专利名称：脊髓灰质炎病毒具有复制能力的重组体萨宾i型株系的制作方法
背景技术：
1.发明领域本发明涉及一种可用于开发活病毒疫苗的载体系统。更具体地说，它涉及脊髓灰质炎病毒具有复制能力的重组体萨宾I型株系，它能用于开发可引起粘膜免疫的活病毒疫苗。2.现有技术描述近来报道，熟知通过血液媒介途径(如输血、同性间性交或共用注射器)的多种传染性病毒疾病也可通过异性间性交传播。在爱滋病(获得性免疫缺陷综合症)情况下，异性传播的数量大大超过血液媒介的例子(Stingl等，美国科学院皮肤病学杂志，22，1210，1988)。在韩国，每527名HIV-1阳性病人中有363人是异性恋，而99名是通过同性途径受到感染(韩国，国家健康研究所，传染病月报，1996年4月)。这些报告极力提示，HIV-1可以不经血液媒介，而通过性器官周围的粘膜组织进行传播。
有些文章报道，HIV-1的传染和扩散很可能开始于粘膜组织中郎格汉斯细胞或树突细胞(DC)的感染。受感染的细胞返回淋巴结以传送抗原，即熟知的归巢性，在此发生病毒复制，结果导致病毒血症和爱滋病发展。换言之，和感染HIV-1病人异性性交的那些人，其泌尿生殖器官粘膜区的郎格汉斯细胞或DC细胞会受到HIV-1感染，这些受感染的DC回到淋巴结，刺激淋巴结中的CD4＋T-细胞并增殖HIV，结果CD4＋-T细胞衰竭，爱滋病随之发展(Tschachler等，皮肤病学研究杂志，88，238，1987；Langhoff等，美国国家科学院院报，88，7998，1991；Patterson & Knight，普通病毒学杂志，68，1177，1987；Patterson等，免疫学，72，361，1991；Cameron等.，科学，257，383，1992；Embreston等，自然，362，369，1993；Fauci等，科学，262，1011，1993；Pantleo等，自然，362，355，1993；Adema等，自然，387，713，1997)。这些实验结果被设置在恒河猴的活体实验所证实。猴生殖器经SIV(猿猴免疫缺陷病毒)处理后受到感染，然后出现了爱滋病症状(Miller & Gardner，爱滋病杂志，4，1169，1991；Miller等，病毒学杂志，63，4277，1989)。此外，多数传染性病毒疾病的扩散均首先是呼吸，消化和泌尿生殖器官的粘膜组织受到感染，因此，竭力推荐开发粘膜疫苗以预防传染性病毒。尤其是，共同粘膜免疫系统-在活机体内一处免疫能引起其他粘膜区的相同免疫，这种粘膜免疫的特殊特性鼓舞着许多研究者去开发粘膜疫苗(Kott，科学，266，1335，1994；Cease & Verzofsky，免疫学年度回顾，12，923，1994)。
很久以来，天花病毒一直被推荐用作一种活的病毒疫苗载体。已报道，通过将疫苗基因引入天花病毒基因组而产生的重组疫苗病毒在免疫过的猴体内可诱导细胞毒性T淋巴细胞。但还不允许将它应用于人类，因为当这种疫苗病毒过量繁殖时可能在免疫个体内引起疫苗综合症。为避免这种可能性，一种减毒的疫苗病毒被建议代替毒性株系而作为疫苗载体，但它不能成功引起有效的免疫(Cooney等，Lancet，337，567，1991；Tartaglia等，病毒学，188，217，1992)。
具有比痘苗病毒更小基因组(34kbp)的腺病毒亦曾被推荐作为疫苗载体(Natuk，等，美国国家科学院院报，89，7777，1992；Gallichar等，传染病杂志，168，622，1993)。但是重组体腺病毒仍有着侧面影响的局限，如角膜炎或corneitis，若把腺病毒作为粘膜疫苗载体，必须将这种问题加以解决。
脊髓灰质炎病毒含有一个7.4kb核苷酸长的正义单链RNA，其编码一种长多蛋白的单一开放阅读框(Kitamura等，自然，291，547，1981)。近来，由于它具有众所周知的诱人优点-安全，易于施用，经济，尤其具有引起终生有效的粘膜免疫的能力(对于一种理想疫苗是很重要的)，因此，几个小组正在试图开发脊髓灰质炎病毒作为一种疫苗载体。
以下是已经出版了的与开发脊髓灰质炎病毒作为疫苗载体有关的疫苗研究工作的概括(1)曾提出用假定的HIV疫苗抗原决定基，如gp41，pND(主要中和域)或gpl20替代VPI(脊髓灰质炎病毒主要外壳蛋白)的某些部分。由此遗传重组产生的嵌合病毒依赖于抗原决定基的特性有效地诱导抗体(Burke等，自然，332，81，1988；Burke等，普通病毒学杂志，70，2475，1989；Evans等，自然，385，1989；Dedieu等，病毒学杂志，66，3161，1992；Rose等，普通病毒学杂志，75，969，1994)。可是，这种嵌合病毒及所引入的疫苗基因的大小均有限。当插入的疫苗抗原决定基大于25个氨基酸残基时嵌合脊髓灰质炎病毒在受感染细胞内就不能被适当地装配。
(2)Morrow和他的同事们(Porter等，病毒学杂志，69，1548，1993；Ansaradi等，肿瘤研究，54，6359，1994；Porter等，病毒学杂志，70，2643，1996；Porter等，疫苗，15，257，1997)建议利用脊髓灰质炎病毒结构基因已被外来序列取代了的脊髓灰质炎病毒微小复制体开发脊髓灰质炎病毒介导的粘膜疫苗。在脊髓灰质炎病毒微小复制体情况下，复制缺损型重组体病毒基因组必须与可表达壳体蛋白的其它载体共转染以便对嵌合病毒基因组进行包装(Porter等，病毒学杂志，69，1548，1995)。此外，必须接种高滴度的微小复制体以引起有效的粘膜免疫，因为它是作为复制缺损型目标特异性免疫原而非活病毒疫苗起作用。
(3)近来，Mattion等，(病毒学杂志，68，3925，1994)和Andino等，科学，265，1448，1994)提出了一种新的策略，即在具有复制能力的重组体脊髓灰质炎病毒中表达外来抗原。他们在脊髓灰质炎病毒多蛋白N末端引入了新的多接点区域和3C-蛋白酶识别位点。根据这个系统，与脊髓灰质炎病毒开放阅读框读框一致地克隆的外源基因后是一个人造3C-蛋白酶位点，可使得外来蛋白从脊髓灰质炎病毒多蛋白上蛋白水解切割下来。外源性核酸被直接插入到脊髓灰质炎病毒基因组中。病毒复制期间，该外源序列作为病毒多蛋白的一部分而表达，继之由病毒编码的蛋白酶进行加工产生游离抗原和成熟病毒蛋白。外源抗原不被包裹在病毒颗粒中，而是被释放到细胞质中。本发明的原理是基于以前出版的脊髓灰质炎病毒特异性3C-蛋白酶的特性。3C-蛋白酶识别特异的氨基酸序列，然后在Glu(Q)/Gly(G)间的接点处将它断开(Hanecak等，美国国家科学院院报，79，3793，1982)，在长多蛋白的分子内会发生这种蛋白水解(Palmenberg & Reuckert，病毒学杂志，41，244，1982；Hanecax等，细胞37，1063，1984)。这些现象在小核糖核酸病毒家族内比较常见(Palmenberg等，病毒学杂志，32，770，1979；Palmenberg & Reuckert，病毒学杂志，41，24，，1982)。已多次证实Q/G切割位点(AXXQG)P4位置的丙氨酸(A)残基对于有效识别和被3C-蛋白酶所切割是必需的(Nicklison等，生物技术学4，33，1986；Pallai等，生物化学杂志，264，9738，1989；Cordingley等，病毒学杂志，63，5037，1989；Orr等，遗传病毒学，70，2931，1989；Petithory t al.，Proc.Natl.Acad，Sci，USA，88，11510，1991；Blair & Sernler，病毒学杂志，65，6111，1991)。基于这些实验结果，Nattion和他的同事们(病毒学杂志68，3925，1994)将多克隆位点和3C-蛋白酶切割位点引入脊髓灰质炎病毒萨宾3型株系的N-端，构建了表达轮状病毒VP7的嵌合脊髓灰质炎病毒。Andino和他的同事们(科学，265，1448，1994)通过将多克隆位点和3C-蛋白酶切割位点引入脊髓灰质炎病毒马洪芮(Mahoney)株系的长多蛋白N-末端而构建了重组体马洪芮载体(MOV-1.4)。通过将各种HIV-1亚基因组克隆至载体中，他们制备了嵌合脊髓灰质炎病毒(科学，265，1448，1994)。Andino小组已报道，表达HIV-1nef基因的这种嵌合脊髓灰质炎病毒经直肠免疫两周后在猴体内诱导了有效的粘膜免疫(Andino等，科学，265，1448，1994)。然而，不经过进一步的去毒步骤，这种重组体马洪芮脊髓灰质炎病毒不能用于人类，因为脊髓灰质炎病毒马洪芮株系是一个具有致命毒性的亲神经病毒，它通过对消化器官原发性感染而感染灵长类中枢神经系统，结果导致麻痹性脊髓灰质炎。而，Mueller和Wimmer(病毒学杂志，72，20-31，1998)报道通过将绿色萤光蛋白基因(gfp252aa)和HIV-1 gag基因克隆至Andino的马洪芮1载体而获得的重组体病毒在传代时并不象Andino等人(科学，265，1448，1994)以前所报道的那样遗传稳定。他们的实验结果指示，多数重组体病毒甚至在单代传代时就丢失了引入的疫苗基因，在传代6代后在RT-PCR实验中发现没有一个子代病毒具有完整长度的外源性插入片段。
(4)1996年Andino和他的同事们报道利用同一马洪芮载体生产了能表达乙型肝炎病毒Pers(118aa，54aa)核心(155aa)蛋白的重组体马洪芮病毒(Yim等，病毒学，218，61，1996)。尽管他们声称这些嵌合病毒在传代过程中直到第6代依然遗传稳定，但他们的RT-PCR实验结果显示，持有Pres基因(118aa)的重组体载体数量在第5代时显著减少。另一方面，他们的实验指示，表达编码55个氨基酸残基的小pres蛋白的重组体病毒与野生型或其他重组体马洪芮株系相比其复制能力明显下降。结果表明，重组体嵌合病毒的复制能力并不象预期那样与插入的疫苗基因的大小紧密相关。这些实验结果使我们得出结论，重组体嵌合病毒的生物学特性取决于几个联合因素，如基因插入片段的大小、病毒载体的特性，以及所引入的疫苗基因等。
(5)Andino等人承认了上面提到有关他们的马洪芮载体的问题后，通过将多克隆位点和2A-蛋白酶切割位点插入到马洪芮多蛋白cDNAP1/P2的连接处而开发出了一种新的马洪芮载体(Mov-2.1)(Taup等，病毒学杂志，71，7841-7850，1997)。这一MOV-2.1载体被用来构建表达SIV gag基因(p17或p27)或env基因(gfp130或gp41)的重组体嵌合病毒。这些重组体嵌合病毒具有与野生型马洪芮类似的复制能力，并且有效地表达所引入的疫苗基因。可是，MOV-2.1载体仍然存在遗传不稳定的问题。在3代内，99％以上重组体嵌合病毒失去所引入的疫苗基因。他们认为传代期间的序列删除是由于新引入的多克隆位点处的重复序列间的同源重组所致。他们在不影响氨基酸序列情况下进行沉默突变而改变序列，使MOV-2.1载体的重复序列的序列同源性降低37％，将它命名为MOV-2.11。通过将SIV-P27基因克隆到被操作过的马洪芮载体内，他们构建了重组体嵌合病毒Sp27(MOV-2.11)。对于未经沉默突变的重组体病毒[Sp27(MOV-2.1)]，第一代后只有20-30％的噬菌斑保留克隆的疫苗基因，第3代后就没有携带克隆基因的噬菌斑了。另一方面，对于重复序列有沉默突变的重组体病毒[SP27(MO-2.11)]，90％以上单次传代噬菌斑保留有克隆基因(gag)，在第3代30-50％的噬菌斑表达SIV基因产物。但是，马洪芮载体MOV-2.11在传代期间仍然存在遗传稳定性问题，尽管他们通过降低序列的同源性对提高马洪芮载体的遗传稳定性取得了某些进展。根据他们的实验结果，随着传代的进行，甚至在三代内，保留插入片段的子代病毒群落就已明显减少第一代(90％)，第二代(50-70％)和第三代(30-50％)。这意味，如果再稍微进一步传代，保留插入片段的重组体嵌合马洪芮病毒即会在总群落中迅速被稀释。
考虑到由Andino小组所构建的马洪芮载体的一些局限性，马洪芮载体不能被允许作为脊髓灰质炎病毒介导的粘膜疫苗载体的模型系统。
因此，积极建议为脊髓灰质炎病毒介导的粘膜疫苗载体开发一种新的模型系统，该系统能克服马洪芮载体所显示的局限性。为此，新的载体应符合下列要求(1)病毒载体对人类必须是安全的；(2)重组体病毒必须是可复制的，同时具有与野生型相当的复制能力；和(3)引入的疫苗基因在病毒传代期间必须能被稳定保留。
发明概述本发明目的之一在于提供在粘膜疫苗的开发中可用作活的病毒疫苗载体的具有复制能力的重组体萨宾I型脊髓灰质炎病毒载体。
本发明另一目的在于提供一种可表达克隆到重组体萨宾I型脊髓灰质炎病毒多克隆位点中的几种疫苗基因的嵌合脊髓灰质炎病毒。
本发明提供一种具有复制能力的重组体萨宾I型脊髓灰质炎病毒载体，其在萨宾I型脊髓灰质炎病毒cDNA长多蛋白第1和第2氨基酸之间具有编码多克隆位点和3C-蛋白酶切割位点的非基因组序列。
本发明进一步提供可表达各种外源性疫苗基因的具有复制能力的嵌合萨宾I型脊髓灰质炎病毒，以及它们的重组体cDNA质粒，所述诸质粒分别在上面提到的具有复制能力的重组体萨宾I型脊髓灰质炎病毒载体的多克隆位点处具有外源性疫苗基因。
通过下述详细解释，上面提到的诸目的和本发明其他特征及应用对本领域普通技术人员将更为明确。
附图简述
图1图示了用于完成本发明的一种重组体质粒pTZ-PVS-3m的构建。
图2图解描述分别衍生自萨宾I型脊髓灰质炎病毒cDNA的具有1个多克隆位点和3C-蛋白酶切割位点的重组体载体pTZ-PVS-3m和pTZ-PVS-4m。
图3是显示野生型和重组体脊髓灰质炎病毒cDNA转染HeLa细胞后能产生子代病毒的照片。HeLa细胞分别被由野生型cDNA合成的RNA转录物(A)、由重组体质粒pTZ-PVS-3m合成的RNA转录物(B)或由重组体质粒pTZ-PVS-4m合成的RNA转录物(C)转染。
图4图解描述通过将HIV-1p24基因插入重组体质粒pTZ-PVS-3m的多克隆位点而产生嵌合脊髓灰质炎病毒PVS-3m/p24和表达HIV-1p24蛋白的步骤。
图5示评价野生型和重组体萨宾I型脊髓灰质炎病毒复制能力的一步生长曲线。培养物上清液中病毒滴度每3小时由TCID50和噬菌斑测定法测定。
图6为感染了嵌合脊髓灰质炎病毒PVS-3m/p24的HeLa细胞的培养物上清液中表达的HIV-1p24蛋白的蛋白质印迹。
泳道1HIV-1/-tat(tat缺损型HIV-1株系由Dr.Sodroski提供，Dana-Farber Cancer Ins.，USA)泳道2对照(感染野生型萨宾I型脊髓灰质炎病毒的HeLa细胞裂解物)泳道3感染嵌合脊髓灰质炎病毒PVS-3m/p24的HeLa细胞裂解物泳道4感染嵌合脊髓灰质炎病毒PVS-3m/p24的HeLa细胞的培养物上清液图7为评价由嵌合脊髓灰质炎病毒PVS-3m/p24表达的HIV-1p24蛋白的抗原性的放射免疫沉淀结果泳道1未经感染的细胞裂解物泳道2感染野生型萨宾I型脊髓灰质炎病毒的HeLa细胞的裂解物泳道3感染嵌合脊髓灰质炎病毒PVS-3m/p24的HeLa细胞的裂解物图8示克隆在嵌合脊髓灰质炎病毒内的p24基因直至第12代的PCR分析，以评估在传代期间嵌合脊髓灰质炎病毒PVS-3m/p24的遗传稳定性泳道1感染野生型萨宾I型脊髓灰质炎病毒的HeLa细胞的PCR产物泳道2感染重组体脊髓灰质炎病毒PVS-3m/p24的HeLa细胞的PCR产物泳道3感染嵌合脊髓灰质炎病毒PVS-3m/p24的HeLa细胞的PCR产物泳道4感染第2代嵌合脊髓灰质炎病毒PVS-3m/p24的HeLa细胞的PCR产物泳道5感染第4代嵌合脊髓灰质炎病毒PVS-3m/p24的HeLa细胞的PCR产物泳道6感染第8代嵌合脊髓灰质炎病毒PVS-3m/p24的HeLa细胞的PCR产物泳道7感染第12代嵌合脊髓灰质炎病毒PVS-3m/p24的HeLa细胞的PCR产物图9为传代直至第12代时嵌合脊髓灰质炎病毒表达的HIV-1p24蛋白的Western印迹结果，以评价传代期间嵌合脊髓灰质炎病毒PVS-3m/p24的表达稳定性泳道1HIV-1/-tat泳道2HeLa细胞裂解物泳道3感染野生型萨宾I型脊髓灰质炎病毒的HeLa细胞的裂解物泳道4感染第一代嵌合脊髓灰质炎病毒PVS-3m/p24的HeLa细胞的细胞溶解产物泳道5感染第三代嵌合脊髓灰质炎病毒PVS-3m/p24的HeLa细胞的细胞溶解产物泳道6感染第六代嵌合脊髓灰质炎病毒PVS-3m/p24的HeLa细胞的细胞溶解产物泳道7感染第九代嵌合脊髓灰质炎病毒PVS-3m/p24的HeLa细胞的细胞溶解产物泳道8感染第十二代嵌合脊髓灰质炎病毒PVS-3m/p24的HeLa细胞的细胞裂解物图10为通过将HIV-1包膜糖蛋白基因env(125aa)克隆至重组体质粒pTZ-PVS-3m的多克隆位点而构建嵌合脊髓灰质炎病毒PVS-3m/p24并表达HIV-1包膜糖蛋白的步骤图解描述。
图11示克隆在嵌合脊髓灰质炎病毒内的HIV-1env基因直至第12代的PCR分析，用于评价传代期间嵌合脊髓灰质炎病毒PVS-3m/env的遗传稳定性泳道1感染野生型萨宾I型脊髓灰质炎病毒的HeLa细胞的PCR产物泳道2感染重组体脊髓灰质炎病毒PVS-3m的HeLa细胞的PCR产物泳道3感染第3代嵌合脊髓灰质炎病毒PVS-3m/env的HeLa细胞的PCR产物泳道4感染第6代嵌合脊髓灰质炎病毒PVS-3m/env的HeLa细胞的PCR产物泳道5感染第9代嵌合脊髓灰质炎病毒PVS-3m/env的HeLa细胞的PCR产物泳道6感染第12代嵌合脊髓灰质炎病毒PVS-3m/env的HeLa细胞的PCR产物图12为由不超过第12代的嵌合脊髓灰质炎病毒表达的HIV-1env蛋白的Western印迹，目的在于评价传代期间嵌合脊髓灰质炎病毒PVS-3m/env的表达稳定性泳道1HeLa细胞的裂解物泳道2感染重组体脊髓灰质炎病毒PVS-3m的HeLa细胞的裂解物泳道3感染第3代嵌合脊髓灰质炎病毒PVS-3m/env的HeLa细胞的细胞溶解产物泳道4感染第6代嵌合脊髓灰质炎病毒PVS-3m/env的HeLa细胞的细胞溶解产物泳道5感染第9代嵌合脊髓灰质炎病毒PVS-3m的HeLa细胞的细胞裂解物泳道6感染第12嵌合脊髓灰质炎病毒PVS-3m/env的HeLa细胞的细胞溶解产物图13为图解描述通过将HCV核心蛋白基因克隆至重组体质粒pTZ-PVS-3m的多克隆位点而构建嵌合脊髓灰质炎病毒PVS-3m/HCVc表达HCV核心蛋白的步骤。
图14示评价嵌合脊髓灰质炎病毒PVS-3m/HCVc复制能力的一步生长曲线。培养物上清液中病毒滴度每3小时由TCID50和噬菌斑测定法测定。
图15为检验HeLa细胞感染嵌合脊髓灰质炎病毒PVS-3m/HCVc时HCV核心蛋白表达模式的HCV核心蛋白Western印迹泳道1HeLa细胞裂解物泳道2感染野生萨宾I型脊髓灰质炎病毒的HeLa细胞的裂解物泳道3感染嵌合脊髓灰质炎病毒PVS-3m/HCVc的HeLa细胞的裂解物泳道4嵌合脊髓灰质炎病毒PVS-3m/HCVc的沉淀泳道5无病毒的HeLa细胞的培养物上清液浓缩物泳道6感染嵌合脊髓灰质炎病毒PVS-3m/HCVc之HeLa细胞的裂解物的沉淀泳道7感染嵌合脊髓灰质炎病毒PVS-3m/HCVc之HeLa细胞的裂解物的上清液图16示克隆在嵌合病毒内的HCV核心蛋白基因直至第12代的PCR分析，用于评价传代期间嵌合脊髓灰质炎病毒PVS-3m/HCVc的遗传稳定性泳道1感染野生型萨宾I型脊髓灰质炎病毒的HeLa细胞的PCR产蝴泳道2感染重组体脊髓灰质炎病毒PVS-3m的HeLa细胞的PCR产物泳道3感染第3代嵌合脊髓灰质炎病毒PVS-3m/HCVc的HeLa细胞的PCR产物泳道4感染第6代嵌合脊髓灰质炎病毒PVS-3m/HCVc的HeLa细胞的PCR产物泳道5感染第9代嵌合脊髓灰质炎病毒PVS-3m/HCVc的HeLa细胞的PCR产物泳道6感染第12代嵌合脊髓灰质炎病毒PVS-3m/HCVc的HeLa细胞的PCR产物图17为由不超过第12代的嵌合脊髓灰质炎病毒表达的HCV核心蛋白的Western印迹，以评价传代期间嵌合脊髓灰质炎病毒PVS-3m/HCVc的表达稳定性。
泳道1感染第1代嵌合脊髓灰质炎病毒PVS-3m/HCVc的HeLa细胞的细胞溶解产物泳道2感染第3代嵌合脊髓灰质炎病毒PVS-3m/HCVc的HeLa细胞的细胞溶解产物泳道3感染第6代嵌合脊髓灰质炎病毒PVS-3m/HCVc的HeLa细胞的细胞溶解产物泳道4感染第9代嵌合脊髓灰质炎病毒PVS-3m/HCVc的HeLa细胞的细胞溶解产物泳道5感染第12代嵌合脊髓灰质炎病毒PVS-3m/HCVc的HeLa细胞的细胞溶解产物发明详述脊髓灰质炎病毒属小RNA病毒科，它是一种因感染及毁坏中枢神经系统的脊髓灰质炎引发剂(Bodian & Howe，1955Couderc等，1989)。应用灭活了的或活的减毒疫苗可有效地控制脊髓灰质炎。通过在猴组织体内和体外对野生型株系多次传代后已经筛选出三种血清型减毒株系(Sabin & Boulger，J.Biol.Stand.，114，1973)。这些株系(萨宾1，2和3)能在灵长类肠道内复制并诱导产生强大粘膜和全身性免疫力，它们显现良好的安全记录。然而有报道说，在美国，每年经口服脊髓灰质炎病毒(OPV)后仍有5-10例与疫苗相关的脊髓灰质炎病(VAP)发生(Ogra & Faden，J.Pediatr.，108，1031，1986；Nkowane等，JAMA，257，1335，1987)。VAP可能是萨宾株系基因变异的结果，如重组(Furione等，病毒学，196，199，1993)或点突变(Guillot等，疫苗，12，503，1994)。在健康免疫者的肠道和VAP病人的中枢神经系统中确实发现了疫苗派生的神经毒性株系(Georgescu等，病素学杂志，68，8089，1994；Friedrich，病毒学学报，40，157，1996)。可是已报道VAP通常与萨宾2型，3型有关，而与萨宾1型却很少相关(furione等，病毒学，196，199，1993；Otelea等，Dev.Biol.Stand.，78，33，1992)。萨宾1型较大数目的减毒突变可能反映出这种株系比2型和3型株系具有更高的安全性。因此，当期望粘膜免疫防御传染病时，脊髓灰质炎病毒萨宾I型株系是用于传送外源抗原到肠道中的活病毒载体最佳候选者。
本发明就是基于萨宾I型株系这些优点。
发明者致力于利用脊髓灰质炎病毒萨宾I型株系作为粘膜疫苗载体。他们通过将一个多克隆位点和3C-蛋白酶切割位点引入萨宾I型脊髓灰质炎病毒cDNA的N末端而构建了一种重组体质粒pTZ-PVS-3m。由该质粒合成的RNA转录物转染HeLa细胞时具传染力，结果产生重组体子代病毒(PVS-3m)。重组体病毒的复制能力略为降低，较野生型萨宾株系约低1-10倍。不过，通过在将各种疫苗基因克隆至载体pTZ-PVS-3m中后，如上述转染得到的嵌合萨宾I型脊髓灰质炎病毒可以维持外源基因的稳定表达至少连续12代。
脊髓灰质炎病毒萨宾I型株系是萨宾和他的同事们在1961年开发的。他们通过在猴肾细胞已建立的细胞系中连续传代野生型马洪芮(Mahoney)株系而开发了一种减毒、神经毒性较小、免疫原性更强的脊髓灰质炎病毒疫苗株系，称为萨宾1型脊髓灰质炎病毒疫苗株系。萨宾I型与野生型马洪芮株系相比有57个核苷酸取代，其中21个引起氨基酸置换。萨宾I型株系的核苷酸序列用SEQ.ID.No.1表示。导致编码结果改变的所有变化集中在VP1主要衣壳蛋白N末端半区(Kitamura等，自然，291，547-553，1981；Nomoto等，美国国家科学院院报，79，5793-5797，1982)。萨宾I型株系的复制能力较野生型马洪芮株系低2-3个对数。由于它在传代期间已失去了亲神经性，因此不引起灵长类麻痹性脊髓灰质炎。不过，它仍保持了亲肠能力，足以引起有效的粘膜和全身免疫。在美国，1961年它开始被批准为一种口服脊髓灰质炎疫苗(OPV)，1963年得到普遍使用(Ogra等，传染病回顾2，352-369，1980)。
为了本发明，通过位点特异性插入实验，新近将多克隆位点和3C-蛋白酶切割位点引入萨宾I型长多蛋白cDNA第1和第2氨基酸之间，构建了重组体质粒pTZ-PCV-3m(图1)。这个多克隆位点设计为具有3个限制性位点SstII，HpaI和EagI。
在脊髓灰质炎病毒的不同部位含有外源性多克隆位点和3C-蛋白酶切割位点的一些重组体质粒中，当用其RNA转录物转录单层HeLa细胞时，重组体质粒pTZ-PVS-3m能最为有效地生产重组体子代毒(图3)。通过TCID50和噬菌斑测定法测定病毒滴度绘制的一步生长曲线揭示重组体脊髓灰质炎病毒PCV-3m的复制能力比野生型萨宾I型株系至多低一个对数；在各种嵌合脊髓灰质炎病毒中属最高(图5)。
在本发明中，三种外源性疫苗基因HIV-1p24(16qaa)，HIV-1env(125aa)和HCV核心蛋白基因(100aa)被成功地引入pTZ-PCV-3m的多克隆位点，当它们的RNA转录物转染至HeLa细胞中时，结果分别产生了嵌合脊髓灰质炎病毒PCV-3m/p24，PCV-3m/env和PCV-3m/HCVc(图4，图10和图13)。
这些嵌合脊髓灰质炎病毒在HeLa细胞中的复制期间有效地表达外源性蛋白质(图6和图15)，所表达的蛋白质保留着最初的抗原性(图7)。此外，这些嵌合脊髓灰质炎病毒在系列传代期间是遗传稳定的(图8，图11和图16)，并且在传代期间外源基因的表达不遭到破坏(图9，图12和图17)。
这些结果有力地提示重组体质粒pTZ-PCV-3m可以作为一种用效的疫苗载体而用于开发防御一些传染病的一些粘膜疫苗。本发明的重组体质粒pTZ-PCV-3m已于1997年8月6日保藏在韩国典型培养物保藏中心(KCTC)，韩国生物科学和生物技术研究所(KRIBB)，位于大田，登记号为KCTC-0365BP。
能被引入本发明重组体质粒pTZ-PCV-3m的多克隆位点的外源性疫苗基因可包括衍生自各种传染性病毒(如HIV，HBV，HCV，人乳头瘤病毒，轮状病毒等)的那些基因，但不限于此。
可通过已知方法将含有几种外源性疫苗基因的重组体脊髓灰质炎病毒转染至宿主细胞(如HeLa细胞)以获得嵌合脊髓灰质炎病毒，可用作口服疫苗。序列表中的独立注解SEQ.ID.No.2是一种人工序列，它是一种用于DNA扩增的具有多克隆位点和3C-蛋白酶切割位点的合成测序引物；SEQ.ID.No.3是一种人工序列，它是由SEQ.ID.No.2编码的肽；
SEQ.ID.No.4是一种人工序列，它是用于DNA扩增的具有多克隆位点和3C-蛋白酶切割位点的引物；SEQ.ID.No.5是一种人工序列，它是由SEQ.ID.No.4编码的肽；SEQ.ID.No.6是一种人工序列，它是用于DNA扩增的、具有多克隆位点和3C-蛋白酶切割位点的引物；SEQ.ID.No.7是一种人工序列，它是用于DNA扩增的、具有多克隆位点和3C-蛋白酶切割位点的引物。
SEQ.ID.No.8是一种人工序列，它是由SEQ ID No.7编码的肽；SEQ.ID.No.9是一种人工序列，它是用于DNA扩增的、具有多克隆位点和3C-蛋白酶切割位点的引物；SEQ.ID.No.10是一种人工序列，它是由SEQ.ID.No.9编码的肽；SEQ.ID.No.11是一种人工序列，它是用于DNA扩增的、具有多克隆位点和3C-蛋白酶切割位点的SstII有义引物；SEQ.ID.No.12是一种人工序列，它是用于DNA扩增的、具有多克隆位点和3C-蛋白酶切割位点的EagI反义引物；SEQ.ID.No.13是一种人工序列，它是一种cDNA合成引物；SEQ.ID.No.14是一种人工序列，它是用于DNA扩增的、具有多克隆位点和3C-蛋白酶切割位点的有义引物；SEQ.ID.No.15是一种人工序列，它是用于DNA扩增的、覆盖萨宾I型脊髓灰质炎病毒第797-814位核苷酸的反义引物；SEQ.ID.No.16是一种人工序列，它是用于PCR扩增的SstII有义引物裂解物SEQ.ID.No.17是一种人工序列，它是用于DNA扩增的EagI反义引物；SEQ.ID.No.18是一种人工序列，它是用于DNA扩增的有义引物；SEQ.ID.No.19是一种人工序列，它是用于DNA扩增的反义引物；SEQ.ID.No.20是具有多克隆位点和3C-蛋白酶切割位点的一种人工序列。实施例通过各实施例详尽地描述本发明，但不应理解这些实施例会限制本发明范围。实施例1重组体质粒pTZ-PCV-3m的构建质粒pVS(1)IC-(O)T(脊髓灰质炎病毒萨宾I型cDNA质粒；得自东京大学Dr.Nomoto)经限制性酶EcoRI消化，分离cDNA。将该cDNA克隆至质粒pTZ-18/R(Pharmacia)中而构建质粒pTZ-PVS(1)。
质粒pTZ-PVS(1)经限制酶PstI消化以减小cDNA部分的大小，使其自连接产生具有脊髓灰质炎病毒cDNA核苷酸序列1-1813的质粒亚克隆pTZ-PVS(1)/5。
将质粒pTZ-PVS(1)/5转化至E.coli CJ236(dut-，ung-，Cmr)在补加了0.25μg/ml尿嘧啶核苷的LB-amp氯霉素培养基(LB，40μg/ml氨苄青霉素，30μg/ml氯霉素)中培养转化体。当培养物的OD600nm达到约0.5-0.6时，细胞被多于10moi/细菌的M13K07辅助噬菌体(Pharmacia)超感染，然后在添加有卡那霉素，胸腺嘧啶核苷和尿嘧啶核苷的LB-amp氯霉素培养基中继续培养约8个小时以获得掺入了尿嘧啶的单链噬菌粒。
噬菌粒经PEG/NaCl(重蒸水中的20％PEG和2.5M NaCl)沉淀并经酚/三氯甲烷抽提，获得SS-DNA。
将1μgSSDNA和5pmole具有SEQ.ID.No.2序列的诱变引物加入10μl缓冲液(20mM Tris-HCl，pH7.4中的2mM MgCl2，50mM NaCl)，在70℃水浴中保温10分钟，随后逐步冷却至30℃而进行退火。
再加入1μl 10X合成缓冲液(每种dNTP各5mM，10mM rATP，100mM Tris-HClpH7.4，50mM MgCl2，20mM DTT)，3个单位T4DNA连接酶(Bio-Rad)和1个单位T4 DNA聚合酶(Bio-Rad)，使其依次在冰上反应5分钟，在25℃反应5分钟，然后在37℃90分钟。
将合成的dsDNA转化至E.coli MV1190(dut+，ung+，Cmr)，通过用SstII，HpaI和EagI这些酶进行消化而筛选出具有SstII，HpaI和EagI限制位点的那些转化体。将通过应用PstI消化质粒pTZ-PVS(1)获得的cDNA片段(覆盖核苷酸1814-7440)连接至加工过的质粒pTZ-PVS(5)的相应PstI位点而产生重组体质粒pTZ-PVS-3m。重组体载体pTZ-PVS-3m在脊髓灰质炎病毒萨宾I型cDNA长多蛋白第1和第2氨基酸之间接点处具有3C-蛋白酶切割位点(AXFQ/G)(Dougherty & Semler，微生物学回顾，57，781-822，1993)和多克隆位点(SstII-HpaI-EagI)。新插入的区域具有SEQ.ID.No.3的氨基酸序列。比较实施例1重组体载体pTZ-PVS-m的构建除使用具有SEQ.ID.No.4序列的不同诱变引物外，按实施例1的相同步骤构建了重组体质粒pTZ-PVS-m。
重组体载体pTZ-PVS-m在脊髓灰质炎病毒萨宾I型cDNAN-末端第3和第4氨基酸接点处具有3C-蛋白酶切割位点和多克隆位点(SstII-HpaI-EagI)。新插入的区域具有SEQ.ID.No.5的氨基酸序列。这个载体被设计为具有以GG…开始的病毒多蛋白N端，期望在3c蛋白酶介导的加工中能保持肉豆蔻酰化位点。比较实施例2重组体载体pTZ-PVS-2m的构建除使用具有SEC.ID.No.6序列的不同诱变引物外，按实施例1的相同步骤构建了重组体载体pTZ-PVS-2m。
重组体载体pTZ-PVS-2m与比较实施例1中的pTZ-PVS-m相似，只是前者在3c蛋白酶介导的加工中在病毒多蛋白N末端仅具1个鸟嘌呤而不是2个。比较实施例3重组体质粒pTZ-PVS-2m/l的构建按实施例1的相同步骤构建重组体质粒pTZ-PVS-2m/1，只是其中有两点不同，即比较实施例2的重组体质粒pTZ-PVS-2m被用作诱变模板，使用具有SEQ.ID.No.7序列的不同诱变引物。
通过应用A/T替换某些G/C部分，将重组体质粒pTZ-PVS-2m/l设计为其多克隆位点具有比比较实施例1的质粒pTZ-PVS-m或比较实施例2的质粒pTZ-PVS-2m更低的G/C含量。同时，多克隆位点变为SstII-HpaI-XhoI，新插入区域具有SEQ.ID.No.8的氨基酸序列。比较例4 重组体载体pTZ-PVS-4m的构建除使用不同的诱变模板和具有SEQ.ID.No.9序列的不同诱变引物外，按实施例1中的相同步骤构建重组体载体pTZ-PVS-4m。
重组体载体pTZ-PVS-4m在萨宾I型脊髓灰质炎病毒cDNA长多蛋白VP3和VP4之间的接点处具有3C-蛋白酶切割位点和多克隆位点(ApaI-HpaI-XhoI)。新插入的外源区域具有SEQ.ID.No.10的氨基酸序列。实施例2由重组体脊髓灰质炎病毒质粒合成的RNA转录物的感染性如前所述(Bae等，核酸研究，21，2703，1993)，实施例1和比较例1-4的质粒经SalI消化而线性化后，进行体外转录以合成RNA转录物。
将RNA转录物(0.1μg)通过DEAE-Dextran方法根据Vender’s方案(Stratagene Kit)转染至单层HeLa细胞中，该细胞生长在添加了10％FCS(胎牛血清)的DMEM培养基(GIBCO/BRL)中。将转染细胞在甲基纤维素-DMEM(添加了10％FCS的DMEM中加1.2％甲基纤维素而制得)中于37℃CO2培养箱中培养2天。为观察噬斑，细胞经0.1％结晶紫染色。表1中所示的噬斑数目表示每种RNA转录物的转染能力。图3显示由重组体质粒合成的每种RNA转录物转染产生的噬斑图象。
表1
表1显示质粒pTZ-PVS-3m的RNA转录物在除野生型株系外的所有重组体质粒中，具有最强的转染能力。于1997年8月6日将重组体质粒pTZ-PVS-3m保藏于韩国典型培养物保藏中心，登记号为KCTC-0365BP。实施例3嵌合脊髓灰质炎病毒质粒pTZ-PVS-3m/p24的构建和嵌合脊髓灰质炎病毒PVS-3m/p24的生产利用2个p24特异性PCR引物基于Terwilliger等，(美国国家科学院院报，86，3857，1989)出版的有关序列信息的SstII-p24有义引物(SEQ.ID.No.11)和EagI-p24反义引物(SEQ.ID.No.12)，通过PCR从HIV-1cDNA(HXB2，来自NIH爱滋病研究和参考试剂计划，USA)扩增覆盖HIV-1p24 N末端169个氨基酸残基的cDNA片段。如图4所示，从琼脂糖凝胶中提取PCR片段，经SstII和EagI消化，然后引入至实施例1中质粒pTZ-PVS-3m的相应位点，构建成重组体质粒pTZ-PVS-3m/p24。
如实施例2所述，将从重组体质粒pTZ-PVS-3m/p24合成的RNA转录物转染至单层HeLa细胞中。转染的HeLa细胞在37℃CO2培养箱中进一步培养直至单层细胞上出现完全细胞病变效应(CPE)。收获培养物上清液作为嵌合脊髓灰质炎病毒PVS-3m/p24的来源。实施例4嵌合脊髓灰质炎病毒PVS-3m/p24的一步生长曲线为了评价表达HIV-1p24蛋白的嵌合脊髓灰质炎病毒的复制能力，通过在每个时间点测定培养物上清液中的病毒滴度而确定一步生长曲线。
在室温将野生型萨宾I型脊髓灰质炎病毒(PVS)或PVS-3m，PVS-4m，PVS-3m/p24或PVS-4m/p24的重组体或嵌合脊髓灰质炎病毒以10moi接种在60mm平板中的HeLa细胞内(4.8×105个细胞)一小时以使病毒能吸附在细胞上。细胞经PBS洗涤，然后换入3mlDMEM，继续在37℃CO2培养箱中培养。感染后，每3小时取培养物上清液，通过噬斑测定法或《病毒学-一种实用方法》(13页，主编BWJ Mahy，IRL出版，1985)中描述的TCID50法对每份样品作病毒滴度测定。结果显示在图5中。
如图5所示，重组体脊髓灰质炎病毒PVS-3m最多比野生型萨宾I型(PVS)的复制能力低1个对数，而嵌合脊髓灰质炎病毒PVS-3m/p24显示出与重组体嵌合脊髓灰质炎病毒PVS-3m类似的复制能力。然而，重组体嵌合脊髓灰质炎病毒PVS-4m显示比野生型萨宾I型(PVS)的复制能力低2个对数以上，整合了p24的质粒pTZ-PVS-4m/p24不太可能产生具有复制能力的嵌合脊髓灰质炎病毒PVS-4m/p24。实施例5嵌合脊髓灰质炎病毒PVS-3m/p24复制期间外源性p24蛋白的表达模式为了确定嵌合脊髓灰质炎病毒PVS-3m/p24在复制期间能否表达HIV-1p24蛋白，将嵌合脊髓灰质炎病毒PVS-3m/p24以10moi浓度接种于HeLa细胞中。6小时后收获细胞，用PBS洗涤2次，将细胞重悬于裂解缓冲液(80mM NaCl，5mM MgCl2，10mM Tris-ClpH7.4，1mM DTT，0.5％NP-40)中，将其置于冰上5分钟，然后离心以除去细胞核和细胞碎片。将上清液和等体积的2X样品缓冲液(50mMTrispH6.8，1％β-巯基乙醇，10％甘油，0.03％溴酚兰)混合，煮沸3分钟，然后在10％SDS-PAGE上分离。将分离的样品用半干印迹转移器(Bio-Rad)转移至硝酸纤维素膜(Millipore)上，然后用爱滋病病人的血清筛查。结果显示在图6中。
在Western印迹实验中，在比野生型p24(24KDa)条带更低的条带处(18.4KDa)检测到重组体p24蛋白(169aa)，这意味着重组体p24是由于嵌合脊髓灰质炎病毒感染而产生的，而不是由于野生型p24的污染所致。因此，图6中所示结果清楚说明本发明的嵌合脊髓灰质炎病毒PVS-3m/p24能有效地表达整合的HIV-1p24蛋白。实施例6嵌合脊髓灰质炎病毒表达的外源性疫苗蛋白抗原性的保留为了确定由实施例4中嵌合脊髓灰质炎病毒PVS-3m/p24产生的HIV-1p24蛋白能否保留野生型p24的抗原性，应用抗p24的抗体进行放射免疫沉淀试验。
将嵌合脊髓灰质炎病毒PVS-3m/p24以10moi接种于HeLa细胞中。感染5小时后，将细胞转移到不含甲硫氨酸/半胱氨酸的新鲜DMEM(GIBCO/BRL)中。饥饿1小时后，将同位素标记的甲硫氨酸/半胱氨酸[(L-35S)-Met/Cys，比活性＞1000Ci/mmole；Amersham]加入至培养基中至终浓度为50μCi/mmole，然后继续培养2小时。通过胰蛋白酶消化收获细胞，经PBS洗涤2次，后用500μl放射免疫沉淀试验(RIPA)缓冲液(150mM NaCl，1％NP-40，0.5％DOC，0.1％SDS，50mM Tris-HCl，pH8.0)在冰上裂解细胞10分钟。离心除去细胞核和细胞碎片后，向上清液中加入3μl兔抗p24抗血清，混合物在4℃反应12小时。将于PBS中的80μl10％蛋白A-琼脂糖加入至反应混合物中，使其在室温下与抗体反应1小时，随后离心回收琼脂糖珠。抗原珠复合物用RIPA缓冲液洗涤3次，重悬于50μl 1X样品缓冲液中，煮沸3分钟，在10％SDS-PAGE上分离，然后通过放射自显影确定已感染细胞裂解产物中有抗体反应性的抗原。结果显示在图7中。
图7中的结果清楚表明本发明的嵌合脊髓灰质炎病毒PVS-3m/p24产生的HIV-1p24蛋白具有与野生型HIV-1p24类似的抗原性。实施例7嵌合脊髓灰质炎病毒PVS-3m/p24的遗传稳定性为了评价实施例4中嵌合脊髓灰质炎病毒PVS-3m/p24的遗传稳定性，将PVS-3m/p24的嵌合子代病毒在HeLa细胞内连续传代，应用对每代病毒中提取的病毒RNA进行RT-PCR确定克隆基因的完整性。病毒颗粒经添加PEG/NaCl至终浓度分别为5％/0.125M而加以沉淀。放置室温下30分钟，通过离心10分钟而沉淀混合物。经酚-三氯甲烷抽提和乙醇沉淀获得病毒RNA。
将提取的RNA(10μg)与cDNA合成引物(SEQ.ID.No.13)(1μg)混合。混合物在70℃变性10分钟。将混合物迅速移至冰上，然后加入逆转录酶反应液(50mM Tris-HClpH8.3，65mM KCl，3mM MgCl2，10mM DTT，1mM dNTP混合物，20单位RNAsin)和200单位MMLV(Moloney Murine Leukemia病毒；GIBCO/BRL)逆转录酶，再在42℃反应60分钟。将反应混合物在100℃保温3分钟使酶失活。
利用萨宾I型有义引物(SEQ.ID.No.14)和萨宾I型反义引物(SEQ.ID.No.15)进行RT-PCR以扩增含有已克隆的外源性基因的加工区域。使用Taq聚合酶(Bionear，韩国)，完成RT-PCR 25个循环，每一循环为94℃1分钟，45℃30秒，72℃45秒。结果示于图8。
图8中，666bp处显示的条带是由已克隆的p24基因(504bp，169aa)及克隆位点周围的部分脊髓灰质炎病毒基因组组成。而，270bp处的条带提示，在转染的诸步骤及重组嵌合病毒传代期间，克隆的p24基因中存在某些内部缺失。然而，如图8所示，666bp处条带亮度并不随传代的进行而减弱，这有力地提示，本发明的嵌合脊髓灰质炎病毒PVS-3m/p24携带克隆的外源性基因在12代后仍很稳定。嵌合病毒的遗传稳定性亦被对传代期间嵌合病毒表达p24的模式的分析所证实。
在嵌合病毒传代期间可以观察到HIV-1p24的表达模式。每代嵌合子代病毒均以10moi浓度接种于HeLa细胞中。感染8小时后收获细胞，对裂解产物进行SDS-PAGE电泳，随后与兔抗p24抗血清进行Western印迹杂交。结果显示在图9中。
图9中的结果证实了脊髓灰质炎病毒PVS-3m/p24传代12代以上时仍稳定不变地表达克隆的p24蛋白，表明在传代期间整合的外源基因被有效保留。
这些实验结果证实由将HIV-1p24基因(169aa)引入重组体载体pTZ-PVS-3m的多克隆位点获得的本发明嵌合脊髓灰质炎病毒PVS-3m/p24能有效表达克隆的p24蛋白，该蛋白质具有与野生型HIV-1p24蛋白类似的抗原性。此外，嵌合脊髓灰质炎病毒PVS-3m/p24保留了克隆的p24基因的序列，并在12代后仍保持良好的p24蛋白表达水平，表明嵌合脊髓灰质炎病毒PVS-3m/p24遗传学足够稳定，可以用作为克隆。
考虑到被用作本发明起始载体的脊髓灰质炎病毒萨宾I型株系至今从未见有关引起人任何负作用的报道，Walker和他的同事们(科学，280，825，1998；Rosenberg等，科学，278，1447，1997)建议本发明的嵌合脊髓灰质炎病毒PVS-3m/p24十分有希望成为一种强有力的抗爱滋病CTL诱导型粘膜疫苗候选者。
为了本发明，评价了重组体质粒pTZ-PVS-3m作为表达HIV-1包膜糖蛋白gp120，特别是V3区域的一种有用疫苗载体的可能性。这样，将编码覆盖HIV-1gp120 V3环区125个氨基酸残基的基因引入重组体质粒pTZ-PVS-3m的多克隆位点，随后产生嵌合脊髓灰质炎病毒PVS-3m/env。评价克隆的外源性env基因的表达和嵌合脊髓灰质炎病毒PVS-3m/env的遗传稳定性。实施例8重组体脊髓灰质炎病毒质粒pTZ-PVS-3m/env的构建和嵌合脊髓灰质炎病毒PVS-3m/env的生产如图10中所述，应用PCR扩增编码包括HIV-1gp120的V3环区在内的125个氨基酸残基(env蛋白第251-375位氨基酸序列)的cDNA片段(375bp)，并将其引入重组体载体pTZ-PVS-3m的多克隆位点。
利用分别在5’端和3’端具有限制酶SstII和EagI识别位点的两种引物SstII-env有义引物(SEQ.ID.No.15)和EagI-env反义引物(SEQ.ID.No.16)，通过PCR从HXB2(从NIH爱滋病研究及参考试剂计划，US获得)扩增env(125aa)基因的预定区域。
PCR产物经SstII和EagI消化，将375bp的基因片段引入实施例1的载体pTZ-PVS-3m中相应的SstII和EagI位点，产生重组体质粒pTZ-PVS-3m/env(图10)。
按实施例2中的步骤，对质粒pTZ-PVS-3m/p24进行体外转录，将RNA转录物转染至60mm培养平板上的单层HeLa细胞中。在补加了10％FCS的DMEM培养基中，于37℃CO2培养箱中培养已转染的HeLa细胞2天。当观察到完全CPE时，收集培养物上清液作为嵌合脊髓灰质炎病毒PVS-3m/env的来源。实施例9嵌合脊髓灰质炎病毒PVS-3m/env的一步生长曲线为了评价表达HIV-1env蛋白的嵌合脊髓灰质炎病毒的复制能力，按实施例4中描述的步骤测定每一时间点的培养物上清液中的病毒滴度，确定了一步生长曲线。试验重复4次，其平均值示于表2中。
表2
如表2所示，嵌合脊髓灰质炎病毒PVS-3m/env的复制能力最多比野生型萨宾I型(PVS)低1个对数，但与PVS-3m的复制能力类似。实施例10嵌合脊髓灰质炎病毒PVS-3m/env复制期间外源性env蛋白的表达模式确定嵌合脊髓灰质炎病毒PVS-3m/env在其生长期间是否表达克隆的env蛋白。将嵌合脊髓灰质炎病毒PVS-3m/env以10moi浓度接种于HeLa细胞中。感染8小时后收获已感染细胞，对其进行10％SDS-PAGE电泳。然后，用爱滋病病人血清进行Western印迹杂交，结果示于图11中。图11中显示的结果证实了本发明嵌合脊髓灰质炎病毒PVS-3m/env能有效地表达HIV-1env蛋白(125aa，15KDa)。实施例11嵌合脊髓灰质炎病毒PVS-3m/env的遗传稳定性为了评价实施例8的嵌合脊髓灰质炎病毒PVS-3m/env的遗传稳定性，将PVS-3m/env的嵌合子代病毒在HeLa细胞中连续传代，按实施例7中描述的相同步骤进行RT-PCR而确定克隆基因(375bp)的完整性。结果示于图11中。图11中显示的结果说明本发明的嵌合脊髓灰质炎病毒PVS-3m/env在传至第12代以上时仍稳定地携带外源性基因。
此外，嵌合脊髓灰质炎病毒的遗传稳定性同样通过对传代期间嵌合病毒env表达模式的分析所证实。
除使用爱滋病病人血清进行Western印迹杂交外，嵌合病毒按实施例7中描述的相同步骤确定传代期间HIV-1env蛋白的表达模式。结果显示于图12中。图12中结果证实了嵌合脊髓灰质炎病毒PVS-3m/env在传代12代以上时仍不变地表达克隆的env蛋白(125aa)，表明该已克隆的外源性基因在传代期间有效地保留着。
这些试验结果证明，通过将HIV-1env基因(125aa)引入重组体载体pTZ-PVS-3m的多克隆位点得到的本发明嵌合脊髓灰质炎病毒PVS-3m/env能有效地表达克隆的env基因。此外，嵌合脊髓灰质炎病毒PVS-3m/env在12代以上时仍保存了克隆的env基因的完整序列，并仍保持良好的env蛋白表达水平，显示嵌合脊髓灰质炎病毒PVS-3m/env在遗传学上足够稳定，可用作疫苗候选者的克隆。
考虑到用作本发明起始载体的脊髓灰质炎病毒萨宾I型株系到目前为止未见有对人类任何负作用的报道，本发明的嵌合脊髓灰质炎病毒PVS-3m/env很有希望可用作抗爱滋病的强有力的口服粘膜疫苗。
如上所示，本发明的重组体载体pTZ-PVS-3m具有多克隆位点和3C-蛋白酶切割位点，使之易于将各种外源性疫苗基因引入重组体萨宾I型脊髓灰质炎病毒中，同时汲取了萨宾I型脊髓灰质炎病毒的优点，因而有利于产生遗传稳定的、可用作抗一些传染性病毒疾病的口服疫苗的嵌合脊髓灰质炎病毒。
为了本发明，为评价重组体载体pTZ-PVS-3m作为疫苗载体用于爱滋病以外的其他传染性病毒疾病的可能性，将丙型肝炎病毒的核心蛋白编码基因(HCVc)克隆至重组体载体pTZ-PVS-3m中。如此，将编码N末端100个氨基酸残基的核心基因一部分引入重组体载体pTZ-PVS-3m的多克隆位点，随后产生嵌合脊髓灰质炎病毒PVS-3m/HCVc。评价克隆的外源性HCVc基因的表达和嵌合脊髓灰质炎病毒PVS-3m/HCVc的遗传稳定性。实施例12嵌合脊髓灰质炎病毒pTZ-PVS-3m/HCVc的构建和嵌合脊髓灰质炎病毒PVS-3m/HCVc的生产通过PCR扩增编码N末端核心100个氨基酸残基的HCVc基因，如图13中所述将扩增产物引入重组体脊髓灰质炎病毒质粒pTZ-PVS-3m中。
利用两种引物SstII-HCVc有义引物(SEQ.ID.No.17)和EagI-HCVc反义引物(SEQ.ID.No.18)，通过PCR从pcDNA/Neo-HCV核心质粒模板(承蒙Sung博士赠与，韩国，Postech)扩增HCV核心基因(300bp，100aa)的设定区域。
PCR产物用SstII和EagI消化，将300bp的基因片段引入实施例1的质粒pTZ-PVS-3m中相应的SstII和EagI位点以生产重组质粒pTZ-PVS-3m/HCVc(图13)。
按实施例2中的步骤，对质粒pTZ-PVS-3m/HCVc进行体外转录，将RNA转录物转染至60mm培养平板中的单层HeLa细胞内。将已转染的HeLa细胞培养在补加了10％FCS的DMEM培养基中于37℃CO2培养箱内培养2天。当观察到完全CPE时，收集培养物上清液，用作嵌合脊髓灰质炎病毒PVS-3m/HCVc的来源。实施例13嵌合脊髓灰质炎病毒PVS-3m/HCVc的一步生长曲线为了评价表达HCV核心蛋白的嵌合脊髓灰质炎病毒的复制能力，按实施例4中描述的步骤，测定每一时间点的培养物上清液的病毒滴度，从而确定一步生长曲线。结果示于表3和图14中。表3中的数值为4次重复试验的平均值表3
<p>如表3和图14所示，嵌合脊髓灰质炎病毒PVS-3m/HCVc在感染12小时后显示出比野生型(PVS)的复制能力最多低10倍。嵌合脊髓灰质炎病毒PVS-3m/HCVc的平均复制能力比野生型萨宾I型低约5倍，比重组脊髓灰质炎病毒PVS-3m低3倍。实施例14嵌合脊髓灰质炎病毒PVS-3m/HCVc的RNA合成实验按以前的报道(Mattion等，病毒学杂志，68，3925，1994)完成。对生长在24孔平板上的HeLa细胞用10moi浓度的野生型和嵌合脊髓灰质炎病毒PVS-3m/HCVc进行模拟感染或感染。室温下吸附1小时后，细胞经PBS洗涤，在含放线菌素D(5μg/ml，Difco)的DMEM中培养。37℃培养1小时后，添加25μci/ml的[5，6-3H]-尿苷(Amersham；比活性45ci/mmole)。细胞每3小时收获一次，用PBS洗涤3次，然后加0.5ml裂解缓冲液(80mM NaCl，5mM MgCl2，10mMTris-HClpH8.2，1mM DTT，10mM氧钒核糖核酸酶复合物和0.5％NP-40)在冰上裂解5分钟。向裂解产物中加入三氯乙酸至终浓度为20％，并将裂解产物在冰上保温30分钟。样品用玻璃纤维滤膜(Whatsman，GF-C-滤膜)过滤，通过闪烁计数器(Hewlett Packard)确定放射活性，结果示于表4中。
表4
如表4所示，在感染的HeLa细胞中，嵌合脊髓灰质炎病毒PVS-3m/HCVc的RNA合成动力学与野生型(PVS)或重组体脊髓灰质炎病毒PVS-3m类似，只是在感染后6小时的水平有些不同。结果提示，实施例13的嵌合病毒较低的复制能力(约低5倍)不是由于RNA合成降低的缘故，而似乎是由于嵌合病毒在装配步骤中低效率的蛋白加工所致。
总而言之，考虑到这样一个事实，即嵌合脊髓灰质炎病毒PVS-3m/HCVc具有与野生型或重组体病毒类似的RNA合成能力，因此嵌合脊髓灰质炎病毒PVS-3m/p24有所降低的复制能力(比野生型PVS约低5倍)对于利用该嵌合脊髓灰质炎病毒作为口服疫苗可能没有负作用。实施例15嵌合脊髓灰质炎病毒PVS-3m/HCVc复制期间外源性HCVc蛋白的表达模式为了确定嵌合脊髓灰质炎病毒PVS-3m/HCVc在其生长期间是否表达HCV核心蛋白，将嵌合脊髓灰质炎病毒PVS-3m/HCVc以10moi接种于单层HeLa细胞中1小时，除去未被吸收的病毒。受感染细胞在37℃CO2培养箱中进一步培养。感染8小时后收获细胞，并对其进行10％SDS-PAGE电泳。利用兔抗血清(蒙Hwang博士赠与，Hallim大学，韩国)或抗HCV核心蛋白的单克隆抗体(Cio-penesis，Sandown，NH，USA)进行Western印迹杂交，结果显示在图15中。图15中的Western印迹信号(泳道3)说明本发明的嵌合脊髓灰质炎病毒PVS-3m/HCVc有效地表达了克隆的HCV核心蛋白(100aa，12KDa)。
图15中，有数条带而非仅有期望的12KDa处的条带，推测这是由于HCV核心蛋白在其N末端通过疏水性残基而与疏水性细胞器融合之故。为证实这一假设，使用同一抗血清通过Western印迹杂交对重组体病毒沉淀(泳道4)，无病毒的培养物上清液浓缩物(泳道5)，或感染了嵌合脊髓灰质炎病毒PVS-3m/HCVc的HeLa细胞的细胞裂解产物的沉淀(泳道6)或细胞裂解产物的上清液(泳道7)进行分析。细胞裂解物的沉淀(泳道6)和上清液(泳道7)是通过用1％NP-40处理受感染细胞而获得的。如图15中所示，在用特异性抗血清筛查时，仅有受感染HeLa细胞的裂解物的沉淀(泳道6)和上清液(泳道7)显示出抗原条带的信号，提示这些信号并不是由于抗血清的非特异性反应。此外，沉淀部分(泳道6)在12KDa处显示一条更清晰，更集中的条带，这一事实使得这个假设更为可信。这些结果和以前的报道部分相符，即HCV的组装是在内质网腔内而不是在细胞质中进行的，并形成膜结合性小泡(Dubission等，1994)。假如HCV核心蛋白-细胞器复合物不影响重组体病毒复制的话，这一复合物将可更为有效地引起抗HCV的CTL免疫与体液免疫。实施例16嵌合脊髓灰质炎病毒PVS-3m/HCVc的遗传稳定性为了评价实施例12的嵌合脊髓灰质炎病毒PVS-3m/HCVc的遗传稳定性，对PVS-3m/HCVc的子代病毒在HeLa细胞内连续传代，按实施例7中描述的同一方法通过RT-PCR确定克隆基因(300bp)的完整性。
结果示于图16中，其中无论哪一代的每一份样品在459bp处均出现1条明显的强带。在传代过程中未检测到由于内部缺失(如PVS-3m/p24中所示)或插入而产生的其它条带。
因此，图16中的结果说明本发明的嵌合脊髓灰质炎病毒PVS-3m/HCV在12代以后仍非常稳定地携带该外源性基因。
此外，通过对传代期间嵌合病毒HCVc表达模式进行分析也证实了该嵌合脊髓灰质炎病毒的遗传稳定性。
除在Western印迹杂交中使用抗HCV核心蛋白的单克隆抗体(Bio-penesis，Sandown，NH，USA)外，按照与实施例7中描述的相同步骤确定重组体病毒传代期间HCV核心蛋白的表达模式。结果示于图17中。图17中显示的结果证实了嵌合脊髓灰质炎病毒PVS-3m/HCVc在12代后仍不变地表达HCV核心蛋白(100aa)。
这些实验结果说明通过将HCV核心基因(100aa)引入重组体载体pTZ-PVS-3m的多克隆位点获得的本发明嵌合脊髓灰质炎病毒PVS-3m/HCVc能有效地表达克隆的HCV核心基因。此外，它保留了克隆的HCV核心基因的完整序列，并在12代后仍以很好的水平表达HCV核心蛋白，说明嵌合脊髓灰质炎病毒PVS-3m/HCVc在遗传上足够稳定，可用作HCV疫苗的候选者。
考虑到用作本发明起始载体的嵌合脊髓灰质炎病毒萨宾I型株系至今未见有关对人类引起任何负作用的报道，因此本发明的嵌合脊髓灰质炎病毒PVS-3m/HCVc很有希望能用作抗HCV的强有力的口服粘膜疫苗。
如上所述，本发明的重组体载体pTZ-PVS-3m具有多克隆位点和3C-蛋白酶切割位点，因而使之易于将各种外源性疫苗基因引入重组体萨宾I型脊髓灰质炎病毒中，并容易产生遗传稳定的嵌合脊髓灰质炎病毒，由于汲取了萨宾I型脊髓灰质炎病毒的优点，该嵌合病毒可被用作为抗一些传染性病毒疾病的口服疫苗。
尽管在上文中已详细地描述了本发明诸优选实施方案，但应明确这样一点，即本领域技术人员显而易见的对本发明内容的各种改变和/或修饰均落入由后附权利要求所限定的本发明精神和范围之内。
序列表<110>Altwell Biotech.Inc.<120>脊髓灰质炎病毒具有复制能力的重组体萨宾I型株系<130>PCT-980807<140><141><150>KR 97-37812<151>1997-08-07<160>20<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>7441<212>DNA<213>A脊髓灰质炎病毒1型<300><303>美国国家科学院院报<304>79<305>19<306>5793-5797<307>1982<400>1ttaaaacagc tctggggttg cacccgcccc agaggcccac gtggcggcta gtactccggt 60attgcggtac ccttgtacgc ctgttttata ctcccttccc gtaacttaga cgcacaaaac 120caagttcaat agaagggggt acaaaccagt accaccacga acaagcactt ctgtttcccc 180ggtgatgttg tatagactgc ttgcgtggtt gaaagcgacg gatccgttat ccgcttatgt 240acttcgagaa gcccagtacc acctcggaat cttcgatgcg ttgcgctcag cactcaaccc 300cagagtgtag cttaggctga tgagtctgga catccctcac cggtgacggt ggtctaggct 360gcgttggcgg cctacctatg gctaacgcca tgggacgcta gttgtgaaca aggtgtgaag 420agcctattga gctacataag aatcctccgg cccctgaatg cggctaatcc caacctcggg 480gcaggtggtc acaaaccagt gattggcctg tcgtaacgcg caagtccgtg gcggaaccga 540ctactttggg tgtccgtgtt tccttttatt ttattgtggc tgcttatggt gacaatcaca 600gattgttatc ataaagcgaa ttggattggc catccggtga aagtgagatt cattatctat 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权利要求
1.一种具有复制能力的重组体萨宾I型脊髓灰质炎病毒载体，该载体在脊髓灰质炎病毒萨宾I型株系cDNA N末端第1和第2氨基酸之间接点处含有编码多克隆位点和3C-蛋白酶切割位点的一段序列。
2.按照权利要求1的具有复制能力的重组体萨宾I型脊髓灰质炎病毒载体，其中所说的编码多克隆位点和3C-蛋白酶切割位点的序列是SEQ.ID.No.19。
3.按照权利要求1或2的具有复制能力的重组体萨宾I型脊髓灰质炎病毒，它是载体pTZ-PVS-3m(KCTC-0365BP)。
4.一种包含外源性疫苗基因和具有复制能力的载体的具有复制能力的嵌合萨宾I型脊髓灰质炎病毒载体，其中所说载体是权利要求1的具有复制能力的重组体萨宾I型脊髓灰质炎病毒载体，所说疫苗基因插入片段被引入到多克隆位点。
5.按照权利要求4的具有复制能力的嵌合萨宾I型脊髓灰质炎病毒载体，其中所说的疫苗基因是从传染性病毒获得的。
6.按照权利要求5的具有复制能力的嵌合萨宾I型脊髓灰质炎病毒载体，其中所说的传染性病毒是HIV-1。
7.按照权利要求5的具有复制能力的嵌合嵌合萨宾I型脊髓灰质炎病毒载体，其中所说的传染性病毒是指丙型肝炎病毒。
8.按照权利要求4的具有复制能力的嵌合萨宾I型脊髓灰质炎病毒载体，其中所说的疫苗基因是HIV-1p24基因。
9.按照权利要求4的具有复制能力的嵌合萨宾I型脊髓灰质炎病毒载体，其中所说的疫苗基因是包含HIV-1gp120的V3环的包膜糖蛋白基因。
10.按照权利要求4的具有复制能力的嵌合萨宾I型脊髓灰质炎病毒载体，其中所说的疫苗基因插入片段是HCV核心基因。
11.被权利要求1的具有复制能力的重组体萨宾I型脊髓灰质炎病毒载体转染的一种宿主细胞。
12.权利要求4的具有复制能力的嵌合萨宾I型脊髓灰质炎病毒载体转染的一种宿主细胞。
13.按照权利要求12的宿主细胞，其中所说的疫苗基因来自传染性病毒。
14.按照权利要求13的宿主细胞，其中所说的传染性病毒是HIV-1。
15.按照权利要求14的宿主细胞，其中所说的传染性病毒是指丙型肝炎病毒。
16.按照权利要求15的宿主细胞，其中所说的疫苗基因插入片段是HIV-1p24基因。
17.按照权利要求16的宿主细胞，其中所说的疫苗基因插入片段是包含HIV-1gp120的V3环的包膜糖蛋白基因。
18.按照权利要求12的宿主细胞，其中所说的疫苗基因插入片段是HCV核心基因。
19.一种生产权利要求1的具有复制能力的重组体萨宾I型脊髓灰质炎病毒载体的方法，它包括下述步骤用权利要求1的载体转染宿主细胞以产生受感染细胞；在培养基中培养受感染细胞产生子代病毒，及从培养物上清液中收获子代病毒。
20.一种生产权利要求4的具有复制能力的嵌合萨宾I型脊髓灰质炎病毒载体的方法，它包括下述步骤用权利要求4的载体转染宿主细胞产生受感染细胞；在培养基中培养受感染细胞以产生子代病毒，及从培养物上清液中收获子代病毒。
全文摘要
本发明提供了含有编码多克隆位点和3C－蛋白酶切割位点之序列的具有复制能力的重组体萨宾Ⅰ型脊髓灰质炎病毒载体。该载体使之易于将病毒疫苗基因从传染性病毒中引入萨宾Ⅰ型脊髓灰质炎病毒内，并产生嵌合萨宾Ⅰ型脊髓灰质炎病毒，期望能成为抵抗一些传染性病毒疾病的有效口服粘膜疫苗。
文档编号C12N5/10GK1239512SQ98801323
公开日1999年12月22日 申请日期1998年8月7日 优先权日1997年8月7日
发明者裴容洙, 郑彗兰 申请人:奥尔特威尔生物技术公司