专利名称:一种生产二羧酸的方法
技术领域:
本发明涉及一种生产二羧酸的方法,更特别涉及一种用大肠杆菌菌株生产诸如苹果酸、延胡索酸和琥珀酸的二羧酸的发酵方法。
背景技术:
羧酸及其衍生物作为精细化学物质广泛用于聚合物、食物、药物和化妆品。例如,琥珀酸可用来生产塑料前体如1,4-丁二醇(BDO)、四氢呋喃和γ丁内酯。从琥珀酸衍生获得新产品仍继续在开发中,包括聚酯的开发。聚酯通过连接琥珀酸和BDO来制得。通常,琥珀酸的酯能作为新的“绿色”溶剂来代替更有害的溶剂,作为每年总市场值超过10亿美元的数百万磅化学品的前体。
从可再生原料(在这里是通过发酵方法)生产羧酸(如苹果酸、琥珀酸和延胡索酸)代替了从不可再生资源获得这些酸的耗能更大的方法。琥珀酸是丙酸产生菌厌氧发酵的中间产物,但是这些方法获得的产量和浓度很低。
已经分离出许多生产琥珀酸的生物体,例如应用的瘤胃细菌Bacteroidesruminicola和Bacteroides amylophilus。然而,瘤胃生物在发酵过程中的性质不稳定。另一类生产琥珀酸的生物体是产琥珀酸厌氧螺菌Anaerobiospirillumsucciniciproducerns(A.Succinicproducens)。已经公布了几个专利关于在厌氧发酵过程中用该生物体生产琥珀酸。其中一个专利(Glassner等,美国专利No.5,143,834)描述了在发酵过程中用该生物体天然产生适中量的琥珀酸。然而,采用产琥珀酸厌氧螺菌的发酵过程有许多问题。一个问题是,该生物是一种严格的厌氧菌,它的培育必须在绝对没有氧的环境下进行。在工业发酵中,该生物体的繁殖很困难,并且需要高技术工作人员。产琥珀酸厌氧螺菌甚至在实验室规模的实践中也很难操作,并且容易在不利的条件下退化。其退化不可逆。该生物体从没有用于工业发酵过程。换句话说,该特定生物的生产规模的发酵试验不存在。另外,该生物体需要外部供应二氧化碳来获得高产量的琥珀酸。在发酵过程中,必须将纯二氧化碳气流喷入发酵培养基内。产琥珀酸厌氧螺菌产生了琥珀酸和乙酸的混合物,琥珀酸和乙酸的摩尔比约为2。发酵培养基中高浓度乙酸的存在增加了琥珀酸纯化的成本。乙酸副产物的产生表明,三分之一的昂贵的葡萄糖没有被转变成琥珀酸。另外,已经表明,产琥珀酸厌氧螺菌没有很高的耐渗透能力,因为它不能耐受高浓度的盐,而且它还会被适中浓度的产物抑制。采用产琥珀酸厌氧螺菌的另一个问题是,在制备用于接种的培养基时需要加入色氨酸,并且需要混合四种不同的溶液,其中一种溶液含有具腐蚀性和毒性的H2S。
很早就知道,大肠杆菌发酵产生了酸的混合物,如J.L.Stokes在1949年“大肠杆菌悬浮发酵葡萄糖”(J.Bacteriol.,57147-158)中描述的那样。然而,对于发酵一摩尔葡萄糖,仅仅产生了1.2摩尔甲酸、0.1-0.2摩尔乳酸和0.3-0.4摩尔琥珀酸。因此,通过发酵生产羧酸的努力导致相当大量的生长底物(如葡萄糖)没有被转变成所需的产物。
Fairoz Mat-Jan等在J.Bacteriol,171卷(1989)中描述了对于发酵中与NAD关联的乳酸脱氢酶(ldh)缺陷的大肠杆菌突变株的研究,该突变株已经被分离出,并表明在厌氧条件下没有生长缺陷,除非同时存在丙酮酸甲酸裂解酶(pfl)缺陷。双重突变株(pfl ldh)在厌氧条件下即使是补加了乙酸也不能在葡萄糖或其它糖类中生长,而pfl突变株却能生长。该研究没有讨论也没有调查琥珀酸或二羧酸的产生。
尽管琥珀酸离子是一些厌氧微生物代谢途径中常见的中间体,但是本领域中仍需要有一种发酵方法来经济地大量或高产量生产琥珀酸和其它羧酸(如苹果酸和延胡索酸)。该方法应采用低成本的营养物和底物,发酵速度应实现高的产量,且发酵液中的产物浓度应当较高。
发明目的因此,本发明的一个目的是提供一种改进的、实用的和经济的方法来生产二羧酸,该方法能克服已有技术中存在的缺点和问题。
本发明的另一个目的是提供一种改进的、实用的和经济的方法来大量生产琥珀酸、苹果酸和延胡索酸。
本发明还有一个目的是提供一种采用大肠杆菌突变株来大量生产琥珀酸、苹果酸和延胡索酸的发酵方法。
本发明的另一个目的是提供一种改进的、实用的和经济的方法,该方法采用大肠杆菌突变株来大量生产琥珀酸、苹果酸和延胡索酸,其中发酵在独立容器内进行,从而能精确地控制溶氧、葡萄糖含量、pH和营养物加入速度。
本发明的其它目的可从本文所含描述部分中明显看出。
概述根据本发明的一个方面,前述及其它目的通过一种生产羧酸的方法来实现,该方法包括下列步骤a)将生产羧酸的生物体接种到含碳源的培养基中;b)在有氧气氛下培养生产羧酸的生物体,促进生物体迅速生长,从而增加生物体的生物量;c)有控制地释放氧气以维持有氧气氛条件;d)有控制地将含有碳源的溶液加入生物量已有增加的生物体中,以维持培养基中的碳源浓度约为0.5-1克/升;e)除去有氧气氛中的氧气,形成无氧气氛条件,使生物体进行无氧代谢;f)有控制地在生物量已有增加的生物体中加入含有碳源的溶液,维持培养基中的碳源浓度大于等于1克/升;和g)利用生物体的无氧代谢将碳源转变成羧酸。
根据本发明的另一个方面,其它目的通过一种生产羧酸的方法来实现,该方法包括下列步骤a)将生产羧酸的生物体接种到含碳源的培养基中;b)在维持pH值和有氧气氛的环境下培育该生物体,促进生物体迅速生长,从而增加生物体的生物量;c)有控制地释放氧气以维持有氧气氛的条件;d)有控制地将含有碳源的溶液加入生物体中,以维持培养基中的碳源浓度约为0.5-1克/升;e)将生物量已有增加的生物体转移到无氧气氛下的生产发酵罐中,使生物体进行无氧代谢;f)有控制地在生物体中加入含有碳源的溶液,维持生产发酵罐中的碳源浓度大于等于1克/升;和g)利用生物体的无氧代谢将碳源转变成羧酸。
附图简述为了更好地理解本发明及其其它目的、优点和性能,在阅读下列内容和所附权利要求时应结合附图,其中
图1显示了实施例1所述实验的结果。
图2显示了实施例2所述实验的结果。
图3显示了实施例3所述实验的结果。
图4显示了实施例4所述实验的结果。
图5显示了实施例5所述实验的结果。
图6显示了实施例6所述实验的结果。
图7显示了实施例7所述实验的结果。
发明详述本发明是一种在可控发酵过程中大量生产琥珀酸、延胡索酸和苹果酸的实用、经济的新方法。在本发明的发酵过程中已经用大肠杆菌菌株(Escherichiacoli)(指AFP-111)克服了本领域中存在的问题。
AFP-111是NZN-111大肠杆菌突变株,它是一种兼性生物体。大肠杆菌非常容易操作。现已知道其详细的分子生物学和生理学性质。因此,通过分子生物学或改进过程参数或培养基很容易改进该方法。另外,大肠杆菌已经广泛用于发酵生产生物药物和化学物质。该生物体有许多生产规模的实践。
大肠杆菌也生产琥珀酸和乙酸的混合物,但是在未优化的条件下,琥珀酸和乙酸的摩尔比约为3或更高。该比例可大大提高。发酵液中更低的乙酸浓度将大大减少琥珀酸纯化成本。另外,大肠杆菌不需要外部供应二氧化碳就可大量生产琥珀酸。在不喷入二氧化碳下,生产峰值期间的琥珀酸产量与产琥珀酸厌氧螺菌采用二氧化碳喷入时所得的产量相当。
通常,野生型大肠杆菌在无氧条件下产生了发酵产物的混合物,其中琥珀酸是较少的组分。然而,当AFP111在无氧条件下生长时,主要的代谢产物却是琥珀酸。AFP-111含有独特的自发的染色体突变,它产生了琥珀酸、乙酸和乙醇的混合物,其中琥珀酸是主要产物。用AFP-111,每份重量的葡萄糖最高产量为99%重量的琥珀酸。用AFP-111可大大降低发酵生产琥珀酸的成本。
大肠杆菌发酵过程由两个阶段组成。首先,AFP-111菌株在发酵罐中在低葡萄糖环境和有氧条件下生长至高细胞密度。在本发明中,葡萄糖既作为生物体生长的碳源,又用来生产二羧酸。当达到所需细胞密度时,停止通入空气,使生物体变为无氧代谢,从而产生二羧酸(包括苹果酸、延胡索酸和琥珀酸)作为最终产物。在本发明的一个实例中,该两阶段发酵过程在单个容器中发生。
大肠杆菌中的琥珀酸产生生化途径涉及一系列转变步骤。丙酮酸首先被转变成草酰乙酸,然后变成苹果酸、延胡索酸,最终变成琥珀酸。在这些酸中,苹果酸、延胡索酸和琥珀酸在工业上是很重要的。AFP-111累积琥珀酸作为最终产物。如果延胡索酸是所需的产物,则使编码将延胡索酸转化为琥珀酸的酶的基因缺失,这样,所得生物体将累积延胡索酸而不是琥珀酸。同样,如果苹果酸是所需的产物,则使编码将苹果酸变为延胡索酸的酶的基因缺失,以获得生产苹果酸的生物体。根据分子生物学技术目前的水平和对全部大肠杆菌连锁图谱的了解,特定基因的缺失只是一项简单的工作。分别采用生产苹果酸和延胡索酸的生物体,运用生产琥珀酸的发酵过程可以容易地用于生产苹果酸和延胡索酸。
整个过程是补料分批式。在该过程中,以足够的速度将浓缩的葡萄糖溶液加入发酵罐中以维持参与葡萄糖浓度小于等于1克/升,其中葡萄糖溶液还含有淡玉米浆(light steep water)作为有机氮源、生长因子和无机营养物。需要低葡萄糖浓度来防止形成过多乙酸。在有氧生长阶段期间形成高浓度的乙酸最终会使生物体的生长停止,从而不能获得高的细胞密度。在无氧生产阶段,高的乙酸浓度会降低琥珀酸产生的速度并最终使其完全停止。用AFOP-111可大大减少发酵生产琥珀酸的成本、计算机根据尾气分析或在线葡萄糖分析控制葡萄糖进料速度,很容易在工业发酵罐中维持低的葡萄糖浓度。这已经成为非常普通的工业实践。
厌氧发酵是从燃料(如葡萄糖)获得能量的最古老的途径。在厌氧细胞中,这是唯一的能量产生过程。在大多数兼性细胞中,这是葡萄糖代谢中必须经历的第一阶段,然后通过三羧酸循环来有氧氧化发酵产物。
使用最广泛的一类发酵是糖酵解,其产生丙酮酸作为次末级产物。丙酮酸的处置取决于生物体中的基因。在有乳酸脱氢酶存在时,当丙酮酸被NADH和H+还原成乳酸时,糖酵解终止。在丙酮酸脱羧酶和乙醇脱氢酶存在时形成乙醇。在丙酮酸甲酸裂解酶(pfl)存在时,发酵终止并产生乙酸、乙醇和甲酸,或氢和二氧化碳。
如果细菌基因组中的一个或多个突变除去了生物体中起丙酮酸分解代谢作用的基因,则丙酮酸会累积。在大肠杆菌无氧生长时,这些基因是丙酮酸甲酸裂解酶(pfl)和乳酸脱氢酶(ldh)。研究人员可从Southern Illinois University,Carbondale,Ill.62901获得大肠杆菌菌株NZN111,该菌株中这两个酶的基因均有突变,由于大肠杆菌染色体DNA序列的改变导致pfl和ldh被灭活。因此,NZN111不能在发酵中生长。AFP-111是通过对NZN-111进行附加的基因改变而获得的,它在无氧条件下产生了琥珀酸、乙酸和乙醇的混合物,其中琥珀酸是主要产物。
已经发现,对NZN111作其它改变(无论是通过选择性培育还是通过质粒转化自发产生的),最终都将获得产生琥珀酸作为主要产物的菌株AFP-111。
在系列培养方法中采用选择性环境时,NZN111会自发产生导致AFP-111型特性的染色体突变。在第一个步骤中,在富含培养基(如Luria Bertaini(LB)肉汤(0.5%酵母抽提物,1%胰蛋白胨和1%氯化钠,pH7.5))中有氧条件下增加NZN111生物量。希望产量约在109至1010个细胞/毫升之间。尽管培养时间可以改变,但是在37℃、标准气压下5-7小时的生长时间就可产生上述浓度。
第二步骤是,现在使累积的生物物质处于富含葡萄糖的无氧条件下,仅使能分解丙酮酸的那些细胞(突变株)生长。例如,将细胞涂布在1.5%琼脂板上,该板含有约1-30克/升(g/l)葡萄糖(较佳的还有10g/l葡萄糖)和30微克(μg)/毫升卡那霉素。在NZN111中的乳酸脱氢酶中插入卡那霉素抗性基因。使培养物在有控制的无氧气氛下37℃生长24小时。产生良好结果的一种无氧气氛是二氧化碳和氢的混合物,它由商业上可从Becton-Dickinson,Cockeysville,Maryland以GASPAKTM购得的气氛控制装置来提供。
培养期间产生了许多AFP 111菌落(每107个细胞约2个),其中约有一半能在液体培养基中生长,来产生所需的混合产物。
在质粒转化情况下,当用含编码突变型苹果酸脱氢酶的基因mdh的质粒pMDH13转化NZN111时,丙酮酸的分解代谢继续产生乳酸。连续培育该转化子(NAN111(pMDH13)),获得含有染色体自发突变的AFP111。AFP111产生琥珀酸、乙酸和乙醇的混合发酵产物,与培养基中所用的葡萄糖重量相比,琥珀酸产率高达99%。pMDH13的开发和转化过程与W.E.Boernke等,(1995年9月10日)Archives of Biochemistry and Biophysis 322,No.143-52页中描述的类似,该文纳入本文作参考。
为了对本文所述的菌株进行实验评价,使细胞在无葡萄糖的生长培养基(Luria肉汤)中作有氧培养,直至细胞密度达到0.5-10OD600。
一旦AFP 111到达该合适的生物量时,将细胞注射或转移到密封的发酵反应容器中。使肉汤与葡萄糖或其它一些合适的糖类(例如木糖、半乳糖或阿拉伯糖,糖浓度在约10-30克/升之间)混合。现在,所含混合物所处的气氛发生变化,变为无氧条件。实现该气氛改变的一种方法是利用通气系统将环境空气转换成二氧化碳。
在将混合物加入发酵反应容器中之前,在容器内加入适量的缓冲培养基(例如MgCO3、CaCO3或CaMg(CO3)2)来维持pH近中性。通常用大约为4至8%重量的缓冲培养基提供合适的缓冲能力。当缓冲培养基以固体形式存在时可获得特别佳的结果,因为这可以赋予发酵液缓释的缓冲性能。
上述过程将产生高产量的琥珀酸。例如,获得的琥珀酸与乙酸的重量比为6∶1,得率为99%。当发酵在浓度约为25-100%的氢气中进行时,琥珀酸与乙酸之比会更高。这些结果表明,与已有技术的生物体不同,突变型AFP111采用外源氢气作为还原剂。例如,当luria肉汤、葡萄糖、缓冲剂和氢气与二氧化碳(二氧化碳从缓冲剂中释放出来)的混合物存在时,获得的琥珀酸与乙酸之比达到9。这个结果反映了将葡萄糖分解代谢确定到所需产物的另一个优点,即,没有产生非目的乙酸的副反应。
下表1描述了原始亲代W1485(也从Southern Illinois University获得)、NAN111和AFP111的二羧酸产物的分布情况。
表1产物得率(以摩尔得率表示),即AFP111及其祖先的最初葡萄糖(摩尔百分数)产物原始亲代 直接亲代 突变株W1485 NZN111 AFP111琥珀酸 17 2 109乳酸 24 0 0丙酮酸 1 17 0甲酸 26 0 0乙酸 51 6 49乙醇 80 15 47总产物 193% 41% 206%**摩尔得率的理论值可以是200%,因为一分子葡萄糖可提供两分子所有产物。
当采用100%的二氧化碳气氛时,可促进琥珀酸生产,每升溶液中的琥珀酸浓度达到大约为45克,产量约为每小时每升1.6克,琥珀酸克数与葡萄糖克数的得率百分数达到99%,琥珀酸和乙酸的重量比约为6。
当NZN111中产生大肠杆菌NAD依赖型苹果酸酶(通过导入基因maeA)时,它也产生琥珀酸。在这种情况下,用可诱导的质粒pMEE2-1使苹果酸酶基因在转化体NZN111(pMEE2-1)表达。
将从大肠杆菌MC1061中分离出来的基因组DNA作为PCR法克隆苹果酸酶的模板。用限制性核酸内切酶Hind III和PstI消化大肠杆菌MC1061,所得消化物在1%TAE琼脂糖凝胶上分离。如上所述,用Photo Nucleic Acid DectectionSystem(目录号8192SA)通过Southern印迹分析测定含苹果酸酶基因的基因组DNA片段的大小。
引物是根据基因的公开的部分DNA序列有义CGAAG AACAA GCGGA ACGAG CAT;反义GGCAG CAGGT TCGGC ATCTT GTC;在标准的100微升(μl)PCR反应中,将1微升(μM)引物与约20纳克(ng)基因组DNA混合,该反应产生了预计位0.8千碱基(kb)苹果酸酶的内部片段。用QiaexGel Extraction试剂盒(Qiagen,Inc.,Chatsworth,California)纯化PCR产物,用BioNick Labelling System(GibcoBRL,Gaithersburg,Maryland)生物素化。将生物素化的PCR产物用作Southern印迹分析大肠杆菌基因组DNA中的探针,大肠杆菌基因组DNA已用Hind III和其它一种第二内切核酸酶切割。测得苹果酸酶基因位于含有2.0-2.5kb的由Hind III和Pst I消化的DNA片段的区域内。
用Hind III和Pst I消化1微克大肠杆菌DNA,并在1%的制备性TAE琼脂糖凝胶上分离。用Qiaex Gel Extraction试剂盒分离纯化出位于2.0-2.5kb区域中的大肠杆菌DNA片段。将纯化的DNA片段连接到pUC19的多接头区域中,pUC19已经用Pst I和Hind III断裂并用虾碱性磷酸酶处理。然后用连接物作为模板,用PCR反应来扩增整个苹果酸酶基因。将1微升连接混合物用作模板,并用1μM靶向苹果酸酶基因的有义引物GATGCC CCATGG ATATTC AAAAAA GAGTGAGT,以及0.25μM靶向连接的pUC19 DNA的反义引物TTTT CCCA GTCAGTTG。扩增参数为94℃变性、55℃杂交1分钟和72℃延伸3分钟,总共循环35次。在1%TAE-琼脂糖凝胶上分析PCR产物,用Qiaex Gel Extraction试剂盒分离纯化获得1.8kb片段。用Bcl和Bgl消化一部分PCR产物,以证明产物确实含有苹果酸酶基因。用Pst I和NcoI消化其余的PCR产物,凝胶分离,再次纯化,然后连接到已经用Nco I和Pst I断裂的表达载体pTRC99a(Pharmacia,Piscataway,New Jersey)的多接头区域。通过标准方法用连接混合物转化大肠杆菌菌株NZN111,通过限制性片段分析用Xmn(预计为0.7kb,1.4kb和3.9kb片段)筛选所得菌落(四个菌落来自实验,2个菌落来自对照)的苹果酸酶基因。含有克隆的苹果酸酶基因的质粒命名为pMEE3。
使100毫升NZN(pMEE3)培养物培养过夜生长,用Qiagen质粒试剂盒分离出质粒。将分离出的质粒用作PCR反应的模板。设计新的引物,使其N端为位于第一次克隆苹果酸酶时所用引物下游的81个碱基对。用20纳克质粒作为模板,并用1μM有义引物AGGAT CCAT GGAAC CAAA AACAA AAAAC和反义引物CGCCA GGGT TTTCC CAGTC ACGAC。扩增参数如上所述。再次用Bcl I和Bgl II的限制性图谱鉴定一部分PCR产物,确证产物含有苹果酸酶基因。用Pst I和Nco I消化其余PCR材料,凝胶分离,重新纯化,然后连接到已经用NcoI和Pst I断裂的表达载体pTRC99a(Pharmacia,Inc.Piscataway,N.J.)的多接头区域中。通过标准方法用连接混合物转化大肠杆菌JM 109,通过限制性片段分析筛选所得菌落(三个为实验克隆,一个为对照克隆)中所需的插入物。含有这种苹果酸酶基因的质粒称为pMEE2。
将1.5毫升的pMEE2过夜培养物接种到30毫升含100微克/毫升氨苄青霉素的LB肉汤中。生长2小时后,将30毫升培养物分成3份10毫升的等份。用0、100μM和10μM异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导酶活性。在0、1、2、3、4小时时从各培养物中取出2毫升样品。根据标准方法分离蛋白,如上所述测定活性。
随时间产生的酶如下表2所示表2LB肉汤中由IPTG诱导的苹果酸酶生产时间(小时)没有IPTG100μM IPTG 10μM IPTGμg/分钟/毫克蛋白0 3.09 - -1 4.83 26.5 5.842 4.26 38.2 10.063 8.46 75.3 32.74 9.92 88.2 38.95使两份NZN 111(pMEE2)培养物以及NZN 111(pTRC99a)(作为对照)在2毫升含氨苄青霉素的LB培养基中有氧生长。各培养物的一份用10μM IPTG诱导。3小时后,OD600由0.6增加到4.8。将1毫升培养物注射到密封的含10毫升LB培养基的58毫升小瓶中,确证LB培养基含有20克/升的葡萄糖、1克/升乙酸和0.5克固体碳酸镁。气氛由高于环境压力1个大气压的压力下的空气、氢气和二氧化碳(比例为1∶1∶2)组成。立即取样,并在37℃、100rpm振荡培育时定期取样。下表3提供了当NZN 111用原来的载体(pTRC99a)和pMEE2转化时的产物产量。
表3NZN 111(pMEE2)中对NZN 111(pTRC99a)中的苹果酸酶表达效果产物 载体 maeA克/升琥珀酸0.3 6.5乳酸 0.4 0.4乙酸 0 0乙醇 0 0.2表3所示结果是培育时间约为9至42小时间的结果。
作为琥珀酸前体的苹果酸在原则上是比琥珀酸更佳的最终产物,因为其生产所需还原步骤少一步。苹果酸生产的理论化学计量比为1摩尔葡萄糖和2摩尔二氧化碳变成2摩尔苹果酸。因此,苹果酸的生产可使葡萄糖没有浪费。也可形成延胡索酸,它是还原途径中苹果酸的脱氢产物和琥珀酸的前体。苹果酸和延胡索酸均能在不产生副产物下形成,但是苹果酸的更高的溶解度使得其适用于大规模生产过程。
用能产生苹果酸酶的基因(如maeA)转化合适的细菌可产生多余的苹果酸。通常,理想的细菌缺少乳酸脱氢酶活性和使丙酮酸代谢的其它酶,从而导致丙酮酸的累积。相反,可用maeA转化细菌来直接产生苹果酸。为了维持高水平地产生苹果酸,细菌必须不能将苹果酸变回乳酸或变成延胡索酸或琥珀酸。由于一些乳酸杆菌缺少起这些转变作用的苹果酸乳酸酶(malolactate enzyme)、延胡索酸酶和延胡索酸还原酶,因此这些菌株是发酵生产苹果酸中特别合适的候选者。由于乳酸杆菌具有高度耐渗透性,因此它的适合性进一步得到增强。Lactobacillusgasseri是一种用于这些应用的近期宿主(near term host),因为它已经显示在葡萄糖发酵时不会使苹果酸代谢,并且在基因水平已被很好地鉴定。干酪乳酸杆菌(Lactobacillus casei)也具有相当大的潜力,因为它表现出的耐渗透性比L.gasseri更高。
通常,合适的乳酸杆菌表达载体(如诱导入缺少功能性乳酸脱氢酶的乳酸杆菌宿主中的pTRK327)中的苹果酸酶基因可形成苹果酸。这可通过将苹果酸酶基因插入宿主中乳酸脱氢酶基因来实现。
用于下列实施例来生产羧酸的化学物质包括酵母抽提物和胰蛋白胨(Difco)、葡萄糖(A.E.Staley)、淡玉米浆(A.E.Staley玉米加工厂,在Loudon,Tn.)、无机化学物质(E.Merck Science或J.T.Baker,试剂级)。所用装置包括1升发酵罐(Virtis)、5升发酵罐(New Brunswick,Bioflow 3000)、泵(Cole-Parmer,MasterFlex)、pH探头(Cole-Parmer)、pH控制器(Cole-Parmer,Chem Cadet)、溶氧计(Cole-Parmer,01971-00)、溶氧探头(Ingold)、高压蒸汽灭菌器(Amsco,Eagle3000)、摇床(New Brunswick)、低温管(Cole Parmer)。
葡萄糖分析仪来自Yellow Springs Instrument Company(YSI 2700选型)。另外,用来测定OD的分光光度计来自Milton Roy(SPEC 21D)。
大肠杆菌AFP-111菌株得自Argonne National Laboratory。AFP-111菌株从NZN-111衍生获得。原种培养物这样制得,将1克碳酸镁(MgCO3)放入250毫升摇瓶中,用泡沫塞盖住并在121℃下高压灭菌20分钟。然后,配制含胰蛋白胨10克/升、酵母抽提物5克/升、葡萄糖5克/升、氯化钠(NaCl)10克/升、磷酸氢二钾(K2HPO4)7克/升、磷酸二氢钾(KH2PO4)3克/升的培养基500毫升。再将培养基121℃高压蒸汽灭菌20分钟,使其冷却至室温。将50毫升培养基无菌转移到含碳酸镁的第一摇瓶中。然后从来自Argonne National Laboratory的琼脂斜面用接种环取满环AFP-111接种到摇瓶内。然后将接种好的摇瓶在摇床上250rpm 37℃培育。
然后,配制含胰蛋白胨10克/升、酵母抽提物5克/升、葡萄糖5克/升、氯化钠10克/升、K2HPO47克/升、KH2PO43克/升和硫酸镁(MgSO4)0.2克/升的培养基1升。使培养基在121℃下高压蒸汽灭菌20分钟,并使其冷却。然后,将850毫升无菌转移到1升发酵罐中。
当250毫升摇瓶培养16小时后,将全部培养液无菌转移到1升发酵罐中。发酵罐维持在37℃、pH7.0下。空气从发酵罐底部底部喷入,搅拌速度设定为500rpm或更高,以确保充分向发酵液传递氧气,避免受氧气限制。用pH控制器维持pH为7,该控制器根据需要开启泵以在发酵罐中加入碱溶液。
碱溶液这样制得用搅拌棒将250毫升去离子水加入500毫升量筒中。用两层覆盖纸盖住量筒并于121℃下高压蒸汽灭菌20分钟,然后使其冷却至室温。然后,加入250毫升30%的氢氧化铵(NH4OH)。然后加入油层以防止氨气逃逸。油在加入量筒中之前先经121℃高压蒸汽灭菌20分钟。溶液通过在磁板上搅拌来混合。所得碱溶液为15%氢氧化铵溶液。
为了制得甘油溶液,将15克甘油置于先加入15毫升去离子水的小摇瓶中。在摇瓶中加入小的搅拌棒,然后用泡沫塞盖住烧瓶并在磁板上混合,制得50%甘油溶液。甘油溶液于121℃下高压蒸汽灭菌20分钟,然后将其冷却至室温。
当发酵罐中的葡萄糖浓度约为1克/升时,从发酵罐中无菌地取出30毫升,并加入50%甘油烧瓶中。然后在磁板上搅拌混合物。然后将混合物无菌转移到低温冷冻管(在包装前经生产商灭菌),每管约1.2毫升。将小管密封并保藏在-70℃冷冻箱中。这些小管作为AFP-111原种培养物用于下列实施例。
实施例1从摇瓶中取出接种物。培养基含有胰蛋白胨10克/升、酵母抽提物5克/升、葡萄糖5克/升、氯化钠10克/升、磷酸氢二钾14克/升、磷酸二氢钾6克/升、硫酸铵2克/升和硫酸镁0.2克/升。将50毫升培养基置于250毫升摇瓶中。给摇瓶盖塞,121℃高压蒸汽灭菌20分钟,冷却至室温并用1毫升原种培养物小管接种。然后在200rpm下37℃培育16小时。发酵培养基含有胰蛋白胨10克/升、酵母抽提物5克/升、葡萄糖5克/升、氯化钠10克/升、磷酸氢二钾1.4克/升、磷酸二氢钾0.6克/升、硫酸铵2克/升和硫酸镁0.2克/升。制得1升培养基,121℃高压蒸汽灭菌20分钟,使其冷却至室温,然后将850毫升转移到1升发酵罐内。将摇瓶中的全部物质接种到发酵罐中。(发酵罐培养基含有低于10克/升的低浓度葡萄糖)。发酵在37℃、pH7.0、搅拌下进行。在需要时通过pH控制器的作用加入15%NH4OH溶液,维持pH在7.0。当发酵液中的原始葡萄糖耗尽时,打开进料泵,向发酵罐中加入补料液。
将250克葡萄糖和50克淡玉米浆溶于400毫升去离子水中,制得补料液(溶液1)。使溶液1于121℃高压蒸汽灭菌20分钟,然后冷却至室温。然后制备溶液2,将氯化钠、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、硫酸铵和硫酸镁溶解在1000毫升去离子水中至浓度分别为5克/升、7克/升、3克/升、22.5克/升和1克/升。使该溶液于121℃高压蒸汽灭菌20分钟,然后冷却至室温,并加入溶液1中。所得溶液用作发酵罐补料液。
进料泵的速度由人工控制,以使发酵罐中的葡萄糖残余浓度保持在小于等于1克/升。当葡萄糖浓度升高至高于1克/升时,减少泵速。若葡萄糖浓度太高(约为5克/升或更高),则关闭泵,直至葡萄糖浓度降低至低于1克/升。在前24小时,对发酵罐通气,以提供有氧环境使生物体生长至高细胞密度。在24小时时660nm下测得的光密度(OD660)为24。然后关闭通气,建立无氧环境,迫使生物体进行无氧代谢产生琥珀酸。维持无氧条件直至试验结束。在无氧阶段,葡萄糖浓度维持在大于等于1克/升。
图1显示了实施例1的结果,该结果归纳在下表4中。
表4琥珀酸最终浓度(克/升) 40.5总产量(克琥珀酸/克葡萄糖) 0.54生产阶段的产量(克琥珀酸/克葡萄糖) 0.95总生产率(克/升-小时) 0.21生产阶段的生产率(克/升-小时) 0.2447小时时的琥珀酸浓度(克/升)17.947小时时的生产率(克/升-小时) 0.38琥珀酸与乙酸的最终摩尔比 1.35实施例2本实施例中的实验基本上与实施例1中的方式相同,只是在6小时而不是24小时后关闭空气。在关闭空气时,OD660为6。
图2描绘出本实施例的结果,该结果归纳在下表5中。
表5发酵时间(小时) 24 47琥珀酸浓度(克/升) 16.0 29.20生产率(克/升-小时) 0.67 0.62结果表明,较早地将发酵罐从有氧变为无氧条件可使结果有显著改善。
实施例3本实施例含有的培养基含有下列物质酵母抽提物2克/升、胰蛋白胨15克/升、氯化钠2克/升、硫酸铵2克/升、氯化钙2克/升、硫酸镁0.2克/升、磷酸二氢钾1.3克/升、氯化锰0.01克/升。在5升发酵罐中进行4种发酵。通过在需要时加入5N NaOH,将这些试验中的pH控制在6.2,6.6,7.0和7.4。接种物用调节至pH7.0的相同培养基在摇瓶中培育。在发酵罐中,细胞在有空气通入、搅拌速度为500rpm的有氧条件下生长至OD660为6(约5至6小时)。将搅拌速度降低至250rpm,将喷入的气体改为纯二氧化碳。
图3描绘了实施例3的结果,该结果归纳在表6中。表6是不同pH值下100小时时的发酵结果比较。
表6pH 6.2 6.6 7.0 7.4琥珀酸(克/升)23.335.730.127.5乙酸(克/升) 3.3 5.3 6.3 6.0葡萄糖用量(克) 126 224 193 184发酵液体积(升) 3.6 4.3 4.4 4.5产量(克琥珀酸/克葡萄糖) 0.670.680.690.67琥珀酸∶乙酸摩尔比 3.6 3.4 2.4 2.3结果表明,在大范围pH内(较佳的在约6.6-7.0内)可产生琥珀酸。
实施例4在本实验中,酵母抽提物和胰蛋白胨均被淡玉米浆代替,后者是一种低成本的玉米加工工业的副产物。用50%NaOH调节淡玉米浆的pH至7.0,制得淡玉米浆。通过Whatman 2号滤纸过滤,除去悬浮的固体。该澄清的滤液用于发酵试验。
接种物在摇瓶中培育获得。配制含有下列物质的溶液氯化钠20克/升、磷酸氢二钾28克/升、磷酸二氢钾12克/升、硫酸铵4克/升和硫酸镁0.4克/升。然后将该溶液于121℃高压蒸汽灭菌20分钟。然后,在250毫升摇瓶中加入30毫升淡玉米浆滤液。盖上瓶塞,于121℃高压蒸汽灭菌20分钟,然后使其冷却至室温。然后在瓶内加入30毫升溶液1(来自实施例1)。因此,该培养基含有50%淡玉米浆滤液。将0.1毫升甘油原种培养物(实施例1)接种到烧瓶中,35℃、200rpm下培育16小时。
配制含有下列物质的溶液2氯化钠20克/升、磷酸氢二钾2.8克/升、磷酸二氢钾1.2克/升、硫酸铵4克/升和硫酸镁0.4克/升。然后使该溶液于121℃高压蒸汽灭菌20分钟并冷却至室温。在1升发酵罐中加入425毫升淡玉米浆滤液。使发酵罐在121℃下高压蒸汽灭菌20分钟,并使其冷却至室温。然后,在1升发酵罐中加入425毫升溶液2,导致发酵培养基中含有50淡玉米浆滤液。发酵罐用摇瓶的全部量接种。发酵在37℃、pH7.0下进行。在需要时通过加入1.5M碳酸钠溶液来维持pH为7.0。通过121℃高压蒸汽灭菌来对该溶液灭菌。在发酵罐中通入空气6小时,使细胞最初有氧生长。在此期间监测溶氧。溶氧水平偶尔低于5%饱和度,但是通过连续通入空气,发酵罐内仍为有氧环境。在此期间结束时,关闭空气,通过生物体的无氧代谢开始生产琥珀酸。同时,打开泵,在发酵罐中加入含约500克/升葡萄糖的溶液。人工调节进料泵的速度,使发酵液中葡萄糖浓度大于等于1克/升。
图4显示了实施例4的结果,该结果归纳在表7中。表7显示了琥珀酸在50%淡玉米浆发酵培养基中的累积情况。
表7发酵时间(小时)244899琥珀酸浓度(克/升) 11.9 25.5 51.0生产率(克/升-小时)0.50 0.53 0.52这些结果表明,琥珀酸可在廉价的培养基中产生,培养基中用低成本的淡玉米浆代替了昂贵的酵母抽提物和胰蛋白胨。
实施例5在本实施例中,将摇瓶和发酵培养基中的淡玉米浆浓度降低至25%。其它条件与实施例4描述的完全相同。加入水以弥补采用较少量淡玉米浆引起的体积缺少。
图5描绘了本实施例的结果,该结果归纳在表8中。表8显示琥珀酸在25%淡玉米浆发酵培养基中的累积情况。
表8发酵时间(小时) 24 48 97琥珀酸浓度(克/升)20.9 35.7 46.3生产率(克/升-小时) 0.87 0.74 0.48结果表明,琥珀酸甚至可在更经济的培养基中生长,培养基中淡玉米浆减少至25%。
实施例6在本实施例中,摇瓶和发酵培养基中的淡玉米浆浓度为25%,碱为1.5M碳酸铵。其它条件与实施例4所述类似。
图6显示了本实施例的结果,该结果归纳在表9中,其显示了琥珀酸在25%淡玉米浆发酵培养基中用碳酸铵作为pH控制时的累积情况。
表9发酵时间(小时) 2448琥珀酸浓度(克/升) 14.8 24.9生产率(克/升-小时) 0.62 0.52结果表明,在琥珀酸发酵过程中,可用碳酸钠以外的碳酸盐(如碳酸铵、碳酸镁等)来控制pH。
实施例7本实施例中描述了四个试验。在两个试验中,摇瓶和发酵培养基中的淡玉米浆浓度为25%,碱为2M NaOH。在另两个试验中,淡玉米浆浓度为50%,碱为15%NH4OH。在采用相同的用于控制pH的碱的每组的两个试验中,在一个试验中,在通过无氧代谢生产琥珀酸的无氧阶段,在发酵罐中喷入约100毫升/分钟的纯二氧化碳。
图7显示了这些结果,并归纳在表10中。表19显示了在淡玉米浆发酵培养基中用氢氧化铵和氢氧化钠控制pH时的琥珀酸累积情况。
表10碱=NaOH有CO2没有CO2发酵时间(小时) 48 72 48 72琥珀酸浓度(克/升) 17.523.96.0 6.0生产率(克/升-小时) 0.360.330.130.08碱=NH4OH有CO2没有CO2发酵时间(小时) 48 72 48 52琥珀酸浓度(克/升) 22.533.48.7 8.4生产率(克/升-小时) 0.470.460.190.16结果表明,如果用非碳酸盐的碱来控制pH,则在无氧阶段需要在发酵罐中通入二氧化碳气体才能大量生产琥珀酸。
本发明还提供了一种通过发酵来生产苹果酸的方法。作为琥珀酸前体的苹果酸在原则上是比琥珀酸更佳的最终产物,因为其生产所需还原步骤少一步。苹果酸生产的理论化学计量比为1摩尔葡萄糖和2摩尔二氧化碳变成2摩尔苹果酸。因此,苹果酸的生产可使葡萄糖没有浪费。也可形成延胡索酸,它是还原途径中苹果酸的脱氢产物和琥珀酸的前体。苹果酸和延胡索酸均能在不产生副产物下形成,但是苹果酸更高的溶解度使得其适用于大规模生产过程。
本发明也可以是一种连续发酵方法,该方法包括发酵罐和沉降槽。沉积在沉降槽底部的细胞返回发酵罐,以增加细胞浓度,从而增加生产率。已经大限,当混合停止时,细胞能非常好地絮凝和沉降。
琥珀酸也通过由发酵罐和超滤单元组成的连续发酵方法来生产。将超滤单元收集的细胞返回发酵罐以增加细胞浓度,从而增加生产率。通过超滤单元从发酵液中除去片段化产物减少了产物抑制,增加了得率。
琥珀酸还通过一种连续发酵方法来生产,其中连续地将吸附剂加入发酵罐并从中除去。发酵产物从发酵液中的除去减轻了产物的抑制,增加了得率。
琥珀酸还通过一种由两个发酵罐串联组成的分批发酵过程来生产。在第一个发酵罐(生长发酵罐)中,使生物体在有氧条件下生长至高细胞密度。然后将生物物质转移到第二个发酵罐(生产发酵罐)中,施加无氧条件以促进琥珀酸的生产。然后清洗生长发酵罐,并用来生长更多的生物物质来转移到另一个生产发酵罐中。由于生产时间比生长时间长的多,因此一个生长发酵罐可用来为多个生产发酵罐提供生物物质。
尽管已经显示和描述了目前认为是本发明的较佳的实例,但是本领域技术人员显然可在不脱离所附权利要求定义的本发明范围内对其作各种变化和改动。
权利要求
1.一种生产羧酸的方法,该方法包括下列步骤a)将生产羧酸的生物体接种到含碳源的培养基中;b)在有氧气氛下培育所述生物体,以促进所述生物体迅速生长,从而增加所述生物体的所述生物量;c)有控制地释放氧气以维持所述有氧气氛;d)有控制地将含有所述碳源的溶液加入所述生物体中,以维持所述培养基中的所述碳源浓度为0.5-1克/升;e)除去所述有氧气氛中的所述氧气,产生无氧气氛,使所述生物体进行无氧代谢;f)有控制地在所述生物体中加入含所述碳源的所述溶液,维持所述培养基中的所述碳源浓度大于等于1克/升;和g)利用所述生物体的所述无氧代谢将所述碳源转变成羧酸。
2.根据权利要求1所述的方法,其中所述生物体选自大肠杆菌和乳杆菌。
3.根据权利要求1所述的方法,其中所述生物体是耐渗透的,所述生物体因而能产生有机酸而所述生物体的代谢不会受到抑制。
4.根据权利要求2所述的方法,其中所述大肠杆菌是AFP-111。
5.根据权利要求2所述的方法,其中所述生物体是从缺失丙酮酸甲酸裂解酶和乳酸脱氢酶基因的亲代生物体中衍生获得的大肠杆菌菌株。
6.根据权利要求1所述的方法,其中所述生物体用基因工程方法改造成能表达使所述生物体可以将丙酮酸转变成二羧酸的酶。
7.根据权利要求6所述的方法,其中所述酶是苹果酸酶。
8.根据权利要求7所述的方法,其中所述生物体通过所述无氧代谢产生琥珀酸、乙酸和乙醇,其中所述琥珀酸是主要产物。
9.根据权利要求7所述的方法,其中所述生物体通过所述无氧代谢产生苹果酸、乙酸和乙醇,其中所述苹果酸是主要产物。
10.根据权利要求7所述的方法,其中所述生物体通过所述无氧代谢产生延胡索酸、乙酸和乙醇,其中所述延胡索酸是主要产物。
11.一种生产羧酸的方法,该方法包括a)将一定生物量的生产羧酸的生物体接种到含碳源的培养基中;b)在具有维持pH值和有氧气氛的环境下培育所述生物体,以促进所述生物体迅速生长,从而增加所述生物体的所述生物量;c)有控制地释放氧气以维持所述有氧气氛;d)有控制地将含所述碳源的所述溶液加入所述生物体中,以维持所述培养基中的所述碳源浓度为0.5-1克/升;e)将生物量已有增加的所述生物体转移到具有无氧气氛的生产发酵罐中,使所述生物体进行无氧代谢;f)有控制地在生物体中加入含所述碳源的溶液,维持所述生产发酵罐中的所述碳源浓度大于等于1克/升;和g)利用所述生物体的所述无氧代谢将所述碳源转变成羧酸。
12.根据权利要求11所述的方法,其中所述生物体选自大肠杆菌和乳杆菌。
13.根据权利要求11所述的方法,其中所述生物体是耐渗透的,所述生物体因而能产生有机酸而所述生物体的代谢不会受到抑制。
14.根据权利要求12所述的方法,其中所述大肠杆菌是AFP-111。
15.根据权利要求12所述的方法,其中所述生物体是从缺失丙酮酸甲酸裂解酶和乳酸脱氢酶基因的亲代生物体衍生获得的大肠杆菌菌株。
16.根据权利要求11所述的方法,其中所述生物体用基因工程方法改造成能表达使所述生物体将丙酮酸转变成二羧酸的酶。
17.根据权利要求16所述的方法,其中所述酶是苹果酸酶。
18.根据权利要求17所述的方法,其中所述生物体通过所述无氧代谢产生琥珀酸、乙酸和乙醇,其中所述琥珀酸是主要产物。
19.根据权利要求17所述的方法,其中所述生物体通过所述无氧代谢产生苹果酸、乙酸和乙醇,其中所述苹果酸是主要产物。
20.根据权利要求17所述的方法,其中所述生物体通过所述无氧代谢产生延胡索酸、乙酸和乙醇,其中所述延胡索酸是主要产物。
全文摘要
本发明是通过发酵来经济地生产羧酸的方法,该方法包括下列步骤:a)将生产羧酸的生物体接种到含碳源的培养基中;b)在有氧气氛下培养产生羧酸的生物体,以促进生物体迅速生长,从而增加生物体的生物量;c)有控制地释放氧气以维持有氧气氛;d)有控制地将含有碳源的溶液加入生物量已有增加的生物体中,以维持培养基中的碳源浓度约为0.5—1克/升;e)除去有氧气氛中的氧气,产生无氧气氛,使生物体进行无氧代谢;f)有控制地在生物量已有增加的生物体中加入含有碳源的溶液,维持培养基中的碳源浓度大于等于1克/升;和g)利用生物体的无氧代谢将碳源转变成羧酸。
文档编号C12N15/09GK1246155SQ98802169
公开日2000年3月1日 申请日期1998年1月30日 优先权日1997年1月31日
发明者N·P·恩希姆, M·唐纳利, C·S·米勒德, L·斯托尔斯 申请人:洛克系德·马丁能量研究有限公司, 芝加哥大学