包含漆酶的耐贮存液体制剂的制作方法

专利名称：包含漆酶的耐贮存液体制剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种包含漆酶的耐贮存液体制剂，改善包含漆酶的液体制剂的贮存稳定性的方法，以及所述液体制剂在个人护理、或漂白、或纺织品中的应用，例如用于织物的染色。
背景技术：
工业酶一般配制成颗粒状固体(例如粉末或粒状，可选地带有某种涂层)，或配制成水基溶液。
许多固体制剂(例如酶粉)都有容易形成粉尘的缺点，除非进行特别的预防，否则就会污染周围的环境，并由此对处理这些组合物的人造成健康危险。
水基的液体酶制剂本质上消除了形成粉尘的危险。由于所有酶事实上是在水的存在下发挥它们的活性，因此一般不太可能制备包含游离(例如未装入胶囊的或未包衣的)酶的耐贮存制剂。
目前可得到的水基液体酶制剂保持效力的贮存时间相当短，因为如果没有在冷却条件下贮存的话，经过数周，剩余酶活性就会降至无法接受的低水平。
Feng Xu等人，(1996)，生物化学与生物物理学学报，1292，第303-311，其中显示不同漆酶与ABTS预先孵育1小时后，其稳定性取决于pH值和温度。
Palmiert等人，(1993)，应用微生物学与生物技术，39，第632-636页，其中显示在25℃下孵育的一种特定漆酶在pH7条件下长300分钟(即6小时)的期间内比在pH3条件下更为稳定。
因此，需要贮存稳定时间在1天以上的、包含漆酶的液体制剂。本发明提供了满足这一需要的制剂。
发明概述本发明的目的是提供一种包含漆酶的耐贮存液体制剂，它在10-60℃下能稳定地贮存更长的时间。
一种包含(i)漆酶和(ii)至少一种多元醇的液体制剂，该制剂的pH值比漆酶的最佳pH值更偏碱性，与相应的不含多元醇且pH值为所述漆酶的最佳pH值的制剂相比，它具有改善的贮存稳定性或存放期限。漆酶漆酶(苯二酚∶氧 氧化还原酶)(按照酶命名法(1992)，AcademicPress，Inc.的E.C.分类1.10.3.2)是含有多铜的一类酶，它们催化酚类的氧化作用。漆酶介导的氧化导致从合适的酚类底物生成芳氧基中间体；如此产生的中间体的最终偶合形成了二聚物、低聚物和聚合反应产物的混合物。某些反应产物可用于形成适用于对诸如头发、羊毛和纺织品等角质纤维进行染色的染料。
漆酶可以从各种微生物来源，特别是细菌和真菌(包括丝状真菌和酵母)得到，可从真菌得到的漆酶的合适实例包括可从曲霉属、脉孢菌属(例如粗糙脉孢菌)、柄孢壳属、葡萄孢属、金钱菌属、层孔菌属、香菇属、侧耳属、栓菌属〔已知其中某些种/菌株有不同名称和/或以前已划分在其他属中；例如，Trametes villosa＝T.pinsitus＝筛孔多孔菌(Polyporus pinsitis)(也称作P.pinsitus或P.villosus)＝筛孔革盖菌〕、多孔菌属、丝核菌属(例如立枯丝核菌)、鬼伞属(例如褶纹鬼伞，灰盖鬼伞)、小脆柄菇属(Psatyrella)、毁丝霉属[例如嗜热毁丝霉(M.thermophila)]、Schytalidium、射脉菌属(例如P.radita；参见WO 92/01046)、革盖菌属(例如毛革盖菌；参见JP 2-238885)、Pyricularia或硬孔菌属的菌株得到的那些漆酶。
在本发明中优选的漆酶包括可从嗜热毁丝霉得到的漆酶，和可从筛孔多孔菌得到的漆酶。
本发明的液体制剂可以含有或不含其他成分。值得考虑的其他成分包括漆酶底物或介体、pH调节剂、抗微生物剂、分散剂和/或粘度调节剂。
本发明还涉及改善漆酶的贮存稳定性的方法，是通过在多元醇的存在下、在比漆酶的最佳pH偏碱性0.5到5.5个pH单位的pH值下贮存漆酶而实现的。
最后，本发明涉及本发明的液体制剂在个人护理中的用途，例如用于染发，在漂白中的用途和在纺织品中的用途，例如用于织物的染色。
附图的简要描述

图1显示了本发明包含嗜热毁丝霉漆酶(120LAMU/g)和30％PEG6000的液体制剂在pH 9.0下相对贮存周数的相对剩余酶活性。
图2显示了包含嗜热毁丝霉漆酶和多元醇以及不同缓冲液的液体制剂的剩余活性百分数。
图3显示了多元醇和经巴氏消毒法消毒嗜热毁丝霉漆酶原料的影响。
图4显示了嗜热毁丝霉漆酶在pH9、9.5和10时的剩余活性。
图5显示了嗜热毁丝霉漆酶和筛孔多孔菌漆酶在缓冲液中的稳定性，测量为在40℃下、在1至16天期间的剩余活性。
图6显示了在包含1)10％ w/w丙二醇和2)10％ w/w丙二醇与3％ w/w葡萄糖的混合物的液体制剂中，嗜热毁丝霉漆酶在40℃下长达21周的长期贮存稳定性。
发明详述本发明的目的是提供一种包含漆酶、贮存稳定性有所改善的液体制剂，当贮存于10-60℃，优选20-45℃时，该制剂保留了显著百分数的剩余酶活性。
本发明人已发现，包含漆酶和多元醇、并具有比漆酶的最佳pH更偏碱性的pH值的液体制剂，其贮存稳定性或存放期限有所改善。
为了得到改善的耐贮存液体制剂，使其存放期限延长至1天以上到数周，在某些情况下甚至是数月，则其pH值必须比所讨论的漆酶的最佳pH值更偏碱性0.5到5.5个pH单位，一般是偏1到4个pH单位。
至少在本发明的上下文中，“改善的耐贮存液体制剂”是在所讨论的漆酶于固定pH值下经过一段时间后的剩余酶活性，与在4℃冷却条件下于相同的固定pH值经过相同时间后的酶活性相比得到的百分数基础上确定的。在4℃下冷藏是包含漆酶(诸如嗜热毁丝霉漆酶)的液体制剂的常规贮存方式。
“显著的剩余酶活性”是指维持的酶活性相当于相应条件下4℃贮存的漆酶酶活性的至少20％、更好是30％以上，如50％或60％以上、甚至更有利是在70％以上、优选在80％以上、特别是在90％以上、甚至达到100％。pH本发明液体制剂的pH值比所讨论的漆酶的最佳pH值更偏碱性，可以是由该制剂的成分产生的“天然”pH值。如果该液体制剂的“天然”pH与本发明的要求不一致，则必须利用pH调节剂，例如缓冲液，将其调节到所需pH值。应当理解，液体制剂必须具有多大的特定pH值取决于具体漆酶，因为漆酶的最佳pH值在pH4-8之间变化。
特定漆酶的最佳pH取决于所存在的底物、稳定剂(即，在本发明中为多元醇)、缓冲液和其他成分。因此，漆酶的最佳pH必须在与将要用于贮存其的制剂相一致的制剂中测量。本领域技术人员可以容易地测定所讨论的漆酶的最佳pH，并在此信息的基础上可以容易地制备本发明的耐贮存液体制剂。漆酶所讨论的漆酶可以是上述的任何一种漆酶。这些漆酶可以从完全不同的来源得到，就它们的结构(分子量，组分)和它们的性能(对底物的特异性，最佳pH，等电点(PI)等)而言，它们是一个相当杂的组。
按照本发明，特别关注的漆酶的实例包括，植物来源的漆酶，例如来源于漆树的漆树(Phus sp.)漆酶，以及微生物来源的漆酶，包括细菌和真菌漆酶，例如Rhizoctonia practicola漆酶(Reinhammar，B.B.A，205，35-47(1970)；Bollag等人，(1978)，加拿大微生物学杂志25，229-233)，来源于毁丝霉属的漆酶，特别是来源于嗜热毁丝霉菌株的漆酶(参见WO 95/33836)，来源于多孔菌属的漆酶，特别是来源于筛孔多孔菌菌株的漆酶(参见WO 96/00290)，来源于Scytalidium sp、特别是S.thermophilum的漆酶(参见WO95/33837)，来源于Pyricolaria sp.、特别是P.oryzae的漆酶，来源于灰盖鬼伞的漆酶。漆酶在本发明的液体制剂中的浓度漆酶在本发明的液体制剂中的浓度取决于其预计的用途，因此可以有从低浓度到高浓度的差别。所讨论的应用领域(例如染发，织物漂白，织物染色等)内的技术人员知道所需漆酶的终浓度。从技术上看，本发明液体制剂的改善的贮存稳定性或存放期限是独立于漆酶的浓度得到的，至少在1mg酶蛋白/ml产物的浓度到最多粘度已高到不可能将产物混合的浓度下是这样的。嗜热毁丝霉漆酶制剂按照WO 95/33836(Novo Nordisk)，以丁香醛连氮作为底物，重组嗜热毁丝霉漆酶的最佳pH为6.5。所以，按照本发明，包含所述漆酶的制剂在Tris缓冲液的存在下，其pH应比6.5更偏碱性，应优选在pH7-12的范围内，尤其是从pH7.5到11。
在于0.25M甘氨酸缓冲液(pH9.0)内的10％单丙二醇(MPG)、0.2％ProxelTM中的嗜热毁丝霉漆酶，40℃下放置4周后，保留了84％的酶活性。在pH9.0的剩余活性百分数比在pH9.5的剩余活性百分数高。
实施例5中描述了pH值从9增加到10所产生的效果，并显示于图4中。嗜热毁丝霉漆酶在pH9.0下似乎更稳定，分别在25℃和40℃下贮存4周后，活性仍保留了93％和84％。筛孔多孔菌漆酶制剂另外，如WO 96/00290(Novo Nordisk)所公开的，利用丁香醛连氮作底物时，重组筛孔多孔菌漆酶的最佳pH为5到5.5。
按照本发明，包含来源于筛孔多孔菌的漆酶和多元醇的液体制剂的pH应该比pH5到5.5更偏碱性，优选应大约为pH5.5-11，尤其是大约pH6-9.5。
如实施例1所示，在pH9.0的60％PEG6000液体中的筛孔多孔菌漆酶，40℃下经过14天后，剩余活性为100％，4周后，剩余活性为65％。多元醇为了使包含漆酶的液体制剂的贮存稳定性得到改善，应存在至少一种多元醇来稳定该制剂。
不受任何理论的限制，我们相信多元醇降低了水的活性，并进一步确保漆酶不会沉淀，不会经受热变性。
本发明人发现，聚合物及其单体，以及单糖、二糖、寡糖和多糖均是可使制剂获得所需稳定性的合适多元醇。
可用于本发明液体制剂的多元醇的实例包括，聚烯化氧(PAO)，诸如聚亚烷基二醇(PAG)，包括聚甲二醇、聚乙二醇(PEG)、甲氧基聚乙二醇(mPEG)和聚丙二醇，聚乙烯醇(PVA)，乙烯-马来酸酐共聚物，苯乙烯-苹果酸酐共聚物，葡聚糖(包括羧甲基-葡聚糖)，纤维素，包括甲基纤维素、羧甲基纤维素、乙基纤维素、羟乙基纤维素、羧乙基纤维素和羟丙基纤维素，脱乙酰壳多糖的水解产物，淀粉，如羟乙基淀粉和羟丙基淀粉，糖原，琼脂糖及其衍生物，瓜尔胶，支链淀粉，菊粉，黄原胶，角叉菜胶，果胶，海藻酸水解产物，生物聚合物，山梨醇，葡萄糖，甘露糖，半乳糖，阿拉伯糖，古洛糖，木糖，苏糖，山梨糖，果糖，甘油，麦芽糖，纤维二糖，蔗糖，直链淀粉，支链淀粉，单丙二醇(MPG)。
在优选的实施方案中，该制剂包含一种聚合物和/或一种糖作为多元醇。合适的聚合物是聚烯化氧(PAO)，优选为聚亚烷基二醇(PAG)，特别是丙二醇。优选的糖是葡萄糖。
在本发明的一个实施方案中，多元醇的分子量在100da到8000da的范围内，优选从200到7000da，如6000da，并可构成本发明液体制剂的5到75％，优选10到60％，尤其是20到50％。
在本发明的一个实施方案中，液体制剂是水基制剂。漆酶可以液体形式或固体形式(无定形的和/或晶状的)存在，一般是以颗粒形式存在，例如分散于液相中(即浆液)。其他成分本发明的液体制剂可以包含或不包含漆酶底物或介体。
在一个实施方案中，本发明的液体制剂进一步包含漆酶底物或介体，如染料前体(在最终产物是染色组合物或产物的情况下)。这要求该制剂中已抽尽了氧气，且pH在上述所讨论漆酶的最佳pH以上的特定范围内。
其他成分包括抗微生物剂，pH调节剂，分散剂，粘度调节剂和/或抗氧化剂。
抗微生物剂抗微生物剂是抑制或阻止诸如细菌、真菌生物(如丝状真菌和/或酵母)等微生物生长的物质。合适的抗微生物剂包括苯甲酸钠、山梨酸钾、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸酯类等。ProxelTM是一种合适的抗微生物剂的商品名。
分散剂分散剂(即有助于防止或延迟分散后的固体物质发生分离(例如沉淀)的物质)包括，例如，某些细碎粘土(诸如陶土(瓷土)、膨润土、漂白土等等)，所谓的“抗絮凝聚合物”，以及阴离子聚合物型的两亲物质。
粘度调节剂适于提高本发明具体组合物粘度的物质的实例包括不同级别的煅制二氧化硅(例如，以诸如AerosilTM，Cab-O-SilTM或Tix-O-SilTM等商品名出售的)，膨润土、陶土、碳酸钙粉、有机粘土(例如Claytone)和聚合物材料，如羟丙基纤维素(例如NatrosolTM)和黄原胶。
pH调节剂适于加入本发明某些具体组合物中的pH调节剂的实例(即当使本发明的组合物与含水介质接触时，有助于调节和/或维持(即，缓冲)该介质的pH值，以便得到与该制剂中的pH敏感组分(例如其中存在的漆酶)相容的pH值的物质)包括，各种无水的无机和有机盐，例如磷酸二氢钾(KH2PO4)，碳酸氢钠(NaHCO3)，乙酸钾(CH3COOK)，乙酸钠(CH3COONa)和柠檬酸二氢钾，甘氨酸缓冲液，Tris-Na缓冲液。
抗氧化剂在本发明的某些具体制剂中，可以有利地加入能保护该制剂的氧化敏感性组分不被氧化(例如被大气中的氧气氧化)的物质(抗氧化剂)。这样的物质包括例如盐以及有机抗氧化剂(如甲硫氨酸和卵磷脂)。本发明液体制剂的制备关于本发明液体制剂的制备，有许多途径都是适用的，主要取决于将要加入其中的漆酶最初获得的形式。
当该漆酶是以不能溶解的固体酶制剂的形式、例如冻干或喷雾干燥的微粒形式获得的，或至少是在液体中的溶解度比较低，则可以简单地将其分散到水中，以形成水基的液相，从而形成浆液。
当该漆酶是以水溶液的形式得到的，则可以将其直接用于本发明的液体制剂。漆酶底物在本发明的上下文中所用的术语“底物”是指在由酶催化的反应中作为反应物的物质。
当在本发明的制剂中加入漆酶底物比较合适时，适用于该目的的酶底物的性质将不仅取决于所讨论的漆酶，而且取决于该制剂的预期用途。
(i)介体在本发明的一个实施方案中，该液体制剂包含漆酶和一种可氧化的底物，因此该可氧化底物的功能是作为介体。介体可以是适于与所用漆酶一起使用的任何介体。介体的实例包括以下这些卤离子(例如氯和溴)；某些金属离子(例如Mn2+)；酚类〔例如，乙酰丁香酮，丁香醛，丁香酸，丁香酸烷基酯(例如丁香酸甲酯、乙酯、丙酯、丁酯、己酯或辛酯)以及其他丁香酸酯[例如，不同分子量的聚乙二醇(PEG)的丁香酸酯，如PEG4000丁香酸酯]，3-(4-羟基-3，5-二甲氧基苯基)丙烯酸乙酯，对羟基肉桂酸，2，4-二氯苯酚，香草醛，7-羟基香豆素，6-羟基-2-萘甲酸，和对羟基苯磺酸酯〕；2，2’-连氮-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸酯)(ABTS；参见，例如WO 94/12620)；和10-甲基-、10-乙基-和10-丙基吩噻嗪(参见，例如WO 94/12621)。其他合适的介体公开在例如WO94/12619、WO 94/12620和WO 94/12621中。
丁香酸酯型、吩噁嗪型或吩噻嗪型的介体通常在本发明的上下文中非常合适，关于这点的一些实例是乙酰丁香酮，丁香酸甲酯，10-吩噻嗪丙酸，10-乙基吩噻嗪-4-羧酸，10-吩噁嗪丙酸和10-甲基吩噁嗪(WO 94/12621中描述的)。
在本发明的组合物中，介体一般将以10-7到10-2mol/g组合物的量存在，通常是以10-5到10-3mol/g组合物的量存在。
(ii)染料前体本发明其他重要的具体制剂是包含漆酶(诸如上述漆酶之一)和其染料前体形式的一种或多种可氧化底物的制剂，该染料前体在水的存在下经历漆酶催化的氧化(通常形成氧化基)，随后聚合形成具有特定颜色的染料。这种漆酶介导的染料形成在纺织品(例如羊毛，棉花和/或合成物质)、纱线、毛皮、兽皮等的染色，和人的个人护理领域中具有重要的工业实用性，已发现它非常适用于例如染发。
在本说明书和权利要求书中所用的术语“染料前体”，其含义不仅包括在漆酶的存在下经氧化可产生强烈有色染料的单个物质，而且包含在相应的方式下氧化后，其自身不单独产生具有强烈颜色的产物，但是当在前一类强显色物质之一的存在下进行氧化时会使其所产生的染料颜色发生改变的单个物质。因此，能对全部染料颜色发挥这种修改作用的可氧化物质(有时将这样的物质称作“变调剂”)都包括在本发明上下文中所用的术语“染料前体”的含义内。
适于加入本发明制剂的染料前体的实例包括，但不限于芳族二胺；二氨基取代的芳族羧酸及其酯；氨基酚类；酚类；萘酚类；和肉桂酸的酚衍生物及其酯。
芳族二胺的实例包括
2-甲基-1，4-二氨基苯，4-甲基-邻苯二胺，1，4-二氨基苯(对苯二胺)，2-甲氧基-对苯二胺，2-甲基-1，4-二氨基苯(对甲苯二胺)，2-氯-1，4-二氨基苯(邻-氯-对苯二胺)，4-氨基二苯胺(N-苯基-对苯二胺)，1-氨基-4-β-甲氧基乙基氨基苯(N-β-甲氧基乙基-对苯二胺)，1-氨基-4-双(β-羟乙基)-氨基苯(N，N-双(β-羟乙基)-对苯二胺)，1，3-二氨基苯(间苯二胺)，2-甲基-1，3-二氨基苯(2，6-二氨基甲苯)，2，4-二氨基甲苯，和2，6-二氨基吡啶。
二氨基取代的芳族羧酸及其酯的实例包括2，3-二氨基苯甲酸，3，4-二氨基苯甲酸，和它们的酯，例如，低级烷基酯(诸如甲酯，乙酯，丙酯，2-丙酯或丁酯)。
氨基酚类的实例包括1-羟基-2-氨基苯(邻氨基苯酚)，1-羟基-3-氨基苯(间氨基苯酚)，1-甲基-2-羟基-4-氨基苯(3-氨基邻甲酚)，1-甲基-2-羟基-4-β-羟乙基氨基苯(2-羟基-4-β-羟乙基氨基-甲苯)，1-羟基-4-氨基苯(对氨基苯酚)，1-羟基-4-甲氨基苯(对甲氨基苯酚)，1-甲氧基-2，4-二氨基苯(2，4-二氨基茴香醚)，1-乙氧基-2，3-二氨基苯(2，4-二氨基苯乙醚)，和
1-β-羟基乙氧基-2，4-二氨基苯(2，4-二氨基苯氧基乙醇)。
苯酚类和萘酚类的实例包括1，2-二羟基苯(邻苯二酚)，1，3-二羟基苯(间苯二酚)，1，3-二羟基-2-甲基苯(2-甲基间苯二酚)，1，3-二羟基-4-氯苯(4-氯间苯二酚)，1，2，3-三羟基苯(连苯三酚)，1， 2，4-三羟基苯，1，2，4-三羟基-5-甲基苯(2，4，5-三羟基甲苯)，1，2，4-三羟基甲苯，1，5-二羟基萘，1，4-二羟基苯(对苯二酚)，和1-羟基萘(α-萘酚)。
肉桂酸的酚衍生物及其酯的实例包括对香豆酸(即，4-羟基肉桂酸)，咖啡酸(即，3，4-二羟基肉桂酸)，芥子酸(即，3，5-二甲氧基-4-羟基肉桂酸)，阿魏酸(即，4-羟基-3-甲氧基肉桂酸)，以及它们的酯，例如，低级烷基酯(诸如甲酯、乙酯、丙酯、2-丙酯或丁酯)。
在本发明的上下文中，令人感兴趣的可作为染料前体的其他物质包括水杨酸(即，2-羟基苯甲酸)及其酯(例如低级烷基酯，如甲酯、乙酯、丙酯、2-丙酯或丁酯)。
特别值得关注的染料前体的实例包括来源于以下成员的化合物对苯二胺(PPD)，对甲苯二胺(PTD)，氯-对苯二胺，对氨基苯酚，邻氨基苯酚，3，4-二氨基甲苯，2-甲基-1，4-二氨基苯，4-甲基-邻苯二胺，2-甲氧基-对苯二胺，2-氯-1，4-二氨基苯，4-氨基二苯胺，1-氨基-4-β-甲氧基乙基氨基苯，1-氨基-4-双(β-羟乙基)-氨基苯，1，3-二氨基苯，2-甲基-1，3-二氨基苯，2，4-二氨基甲苯，2，6-二氨基吡啶，1-羟基-2-氨基苯，1-羟基-3-氨基苯，1-甲基-2-羟基-4-氨基苯，1-甲基-2-羟基-4-β-羟乙基氨基苯，1-羟基-4-氨基苯，1-羟基-4-甲氨基苯，1-甲氧基-2，4-二氨基苯，1-乙氧基-2，3-二氨基苯，1-β-羟基乙氧基-2，4-二氨基苯，吩嗪类，诸如4，7-吩嗪二羧酸，2，7-吩嗪二羧酸，2-吩嗪羧酸，2，7-二氨基吩嗪，2，8-二氨基吩嗪，2，7-二氨基-3，8-二甲氧基吩嗪，2，7-二氨基-3-甲氧基吩嗪，2，7-二氨基-3-甲氧基吩嗪，3-二甲基-2，8-吩嗪二胺，2，2’-[(8-氨基-7-甲基-2-吩嗪基)亚氨基]双-乙醇，2，2’-[(8-氨基-7-甲氧基-2-吩嗪基)亚氨基]双-乙醇，2，2’-[(8-氨基-7-氯-2-吩嗪基)亚氨基]双-乙醇，2-[(8-氨基-7-甲基-2-吩嗪基)氨基]-乙醇，2，2’-[(8-氨基-2-吩嗪基)亚氨基]双-乙醇，3-氨基-7-(二甲氨基)-2，8-二甲基-5-苯基氯，9-(二乙氨基)-苯并[α]吩嗪-1，5-二醇，N-[8-(二乙氨基)-2-吩嗪基]-甲磺酰胺，N-(8-甲氧基-2-吩嗪基)-甲磺酰胺，N，N，N’，N’-四甲基-2，7-吩嗪二胺，3，7-二甲基-2-吩嗪胺，对氨基苯甲酸类，诸如对氨基苯甲酸乙酯，对氨基苯甲酸甘油酯，对氨基苯甲酸异丁酯，对二甲氨基苯甲酸戊酯(p-dimethylamino benzoic acid amil)，对二甲氨基苯甲酸辛酯，对二乙氧基氨基苯甲酸戊酯，对二丙氧基氨基苯甲酸乙酯，乙酰水杨酸，靛红衍生物，和2，3-二氨基苯甲酸。
(iii)漆酶的其他底物已证明漆酶非常适合引起含有酚取代基的多糖(例如，来自小麦或糠的阿拉伯木聚糖，或来自甜菜及相关植物的果胶)的胶凝作用，以用于食品或用于制备高吸水性物质(参见，例如，WO 96/03440)。类似地，已证明在用木素纤维物质(例如木浆)和诸如上面所提到的阿拉伯木聚糖或果胶等酚多糖制备基于木质纤维素的产品时，漆酶非常有用(参见，例如WO96/03546)。
因此，提供本发明的、包含例如合适浓度的漆酶和酚多糖形式的漆酶底物的制剂将是适当的。使用这样一种现成的耐贮存制剂可以使上述应用的效果更好。材料与方法材料酶没有任何副活性的、高纯度重组筛孔多孔菌漆酶(3525LACU/ml)，在4℃下储存于20mM Tris-缓冲液中，pH约为7.0或8.0。
用巴氏消毒法消毒的和未经巴氏消毒法消毒的重组嗜热毁丝霉漆酶(由Novo Nordisk A/S，Bagsvaerd，Denmark生产的水浓缩液；Mettler干物质含量18.5％w/w；每克浓缩液中约有50mg纯漆酶蛋白)；MES缓冲液(2-N-吗啉代-乙磺酸(Sigma M-8250)。用3N NaOH将pH调节到5.5(Merck 1.06498)。马来酸，1.0M马来酸37％paM*)800380 23.2g软化水，Milli Q 加至200ml用称量皿称取23.2g马来酸，并在持续搅拌下加入150ml水。继续搅拌直至溶解。
将该溶液定量转移到200ml容量瓶中并用水加至刻度线。*)pro analysi MerckTris缓冲液1.0M；储备溶液三(羟甲基)氨基甲烷Sigma T-1378 121.1g软化水，Milli Q 加至1L用称量皿称取Tris，在连续搅拌下加入800ml水。继续搅拌直至溶解。
将该溶液定量转移到1升容量瓶中，用水加至刻度线。Tris缓冲液25mM；pH7.50Tris缓冲液1.0M25.0ml马来酸，1.0M 5.0ml软化水加至1L
将pH调至7.50±0.05。
将50ml Tris缓冲液1.0M(刻度杯)倒入1升容量瓶中，加入约700ml水。此时加入5ml马来酸(1M)。调节pH到7.50±0.05，并用水加至刻度线。(pH不可以用HCl调节，因为它对漆酶有抑制作用。)稀释介质PEG 6000 paM 807491 25.0gTriton X-100，Sigma T-9248 5.0gMilli Q水加至0.5L用称量皿称取25.0g PEG 6000和5.0g Triton X-100，在连续搅拌下加入400ml水。继续搅拌至溶解。
将该溶液定量转移到0.5升容量瓶中，用水加至刻度。丁香醛连氮，0.56mM；储备溶液丁香醛连氮anh Sigma S-7896 10.0mg乙醇96％ 50ml用50ml容量瓶称取丁香醛连氮并加入乙醇50ml。搅拌直至溶解(约3小时)。丁香醛连氮，0.28mM；48％乙醇丁香醛连氮，0.56mM25.0ml软化水，Milli Q 加至50ml将25ml丁香醛连氮(0.56mM)(全移液管)转移到50ml容量瓶中。用水加满至刻度。校对试剂丁香醛连氮，0.056mM；48％乙醇丁香醛连氮，0.28mM 2ml乙醇，96％ 4ml软化水，Milli Q 加至10ml该溶液在360nm处的吸收值约为2.2(用6％乙醇作对照)。乙醇，6％乙醇，96％ 62.5ml
软化水，Milli Q 加至1000L将62.5ml乙醇，96％(刻度杯)转移到1升容量瓶中。用水加满至刻度。Tris Na缓冲液(制剂中为20mM)甘氨酸缓冲液磷酸盐缓冲液山梨醇糖浆(制剂中为60％干物质)PEG 6000(制剂中为30％或60％干物质)PEG 600(制剂中为30％或60％干物质)ProxelTM缓冲液中用的离子水Triton X-100丁香醛连氮(Sigma S-7896)马来酸(Merck 800380)Tris(SIGMA 7-9，T-1378)设备<COBAS>FARA离心分析器(Roche)分光光度计Shimadzu UV 2101 PC方法漆酶活性的测定(LACU)可以用LACU法测定筛孔多孔菌漆酶和其他漆酶的酶活性。
漆酶活性是根据需氧条件下丁香醛连氮的氧化测定的。所得紫色产物在530nm进行光度测定。分析条件为19mM丁香醛连氮，23.2mM乙酸盐缓冲液，pH5.5，30℃，1分钟反应时间。
1个漆酶单位(LACU)是在这些条件下，每分钟催化1.0微摩尔丁香醛连氮转化的酶量。漆酶活性的测定(LAMU)可用LAMU法测定嗜热毁丝霉漆酶的活性。1个漆酶单位(LAMU)是在以下分析条件下，每分钟催化1.0微摩尔丁香醛连氮转化的酶量。
在需氧条件下，漆酶催化丁香醛连氮氧化形成四甲氧基-偶氮-双亚甲基苯醌。所得紫色产物在530nm处进行光度测定。分析条件是反应溶液中16.5μM丁香醛连氮，20.3mM Tris/马来酸缓冲液，pH 7.5，30℃，1分钟反应时间，酶活性范围在0.0006-0.0028LAMU/ml之间。检出限(LOD)0.005 LAMU/ml定量检出限(LOQ)0.01 LAMU/ml测量范围 0.01-0.044 LAMU/ml以每分钟吸光度的变化为基础进行计算，它与酶活性成比例，与反应时间和酶浓度成线性关系。
用一种稳定、均匀的样品作为浓度对照样品，用于测定活性水平。将该浓度对照样品用稀释液(50g PEG6000溶于Milli-Q水中，至1升)稀释到预期活性0.025 LAMU/ml。进行分析前样品先放置15分钟。例如，用<COBAS>FARA离心分析器对未知的漆酶测试样品进行分析。<COBAS>FARA程序表操作T空转子旋转，直到达到容器室中的温度。
操作P将25微升浓度对照样品或测试样品，20微升软化水(Milli-Q)和325微升缓冲液(即，25mM Tris/马来酸缓冲液，pH7.5)加入转子中它们各自的室中。
操作I当转子加速时，缓冲液和样品在容器中混合。
操作SR将30微升底物(即，0.56mM丁香醛连氮)加入转子中最小的一个室中。
操作A当转子加速并离心时，该底物在容器中混合。读取浓度对照样品和未知漆酶测试样品的吸光度读数25次(间隔5秒读一次)。用第12次到第24次的吸光度读数(60-120秒)来计算ΔABS/分钟。依据<COBAS)FARA读数计算活性，为[U/ml]。进行以下计算LAMU/g=A×Vol×DW]]>A＝从<COBAS>FARA读数装置读取的[U/ml]值[LAMU/ml]，Vol＝用于样品稀释的管子[ml]D＝被溶解样品的稀释度[ml/ml]W＝重量[g]用下列计算式将该活性转化为活性A＝F×ΔABS/分钟ΔABS/分钟＝用<COBAS>FARA计算出的、在530nm处的每分钟吸光度的变化值。F=Vv×E×b]]>F=0.400×10-3×10-3*)0.025×10-3×0.065×1.6]]>F＝0.154**)*)10-3＝微摩尔/升转化为微摩尔/毫升。**)1.6cm样品通路长度V＝<COBAS>FARA中反应混合物的总体积[L]v＝反应混合物中的测试体积[L]E＝530nm处的微摩尔消光系数
。b＝样品通路长度(cm)。在1.6cm(b)的容器中，相应于该样品通路长度的总体积(V)为400ml。实施例实施例1缓冲液中的嗜热毁丝霉漆酶和筛孔多孔菌漆酶在最佳pH值下(没有多元醇)的贮存稳定性嗜热毁丝霉漆酶和筛孔多孔菌漆酶在40℃和它们的最佳pH(即分别为pH6.5和5.5)条件下贮存16天。
将该嗜热毁丝霉漆酶溶解于25mM Tris/HCl缓冲液中，将pH调节到pH6.5，使活性成为1000 LAMU/ml。将筛孔多孔菌漆酶溶解于25mM MES缓冲液中，将pH调节到pH5.5，使活性成为1000LACU/ml。
将溶解后的酶分别置于4℃和40℃下，在以下时间间隔时取出样品进行分析24小时，3天，7天和16天。
相对剩余活性针对的是保存在4℃下的相应制剂(空溶液，theblind)，即在4℃下的剩余活性被认为是100％剩余活性。
从图5中可以看出该试验的结果。16天后，嗜热毁丝霉漆酶和筛孔多孔菌漆酶在40℃下的相对剩余活性分别为3％和8％。实施例2筛孔多孔菌漆酶的贮存稳定性(14天)在pH7.0、8.0和9.0下，检测包含高纯度筛孔多孔菌漆酶(10LACU/g)和两种不同多元醇的液体制剂的贮存稳定性。
制备表1和表2中详列的样品并贮存14天。以4℃样品在相应条件下的漆酶活性为基础，计算经贮存后的剩余漆酶活性。表1
表2
从表1和表2中可以看出，在多元醇的存在下，贮存稳定性改善了。实施例3筛孔多孔菌漆酶的贮存稳定性(4周)用PEG6000在40℃下重复实施例1中所述的测试，不同的只是储存期为4周。表3
从表3中可以看出，4周后，在更高的pH值下保持了显著的剩余活性。实施例4嗜热毁丝霉漆酶的贮存稳定性在pH7.0、8.0和9.0下，检测包含重组嗜热毁丝霉漆酶(120LAMU/g)和30％或60％PEG6000和PEG600的液体制剂的贮存稳定性。
在该测试中使用以下成分AIPEG6000为30％或60％AIIPEG600为30％或60％BpH8.0或pH9.0 20mM Tris/马来酸缓冲液储存将这些制剂储存于带有橡胶密封盖的20ml样品容器中。在盖紧盖子之前，将该容器抽真空并用氩气充满真空。以这种方式，将这些制剂储存在惰性气氛中。
储存温度4，25和40℃取样期1，2和4周表4显示了包含PEG6000的制剂的贮存稳定性试验结果表4
表5中显示了包含PEG600的制剂的贮存稳定性试验结果。表5
从表4和表5中可以看出，分别包含嗜热毁丝霉漆酶和作为多元醇的PEG6000或PEG600的液体制剂具有改善的贮存稳定性。另外，从图1中可以看出，包含30％PEG6000的制剂在pH9.0下保持了显著的剩余酶活性。实施例5嗜热毁丝霉漆酶的贮存稳定性包含嗜热毁丝霉漆酶、单丙二醇(MPG)或甘油和pH9和10的缓冲液的液体制剂的贮存稳定性。
对表6中显示的以下制剂进行检测，它们都包含·320-370 LAMU/g·0.2％ ProxelTM表6
*制剂No.9是基于经巴氏消毒法消毒的原料。制剂No.1-8是基于未处理过的原料。结果图2中显示了储存4周后的剩余活性。
所有活性都计算为相对于相同期间内、在4℃下储存的参照样品平均活性的百分数(基于0、2和4周的平均结果)。
结果表明，所有制剂在25℃下储存4周后，均保留了80％以上的活性。在40℃下储存后，除了包含硼砂(pH 9)和空溶液(the blind)(NaOH制剂，其中pH调节到9，没有加入其他缓冲液)的制剂以外，其他所有制剂也保留了初始活性的至少80％。实施例6不同参数对贮存稳定性的影响检测★用甘油代替MPG，和★提高MPG的量，和★使用经巴氏消毒法消毒的原料，对剩余酶活性的影响。
检测以下制剂(显示于表7中)，它们都包含·320-370 LAMU/g·0.2％ ProxelTM表7
*制剂4是基于经巴氏消毒法消毒的原料结果图3显示了试验结果。从中可以看出，4周后，包含嗜热毁丝霉漆酶的所有液体制剂均具有80％以上的剩余活性。实施例7嗜热毁丝霉漆酶在不同pH值下的贮存稳定性检测包含了含有10％MPG和0.2％ ProxelTM的0.25M甘氨酸缓冲液的液体制剂中嗜热毁丝霉漆酶(250 LAMU/g)的剩余活性。
从图4中可看出试验结果。该漆酶在pH9.0下最稳定，其中在25℃和40℃下储存4周后，分别保留了93％和84％的活性。实施例8嗜热毁丝霉漆酶在40℃下储存21周嗜热毁丝霉漆酶分别在液体制剂1和2中，于40℃下(pH9.0)储存21周。制剂1250 LAMU/g(或3.1mg酶蛋白质/g)10％ w/w丙二醇0.2％ ProxelTM0.25M甘氨酸缓冲液(从2M甘氨酸缓冲液配制，其中pH值用4N NaOH调节到9.0)将所有成分充分搅拌，pH调至9.0±0.1，并加入软化水到终体积。制剂2250 LAMU/g(或3.1mg酶蛋白质/g)10％ w/w丙二醇3％ w/w葡萄糖0.2％ ProxelTM0.25M甘氨酸缓冲液(用2M甘氨酸缓冲液配制，其中pH用4N NaOH调节到pH9.0)将所有成分充分搅拌，pH调至9.0±0.1，并加入软化水到终体积。
图6显示了试验结果。相对剩余活性相对的是保持在4℃下的相应制剂(空溶液)，即在4℃下的剩余活性被认为是100％剩余活性。
从图6可看出，在40℃下储存20周后，制剂1(10％ w/w丙二醇)的剩余活性约为65％，制剂2(10％ w/w丙二醇+3％ w/w葡萄糖)的剩余活性约为90％。
权利要求
1.一种液体制剂，它包含(i)漆酶，(ii)至少一种多元醇，该制剂具有比所述漆酶的最佳pH值更偏碱性的pH值。
2.按照权利要求1的液体制剂，其中所述多元醇是聚合物或其单体，或糖，如单糖、二糖、低聚糖或多糖。
3.按照权利要求2的液体制剂，其中多元醇是聚烯化氧(PAO)，诸如聚亚烷基二醇(PAG)，包括聚甲二醇(PMG)、聚乙二醇(PEG)、甲氧基聚乙二醇(mPEG)和聚丙二醇，聚乙烯醇(PVA)，乙烯-马来酸酐共聚物，苯乙烯-苹果酸酐共聚物，葡聚糖，包括羧甲基葡聚糖，纤维素，包括甲基纤维素、羧甲基纤维素、乙基纤维素、羟乙基纤维素、羧乙基纤维素和羟丙基纤维素，脱乙酰壳多糖的水解产物，淀粉，如羟乙基淀粉和羟丙基淀粉，糖原，甘油，山梨醇，琼脂糖及其衍生物，瓜尔胶，支链淀粉，菊粉，黄原胶，角叉菜胶，果胶，藻酸水解产物，生物聚合物，山梨醇，葡萄糖，甘露糖，半乳糖，阿拉伯糖，古洛糖，木糖，苏糖，山梨糖，果糖，甘油，麦芽糖纤维二糖，蔗糖，直链淀粉，支链淀粉，单丙二醇(MPG)。
4.按照权利要求2-3任一项所述的液体制剂，其中聚合物和/或糖被用作多元醇。
5.按照权利要求2-4任一项所述的液体制剂，其中聚合物是聚烯化氧(PAO)，优选为聚亚烷基二醇(PAG)，特别是丙二醇。
6.按照权利要求2-4任一项所述的液体制剂，其中的糖是葡萄糖。
7.按照权利要求2-6任一项所述的液体制剂，其中聚合物和/或糖的分子量为200da至8000da，优选400到7000da，尤其是6000da。
8.按照权利要求1-7任一项所述的制剂，其中多元醇占该液体制剂的5至75％，优选10至60％，尤其是20至50％。
9.按照权利要求1-8任一项所述的制剂，其中加入pH调节剂来调节该液体制剂的pH值。
10.按照权利要求1-9任一项所述的制剂，其中该液体制剂的pH值比所述漆酶的最佳pH更偏碱性0.5到5.5个pH单位，优选更偏碱性1到4个pH单位。
11.按照权利要求1-10任一项所述的制剂，其中漆酶来源于植物或微生物，特别是来源于细菌或真菌。
12.按照权利要求11的制剂，其中漆酶来自毁丝霉属的丝状真菌，特别是来自嗜热毁丝霉。
13.按照权利要求12的制剂，其中该制剂的pH在7到12之间，优选在7.5到11之间。
14.按照权利要求11的制剂，其中漆酶来自多孔菌属的丝状真菌，特别是来自筛孔多孔菌。
15.按照权利要求14的制剂，其中该制剂的pH在5.5到11的范围内，优选6.5至9.5。
16.按照权利要求1-15任一项所述的制剂，其中进一步包含抗微生物剂、分散剂和/或粘度调节剂。
17.按照上述任一项权利要求所述的制剂，其中该液体制剂是水基制剂。
18.改善漆酶贮存稳定性的方法，是通过将该漆酶在多元醇的存在下、在比该漆酶最佳pH值更偏碱性0.5到5.5个pH单位的pH值下进行贮存而实现的。
19.按照权利要求1-17任一项所述的包含漆酶的液体制剂在个人护理，如染发中的用途。
20.按照权利要求1-17任一项所述的包含漆酶的液体制剂在织物的漂白或染色中的用途。
全文摘要
本发明涉及一种包含漆酶的耐贮存液体制剂,它包含:(i)漆酶,(ii)至少一种多元醇,该制剂的pH比漆酶的最佳pH更偏碱性。本发明的另一个目的是提供一种改善包含漆酶的液体制剂的贮存稳定性的方法,以及所述液体制剂在个人护理、或漂白、或纺织品中的应用,例如用于织物的染色。
文档编号C12R1/645GK1250475SQ9880327
公开日2000年4月12日 申请日期1998年3月10日 优先权日1997年3月12日
发明者N·H·索伦森, G·拉斯穆森, L·R·亨里克森 申请人:诺沃挪第克公司