专利名称：组织特异性启动子的制作方法
技术领域：
本发明涉及前列腺基因启动子与通用的增强子SV40增强子的联合，从而产生在前列腺细胞中有活性的基本不依赖于雄激素的启动子，这些前列腺细胞在它们的生长和生存中是不依赖于雄激素的。
背景技术：
已经鉴定了在雄性的前列腺中领先表达的许多基因。利用转染技术或在转基因小鼠中表达基因之后已经研究了许多这样的基因的启动子和调节区。大多数鉴定为前列腺特异性的基因是雄激素可诱导的，他们的功能的方面已经详细地研究了。所以，在前列腺特异的抗原(PSA)(Cleutjens，Vaneekelen等人，1996，Riegman，Vliestra等人，1991)，人腺激肽释放酶(KLK2)(Murtha，Tindall等人，1993)，大鼠前列腺类固醇结合蛋白质(PSBP)(Claessens，Rushmere等人，1990；Rushmere，Parker等人，1987)，Probasin(Pb)(Kasper，Rennie等人，1990；Rennie，Bruchovsky等人，1993)，和前列腺酸性磷酸酶基因(Virkkunen，Hedberg等人，1994)，和在大鼠PSBPC3(1)基因的内含子中的调节元件中，和大鼠20千道尔顿雄激素调节蛋白(Ho，Marschke等人，1993)中已经鉴定了雄激素效应元件的诱导表达和/或结合雄激素受体的重要性。
虽然结合PSBP C3基因启动子和第一内含子的区域的组织特异因子已经得到鉴定，但参与赋予表达的区别于雄激素效应性的前列腺特异性的元件还没有很好鉴定(Celis，Claessens等人，1993；Zhang，Parker等人，1990)。具有4kb上游和2kb下游侧接序列的大鼠PSBP C(3)基因在转基因小鼠中组织特异性地并在适当的激素控制下得到表达(Allison，Zhang等人，1989)。利用来自大鼠PSBP C3(1)基因的5kb上游区表达SV40T-抗原可以引发前列腺肿瘤，但表达不是高度受限制的，其它异常状态是常见的(Maroulakou，Anver等人，1994)。利用转基因小鼠的研究已经确定probasin和PSBP C(3)基因的区域可以赋予前列腺特异性。
PSA和probasin调节区在前列腺表达基因中是两个研究最多的。已经确定大鼠probasin基因的上游的430bp区能够赋予报道基因表达的前列腺特异性(Greenberg，Demayo等人，1994；Matusik；WO9403594)；当用于SV40T抗原的靶表达时，前列腺肿瘤特异地发生(Greenberg，Demayo等人，1995)。这一表达不是总是特异的，但特异性明显由包含来自小鸡溶菌酶基因的MAR(基质附着区)而提高(Greenberg，Demayo等人，1994)。430bp启动子区强烈地应答雄激素诱导，并且结合雄激素受体(AR)的雄激素效应元件已经得到鉴定(Claessens，Rushmere等人，1990；Kasper，Rennie等人，1994；Matusik，WO9403594；Rennie，Bruchovsky等人，1993)。在碱基-426和-286之间的负调节区也已经得到鉴定(Rennie，Bruchovsky等人，1993)。
PSA上游区(到-630bp)也作为强雄激素效应性启动子起作用并且也已经鉴定了雄激素效应元件。但是，这一区不足于在转基因小鼠中指导组织特异表达。利用该630bp人PSA启动子区在转基因小鼠中表达和活化的Ha-ras致癌基因导致唾液腺而不是前列腺肿瘤的发育(Schaffner，Barrios等人，1995)。在转录起始位点上游的4到5kb区中最近已经鉴定了增强子区。已经证明PSA增强子可作为雄激素可诱导增强子并且结合PSA启动子展示了明显的细胞类型特异性(Henderson，WO9519434；Schuur，Henderson等人，1996)。同样Pang等人已经报道了从前列腺癌病人分离的等当启动子区与公开序列相比含有7个突变，并且在前列腺癌细胞系LNCaP中是高度活化的(Belldegrun和Pang，WO9614875；Pang，Taneja等人，1995)。
病毒SV40增强子是第一个鉴定的增强子，并且得到广泛的鉴定。不管在基因的上游或下游它具有从各种各样启动子增强表达的特性，并且在两个方向都有功能。SV40增强子已经用于与类固醇效应性启动子的连接的报道数量有限。例如，Israel和Kaufman(Israel和Kaufman1989)报道了构建体中地塞米松诱导的表达(达到17倍)，该构建体将SV40增强子和腺病毒主要晚期启动子与起源于小鼠乳房癌肿瘤病毒LTR启动子/增强子的不同拷贝数的糖皮质激素效应元件结合。Wynshaw-Boris等人(Wynshaw-Boris，Short等人，1986)发现了SV40增强子对大鼠磷酸烯醇丙酮酸羧激酶基因的糖皮质激素诱导的基本转录水平(约6倍)的影响较小。发现大鼠生长激素基因的基因内序列介导的3到5倍糖皮质激素的诱导在存在或不存在SV40增强子时是相当的(Birnbaum和Baxter1986)。在另一种情况下，观察到酪氨酸氨基转移酶基因的糖皮质激素效应区能够赋予SV40增强子/早期启动子2到3倍糖皮质激素诱导(Grange，Roux等人，1989)。这些例子表明当SV40增强子结合类固醇效应性启动子存在时，通常看到了连续的类固醇效应。
本发明人已经将SV40增强子与两个前列腺表达的雄激素诱导的基因probasin和PSA的启动子区结合在各种构建体中。他们已经观察到启动子的诱导的基本水平的实质性增加，对应的雄激素诱导活性水平没有增加。所以，启动子/增强子联合现在基本不是雄激素依赖的，但对于前列腺和非前列腺细胞中的表达保持了它们的特异性方式。所以，probasin/SV40增强子联合显示了实质性的前列腺特异性，而PSA/SV40增强子联合是随意的。
发明概要因此，在本发明的第一方面包括提供编码序列在特异组织中优先表达的遗传构建体，该构建体包括下面的元件(1)来自组织特异性基因的类固醇效应性启动子，(2)编码序列，和(3)SV40增强子，元件排列如下来自组织特异性基因的类固醇效应性启动子在编码序列的上游并且SV40增强子位于编码序列的3’，或者SV40增强子在编码序列的上游并且来自组织特异性基因的类固醇效应性启动子定位于SV40增强子和编码序列之间，或者来自组织特异性基因的类固醇效应性启动子在编码序列的上游并且SV40增强子定位于编码序列的内含子内；其中启动子在构建体中比它的天然状态具有更低的类固醇效应水平。
在本发明的第二个方面包括了含有来自组织特异性基因的类固醇效应性启动子，和SV增强子以及可以插入编码序列的插入位点的遗传盒，所述插入位点邻接并且位于启动子的下游，其中启动子在盒中比天然状态具有的类固醇效应性水平低。
在本发明的这一方面，SV40增强子可以是在组织特异启动子的上游或相反。
在本发明的优选的实施方案中，来自组织特异性基因的启动子是雄激素效应性的，同样优选的是组织特异性基因是前列腺特异的。
在其它优选的实施方案中，组织特异启动子是probasin启动子，特别是如本文所述的Pb430或Pb286。在另一个实施方案中，启动子是PSA启动子，特别是本文所述的PSA630。
在本发明的第三方面，包括含有本发明的第一方面的遗传构建体或本发明的第二方面的遗传盒的载体。
在目前优选的载体是人腺病毒5型或羊腺病毒。
在本发明的另一方面提供了治疗癌，特别是前列腺癌，膀胱癌，和乳房癌的方法，包括利用本发明的构建体进行基因治疗。这些构建体的利用能够在基因治疗中将雄激素切除术治疗与治疗基因的表达结合用于不依赖于雄激素或依赖于雄激素的前列腺癌。
通过本说明书，除非文中需要另有说明，词汇“含有”应理解为指含有所述的要素，或要素的整合或集合或不排除任何其它要素的整合或要素或整合的整合或集合。
发明的详细说明为了可以更清楚地理解本发明的特性，参考下面的非限制实施例描述其优选的形式。
图1A显示了质粒pCATSAT的线性图。显示了限制酶位点H(HindIII)，Sp(SphI)，P(PstI)，S(SalI)，X(XbaI)，和BamHI；amp和ori分别是质粒氨苄青霉素抗性基因和复制原点。氯霉素乙酰转移酶(CAT)和丝氨酸乙酰转移酶基因以及劳斯肉瘤病毒启动子(RSV)和来自人生长激素基因或SV40的多腺苷酸化区。
图1B显示了在pCATSAT载体中制造的多个启动子/增强子构建体。CAT基因的上游启动子区来自probasin(Pb430或Pb286)或PSA(Psa630)基因。SV40增强子表示为黑盒，它的方向表示为NcoI(N)位点的方向。
图2显示了SV40增强子的序列。用于克隆的BstYI位点和单一的NcoI位点下面划线。
图3显示了含有Pb430启动子的构建体在多个细胞类型中的转录活性。
图4显示了含有286碱基对probasin启动子的构建体在多个细胞类型中的转录活性。
图5显示了含有630碱基对PSA启动子的构建体在多个细胞类型中的转录活性。
图6显示了重组腺病毒Ad5SVbPb430PNP。在人腺病毒5型的缺失的Ela/6区中插入含有SVbPb430增强子/启动子、大肠杆菌嘌呤核苷磷酸酶基因(PNP)和SV40多聚腺苷酸化区(SVpolyA)的盒。下面的括号中显示了包括在病毒Ad5PSAPNP中的含有PSA630碱基对启动子的等价盒。
图7A显示了利用Ad5SVbPb430PNP(SVPb)或Ad5PSAPNP与6MPDR结合的治疗对于PC3细胞存活力的影响。存活力测量为相对于没有病毒或药物的对照的代谢活性，MOI-感染复数。
图7B显示了病毒加药物处理对MRC5细胞的影响。
图7C显示了病毒加药物处理对HepG2细胞的影响。
实施例质粒构建体在图1中图解表示了以不同的位置和方向结合大鼠probasin和人PSA基因的启动子区和SV40增强子区的下述质粒。利用基本质粒pCATSAT已经制备了所有质粒。该质粒通过在BamHI位点插入参考基因，丝氨酸乙酰转移酶(SAT)，衍生自pCAT基本质粒(Promega)。这一参考报道基因是在普遍表达的劳斯肉瘤病毒启动子(RSV)的控制下并且含有来自人生长激素基因的3’多聚腺苷酸化区。如图所示在SV40和人生长激素3’多聚腺苷酸化区之间再生一BamHI位点。
通过PCR从大鼠基因组DNA分离来自-426(HindIII)或-286到+28的SacI位点的Probasin序列并且克隆进入pCATSAT以分别产生Pb430和Pb286构建体。对于Pb430，利用在+28的SacI位点和掺入5’引物的位点，将PCR片段作为SacI片段克隆入pBluescriptSK+的SacI位点。然后作为HindIII-XbaI片段再克隆进入pCATSAT。利用分别包含在5’引物和3’引物中的位点，将Pb286PCR片段作为EcoRI到SpeI片段克隆入pBluescriptSK+；然后，作为HindIII-SpeI片段克隆进入HindIII-XbaI切割的pCATSAT。PSA630质粒含有位于PSA转录起始位点5’的从EcoRI位点(-630)到HindIII位点(+6)的序列，该序列是通过PCR扩增从人基因组DNA分离的。
从质粒pCAT增强子(Promega)分离BstYI片段形式的SV40增强子序列。图2显示了增强子区的序列。唯一的NcoI位点下面划线。将这一片段亚克隆进入质粒Pb430CATSAT和PSA630CATSAT的BamHI位点以分别产生质粒Pb430CATSATSVa和Pb430CATSATSVb以及PSA630CATSATSVa和PSA630CATSATSVb。如图1所示，增强子的a和b方向的区别在于NcoI位点的位置。为将增强子置于PB430启动子上游，将BstYI增强子片段克隆进入BamHI切割的pBluescriptSK+(Stratagene)，然后以XbaI-KpnI片段形式再克隆进入pUC19。然后，以HindIII片段形式切出，并且克隆进入Pb430CATSAT的HindIII位点，得到质粒SVaPb430CATSAT和SVbPb430CATSAT。利用掺入5’PCR引物的BamHI位点，将SV40增强子克隆在pBluescriptSK+质粒中的Pb286启动子的前面。然后，如图1所示，以HindIII-SpeI片段形式将Pb286前面的两个增强子方向再克隆进入HindIII-XbaI裂解的pCATSAT得到了质粒SVaPb286CATSAT和SVbPb286CATSAT。
实施例1利用Pb430CATSAT构建体和含有任意方向(CAT基因的下游或紧接probasin启动子的上游)SV40增强子的质粒转染各种细胞类型。
细胞类型利用的前列腺肿瘤起源的细胞系是LNCaP(从L.Chung博士处得到)和PC-3(从ATCC处得到)。LNCaP细胞是雄激素敏感的并且表达突变的雄激素受体；PC-3，DU145和TsuPr细胞是不依赖于雄激素的。起源于其它组织的肿瘤细胞系包括乳房癌细胞系MCF-7(从ATTC获得)，肝细胞系HepG2细胞(来自G.Schreiber博士)，和膀胱癌细胞系BL13(Russell，Wass等人，1989)。从F.Graham博士获得腺病毒转化的人293胚肾细胞。从R.Holliday博士获得正常肺成纤维细胞系MRC5和中国仓鼠卵巢细胞系CHO K1。在T培养基(Thalmann，Sikes等人，1996)中维持LNCaP细胞。在含有2毫摩尔/升谷氨酸，非必需氨基酸和10％胎牛血清(FBS)的RPMI1640中培养PC-3，DU145和TsuPr MCF7和BL13细胞。在含有2毫摩尔/升谷氨酸，0.45％葡萄糖和10％FBS的Dulbecco’s MEM中维持了HepG2和MRC5细胞。在含有非必需氨基酸和10％FBS的MEM中维持CHO和293细胞。
转染为了转染，在35毫米的培养皿中播种细胞至30到50％铺满并且利用DOTAP(Boehringer)根据制造商的方案在第二天转染。对于每个细胞类型优化DNA和DOTAP的量。通常，将2.5微克DNA与15微升DOTAP混合用于转染一个培养皿。对照转染含有作为阴性对照的质粒(pBR322)DNA或作为阳性对照的RSVCAT和RSVSAT质粒的标准混合物。根据制造商的说明利用Lipofectamine(Gibco-BRL)进行MRC5细胞转染。利用另一个阳离子脂转染试剂CS067和T.Lockett提供的类似的方案进行DU145和TsuPr细胞的转染(也可以使用其它转染试剂如Lipofectamine)。
CAT和SAT测试在转染后44-48小时利用PBS漂洗细胞3次，并且通过刮进1.5毫升离心管并且短时离心收集细胞。在含有500微摩尔浓度Pefabloc蛋白酶抑制剂(Boehringer)的60微升0.1摩尔/升Tris HCl，pH7.5中重悬细胞沉淀。通过三次循环冷冻和解冻溶解细胞，在微离心机中沉淀碎片5分钟。取上清液进行SAT测试，在65℃加热剩余的提取物10分钟。再次沉淀碎片，将上清液用于CAT测试(Sleigh 1986)。将非加热提取物用于丝氨酸乙酰转移酶活性的测试。反应混合物(20微升)含有2或4微升细胞提取物，1毫摩尔/升乙酰辅酶A，和含有0.1微居里14C丝氨酸的200微摩尔/升丝氨酸(Amersham，50毫居里/毫升，150毫居里/毫摩尔)。在20和120分钟之间取等分试样，通过在95℃加热3分钟停止反应。通过薄层层析分离反应产物，并且进行磷成象分析(分子动力学)。利用ImageQuant软件确定丝氨酸到乙酰丝氨酸的转化程度。在每个实验的对照转染中RSVCAT与RSVSAT的比例可用于校正相对于RSV启动子的启动子活性。
启动子活性图2显示了不同细胞类型中含有Pb430启动子和不同排列的SV40增强子的构建体的活性。在LNCaP前列腺细胞系中单独启动子显示了低的活性，而在缺乏雄激素受体的PC-3细胞系中单个启动子显示了可忽略不计的活性。在PC-3细胞中雄激素受体共转染导致强烈刺激表达，表明了启动子关键性的雄激素依赖性。在非前列腺细胞系中，在乳房癌细胞系MCF-7和肝细胞系HepG2中看到了轻微的活性。对于所有四个含有增强子的构建体，在大多数细胞类型中看到了增强的表达。在PC-3，DU145和TsuPr前列腺细胞系中看到了最明显的增强，在这些细胞系中的表达是RSV启动子的10-60％。在缺乏雄激素的受体的共转染时，看到了高水平的表达。确实，当雄激素受体共转染时，通常发现活性在PC-3细胞中是低的，也许反映了在结合因子或刺激途径之间的竞争。在DU145和TsuPr细胞系中看到了同样的效果(数据未显示)。Pb430SVa，SVaPb430和SVbPb430构建体显示了在前列腺PC-3和DU145细胞中比任何其它测试细胞类型高3.5到6倍的表达。在分泌性表皮来源的细胞系，乳房癌细胞系MCF-7和膀胱癌细胞系BL13中看到了非前列腺细胞类型中最高的表达。应该注意到在MCF-7细胞系中表达了雄激素受体。例如对于SVbPb430构建体，在其它细胞系，293(肾)，MRC5(肺成纤维细胞)和HepG2(肝)中的表达至少低20倍。其它实验已经显示在大多数非前列腺细胞系中AR基因共转染也活化了Pb430启动子。与在PC-3细胞中的功能相似，Pb430/SV40增强子的结合显示没有或减少很多的对AR基因共转染的需求。所以，probasin启动子/SV40增强子结合提供了相对于其它细胞类型来说在PC-3雄激素不依赖性的前列腺细胞中表达的基本特异性。与单个probasin启动子相比高水平表达不需要存在雄激素受体也使实用性明显提高，因为这些结合将在不依赖雄激素的癌细胞中活化，并且可以在继续为了去除雄激素依赖的肿瘤细胞设计的雄激素切除术治疗的同时使用。
实施例2利用Pb286CATSAT构建体和在两个方向的在Pb286启动子的上游的含有SV40增强子的质粒转染各种的细胞类型。
图4显示了转染的结果。正如Pb430启动子，Pb286启动子在PC3细胞中非常弱地表达，但当利用雄激素受体共转染时表达很高。同样，在缺乏雄激素受体时，Pb286启动子与SV40增强子的结合在PC-3细胞中高表达。对于SVb增强子方向，表达是存在雄激素受体时观察到的表达的70％，而对于SVa方向，表达在存在AR时减少(类似于Pb430构建体)。尽管在PC-3细胞中表达比非前列腺细胞类型中表达高，但表达的特异性比观察到的Pb430构建体表达特异性低。所以，在去除从启动子表达需要雄激素诱导这一点，增强子的影响相同于观察到的Pb430构建体。
实施例3从掺入SV40增强子的PSA启动子构建体的表达对AR的需求降低通过单独或结合AR基因转染，在许多细胞系中检测了从启动子构建体PSA630，PSA630SVa和PSA630SVb的表达。在图5中显示了结果。在研究的所有细胞类型中，在存在AR时发现从PSA630启动子的表达明显增强。但诱导水平差异很大。在差不多所有细胞类型中，在存在AR时，含有位于CAT基因的3’的两个方向的SV增强子的构建体显示了表达的增强作用降低。AR的影响在不同的情况中的范围是从三倍诱导到两倍抑制。唯一的例外是在MGF-7细胞中，其中对于SVa和SVb构建体AR分别增强表达5.8和4.3倍，而缺乏增强子时为10倍。尽管这些基于PSA630的构建体显示了很低的前列腺特异性，但SV40增强子对从这一雄激素效应性启动子表达的影响类似于对Pb启动子的影响，即表达变得基本上是雄激素不依赖的。
实施例4以SalI-XbaI片段从pSVbPb430CATSAT切出SVbPb430启动子盒，并且平末端化。将它再克隆在质粒pXCX3/PSAPNPase(Lockett等人，1997)中的大肠杆菌嘌呤核苷磷酸酶(PNP)基因的前面，该质粒已经用KpnI和HindIII酶切，平末端化和再连接除去PSA启动子并且随后利用SpeI酶切和平末端化。然后通过重组用于构建携带在SVbPb430调节序列控制下的PNP基因的重组人5型腺病毒(图6)。如Lockett等人(1997)所述进行遗传操作和病毒构建。PNP基因转化前体药物6-甲基嘌呤-2-脱氧核糖核苷成为毒性产物6-甲基嘌呤。6-甲基嘌呤可以通过掺入RNA和DNA致死细胞并且因为它是不带电的，它可以在细胞之间扩散和致死不表达酶的细胞(“旁观者”效应)。
在介导前体药物依赖性细胞致死中病毒Ad5SVbPb430PNP与病毒Ad5PSAPNP的活性和特异性相当，后一病毒中PNP基因的表达是在前列腺特异抗原(PSA)基因的启动子的控制下。在16毫米的孔(24孔平板)每孔播种细胞约105，24小时后，以1到200噬斑形成单位(pfu)/细胞的比例范围加入病毒(参见图7)。在单独病毒存在，病毒加50微摩尔/升6-MPDR，或6-MPDR单独时温育细胞。利用AlamarBlue测试通过测量代谢活性在6天后确定细胞生长和生存力。没有观察到药物单独的效应。在高剂量的病毒时，看到单独病毒的一些效应，并且在图7中细胞致死效应校正了病毒单独效应。
可以看到在致死前列腺PC-3细胞时Ad5SVbPb430PNP比Ad5PSAPNP更加有效；在至少低10倍病毒输入时看到了等价的抑制。对于非前列腺细胞MRC-5和HepG2没有看到致死作用中的同样的差异；两种病毒显示了相等的对HepG2细胞的抑制；而仅在最高病毒测试水平(200pfu)看到在利用Ad5SVbPb430PNP感染后MRC-5细胞的代谢活性明显的降低。相当的细胞致死作用程度需要的病毒输入对于非前列腺细胞比PC-3前列腺细胞系高5到10倍。
所以，在病毒递送的酶前体药物治疗的过程中，SVbPb430启动子提供了与PSA启动子相比在前列腺细胞中提高的活性，并且显示了对于前列腺细胞的明显的选择性。
在这些实施例中应理解的是，这些启动子/增强子结合是新的并且比原始启动子具有更高的实用性，因为他们可以在雄激素效应性和雄激素不依赖性前列腺细胞和在缺乏雄激素(如在进行雄激素切除术治疗的癌症病人中)时以特异于前列腺的方式控制基因的表达。这例如在基因治疗不依赖雄激素的前列腺癌中治疗基因的表达中特别重要。
应理解的是本发明的构建体也可以用于已经外科治疗(切割)或使用雄激素合成或作用的抑制剂的病人。特别地，这样的雄激素阻断治疗可以继续而基本上不影响这些启动子的活性。
本领域的技术人员应理解的是对如特异的实施方案所示的本发明可以产生许多变化和/或修饰而不脱离本发明的精神或范围。所以，本实施方案应被认为是说明性的而不是限制性的。
参考文献Allison.J，Y-L，Zhang和M.G.Parker(1989)“在转基因小鼠中编码大鼠前列腺类固醇结合蛋白质的基因的组织特异和激素性调节”分子细胞生物学92254-2257Belldegrun，A.S.和S.Pang，“含有用于生产异源蛋白，或用于前列腺癌的基因治疗的前列腺特异性抗原启动子的核酸”专利，WO9614875。
Birnbarm，M.J.和J.D.Baxter(1986)“糖皮质激素调节缺乏5’侧接序列的大鼠生长激素基因的表达”生物化学杂志，261(1)291-297。
Celis，L.，F.Claessens，B.Peeters，W.Heyns，G.Verhoeven和W.Rombauts(1993)“与C3(1)基因内含子中的雄激素效应性单位相互作用的蛋白质”分子细胞内分泌学，94165-172。
Claessens，F.，N.K.Rushmere，P.Davies，L.Celis，B.Peeters和W.A.Rombauts(1990)“雄激素受体复合物与前列腺结合蛋白质基因的序列特异结合”分子细胞内分泌学，74203-212。
Cleutjens，K.B.J.M.，C.C.E.M.Vaneekelen，H.A.G.M.Vanderkorput，A.O.Brinkmann和J.Trapman(1996)“在前列腺特异抗原启动子的类固醇激素调节活性中共同操作的两个雄激素效应区”生物化学杂志，271(11)6379-6388。
Grange，T.J.Roux，M.Fromont-Racine和R.Pictet(1989)“转染的嵌合酪氨酸氨基转移酶基因的阳性和阴性调节拷贝数影响”实验细胞研究，180220-223。
Greenberg，N.M.，F.Demayo，M.J.Finegold，D.Medina，W.D.Tilley，J.O.Aspinall，G.R.Gunha，A.A.Donjacour，R.J.Matusik和J.M.Rosen(1995)“在转基因小鼠中的前列腺癌”美国科学院学报，92(8)3439-3443。
Greenberg，N.M.，F.J.Demayo，P.C.Sheppard，R.Barrios，R.Lebovitz，M.Finegold，R.Angelopoulou，J.G.Dodd，M.L.Duckworth，J.M.Rosen和R.J.Matusik(1994)，“大鼠probasin基因启动子指导的激素性和发育性特异于转基因小鼠中的前列腺的异源基因的表达”分子内分泌学，8(2)230-239。
Henderson，D.R.，用于治疗和预防前列腺癌或肥大的特异于表达用于表达毒素，免疫刺激剂或反义化合物的特异于前列腺的抗原的细胞的转录调节剂。专利WO9519434。
Ho，K.C.，K.B.Marschke，J.A.Tan，S.G.A.Power，E.M.Wilson和F.S.French(1993)，“在雄激素调节的20kDa蛋白质基因的内含子-1中的复合物效应元件展示依赖于细胞类型的雄激素受体特异性”生物化学杂志，268(36)27226-27235。
Israel，D.I.和R.J.Kaufman(1989)，“在含有多个GRE的高度可诱变表达载体在CHO细胞中过量表达糖皮质激素受体”核酸研究17(2)4589-4604。
Kasper，S.，P.S.Rennie，N.Bruchovsky，P.C.Sheppard，H.Cheng，L.Lin，R.P.C.Shiu，R.Snoek，和R.J.Matusik(1994)“probasin基因的雄激素诱导需要雄激素受体与两个DNA序列的协同结合”生物化学杂志，269(50)31763-31769。
Lockett LJ，Molloy PL，Russell PJ和Both GW，相同的腺病毒载体递送的两个酶前药物系统体外致死肿瘤细胞的相对效率，临床癌症研究，(1997)出版。
Maroulakou，I.G.，M.Anver，L.Garrett和J.E.Green(1994)“在携带大鼠c3(1)猴病毒40大肿瘤抗原融合基因的转基因小鼠中的前列腺和乳房腺癌”美国科学院细胞91(23)11236-11240。
Matusik，R.J.用于生产转基因动物和用于人前列腺癌治疗的含有大鼠probasin基因的5’一侧接区域的雄激素效应元件分离的DNA分子，专利WO9403594。
Murtha，P.，D.J.Tindall和C.Y.F.Young(1993)“人前列腺特异激素释放肽hKLK2的雄激素诱导-在基因的5’启动子区中雄激素效应元件的鉴定”生物化学32(25)6459-6464。
Pang，S.，S.Taneja，K.Dardashti，P.Cohan，R.Kaboo，M.Sokoloff，C.L.Tso，J.B.Dekernion和A.S.Belldegrun(1995)“从患有前列腺癌的病人中分离的特异于前列腺的抗原启动子的前列腺组织特异性”人基因治疗，61417-1426。
Rennie，P.S.，N.Bruchovsky，K.J.Leco，P.C.Sheppard，S.A.McQueen，H.Cheng，R.Snoek，A.Hamel，M.E.Bock，B.S.MacDonald，B.E.Nickel，C.Chang，S.Liao，P.A.Cattini和R.J.Matusik(1993)“参与probasin基因的调节的两个顺式作用DNA元件的定性”分子内分泌学，7(1)23-36。
Riegman，P.H.J.，R.J.Vliestra，J.A.G.M.van der Korput，A.O.Brinkmann和J.Trapman(1991)前列腺特异抗原基因的启动子“含有功能雄激素效应元件”，分子内分泌学，5(12)1921-1930。
Rushmere，N.K.，M.G.Parker和P.Davies(1987)“雄激素效应基因的雄激素受体结合区”分子细胞内分泌学51259-265。
Russell，P.J.，J.Wass，R.Lukeis，O.M.Garson，M.Jelbart，E.J.Wills，J.Philips，J.Brown，N.Carrington，P.C.Vincent和D.Raghavan(1989)“起源于多倍非整倍体人膀胱转移细胞癌，UCRU-BL-13的细胞系的鉴定”癌症研究杂志，44276-285。
Schaffner，D.L.，R.Barrios，M.R.Shaker，S.Rajagopalan，S.L.Huang，D.J.Tindall，C.Y.F.Young，P.A.Overbeek，R.M.Lebovitz 和M.W.Lieberman(1995)，“携带PSArasT24杂合体基因的转基因小鼠发育了唾液腺和肠胃道肿瘤”实验室研究72(3)283-290。
Schuur，E.R.，G.A.Henderson，L.A.Kmetec，J.D.Miller，H.G.Lamparski和D.R.Henderson(1996)，“特异于前列腺的抗原表达受到上游增强子的调节”生物化学杂志，271(12)7043-7051。
Sleigh，M.J.(1986)，“非层析测试真核细胞中氯霉素乙酰转移酶基因的表达”生物化学分析，156(1)251-256。
Thalmanm，G.N.，R.A.Sikes，S.M.Chang，D.A.Johnston，A.C.，von，Eschenbach和L.W.K.Chung(1996)在前列腺特异抗原表达中的苏拉明诱导的下降对人前列腺癌的LNCaP模型中肿瘤生长没有影响。自然癌症的研究杂志88(12)794-801。
Virkkunen，P.，P.Hedberg，J.J.Palvimo，E.Birr，K.Porvari，M.Ruokonen，P.Taavitsainen，O.A.Janne和P.Vihko(1994)“人和大鼠前列腺特异酸磷酸酶基因和他们的启动子的结构比较推断的雄激素效应元件的鉴定”生物化学和生物物理研究通讯202(1)49-57。
Wynshaw-Boris，A.，J.M.Short，D.S.Loose和R.W.Hanson.(1986)“磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(GTP)启动子调节区的鉴定1.多个激素调节元件和增强子的影响”生物化学杂志261(21)9714-9720。
Zhang，Y.L.M.G.Parker和O.Bakker(1990)“在雄激素调节的C3基因的启动子中核蛋白质与CCAAT基序的结合中的组织特异差别”分子内分泌学，4(8)1219-1225。
权利要求
1.使编码序列在特异组织中优先表达的遗传构建体，该构建体包括下面元件(1)来自组织特异性基因的类固醇效应性启动子，(2)编码序列，和(3)SV40增强子，元件排列如下来自组织特异性基因的类固醇效应性启动子在编码序列的上游并且SV40增强子位于编码序列的3’，或者SV40增强子在编码序列的上游并且来自组织特异性基因的类固醇效应性启动子定位于SV40增强子和编码序列之间，或者来自组织特异性基因的类固醇效应性启动子在编码序列的上游并且SV40增强子定位于编码序列的内含子内；其中启动子在构建体中比它的天然状态具有更低的类固醇效应水平。
2.根据权利要求1的遗传构建体，其中来自组织特异性基因的类固醇效应性启动子在编码序列的上游，SV40增强子在编码序列的3’。
3.根据权利要求1的遗传构建体，其中SV40增强子在编码序列的上游，来自组织特异性基因的类固醇效应性启动子定位于SV40增强子和编码序列之间。
4.根据权利要求1的遗传构建体，其中来自组织特异性基因的类固醇效应性启动子在编码序列的上游，SV40增强子定位于编码序列内的内含子中。
5.根据权利要求1到4任一项的遗传构建体，其中来自组织特异性基因的类固醇效应性启动子是雄激素效应性的。
6.根据权利要求1到5任一项的遗传构建体，其中组织特异性基因是前列腺特异性的。
7.根据权利要求1到6任一项的遗传构建体，其中来自组织特异性基因的类固醇效应性启动子是probasin启动子。
8.根据权利要求7的遗传构建体，其中启动子是Pb430或Pb286。
9.根据权利要求1到6任一项的遗传构建体，其中来自组织特异性基因的类固醇效应性启动子是PSA启动子。
10.根据权利要求9的遗传构建体，其中启动子是PSA630。
11.含有来自组织特异性基因的类固醇效应性启动子和SV40增强子和插入位点的遗传盒，其中所述的插入位点可以插入编码序列，插入位点邻接并位于启动子的下游，其中启动子在盒中的类固醇效应性的水平比它的天然状态低。
12.根据权利要求11的遗传盒，其中SV40增强子定位于组织特异性基因的类固醇效应性启动子的上游。
13.根据权利要求11的遗传盒，其中SV40增强子是在组织特异性基因的类固醇效应性启动子的下游。
14.根据权利要求11到13任一项的遗传盒，其中组织特异性基因的类固醇效应性启动子是雄激素效应性的。
15.根据权利要求11到14任一项的遗传盒，其中组织特异性基因是前列腺特异性的。
16.根据权利要求11到15任一项的遗传盒，其中组织特异性基因的类固醇效应性启动子是probasin启动子。
17.根据权利要求16的遗传盒，其中启动子是Pb430或Pb286。
18.根据权利要求11到15任一项的遗传盒，其中组织特异性基因的类固醇效应性启动子是PSA启动子。
19.根据权利要求18的遗传盒，其中启动子是PSA630。
20.包括权利要求1到10任一项的遗传构建体或权利要求11到19任一项的遗传盒的载体。
21.根据权利要求20的载体，其中载体是人腺病毒5型。
22.根据权利要求20的载体，其中载体是羊腺病毒。
全文摘要
本发明提供了遗传构建体,该构建体提供了在特异的组织中编码序列的优选表达。构建体包括下面的元件:(1)来自组织特异性基因的类固醇效应性启动子,(2)编码序列和(3)SV40增强子。元件排列如下:来自组织特异性基因的类固醇效应性启动子在编码序列的上游并且SV40增强子位于编码序列的3’,或者SV40增强子在编码序列的上游并且来自组织特异性基因的类固醇效应性启动子定位于SV40增强子和编码序列之间,或者来自组织特异性基因的类固醇效应性启动子在编码序列的上游并且SV40增强子定位于编码序列的内含于内。在构建体中启动子的类固醇效应水平比其在天然状态的类固醇效应水平低。
文档编号C12N9/64GK1250477SQ98803248
公开日2000年4月12日 申请日期1998年2月3日 优先权日1997年2月3日
发明者彼得·劳伦斯·莫洛伊 申请人:联邦科学技术研究组织