293细胞(13)(人原胚肾癌细胞株，是转染腺病毒的宿主细胞株)，从形成的空斑中筛选出含有重组毒素基因的腺病毒突变体(14)，用PCR(polymerase chain reaction，聚合酶链式反应)法鉴定重组毒素腺病毒突变体(Z)。该重组毒素腺病素突变体即是能特异性地在p53功能缺陷的肿瘤细胞中复制的重组毒素腺病毒突变体。
本发明的积极效果1.克服了现代癌症治疗方案中毒素本身缺乏靶向性，毒副作用大的缺点。2.取代了单基因治疗方案，本治疗方案不仅保留了dL1520在p53功能缺陷的肿瘤细胞中自我复制的功能，而且使毒素基因的表达产物仅特异地作用于p53功能缺陷的肿瘤细胞从而有效地提高了毒素作用的靶向性，降低了毒素的毒副作用。3.把腺病毒突变体dL1520和毒素基因二者的优势有机结合起来，可进一步开发为一种效率更为强大的抗肿瘤新药。
附图及图面说明图1CBC-015的构建过程示意2CBC-015的结构示意3、图4质粒的限制性酶谱图5附图2的注释图6附图1的注释图中序号说明；(A)质粒pVC45F；(B)质粒pGL3-control；(C)质粒pABS.4；(D)腺病毒质粒pBHG11；(E)质粒pUC18；(F)腺病毒突变体dL1520；(a)PE基因；(b)载体pGL3-ΔIuc；(c)PE基因表达质粒pGL3-PE ；(d)PE基因表达单元；(e)载体pABS.4；(f)中间载体pABS-PE；(g)PE基因与卡那霉素基因融合片段；(h)载体pBHGH；(i)腺病毒中间质粒；(j)缺失Elb的腺病毒DNA片段；(k)载体pUC18；(1)腺病毒质粒pAdΔElb；(Z)PCR鉴定重组毒素腺病毒突变体。
(1)限制性内切核酸酶Nco I和Spe I双酶切；(2)核酸限制性内切酶Nco I/Xba I双酶切；(3)连接；(4)限制性内切核酸酶Sma I/BamHI双酶切；(5)限制性内切核酸酶Ecll36 II/BamH I双酶切；(6)连接；(7)限制性内切核酸酶PacI酶切；(8)限制性内切核酸酶pac I酶切；(9)连接；(10)限制性内切核酸酶Sma I/Sph I双酶切；(11)限制性内切核酸酶Sph I酶切；(12)连接；(13)转染293细胞；(14)从空斑选择含重组霉素基因的腺病毒突变体；(15)图距单位(map units，即mu)；(16)Ad5，5型腺病毒；(17)缺失(6.3-9.8mu)；(18)缺失(77.5-86.2)mu；(19)ITR末端重复系列；(20)Ela早期转录区la；(21)Elb早期转录区lb；(22)E3早期转录区3；(23)ATG转录起始密码；(24)转录方向；(25)SV40基因启动子；(26)毒素基因；(27)SV40加poly(A)信号；(28)SV40增强子。
实施例见图2和说明书中CBC-015构建过程。
取质粒(A)、(B)、(C)、(D)、(E)、(F)各5μg，经图1中(1)、(2)、(3)、(4)、(5)、(6)、(7)、(8)、(9)、(10)、(11)、(12)中各过程分别处理。实现中间产物(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)、(i)、(j)、(k)、(l)，用最后产物(i)和(l)共转染293细胞后从空斑中筛选含重组毒素基因的腺病毒突变体，通过PCR(聚合酶链式反应)法鉴定重组毒素腺病突变体。
权利要求
1.一种治疗肿瘤抑制基因p53缺陷肿瘤的腺病毒突变体，其特征是质粒pVC45F(A)经限制性内切核酸酶双酶切后，回收包含PE基因的片段(a)；同时，质粒pGL3-control(B)，经限制性内切核酸酶双酶切后得到载体pGL3-ΔLuc(b)；将(b)与(a)连接起来，从而构建成PE基因表达质粒pGL3-PE(c)；该表达质粒经限制性内切核酸酶，双酶切，得到PE基因表达单元(d)；质粒pABS.4(C)经双酶切，得到载体pABS.4(e)；再将(e)与(d)连接，连接产物为PE基因表达中间载体命名为pABS-PE(f)；将(f)经限制性内切核酸酶酶切，得到PE基因与卡那霉素基因融合片段(g)；腺病毒质粒pBHG11(D)经酶切后得到载体pBHG11(h)，将(h)与(g)连接，从连接产物中筛选出重组质粒，命名为腺病毒中间质粒pBHG-PE(i)；腺病毒突变体dL1520(F)经限制性内切核酸酶酶切，回收缺失E1b的腺病毒DNA片段(j)；质粒pUC18(E)经双酶切后得到的载体pUC18(k)；将(k)与(j)连接，从连接后产物中筛选出重组质粒，命名为腺病毒质粒pAdΔElb(l)；将(l)与(i)共转染293细胞(13)，从形成的空斑中筛选出含有重组毒素基因的腺病毒突变体(14)，用PCR鉴定重组毒素腺病毒突变体(Z)。
2.按权利要求1所说的腺病毒突变体，其特征是质粒pVC45F(A)可以包含绿浓杆菌外毒素基因或白喉毒素基因或葡萄球菌内毒素A或蓖麻毒素基因。
3.按权利要求1、2所说的腺病毒突变体，其特征是质粒pGL3-control(B)含报告基因——荧光素酶基因，真核基因表达调控序列猿猴病毒40(即SV40)基因启动子，SV40增强子和SV40加poly(A)(即多聚腺苷酸)信号。
全文摘要
本发明提供一种具有特异性治疗肿瘤抑制基因p53缺陷肿瘤的重组毒素腺病毒突变体。主要特点是用质粒pVC45F,质粒pGL3－control,质粒pABS.4,腺病毒质粒pBHG11,质粒pUC18,腺病毒突变体dL1520等经一系列中间过程,得到基因表达质粒等等中间产物,将最后得到的产物质粒pBHG－PE与质粒pAd△E1b转染293细胞,从形成的空斑中筛选出含有重组毒素基因的腺病毒突变体,用PCR鉴定重组毒素腺病毒突变体,命名CBC－015,该重组突变体可进一步开发为一种效率强大的抗肿瘤新药,用于p53缺陷肿瘤的基因治疗。
文档编号C12N7/01GK1258742SQ9812402
公开日2000年7月5日 申请日期1998年12月25日 优先权日1998年12月25日
发明者魏于全, 田聆 申请人:华西医科大学