在植物中合成长链多不饱和脂肪酸的方法和组合物的制作方法

专利名称：在植物中合成长链多不饱和脂肪酸的方法和组合物的制作方法
相关申请的相互参考本申请是1997年4月11日提交的USSN08/834,655的部分继续申请，并是1997年4月11日提交的USSN08/833,610、1997年4月11日提交的USSN08/834,033和1997年10月24日提交的USSN08/956,985的部分继续申请。这些公开文本在此引入作为参考。
引言发明领域本发明涉及调节能改变一种宿主植物中长链多不饱和脂肪酸(PUFAS)的产生的酶和/或酶成分的水平。本发明用植物中PUFAS的产生举例说明。背景多不饱和脂肪酸(PUFAs)的两个主要家族为ω3脂肪酸如花生四烯酸和ω6脂肪酸如二十碳五烯酸。PUFAs是细胞原生质膜的重要成分，在那里，它们以磷脂的形式存在。PUFAs还是人和动物体内其他重要分子包括前列环素、白三烯和前列腺素的前体。PUFAs对于正常发育特别是婴儿脑部发育以及组织的形成和修复来说是必需的。
四种主要的重要长链PUFAs包括二十二碳六烯酸(DHA)、二十碳五烯酸(EPA)、γ-亚麻酸(GLA)和Stearidonic acid(SDA)，DHA和EPA主要见于不同种类的鱼油，GLA见于多种植物包括月见草(Oenothera biennis)、琉璃苣(Borago officinalis)和黑茶簏子(Ribes nigrum)的种子，SDA见于海产油和植物种子。GLA和另一种重要的长链PUFA---花生四烯酸(ARA)都见于丝状真菌。ARA可从动物组织包括肝脏和肾上腺中纯化。
对于DHA来说，存在多种商业生产来源，包括多种海洋生物、获自冷水海鱼的油和蛋黄部分。对于ARA来说，微生物包括被孢霉属、虫霉属、腐霉属和紫球藻属可用于商业生产。SDA的商业来源包括毛束草属和蓝蓟属。GLA的商业来源包括月见草、黑茶簏子和琉璃苣。但是，从天然原料商业生产PUFAs伴随有几个不利之处。PUFAs的天然原料例如动物和植物趋向于具有高异质的油成分，因此由这些原料获得的油需要充分地纯化来分离一种或多种所需的PUFAs或来生产一种富集了一种或多种PUFA的油。天然原料的获得还受制于不能控制的波动。鱼资源可能天然改变或可能由于过度捕捞而缺乏。鱼油有着令人讨厌的味道和气味，这种味道和气味几乎不可能从所需的产品中用商业化的方法去除，从而使这种产品不能作为保健食品。动物油特别是鱼油能积累环境污染物。气候和疾病可导致鱼和植物原料产量的波动。可用来生产替代油的作物的耕地受到人口持续增长以及伴随而来的、不断增加的、在剩余的耕地上进行食品生产的需求的竞争。能够产生PUFAs的作物如琉璃苣并没有进行商业种植，而且在单种栽培时可能不理想。因此在更有价值和技术更成熟的作物能够生长的地方种植这种作物是没有商业竞争力的。有机体如被孢霉的大规模发酵也非常昂贵。天然动物组织含有较低数量的ARA，并且难以加工。微生物如Porphyridium和被孢霉从商业尺度来说难以培养。
含有PUFAs的保健食品和药物制剂能保留PUFA来源的缺陷。保健品如鱼油胶囊可能只含有低水平的特定所需成分，因而需要较大的剂量。高剂量会导致高水平的有害成分包括污染物的摄入。在提供脂肪酸保健品时必需小心，因为过分添加可能导致内源生物合成途径的抑制，并导致与体内其他不同脂成分的必需脂肪酸竞争，从而产生有害的结果。例如食物中含高水平的ω-3脂肪酸的爱斯基摩人容易流血(U.S.Pat.No.4,874,603)。保健品中令人讨厌的味道和气味使这种食谱难以接受，从而阻碍病人的顺应性。
多种酶参与PUFA的生物合成。亚油酸(LA，182Δ9，12)由一种Δ12脱氢酶从油酸(181Δ9)产生。GLA(183Δ6，9，12)由一种Δ6脱氢酶从亚油酸(LA，182Δ9，12)产生。ARA(204Δ5，8，11，14)从DGLA(203Δ8，11，14)产生由一种Δ5脱氢酶催化。但是，动物不能在Δ9位置以外去饱和，因此不能将油酸(181Δ9)转变为亚油酸(182Δ9，12)。同样，哺乳动物不能合成α-亚麻酸(ALA，183Δ9，12，15)。其他的真核细胞包括真菌和植物含有能在位置Δ21和Δ15去饱和的酶。因此，动物的主要多不饱和脂肪酸来源于食物和/或由亚油酸(182Δ9，12)或∝-亚麻酸(183Δ9，12，15)去饱和和延长来衍生。
多不饱和脂肪酸被认为适用于营养、药物、工业和其他目的。由天然原料和化学合成提供的多不饱和脂肪酸非常昂贵，难以满足商业化的要求。因此，从天然产生这些脂肪酸的物种中获取参与PUFA生物合成的遗传物质，并将分离到的遗传物质单独或组合在一种能进行操作来允许商业规模的PUFAS产生的异源系统中进行表达，将十分有意义。
本发明进一步涉及含有本发明的长链脂肪酸的配方食品、保健食品或液体或固体形式的保健食品。这些配方食品和保健品可用于人或动物。
本发明的配方食品和保健品可进一步包含至少一种选自椰子油、豆油、菜籽油、甘油单酯和甘油二酯、葡萄糖、食用乳糖、电渗析乳清、电渗析脱脂乳、乳清、豆蛋白和其他蛋白水解物的常量营养物。
本发明的配方食品可进一步包含至少一种选自维生素A、C、D、E和B复合物的维生素，和至少一种选自钙、镁、锌、锰、钠、钾、磷、铜、氯、碘、硒和铁的矿物质。
本发明进一步涉及一种治疗患有摄取或产生多不饱和脂肪酸不足的病人的方法，该方法包括给予病人一种足以有效治疗病人的剂量的本发明的代用食品。
本发明进一步涉及本发明的物质的化妆品和药物组合物。
本发明进一步涉及药用载体中的转基因油。本发明进一步涉及含有转基因油的营养保健品、化妆品和婴儿配方食品。
本发明进一步涉及一种获得改变的长链多不饱和脂肪酸生物合成的方法，该方法包含以下步骤在转基因能够表达和细胞中长链多不饱和脂肪酸生物合成能够改变的条件下，培养一种细胞中含有一种转基因的微生物，该转基因编码一种转基因产物，这种转基因产物使一种脂肪酸分子在自所说脂肪酸分子的羧端的碳5，5或12处去饱和，其中该转基因与一种表达控制序列操纵连接。
本发明进一步涉及含有至少一种选自维生素、矿物质、碳水化合物、糖、氨基酸、游离脂肪酸、磷脂、抗氧化剂和酚类化合物的营养物质的药物组合物。相关文献用一种Δ6-脱氢酶产生γ-亚麻酸在USJPN5,552,306和USPN5,614,393中介绍。用高山被孢霉(Mortierella alpina)产生8，11-二十碳二烯酸在USPN5,376,541中公开。用沟鞭藻产生二十二碳六烯酸在USPN 5,407,957中介绍。从琉璃苣克隆一种Δ6-脱氢酶在PCT公开文本WO96/21022中介绍。克隆Δ9-脱氢酶在公开的专利申请PCT WO91/13972、EP 0 550 162 A1、EP 0 561 569 A2、EP 0644 263 A2和EP 0736 598A1以及USPN 5,057,419中介绍。从不同的有机体中克隆Δ12脱氢酶在PCT公开文本WO94/11516和USPN5,443,974中介绍。从不同的有机体中克隆Δ15脱氢酶在PCT公开文本WO93/11245中介绍。一种来自Thumbergia alata的Δ6棕榈酰-酰基载体蛋白脱氢酶及其在大肠杆菌中的表达在USPN 5,614,400中介绍。使用一种35S启动子在转基因大豆胚中表达一种大豆硬脂酰-ACP脱氢酶在USPN 5,443,974中公开。
发明简述本发明提供了在植物和植物细胞中制备多不饱和长链脂肪酸和脱氢酶的新型组合物和方法。这些方法涉及培养一种感兴趣的转化了一种在宿主植物细胞中有功能的表达盒的宿主植物细胞，该表达盒含有一个转录和翻译起始区域，该区域与编码一种能调节PUFAs产生的脱氢酶多肽的DNA序列的5’端框内连接。脱氢酶多肽的表达使参与PUFA生物合成的酶的浓度改变，结果使宿主植物细胞的PUFA谱改变。最感兴趣的是对植物组织和/或植物部位如叶、根、果实和种子中PUFA产生的选择控制。本发明适用于例如DHA、EPA、ARA和GLA的大规模生产，和适用于食用植物组织和/或植物部位的脂肪酸谱的改变。
本发明进一步包括一种纯化的、与SEQ ID NO1-SEQ ID NO52所示的核苷酸和多肽序列基本上相关或同源的核苷酸序列或多肽序列。本发明进一步涉及使用SEQ ID NO1到SEQ ID NO40所示的序列作为鉴定相关序列的探针、作为表达系统的成分、作为用于生产转基因油的系统的成分的方法。
附图简述

图1显示了多种有机体包括藻类、被孢霉和人中从棕榈酸(C16)合成花生四烯酸(204Δ5，8，11，14)和stearidonic acid(184Δ6，9，12，15)的可能途径。这些PUFAs可作为人和其他动物的其他重要分子包括前列环素、白三烯和前列腺素的前体，一些这样的重要分子在图中示出。
图2显示了同样从多种有机体中编辑的除ARA外的PUFAs包括EPA和DHA产生的可能途径。
图3A-E显示了高山被孢霉Δ6脱氢酶的DNA序列(SEQ ID NO1)和推导的氨基酸序列(SEQ ID NO2)。
图4显示了高山被孢霉Δ6脱氢酶氨基酸序列与其他的脱氢酶和相关序列(SEQ ID NO7、8、9、10、11、12和13)的并列比较。
图5A-D显示了高山被孢霉Δ12脱氢酶的DNA序列(SEQ ID NO3)和推导的氨基酸序列(SEQ ID NO4)。
图6显示了PCR片段(见实施例1)的推导的氨基酸序列(SEQ IDNO14)。
图7A-D显示了高山被孢霉Δ5脱氢酶的DNA序列(SEQ ID NO5)。
图8显示了Δ5脱氢酶的蛋白序列(SEQ ID NO6)与Δ6脱氢酶和相关序列(SEQ ID NO15、16、17和18)的并列比较。
图9显示了Ma29的蛋白序列与重叠群253538a的并列比较。
图10显示了Ma524的蛋白序列与重叠群253538a的并列比较。
序列表简述SEQ ID NO1显示了高山被孢霉Δ6脱氢酶的DNA序列。
SEQ ID NO2显示了高山被孢霉Δ6脱氢酶的氨基酸序列。
SEQ ID NO3显示了高山被孢霉Δ12脱氢酶的DNA序列。
SEQ ID NO4显示了高山被孢霉Δ12脱氢酶的氨基酸序列。
SEQ ID NO5显示了高山被孢霉Δ5脱氢酶的DNA序列。
SEQ ID NO6显示了高山被孢霉Δ6脱氢酶的氨基酸序列。
SEQ ID NO7-SEQ ID NO13显示了与高山被孢霉Δ6脱氢酶相关的氨基酸序列。
SEQ ID NO14显示了实施例1的一个PCR片段的氨基酸序列。
SEQ ID NO15-SEQ ID NO18显示了与高山被孢霉Δ5和Δ6脱氢酶相关的氨基酸序列。
SEQ ID NO19-SEQ ID NO30显示PCR引物序列。
SEQ ID NO31-SEQ ID NO37显示人核苷酸序列。
SEQ ID NO38-SEQ ID NO44显示人多肽序列。
SEQ ID NO45-SEQ ID NO46显示一种盘基网柄菌(Dictyostelium discoideum)脱氢酶的核苷酸和氨基酸序列。
SEQ ID NO47-SEQ ID NO50显示一种裂殖壶菌cDNA克隆的核苷酸和氨基酸序列。
优选实施方案的描述为保证对本发明的完全理解，提供如下定义Δ5脱氢酶Δ5脱氢酶是一种在脂肪酸羧基端的5和6碳原子之间引入一个双键的酶。
Δ6脱氢酶Δ6脱氢酶是一种在脂肪酸羧基端的6和7碳原子之间引入一个双键的酶。
Δ9脱氢酶Δ9脱氢酶是一种在脂肪酸羧基端的9和10碳原子之间引入一个双键的酶。
Δ12脱氢酶Δ12脱氢酶是一种在脂肪酸羧基端的12和13碳原子之间引入一个双键的酶。
脂肪酸脂肪酸是一组含有一个长烃链和一个末端羧基基团的化合物。脂肪酸包括如下
考虑到这些定义，本发明涉及提供新型DNA序列、DNA结构、方法和组合物来改变植物细胞中多不饱和长链脂肪酸的含量。植物细胞用含有一种编码能在植物细胞中增加一种或多种PFUA数量的多肽的DNA的表达盒转化。更符合需要的是，可以制备能将表达盒整合到一种宿主细胞的基因组中的整合结构。宿主细胞经过操作来表达一种编码一种(多种)具有去饱和活性的多肽的有义或反义DNA。“脱氢酶”是一种多肽，它能使一种或多种脂肪酸去饱和，来产生一种所需的单价的或多不饱和脂肪酸或其前体。“多肽”是指任何一种氨基酸链，而不考虑其长度或翻译后修饰如糖基化或磷酸化。所表达的酶的底物可以由宿主细胞产生或可以外源提供。
为在一种宿主细胞中成功表达，转化DNA与在宿主细胞中有功能的转录和翻译起始和终止调节区域操纵连接。含有要表达基因的结构可以以整合到宿主细胞的基因组中或以能在宿主细胞中自主复制的形式提供。为制备亚油酸(LA)，使用的表达盒一般包括一个能提供Δ12脱氢酶活性的表达盒，优选在一种能产生或摄取油酸的宿主细胞中。为制备ALA，使用的表达盒一般包括一个能提供Δ15或ω3脱氢酶活性的表达盒，优选在一种能产生或摄取LA的宿主细胞中。为制备GLA或SDA，使用的表达盒一般包括一个能提供Δ6脱氢酶活性的表达盒，尤其是在一种能分别产生或摄取LA或ALA的宿主细胞中。ω6型不饱和脂肪酸例如LA或GLA的制备优选在一种能产生ALA的植物中通过抑制Δ15或ω3型脱氢酶的活性来进行，这可通过提供一种Δ15或ω3的反义转录本的表达盒或通过破坏Δ15或ω3脱氢酶基因来完成。类似地，LA或ALA的制备优选在一种含有Δ6脱氢酶活性的植物中通过提供一种Δ6的反义转录本的表达盒或通过破坏Δ6脱氢酶基因来完成。油酸类似物的制备优选在一种含有Δ12脱氢酶活性的植物中通过提供一种Δ12的反义转录本的表达盒或通过破坏Δ12脱氢酶基因来完成。为制备ARA，一般使用一个表达盒来提供Δ5脱氢酶活性，尤其是在一种能产生或摄取DGLA的宿主细胞中。ω6型不饱和脂肪酸例如ARA的制备优选在一种能产生ALA的植物中通过抑制Δ15或ω3型脱氢酶的活性来进行，这可通过提供一种Δ15或ω3的反义转录本的表达盒或通过破坏Δ15或ω3脱氢酶基因来完成。
脂肪酸的转基因植物制备PUFAs的转基因植物制备与从天然原料如鱼或植物中纯化相比具有多种优点。从重组植物中制备脂肪酸能通过在宿主中提供新的合成途径或抑制不需要的途径来使天然产生的植物脂肪酸谱改变，从而提高所需PUFAs或其接合形式的水平，并降低不需要的PUFAs的水平。在转基因植物中制备脂肪酸还有一个优点，即可以在特定的组织和/或植物部位表达脱氢酶基因来使这些组织或部位的所需PUFAs的水平大大提高，从而使从这些组织进行回收具有更大的商业意义。例如，所需PUFAs可在种子中表达，而分离种子油的技术已经较为成熟。除了能为所需PUFAs的纯化提供原料外，种子油成分还可通过单独或与其他基因如延伸酶组合表达脱氢酶基因来使种子油具有一种浓缩形式的特定PUFA谱。然后就可将浓缩的种子油加入到动物乳和/或合成或半合成乳中来作为不可能或不需要哺乳时的婴儿配方食品，或用于成人或婴儿营养不良或疾病时。
为制备PUFAs，根据宿主细胞、可用的底物和所需的末端产物，有几种多肽特别是脱氢酶引起了人们的注意，它们包括那些能催化硬脂酸至油酸、LA至GLA、ALA至SDA、油酸至LA、LA至ALA的转变的多肽，其中包括能在Δ6、Δ9、Δ12、Δ15或ω3位置去饱和的酶。选择一种特定的具有去饱和活性的多肽，需要考虑的内容包括多肽的最适pH、该多肽是否是一种限速酶或其成分、所用的脱氢酶是否是合成所需的多不饱和脂肪酸所必需、和/或该多肽所需的辅因子。表达的多肽优选具有与其在宿主细胞中位置的生物化学环境相匹配的参数。例如，多肽可能在宿主细胞中与其他酶竞争底物。因此，在决定一种给定的多肽是否适合在一种给定的宿主细胞中改变PUFA的产生时，需要分析多肽的Km和比活。因此在一种特定情况下使用的多肽是能够在所考虑的宿主细胞中所具有的环境中有功能的多肽，而不是任何一种具有脱氢酶活性并具有所需的能改变一种所需PUFA的相应产生的特征的多肽。由棕榈酸(C16)合成花生四烯酸(204Δ5、8、11、14)的示意图在图1中显示。该途径的一个关键酶是一种能将DH-γ-亚麻酸(DGLA，二十碳三烯酸)转变为ARA的Δ5脱氢酶。图中还显示了由一种Δ6脱氢酶催化的α-亚麻酸(ALA)向stearidonicacid的转变。除ARA外的PUFAs包括EPA和DHA的产生示于图2。由硬脂酸(C18)合成花生四烯酸(204Δ5、8、11、14)中的一个关键酶是一种Δ6脱氢酶，该酶将亚油酸转变为γ-亚麻酸。图中还显示了由一种Δ6脱氢酶催化的α-亚麻酸(ALA)向stearidonic acid的转变。为制备ARA，所用的DNA序列编码一种具有Δ5脱氢酶活性的多肽。在具体情况下，它可与一种能产生具有Δ6脱氢酶活性的多肽的表达盒偶联，并任选与一种能产生Δ15转录产物反义序列的表达盒操纵连接。所用表达盒的组合的选择部分依赖于宿主细胞的PUFA谱。当宿主细胞Δ5脱氢酶活性受到限制时，Δ5脱氢酶的超表达一般单独就足以提供增强的ARA产生。
具有脱氢酶活性的多肽的来源具有脱氢酶活性的多肽和编码这种多肽的寡核苷酸的来源是能产生一种所需多不饱和脂肪酸的有机体。作为一个例子，能够产生ARA的微生物可用作Δ5脱氢酶基因的一种来源；能够产生GLA或SDA的微生物可用作Δ6脱氢酶和/或Δ12脱氢酶基因的一种来源；这种微生物包括，例如，属于被孢霉属、耳霉属、腐霉属、疫霉属、青霉属、紫球藻属、Coidosporium、毛霉属、链孢属、曲霉属、红酵母属、和虫霉属的微生物。在紫球藻属中，特别感兴趣的是血色紫球藻(Porphyridium cruentum)。在被孢霉属中，特别感兴趣的是长孢被孢霉(Mortierella elongata)，微小被孢霉(Mortierellaexigua)，喜湿被孢霉(Mortierella hygrophila)，拉曼被孢霉(Mortierella ramanniana)angulispora变种，和高山被孢霉。在毛霉属中，特别感兴趣的是卷枝毛霉(Mucor circinelloides)和爪哇毛霉(Mucorjavanicus)。
编码所需脱氢酶的DNA可用多种方法进行鉴定。例如，一种所需脱氢酶的来源如来自被孢霉的基因组或cDNA文库可用能用酶或化学方法进行检测的合成探针进行筛选，探针可由DNA、RNA、或非天然产生的寡核苷酸或其混合物制备。探针可由已知的脱氢酶的DNA用酶学方法合成来用于正常或降低严格条件的杂交方法。寡核苷酸探针也可用来对来源进行筛选，并且可以以已知脱氢酶的序列包括已知脱氢酶中的保守序列或获自所需纯化蛋白的肽序列为基础。以氨基酸序列为基础的寡核苷酸探针可进行简并来包容遗传密码的简并性，或可改变为来源有机体的优选密码子。寡核苷酸还可用作引物来对一种已知或可疑的来源的反转录mRNA进行PCR。PCR产物可以是全长的cDNA，或可以制备成一种用来获得全长cDNA的探针。另外，一种所需蛋白可全序列测定，并且编码该多肽的DNA可进行全合成。
一旦分离到所需的基因组或cDNA，可用已知的方法对其测序。本领域的技术人员都知道，这些方法会产生错误，因此对同一区域进行多次测序是常规，并且还可用来测量所获得的序列中的错误频率，特别是具有重复序列、大的二级结构或异常碱基组成的区域，例如含有高GC碱基含量的区域。当出现不一致时，可进行重新测序并可使用特殊的方法。特殊方法可包括用以下手段来改变测序条件不同的温度、不同的酶、能使寡核苷酸形成更高级结构的蛋白、改变的核苷酸如ITP或甲基化的dGTP、不同的凝胶组成如加入甲酰胺、不同的引物或处于问题区域不同距离的引物或不同的模板如单链DNA。也可进行mRNA测序。
就大多数而言，编码具有脱氢酶活性的多肽的序列中，一些或全部都来自一种天然原料。但在某些场合，例如，需要用宿主优选的密码子来对全部或部分密码子进行修饰以增强表达。宿主优选的密码子可用特定的感兴趣的宿主中表达量最大的蛋白中频率最高的密码子来确定。这样就可全部或部分合成具有脱氢酶活性的多肽的编码序列。全部或部分DNA也可合成来去除任何不稳定的序列或转录的mRNA中存在的二级结构区域。全部或部分DNA还可合成来将碱基组成改变成一种在所需宿主中更优选的碱基组成。合成序列及将序列连接的方法已在文献中详细介绍。体外诱变和选择、定点诱变或其他方法可用来获得天然产生的脱氢酶基因的突变，从而制备一种具有体内脱氢酶活性并具有更理想的在宿主细胞中功能所需的物理和动力学参数的多肽，例如长半衰期或一种所需多不饱和脂肪酸的较高产生率。
所需的cDNA具有少于60％A+T组成，优选少于50％A+T组成。在以20个碱基对的滑动窗口定域尺度进行衡量时，优选在cDNA中没有大于75％A+T组成的定域，在以60个碱基对的窗口进行衡量时，优选cDNA中没有大于60％A+T的定域，更优选没有大于55％A+T组成的定域。
高山被孢霉脱氢酶最引起人们注意的是高山被孢霉Δ5脱氢酶、Δ6脱氢酶和Δ12脱氢酶。Δ5脱氢酶含有446个氨基酸，其氨基酸序列示于图7。编码高山被孢霉Δ5脱氢酶的基因可在转基因微生物中表达来增加ARA从DGLA合成。其他与高山被孢霉Δ5脱氢酶DNA在序列上基本上相同或编码与高山被孢霉Δ5脱氢酶多肽在序列上基本上相同的多肽的DNA也可以使用。高山被孢霉Δ6脱氢酶含有457个氨基酸，其预期的分子量为51.8kD，其氨基酸序列示于图3。编码高山被孢霉Δ6脱氢酶的基因可在转基因植物或动物中表达来增加GLA从油酸或stearidonic acid(SDA)从ALA合成。其他与高山被孢霉Δ6脱氢酶DNA在序列上基本上相同或编码与高山被孢霉Δ6脱氢酶多肽在序列上基本上相同的多肽的DNA也可以使用。
高山被孢霉Δ12脱氢酶含有示于图5。编码高山被孢霉Δ12脱氢酶的基因可在转基因植物中表达来增加LA从油酸合成。其他与高山被孢霉Δ12脱氢酶DNA在序列上基本上相同或编码与高山被孢霉Δ12脱氢酶多肽在序列基本上相同的多肽的DNA也可以使用。
在序列上基本相同是指这样一种氨基酸序列或核酸序列，该氨基酸序列或核酸序列能显示与高山被孢霉Δ5脱氢酶氨基酸序列或编码该氨基酸序列的核酸序列具有优选为至少60％、80％、90％或95％的同源性。就多肽来说，比较序列的长度一般为至少16个氨基酸，优选为至少20个氨基酸，更优选为35个氨基酸。就核酸来说，比较序列的长度一般为至少50个核苷酸，优选为至少60个核苷酸，更优选为至少75个核苷酸，最优选为110个核苷酸。典型的同源性用序列分析软件来测定，例如Genetics Computer Group，University ofWisconsin Biotechnology Center，1710 University Avenue，Madison，Wisconsin 53705的序列分析软件包、MEGAlign(DNAStar，Inc.，1228 S.Park St.，Madison，Wisconsin 53715)、和MacVector(Oxford Molecular Group，2105 S.Bascom Avenue，Suite200，Campbell，California 95008)。这些软件通过确定各种取代、删除和其他修饰的同源程度来使相似序列匹配。保守取代通常包括下列各组取代甘氨酸和丙氨酸；缬氨酸、异亮氨酸和亮氨酸；天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺；丝氨酸和苏氨酸；赖氨酸和精氨酸；以及苯丙氨酸和酪氨酸。取代也可以以保守的疏水性或亲水性(Kyte和Doolittle，J.Mol.Biol.157105-132，1982)或以保证相似的多肽二级结构(Chou和Fasman，Adv.Enzyomol.4745-148，1978)的能力为基础来进行。
其他脱氢酶本发明的范围还涉及来自相同或其他有机体的相关脱氢酶。这种相关的脱氢酶包括在相同或不同被孢霉中天然产生的已公开Δ5、Δ6和Δ12脱氢酶的突变体以及来自其他物种的已公开Δ5脱氢酶的同源物和具有脱氢酶活性的进化上相关的蛋白。还包括虽然不与高山被孢霉Δ5脱氢酶基本上相同但能分别在一种脂肪酸分子的羧基端的5、6或12碳原子处催化脂肪酸的去饱和的脱氢酶。相关脱氢酶可用其基本上与已公开的脱氢酶相同的功能来鉴定，即也能够有效将DGLA转变为ARA、LA转变为GLA、ALA转变为SDA或油酸转变为LA。相关脱氢酶还可通过在序列数据库中筛选与已公开脱氢酶同源的序列、用一种以已公开脱氢酶为基础的探针与一种由来源有机体构建的文库杂交、或使用来自来源有机体的mRNA和以已公开脱氢酶为基础的引物进行RT-PCR来进行鉴定。这种脱氢酶包括来自人、盘基网柄菌和三角褐指藻的脱氢酶。
一个脱氢酶中对于脱氢酶活性来说重要的区域可通过常规诱变、表达所获得的突变多肽、确定其活性来确定。突变可包括删除、插入和点突变或它们的组合。一个典型的功能分析从删除突变开始，以确定对功能必需的蛋白N-和C-末端极限，然后进行内部删除、插入或点突变来进一步确定对功能来说是必需的区域。其他技术如盒式诱变或全合成也可以使用。删除突变可用例如外切核酸酶以顺序移去5’或3’编码区来完成。这些技术可使用试剂盒。删除后，可将含有起始或终止密码子的寡核苷酸分别与5’或3’删除后的删除编码区连接来使编码区完整。另外，可通过多种方法包括定点诱变、诱变PCR或与在存在的限制酶切位点上消化的DNA连接来将编码起始或终止密码子的寡核苷酸插入编码区。内部删除可用类似的方法来完成，这些方法包括，使用DNA中存在的限制内切酶位点、使用突变引物进行定点诱变或诱变PCR。插入可通过如接头扫描诱变、定点诱变或PCR诱变的方法来进行。点突变可用如定点诱变或诱变PCR的技术来完成。
化学诱变也可用来确定对一种脱氢酶多肽的活性来说是重要的区域。表达一种突变结构，并分析所获得的改变蛋白的脱氢酶功能。这种结构功能分析可确定哪个区域可被删除，哪个区域能忍受插入、以及哪种点突变能使突变蛋白的功能与天然脱氢酶的功能基本上相似。所有这样的突变蛋白和编码它们的核苷酸序列都在本发明的范围内。
脱氢酶基因的表达当获得了编码一种脱氢酶多肽的DNA后，将其置于一个能在一种宿主中复制的载体中，或在体外用技术如PCR或长链PCR进行增殖。复制型载体包括质粒、噬菌体、病毒、粘粒等。理想的载体包括那些用于对所感兴趣基因进行诱变或用于所感兴趣基因在宿主细胞中表达的载体。长链PCR技术使大结构的体外增殖成为可能，因此，对所感兴趣的基因进行修饰如诱变或加入表达信号以及对所产生的结构进行扩增可完全在体外进行，而不需要使用一种复制载体或一种宿主。
为表达一种脱氢酶多肽，有功能的转录和翻译起始和终止区域被操纵连接到编码脱氢酶多肽的DNA上。转录和翻译起始和终止区域来自多种非限制性的来源，包括要表达的DNA、已知或怀疑能在所需系统中表达的基因、表达载体、化学合成、或来自一种宿主细胞的内源基因座。在一种植物组织和/或植物部位中表达具有特定的优势，特别是当组织或部位容易收获时，例如种子、叶、果实、花、根等。可通过使用特殊的调节序列如USPN5,463,174、USPN4,943,674、USPN5,106,739、USPN5,175,095、USPN5,420,034、USPN5,188,958和USPN 5,589,379中的调节序列来使表达定向于植物的特定位置。另外，表达的蛋白可以是一种酶，这种酶产生一种能直接或经过进一步修饰后掺入到宿主植物的液体部分中。在本文中，脱氢酶基因或反义脱氢酶转录物的表达能改变植物部分和/或植物组织中发现的特殊PUFAs或其衍生物的水平。Δ5脱氢酶多肽编码区单独或与其他基因一起表达，来产生含有高含量的所需PUFAs的组织和/或植物部位，或PUFA组成与人乳非常相似的组织和/或植物部位(Prieto et al.，PCT公开文本WO 95/24494)。终止区可来自获得起始区的基因的3’区或来自一个不同的基因。大量的终止区已知和被发现适用于来自相同和不同属和种的各种宿主。终止区一般按方便而不是因为任何具体的特性进行选择。
宿主细胞的选择部分受转基因细胞的所需PUFA谱和宿主细胞的天然谱的影响。例如，为由油酸制备亚油酸，所用的DNA序列编码一个具有Δ12脱氢酶活性的多肽，为由亚油酸制备GLA，所用的DNA序列编码一个具有Δ6脱氢酶活性的多肽。一种表达Δ12脱氢酶活性并且缺乏或被删除了Δ5脱氢酶活性的宿主细胞的使用，可与一种能单独提供Δ6脱氢酶超表达的表达盒联合使用，这一般足以在转基因细胞中提供提高的GLA产生。当宿主细胞表达Δ9脱氢酶活性时，同时表达一种Δ12和Δ6脱氢酶能提供提高的GLA产生。在Δ6脱氢酶活性的表达与Δ12脱氢酶活性的表达偶联的具体场合，需要宿主细胞天然具有或被突变为具有低Δ5脱氢酶活性。另外，一种用于Δ6脱氢酶表达的宿主细胞可以具有或被突变为具有高的Δ12脱氢酶活性。
在宿主细胞中的表达可以以一种瞬时或稳定的方式完成。瞬时表达可由导入的含有在宿主细胞中有功能的表达信号的结构来产生，但这种结构在宿主细胞中不能复制，并且很少整合，或者宿主细胞不能增殖。瞬时表达也可通过诱导一种与感兴趣基因操纵连接的调节启动子的活性来完成，虽然这种诱导系统通常显示一种低的基础表达水平。稳定表达可通过导入一种能整合到宿主基因组中或能在宿主细胞中自主复制的结构来完成。感兴趣基因的稳定表达可使用位于表达结构上或与表达结构一起转染的选择标记，接着选择表达该标记的细胞来进行选择。当稳定表达是整合产生时，结构的整合可随机发生在宿主基因组中，或可通过使用含有与宿主基因组同源性足以与宿主基因座进行靶向重组的区域的结构来进行定向。当结构被定向于一个内源基因座时，所有或一些转录和翻译调节区域可由内源基因座提供。
当需要在来源植物中脱氢酶多肽的表达提高时，可以使用多种方法。编码脱氢酶多肽的额外基因可被引入到宿主有机体中。天然脱氢酶基因座的表达也可通过同源重组的方法来提高，例如通过将一个强启动子插入到宿主基因组中来提高表达，通过从宿主基因组中删除信号来从mRNA或编码蛋白中去除不稳定的序列，或通过在mRNA中加入稳定序列(见USPN4,910,141和USPN5,500,365)。
当需要表达一种以上的不同基因时，可使用合适的调节区域和表达方法，导入的基因可在宿主细胞中通过使用复制载体或通过整合到宿主基因组中进行扩增。当两个或更多的基因在分开的复制载体上表达时，每个复制载体都需要不同的复制方式。每种导入的结构，不管是整合的还是非整合的，都应具有不同的选择方式，并应与另一个结构缺乏同源性，来维持稳定表达并防止结构之间的元件重排。导入结构的调节区域、选择方法和增殖方法的明智选择可用实验来确定，这样所有的导入基因都以所需的水平表达来提供所需产物的合成。
含有感兴趣基因的结构可用标准技术导入一种宿主细胞中。这些技术包括转染、感染、粒子轰击、电转化、显微注射、刮擦、或其他将感兴趣基因导入宿主的方法(见USPN 4,743,548、USPN4,953,855、USPN 5,068,193、USPN 5,188,958、USPN 5,463,174、USPN 5,565,346和USPN 5,563,347)。为方便起见，一种用任何方法进行操作后摄取了一个DNA序列或结构的宿主细胞在这里将被称为“转化的”或“重组子”。所获得的宿主将至少有一个拷贝的表达结构，并根据该基因是否被整合到基因组中、是否被扩增或是否存在于一种具有多拷贝数的染色体外元件上，宿主可以具有两个或更多的表达结构拷贝。
转化的宿主细胞可通过选择导入结构上含有的一种标记进行鉴定。另外，一个独立的标记结构可与所需的结构一起导入，如同许多转化技术将许多DNA分子导入宿主细胞一样。通常，转化宿主根据其在选择培养基上生长的能力来选择。选择培养基可掺入一种抗生素或缺少一种未转化的宿主细胞生长所必需的因子，例如一种营养或生长因子。因此一种导入的标记基因可提供抗生素抗性，或编码一种必需生长因子或酶，并在转化的宿主细胞中表达时允许其在选择培养基上生长。理想的情况是，感兴趣的是针对卡那霉素和氨基糖苷G418的抗性(见USPN 5,034,322)。当表达的标记蛋白可被直接或间接检测时，也可对转化宿主进行选择。标记蛋白可单独表达或与其他蛋白融合表达。标记蛋白可用其酶活性进行检测，例如β-半乳糖苷酶能将底物X-gal转变为一种生色产物，荧光素酶可将荧光素转变为一种发光产物。标记蛋白可通过其光产生或改变的特性进行检测，例如，Aequorea victoria的绿色荧光蛋白在用蓝光照射时发荧光。抗体可用于检测标记蛋白或感兴趣蛋白上的一种，例如，分子标记物。表达标记蛋白或标记物的细胞可通过，诸如目测或通过技术如FACS或用抗体淘筛来进行选择。
使用上述方法制备的PUFAs和组合物在宿主植物组织和/或植物部分中可以以游离脂肪酸或接合物形式如酰基甘油、磷脂、硫脂或糖脂的形式被发现，并可用本领域熟知的多种方法从宿主细胞中抽提。这些方法可包括用有机溶剂抽提、超声波、使用如二氧化碳的超临界流体抽提、和物理方法如压榨、或者它们的组合。特别感兴趣的是用己烷或甲醇和氯仿进行抽提。在需要时，可使水层酸化来使带负电荷的部分质子化，从而促进所需产物分配到有机层中。抽提后，有机溶剂可在氮气流的环境中蒸发去除。在以接合物形式抽提时，产物可用酶或化学方法切割以释放游离脂肪酸或较低复杂程度的感兴趣接合物，然后进行进一步的操作来制备所需的终产物。在需要时，脂肪酸接合形式用氢氧化钾切割。
脂肪酸的纯化当需要进一步纯化时，可以使用标准的方法。这样的方法包括抽提、用尿素处理、分级结晶、HPLC、分级蒸馏、硅胶层析、高速离心或蒸馏，或这些技术的组合。反应基团如酸或烯基团的保护可在任何步骤用已知的技术例如烷基化或碘化来进行。使用的方法包括脂肪酸的甲基化以产生甲酯。类似地，保护性基团可在任何步骤移去。在需要时，含有ARA、DHA和EPA的级份的纯化可用尿素和/或分级蒸馏来完成。
脂肪酸的用途本发明的脂肪酸的用途有几种。以本发明的DNAs为基础的探针在分离相关分子的方法中或检测表达脱氢酶的有机体的方法中使用。当用作探针时，DNAs或寡核苷酸必须是可以检测的。这一般通过在一个内部位点如通过整合一个修饰的残基或在5’或3’末端加上一个标记来完成。这样的标记可被直接检测、可与一个被检测标记的第二分子结合、或可与一个未标记的第二分子和一个检测标记的第三分子结合。这个方法可扩大到只要在实践中能获得一个可信的检测信号而没有不能被接受水平的背景信号。第二、第三或桥连系统可包括针对其他任何分子包括标记或其他抗体的抗体的使用，并可使用任何能相互结合的分子，例如一种生物素-链亲和素/亲和素系统。检测标记一般包括放射性同位素、能够化学或酶学发光或改变光的分子、能够产生可检测的反应产物的酶、磁性分子、发荧光的分子或在结合后荧光或光发射特征改变的分子。标记方法的例子见于USPN5,011,770。另外，靶分子的结合可通过用等温滴定热量计测量探针与靶结合的溶液的热量变化来直接检测，或将探针或靶包被在一个表面并分别检测靶或探针结合而产生的从表面散射的光的改变来进行检测，如同用BIAcore系统所进行的。
用重组方法制备的本发明的PUFAs可应用于广泛的领域。用不同形式的PUFAs对人或动物进行补充不仅能导致加入的PUFAs的水平提高，而且也使其代谢衍生物的水平提高。例如，当固有的Δ6脱氢酶途径在一个个体中功能异常时，用GLA处理不仅导致GLA水平提高，也使下游产物如ARA和前列腺素的水平提高(见图1)。复杂的调节机制需要将多种PUFAs组合起来或加入不同的PUFAs的接合物来防止、控制或克服这种机制，以在一个个体中获得特定PUFAs的所需水平。
用本公开的方法制备的PUFAs或其衍生物可以用作膳食补充，特别是在婴儿配方食品中，用于正在进行静脉喂养的病人或用于防止或治疗营养不良。特殊的脂肪酸如EPA可用于改变婴儿配方食品中的组成来较好地模仿人乳中的PUFA组成。据报道人乳中占优势的三酰甘油是1、3-二-油酰基-2-棕榈酰，并且据报道2-棕榈酰甘油酯的吸收比2-油酰或2-lineoly甘油酯好(USPN 4,876,107)。通常，人乳具有的脂肪酸谱包含约0.15％至约0.36％的DHA、约0.03％至约0.13％的EPA、约0.30％至约0.88％的ARA、约0.22％至0.67％的DGLA和约0.27％至约1.04％的GLA。婴儿配方食品中GLA∶DGLA∶ARA的一个优选比例分别为约1∶1∶4至1∶1∶1。本领域的技术人员可以不经过多实验确定能提供这些PUFA比例的油的数量。PUFAs或含有它们的宿主细胞还可用作动物饲料添加剂来使一种动物的组织或乳脂肪酸组成改变为更适用于人或动物消费。
营养组合物本发明还包括营养组合物。本发明的组合物包括用于人体吸收的一切食品或制剂，包括用于肠胃吸收或肠胃外吸收，所述组合物在摄入身体以后(a)起到营养或组建组织或补充能量的作用和/或(b)维持、恢复或支持适当的营养状态或代谢功能。
本发明的营养组合物至少包括一种按照本发明方法生产的油或酸，并可以是固体或液体形式。另外，所述组合物可以包括可食用的常量营养物、维生素和矿物质，其含量适用特定用途的需要。所述成分的含量可根据以下条件而变化所述组合物是用于正常、健康的婴儿、儿童还是用于具有特殊要求的成年人，如伴随有某种代谢症状(例如，代谢障碍)的成年人。
可添加到所述组合物中的常量营养物的例子包括，但不限于食用脂肪、碳水化合物和蛋白。所述食用脂肪的例子包括，但不限于椰子油、大豆油、和甘油一酯和二酯。所述碳水化合物的例子包括，但不限于葡萄糖、食用乳糖和水解淀粉。另外，可用于本发明营养组合物中的蛋白的例子包括，但不限于大豆蛋白、电渗析乳清、电渗析脱脂奶、乳清、或上述蛋白的水解产物。
就维生素和矿物质而言，可将下列成分添加到本发明的营养组合物中钙、磷、钾、钠、氯、镁、锰、铁、铜、锌、硒、碘和维生素A、E、D、C和B复合物。也可以添加诸如此类的其它维生素和矿物质。
用于本发明的营养组合物中的成分为半纯化或纯化来源。半纯化或纯化是指通过纯化天然材料或通过合成而制备的材料。
本发明的营养组合物的例子包括，但不限于婴儿配方食品、保健食品、和再水合组合物。特别感兴趣的营养组合物包括，但不限于用于为婴儿肠道和肠胃外补充营养的组合物，特殊的婴儿配方食品，老年人保健品，和供具有胃肠道疾病和/或吸收障碍的患者食用的保健品。
营养组合物本发明的典型的营养组合物含有食用常量营养物、维生素和矿物质，其用量符合特定用途的需要。所述成分的用量可根据下列条件而变化该制剂是用于临时受到胁迫的正常的、健康的个体，或用于由于某种慢性或急性疾病状态(例如，代谢障碍)而具有特殊要求的患者。本领域技术人员可以理解用于本发明营养制剂中的成分是半纯化的或纯化的。半纯化或纯化是指通过纯化天然材料或通过合成而制备的材料。以上技术在本领域中是众所周知的(例如，参见联邦食品成分和食品加工管理条例；推荐的饮食许可，第10版，国家学术出版社，华盛顿特区，1989)。
在一种优选实施方案中，本发明的营养制剂是一种肠道营养制品，更优选是一种成年人或儿童肠道营养制品。因此，在本发明的另一方面，提供了一种营养制剂，这种制剂适于喂养已经历胁迫的成年人。该配方食品除了本发明PUFAs之外，还包括常量营养物、维生素和矿物质，其用量被设计成能提供成年人的日常营养需要。
所述主要营养成分包括食用脂肪、碳水化合物和蛋白。代表性食用脂肪有椰子油、大豆油和甘油一酯和二酯，以及本发明的PUFAs油。典型的碳水化合物是葡萄糖、食用乳糖和水解玉米淀粉。典型的蛋白来源是大豆蛋白、电渗析乳清或电渗析脱脂奶或乳清、或上述蛋白的水解产物，不过也可以得到和使用其它蛋白来源。所述常量营养物以常见的营养化合物形式加入，其添加量相当于人乳汁中的含量或能量基础，即以每卡路里为基础。
用于制备液体和肠道营养配方食品的方法在本领域中众所周知，并在实施例中详细说明。
可以对肠道配方食品进行消毒，并随后用作随时食用(RTF)的基础或储存在浓缩液体或粉末中。所述粉末可以通过按对上述方法制备的肠道配方食品进行喷雾干燥制备，而且，通过使该浓缩物重新水合可以重构所述配方食品。成年人和婴儿营养配方食品在本领域中是众所周知的，并可以由商业渠道购买(由Abbott实验室的Ross产品部出售的Similac，Ensure，Jevity和Alimentum)。可将本发明的油或酸以下文所述的用量添加到上述任一种配方食品中。
在液体形式下，所述营养组合物的能量密度通常可以在大约0.6-3.0Kcals/ml范围内。在固体或粉末形式下，所述营养保健品可以含有大约1.2-9Kcals/g，优选3-7 Kcals/g。一般，液体制品的渗透压应当低于700mOsm，更优选低于660mOsm。
所述营养配方食品除了本发明的PUFAs之外通常还包括维生素和矿物质，以便帮助个体摄入所述物质的最低日常需求。除了上面列举的PUFAs之外，还需要为所述营养组合物补充锌、铜、和叶酸以及抗氧化剂。据信，上述物质也能加强受到胁迫的免疫系统，因此为所述个体带来进一步的好处。锌、铜或叶酸的存在是选择性的，而不是必需的，以便对免疫抑制产生有益影响。类似地，药物组合物中也已补充上述物质。
在一种更优选的实施方案中，所述营养组合物除了所述抗氧化剂系统和PUFAs成分之外还含有一种碳水化合物来源，其中，占所述碳水化合物至少5％的是一种可摄入的寡聚糖。在一种更优选的实施方案中，所述营养组合物另外含有蛋白、牛黄酸和肉碱。
通过公开方法制备的PUFAs或其衍生物可被用作食用替代品或保健品，特别是婴儿配方食品，用于对患者进行静脉输液或用于预防或治疗营养不良。通常，人类乳汁的脂肪酸分布为，包括大约0.15％至大约0.36％的DHA，大约0.03％至大约0.13％的EPA，大约0.30％至大约0.88％的ARA，大约0.22％至大约0.67％的DGLA和0.27％至大约1.04％的GLA。另外，有报导称人乳汁中的主要甘油三酯是1，3-二-油酰-2-棕榈酰，还报导说2-棕榈酰甘油酯的吸收好于2-油酰或2-亚油酰甘油酯的吸收(USPN4,876,107)。因此，本发明生产的诸如ARA、DGLA、GLA和/或EPA的脂肪酸可被用于改变婴儿配方食品的组成，以便更好地重现人乳汁的PUFA组成。具体地讲，用于药物和保健食品，特别是母乳替代品或添加物中的油类组合物优选包括ARA、DGLA和GLA中的一种或几种。更优选，所述油包括大约0.3-30％的ARA，大约0.2-30％的DGLA，和大约0.2-30％的GLA。
除了其浓度之外，可以调整ARA、DGLA和GLA的比例，以适应特定的最终用途。在制备母乳添加物或代用品时，油类组合物含有ARA、DGLA和GLA中的两种或两种以上，其比例大约为1∶19∶30至6∶1∶0.2。例如，动物乳汁的ARA∶DGLA∶DGL的比例为1∶19∶30至6∶1∶0.2，其中，包括中间比例，该中间比例优选为大约1∶1∶1，1∶2∶1，1∶1∶4。当与一种宿主细胞一起生产时，调整诸如ARA和DGLA的前体底物向ARA转化率和百分比可以精确控制PUFA的比例。例如，5-10％的DGLA向ARA转化的比例，可被用于产生约1∶19的ARA与DGLA的比例，而大约75-80％的转化率可被用于产生大约6∶1的ARA与DGLA的比例。因此，无论是在细胞培养系统还是在宿主动物中，按所述方法调节脱氢酶表达的时间、程度和特异性，可被用于调节PUFA的含量和比例。根据所使用的表达系统，例如，细胞培养物或能在其乳汁中表达油类的动物，还可以提取所述油类并以需要的浓度和比例重新混合。具有所述PUFA比例的油类可以通过以下标准方法确定。还可将PUFAs或含有它的宿主细胞用作动物保健食品，以便改变动物组织或乳汁脂肪酸的组成，使其更有利于人或动物吸收。
对于保健食品来说，可将纯化的PUFAs或其衍生物添加到烹饪油、脂肪或配制的人造黄油中，以便在正常使用时受体即可获得需要的量。还可将PUFAs掺入婴儿配方食品、营养保健品或其它食品中，还可将其用作消炎或胆甾醇降低剂。
药物组合物本发明还包括含有按照本文所披露的本发明的方法生产的一种或几种酸和/或所生成的油的药物组合物。更具体地讲，所述药物组合物可以包括一种或几种所述酸和/或油，以及一种标准的、众所周知的、无毒的、可以药用的载体、佐剂或载体，如磷酸缓冲的盐溶液、水、乙醇、多元醇、植物油、湿润剂或诸如水/油乳液的乳液。所述组合物可以是液体或固体形式。例如，所述组合物可以是片剂、胶囊、可摄取的液体或粉末、可注射的、或外用软膏或霜剂形式。
例如，服用的可行途径包括，口服、直肠使用和肠胃外使用。当然，服用的途径取决于需要的效果。例如，如果该组合物被用于治疗粗糙、干燥、或老化的皮肤，用于治疗受伤或烧伤的皮肤，或用于治疗受疾病或病症影响的皮肤或毛发，就可以涂在表皮上。
患者服用所述组合物的剂量可以由本领域普通技术人员根据诸如患者体重、患者年龄、患者的免疫状态等的各种因素确定。
例如，就剂型而言，所述组合物可以是溶液、分散剂、悬浮液、乳液或消毒的粉末，这种粉末可在以后重建。
另外，本发明的组合物还可用于美容目的。可将其添加到现有的化妆品组合物中，以便制成一种混合物，或者用作单一的组合物。
药物组合物还可被用于给个体服用PUFA成分。合适的药物组合物可以包括生理上可以接受的无菌水或非水溶液，分散剂，悬浮液或乳液，以及用于重建成用于摄入的无菌溶液或分散剂的无菌粉末。合适的含水和无水载体、稀释剂、溶剂或载体的例子包括水、乙醇、多元醇(丙二醇、聚乙二醇、和甘油等)，其合适的混合物，植物油(如橄榄油)和诸如油酸乙酯的可注射的有机酯。例如，对于分散剂来说，通过维持需要的粒度和通过使用表面活性剂可以维持合适的流动性。可能还需要增加等渗剂，例如，糖和氯化钠等。除了上述惰性稀释剂之外，所述组合物还可以包括诸如湿润剂、乳化剂和悬浮剂、增甜剂、香味剂和芳香剂的佐剂。
对悬浮液来说，除了所述活性化合物之外，还可以包含悬浮剂，例如，乙氧基化异十八烷醇，聚氧乙烯山梨醇和山梨聚糖酯，微晶纤维素，偏氢氧化铝、膨润土、琼脂-琼脂和黄蓍胶或上述物质的混合物等。
诸如片剂和胶囊的固体剂型可以用本领域众所周知的技术制备。例如，本发明的PUFAs可以用诸如乳糖、蔗糖和玉米淀粉的常规片剂基材制成片剂，所述片剂与诸如阿拉伯胶、玉米淀粉或明胶的粘结剂，诸如马铃薯淀粉或藻酸之类的崩解剂和诸如硬脂酸或硬脂酸镁的润滑剂组合。通过将所述赋形剂连同所述抗氧化剂和PUFA成分一起掺入明胶胶囊制备胶囊。掺入药用制剂中的抗氧化剂和PUFA成分的量应当落入上述规定的范围。
在本申请中，“治疗”一词是指预防或降低不需要的症状的发病率。例如，治疗免疫抑制是指预防这种抑制的发生或减弱这种抑制的量。术语“患者”和“个体”可以互换使用，这两个词都是指动物。本申请中所说的“动物”一词是指所有温血动物，包括，但不限于狗、人、猴子、和猿。在本申请中，“大约”一词是指根据具体应用在标明的范围或数量的基础上波动合理的量。在本说明书中所规定的所有数量或范围都应当被视为由术语“大约”修饰。
“剂量”和“用量”可以互换使用，并且是指在单一的方案中由患者摄取的营养或药物组合物的量，所述方案被设计用于输送有效量的抗氧化剂和结构甘油三酯。本领域技术人员容易理解的是，液体营养粉的单一剂量或用量应当提供上文所述量的抗氧化剂和PUFAs。所述剂量或用量应当是一个典型的成年人在一次用药时能够消耗的体积。所述量可以根据患者的年龄、体重、性别或医学症状而有很大的变化。不过，作为一般的原则，液体营养药物的单一用量或剂量应当被视为包括100-600ml的体积，更优选125-500ml，最优选125-300ml。
即使不需要对其饮食进行补充，也可将本发明的PUFAs添加到食品中。例如，可将所述组合物添加到任何类型的食品中，包括，但不限于人造黄油、改性黄油、奶酪、奶、酸奶、巧克力、糖果、小吃、沙拉油、烹饪油、烹饪脂肪、肉、鱼和饮料。
药用用途就药用用途(人用或兽用)而言，所述组合物通常通过口服服用，不过，可以通过能成功地吸收它的任何途径服用，例如，肠胃外(即皮下、肌内或静脉)，直肠或阴道或表皮使用，例如，作为皮肤软膏或洗液。本发明的PUFAs可以单独使用或与可以药用的载体或赋形剂组合使用。在可能的情况下，明胶胶囊是优选的口服剂型。上文所提出的保健食品也可以提供一种口服途径。本发明的不饱和酸可以缀合形式、或作为盐、酯、酰胺或所述脂肪酸的药物前体服用。本发明包括所有可以药用的盐；特别优选的是钠盐、钾盐或锂盐。还包括诸如N-烷基多羟胺盐，参见PCT公开文件WO96/33155。优选地酯是乙酯。作为固体盐，所述PUFAs还可以片剂形式服用。为了静脉内服用，可将所述PUFAs或其衍生物掺入诸如Intralipids的市售制剂中。典型的正常成年人血浆脂肪酸组成为，包括6.64-9.46％的ARA，1.45-3.11％的DGLA和0.02-0.08％的GLA。所述PUFAs或其代谢前体可以单独服用或用于与其它PUFAs组成的混合物一起使用。以便在患者体内达到正常的脂肪酸分布。如果需要，制剂的每一种成分可以分别以试剂盒形式提供，以便单独使用或多次使用。特定脂肪酸的典型剂量为每天0.1毫克至20克，或者甚至100克，而且，如果需要优选为每天10毫克至1、2、5或10克，或者它的摩尔当量的衍生物形式。肠胃外营养复合物包括以本发明所包括的甘油三酯为参数计算的重量百分比大约为2-30％的脂肪酸；优选为含有重量百分比大约占总PUFA组合物重量1-25％的GLA(USPN5,196,198)。可以选择性地添加其它维生素，特别是脂溶性维生素，如维生素A、D、E和L-肉碱。如果需要，可以添加诸如α生育酚的防腐剂，通常大约占其重量的0.1％。
合适的药物组合物可以包括生理学上能接受的无菌水溶液或非水溶液，分散剂，悬浮液或乳液，以及用于重建成无菌注射液或分散剂的无菌粉末。合适的水和非水载体、稀释剂、溶剂或载体的例子包括水、乙醇、多元醇(丙二醇、聚乙二醇和甘油等)，它们的合适的混合物，植物油(如橄榄油)和诸如油酸乙酯的可注射的有机酯。例如，对于分散剂来说，通过维持需要的粒度和通过使用表面活性剂可以维持合适的流动性。可能还需要增加等渗剂，例如糖和氯化钠等。除了上述惰性稀释剂之外，所述组合物还可以包括诸如湿润剂、乳化剂和悬浮剂、增甜剂、香味剂和芳香剂的佐剂。
对悬浮液来说，除了所述活性化合物之外，还可以包含悬浮剂，例如，乙氧基化异十八烷醇，聚氧乙烯山梨醇和山梨聚糖酯，微晶纤维素，偏氢氧化铝、膨润土、琼脂-琼脂和黄蓍胶或上述物质的混合物等。
一种特别优选的药物组合物含有溶解在水基质或溶剂中的二乙酰酒石酸单-和二甘油酯。二乙酰酒石酸单-和二甘油酯的HLB值大约为9-12，并且比现有的、HLB值为2-4的抗菌脂类明显更加亲水。所述现有的疏水脂类不能制成含水组合物。如本文所披露的，现在可将这种脂类与二乙酰酒石酸的单-和二甘油酯一起溶解到含水介质中。按照本实施方案，将二乙酰酒石酸的单-和二甘油酯(例如，DATEM-C120)与其它活性抗菌脂类(例如，182和120单甘油酯)一起熔化，并混合，以得到均匀的混合物。均匀性可以提高抗菌活性。该混合物可以完全分散在水中。在不添加二乙酰酒石酸的单-和二甘油酯、并且在导入水中之前与其它单甘油酯预混合的情况下这是不可能的。然后，可以在无菌条件下将所述含水组合物与生理上可以接受的稀释剂、防腐剂、缓冲液或制备喷雾剂或吸入剂所需要的推进剂混合。
本发明还包括用脂肪酸治疗多种疾病。含有本发明PUFAs的保健品可用于治疗血管成型术之后的再狭窄。可以用本发明的PUFAs治疗炎症、类风湿关节炎和哮喘及牛皮癣。有证据表明PUFAs可能参与了钙的代谢，表明本发明的PUFAs可用于治疗或预防骨质疏松和肾结石或尿路结石。
本发明的PUFAs可用于治疗癌症。业已证实恶性细胞具有改变了的氨基酸组成；业已证实添加脂肪酸能延缓其生长，并导致细胞死亡，并能增强其对化疗剂的感受性。业已证实GLA能引起癌细胞再表达E-钙粘蛋白细胞粘着分子，这种分子的丧失与入侵性转移瘤相关。给胰腺癌患者临床试验静脉服用水溶性GLA锂盐，从统计学上看显著提高了其存活率。PUFA保健品还可用于治疗与癌症相关的恶病质。
本发明的PUFAs还可用于治疗糖尿病(USPN4,826,877；Horrobin等，美国临床营养学杂志，57卷(增刊)，732S-737S)。在患糖尿病的动物体内业已证实了改变了的脂肪酸代谢和组成。这种改变业已表明与由糖尿病引起的某些长期并发症相关，包括视网膜病、神经病、肾病和生殖系统损伤。业已证实含有GLA的月见草油能预防并逆转糖尿病性神经损伤。
本发明的PUFAs可用于治疗湿疹，降低血压并提高数学得分。业已证实必需脂肪酸缺陷与湿疹相关，而且研究业已证实了用GLA治疗湿疹具有良好效果。还证实GLA能降低与紧张相关的血压升高。并能提高在计算测验中的表现。业已证实GLA和DGLA能抑制血小板聚集，引起血管舒张，降低胆甾醇含量，并抑制血管壁平滑肌和纤维组织的增殖(Brenner等，实验医学生物学进展，83卷，p.85-101，1976)。业已证实单独服用GLA或DGLA，或与EPA组合使用能降低或预防胃肠出血，以及其它由非类固醇抗炎药物引起的副作用(USPN4,666,701)。还证实GLA和DGLA能预防或治疗子宫内膜异位和经前综合症(USPN4,758,592)，并能治疗肌痛性脑脊髓炎和在病毒感染之后出现的慢性疲劳(USPN5,116,871)。
本发明PUFAs的其它用途包括用于治疗AIDS、多发性硬化、急性呼吸道综合症、高血压和炎性皮肤病。本发明的PUFAs还可用于供一般健康个体使用的配方食品，以及用于老年病治疗。
兽医用途应当指出的是，上述药物和营养组合物可用于动物和人类，因为动物存在着很多与人相同的需要和症状。例如，可将本发明的油或酸用于动物饲料添加剂。
提出以下实施例是为了说明目的，而不是为了限定。
实施例实施例1从高山被孢霉中分离Δ5脱氢酶核苷酸序列实施例2从高山被孢霉中分离Δ6脱氢酶核苷酸序列实施例3鉴定高山被孢霉Δ脱氢酶的Δ6脱氢酶同源物实施例4从高山被孢霉中分离Δ12脱氢酶核苷酸序列实施例5从高山被孢霉中分离细胞色素b5还原酶的核苷酸序列实施例6在面包酵母中表达高山被孢霉脱氢酶克隆实施例7Ma29转基因芸苔属植物叶的脂肪酸分析实施例8在欧洲油菜(Brassica napus)中表达高山被孢霉Δ6脱氢酶实施例9在欧洲油菜中表达高山被孢霉Δ12脱氢酶实施例10在欧洲油菜中同时表达高山被孢霉Δ6和Δ12脱氢酶实施例11在欧洲油菜中同时表达高山被孢霉Δ5和Δ6脱氢酶实施例12在欧洲油菜中同时表达高山被孢霉Δ5、Δ6和Δ12脱氢酶实施例13Δ6去饱和油的立体专一性分布实施例14转基因植物的脂肪酸组成实施例15通过杂交完成Δ6和Δ12脱氢酶在欧洲油菜中的组合表达实施例16在大豆中表达高山被孢霉脱氢酶实施例17人脱氢酶基因序列实施例1从高山被孢霉中分离Δ5脱氢酶核苷酸序列高山被孢霉通过一种Δ5脱氢酶从前体203产生花生四烯酸(ARA，204)。一个编码高山被孢霉的Δ5脱氢酶的核苷酸序列(见图7)通过PCR扩增用高山被孢霉1st链cDNA和简并寡核苷酸引物获得，简并寡核苷酸引物对应于Synechocystis和Spirulina的Δ6脱氢酶之间保守的氨基酸序列。所用的程序如下使用Hoge等(1982)Experimental Mycology 6225-232的方法从一种高山被孢霉的3天的产PUFA的培养物中分离总RNA。使用BRL’s Lambda-ZipLox系统按照厂商的指导用此RNA制备双链cDNA。将几个大小的高山被孢霉cDNA分别包装来制备具有不同平均大小插入子的文库。“全长”文库含有大约3×106克隆，平均插入大小为1.77kb。“测序级”文库含有大约6×105克隆，平均插入大小为1.1kb。
使用BRL Superscript RTase和引物TSyn 5’-CAAGCTTCTGCAGGAGCTCTTTTTTTTTTTTTTT-3’(SEQ ID NO19)将5ug的总RNA反转录。简并寡核苷酸被设计为两种蓝细菌的Δ6脱氢酶之间的保守区。使用的特异性引物为D6DESAT-F3(SEQ ID NO20)5’-CUACUACUACUACAYCAYACOTAYACOAAYAT-3’D6DESAT-R3(SEQ ID NO21)5’-CAUCAUCAUCAUOGGRAAOARRTGRTG-3’其中Y＝C+T，R＝A+G，O＝I+C。PCR在一个含有下述物质的25ul体积中进行由40ng总RNA衍生的模板、2pM的每种引物、200uM的每种脱氧核糖核酸三磷酸、60mM Tris-Cl、pH8.5、15mM(NH4)2SO4、2mM MgCl2。样品首先在95度(所有温度为摄氏)变性5分钟，然后在72度保温，加入0.2U的Taq聚合酶。PCR热循环条件如下94度1分钟、45度1.5分钟、72度2分钟。PCR连续进行35个循环。使用这些引物在高山被孢霉第一链cDNA上进行的PCR产生一条550bp的反应产物。比较高山被孢霉PCR片段的推导氨基酸序列显示了与Δ6脱氢酶(见图4)同源的区域。但是在比较的区域中只有约28％的同源性。该推导的氨基酸序列示于SEQ ID NO14。
该PCR产物被用作探针来从高山被孢霉文库分离相应的cDNA克隆。最长的cDNA克隆Ma29被命名为pCGN5521并对两条链进行完全测序。该cDNA以一个1481bp的插入子形式包含在载体pZL1中(Bethesda Research Laboratories)，并从第一个ATG开始，它包含一个编码446个氨基酸的开放阅读框。该阅读框含有由PCR片段推导的序列。该cDNA插入子的序列被发现含有与Δ6脱氢酶同源的区域(见图8)。例如，三个保守的“组氨酸盒”(它们已在其他膜结合脱氢酶中被发现(Okuley等，(1994)The Plant Cell 6147-158))被发现存在于被孢霉序列的氨基酸位置171-175、207-212和387-391(见图5A-5D)。但是，作为典型的被孢霉的第三组氨酸盒的“HXXHH”氨基酸基元被发现为QXXHH。编码蛋白的氨基端显示与细胞色素b5蛋白有明显的同源性。这样，该被孢霉cDNA克隆似乎代表一个细胞色素b5与一种脂肪酸脱氢酶的融合。因为细胞色素b5被认为作用为膜结合脱氢酶的电子供体，因此这种脱氢酶蛋白的N末端细胞色素b5区域可能参与其功能。这对于在异源系统中表达脱氢酶来生产PUFA是有优势的。
实施例2从高山被孢霉中分离Δ6脱氢酶核苷酸序列一个来自编码一种高山被孢霉的Δ6脱氢酶的部分cDNA克隆Ma524的核酸序通过对实施例1中介绍的来自高山被孢霉cDNA文库进行随机测序来获得。含有cDNA的质粒按下述方法进行酶切将5ul噬菌体与100ul培养于加有10ug/ml卡那霉素、0.2％麦芽糖和10mM MgSO4的ECLB中的DH10B(ZIP)混合，在37度温育15分钟。加入0.9ml的SOC，并立即将100μl细菌铺于10个含有ECLB+50ug青霉素的平板。不需要45分钟的复苏期。将平板在37度温育过夜。将克隆挑入ECLB+50ug青霉素培养基并过夜培养来制备甘油贮存物和小量制备DNA。将一份用作小量制备的培养物贮存为甘油贮存物。在ECLB+50ug青霉素/ml上铺板比在100ug/ml上铺板可产生更多的克隆和更高比例的含有插入子的克隆。
随机挑取克隆，使用Qiagen小量制备试剂盒纯化质粒DNA。从cDNA插入子的5’末端获得DNA序列，并使用BLAST算法与数据库比较。根据与以前鉴定的Δ6脱氢酶的DNA序列同源性，Ma524被鉴定为一个可能的Δ6脱氢酶。从高山被孢霉文库分离了一个全长的cDNA克隆。此克隆的丰度似乎略少于(2X)Ma29。Ma524与一种Caenorhabditis elegans粘粒---WO6D2.4以及公共数据库中来自集胞蓝细菌属和螺旋蓝细菌属的两种Δ6脱氢酶显示有明显的同源性，WO6D2.4是一种来自向日葵的细胞色素b5/脱氢酶融合蛋白。
此外，Ma524显示与琉璃苣Δ6脱氢酶序列(PCT公开文本WO96/21022)有明显的同源性。这样Ma524显示编码一种与琉璃苣和藻类Δ6脱氢酶相关的Δ6脱氢酶。应当注意，虽然Ma524的氨基酸序列和琉璃苣的Δ6相似，它们的碱基组成却很不相同琉璃苣的cDNA具有60％A+T的全部碱基组成，其中某些区域超过70％，而Ma524具有平均为44％A+T组成，没有区域超过60％。这可为在具有不同偏好的碱基组成的微生物或动物中表达cDNAs提供指导。已知当宿主具有与导入基因非常不同的碱基组成时，重组基因的表达不好。这种表达不好的推测机制包括mRNA的稳定性或转录性降低。
实施例3鉴定高山被孢霉Δ6脱氢酶的Δ6脱氢酶同源物使用Ma524氨基酸序列在NCBI对est数据库进行BLASTX检索鉴定了编码可能的Δ6脱氢酶的核酸序列。几个序列显示明显的同源性。具体地说，两种拟南芥菜序列的推导氨基酸序列(登记号F13728和T42806)与Ma524的推导氨基酸序列两个不同区域显示同源。设计下面的PCR引物ATTS4723-FOR(与F13728互补)5’-CUACUACUACUAGGAGTCCTCTACGGTGTTTTG，SEQ ID NO22和T42806-REV(与T42806互补)5’-CAUCAUCAUCAUATGATGCTCAAGCTGAAACTG，SEQ ID NO23。使用BRL Superscript RTase和引物TSyn 5’-CCAAGCTTCTGCAGGAGCTCTTTTTTTTTTTTTTT-3’，(SEQ ID NO24)将5ug分离自拟南芥菜正在发育的长角果的总RNA反转录。PCR在一个含有下述物质的50ul体积中进行由25ng总RNA衍生的模板、2pM的每种引物、200uM的每种脱氧核糖核酸三磷酸、60mM Tris-Cl、pH8.5、15mM(NH4)2SO4、2mM MgCl2、0.2U的Taq聚合酶。循环参数如下94度30秒、50度30秒、72度30秒。PCR连续进行35个循环，接着再在72度延伸7分钟。PCR产生一个约750碱基对的片段，接着将此片段亚克隆，命名为12-5，并测序。该片段的每个末端对应于获得PCR引物的Arabidopsis est。这就是命名为12-5的序列。将12-5的推导氨基酸序列与Ma524和来自人(W28140)、鼠(W53753)和C.elegans(R05219)的序列在图4中进行比较。根据同源性，这些序列代表脱氢酶多肽。使用以est序列为基础的引物可以克隆全长的基因。然后这些基因可被置于表达载体中，并在宿主细胞中表达。它们的Δ6或其他脱氢酶活性可按下面的介绍进行确定。
实施例4从高山被孢霉中分离Δ12脱氢酶核苷酸序列基于其积累的脂肪酸，高山被孢霉具有一种ω6型的脱氢酶。该ω6脱氢酶负责从油酸(181)产生亚油酸(182)。亚油酸是Δ6脱氢酶的一种底物。本实验被设计来确定高山被孢霉是否具有一种Δ12脱氢酶多肽，如果有，鉴定相应的核苷酸序列。按照在Ma524时介绍的方法(见实施例2)，根据DNA序列与以前鉴定的脱氢酶的同源性，一个来自高山被孢霉测序级文库的随机克隆---Ma648被测序并被鉴定为一种可能的脱氢酶。Ma648 cDNA的5’末端的推导氨基酸序列显示与大豆微粒体ω6(Δ12)脱氢酶(登记号#L43921)以及蓖麻籽油酸12-羟化酶(登记号#U22378)显示明显的同源性。此外，还观察到与多种其他的ω6(Δ12)和ω3(Δ15)脂肪酸脱氢酶序列的同源性。
实施例5从高山被孢霉中分离细胞色素b5还原酶的核苷酸序列一种编码高山被孢霉的细胞色素b5还原酶的核酸序列按下述方法获得。按实施例1的介绍以从高山被孢霉分离的总RNA为基础构建一个cDNA文库。从其中一个克隆M12-27的5’和3’末端获得DNA序列。用M12-27的3’末端推导的氨基酸序列对公共数据库进行检索显示了与已知的细胞色素b5还原酶序列具有明显的同源性。具体地说，在一个49个氨基酸的区域中，被孢霉克隆与猪的一种b5还原酶有55％的相同(77％同源性)(见图4)。
实施例6在面包酵母中表达高山被孢霉脱氢酶克隆酵母的乙酸锂转化按标准程序进行(Methods in Enzmology，Vol.194，p.186-187，1991)。简而言之，酵母在30℃培养于YPD中，离心细胞，重悬于TE，再离心，重悬于含有100mM乙酸锂的TE，再离心，并重悬于TE/乙酸锂。重悬酵母在30℃振荡温育60分钟。加入载体DNA，然后将酵母分装到试管中。加入转化DNA，并将试管在30℃温育30分钟。加入PEG溶液(35％(w/v)PEG4000，100mM乙酸锂，TE pH7.5)，接着在30℃温育50分钟。42℃下进行5分钟的热休克，沉淀细胞，用TE洗涤，再沉淀，并重悬于TE。然后将重悬的细胞铺于选择培养基。脱氢酶在转化的酵母中的表达来自高山被孢霉的cDNA克隆在面包酵母中筛选脱氢酶活性。使用一种油菜Δ15脱氢酶(使用来自欧洲油菜品种212/86的种子的1st链cDNA，使用以公开的序列(Arondel等，Science 2581353-1355)为基础的引物，用PCR的方法获得)作为阳性对照。将Δ15脱氢酶基因和来自cDNA克隆Ma29的基因置于表达载体pYES2(Invitrogen)中分别产生质粒pCGR-2和pCGR-4。将这些质粒转入酿酒酵母菌株334，并用半乳糖诱导后在存在能检测特殊酶活性的底物时表达。对照菌株是含有未改变的pYES2载体的酿酒酵母菌株334。所用的底物、产生的产物和标明的脱氢酶活性为DGLA(转变为ARA将表明Δ5脱氢酶活性)、亚油酸(转变为GLA将表明Δ6脱氢酶活性，转变为ALA将表明Δ15脱氢酶活性)、油酸(一种酿酒酵母产生的内源性底物，转变为亚油酸将表明Δ12脱氢酶活性，这种酶活性是酿酒酵母缺乏的)、或者ARA(转变为EPA将表明Δ17脱氢酶活性)。结果由下面的表1提供。脂部分按下述方法抽提培养物在15℃生长48-52小时。离心沉淀细胞，用无菌双蒸水洗涤一次，再沉淀。沉淀用甲醇振荡摇匀，加入氯仿和tritridecanoin(作为一种内在标准)。混合物在室温下至少温育1小时或在4℃温育过夜。抽提氯仿层，并滤过一张Whatman滤纸，并加入1克无水硫酸钠来去除颗粒和残余的水。有机溶剂在40℃在氮气流下蒸发。然后将抽提的脂衍生为脂肪酸甲酯(FAME)，并通过在一个封闭的试管中加入2ml的0.5N的氢氧化钾来进行气相色谱分析(GC)。将样品加热至95℃-100℃ 30分钟，并冷却至室温。加入大约2ml溶解在甲醇中的三氟化硼并重复加热。在抽提的脂混合物冷却后，加入2ml水和1ml己烷来抽提FAME进行GC分析。用产生的产物除以(产生的产物和加入的底物)总量然后乘以100来计算转化百分比。在计算油酸的转化百分比时，由于没有底物加入，产生的总亚油酸除以(产生的油酸和亚油酸)的总量，然后乘以100。
表1在面包酵母中表达高山被孢霉脱氢酶
Δ15脱氢酶对照克隆显示了16.3％的底物转化。表达Ma29 cDNA的pCGR-4克隆将15.3％的203底物转变为204w6，这说明该基因编码一种Δ15脱氢酶。在这些场合背景(底物的非特异性转变)在0-3％之间。表达Ma524 cDNA的pCGR-5克隆显示将6％的底物转变为GLA，这说明该基因编码一种Δ6脱氢酶。表达Ma648 cDNA的pCGR-7克隆将63.4％的底物转变为LA，这说明该基因编码一种Δ12脱氢酶。使用不同浓度的底物观察到了活性的底物抑制。当底物增加至100uM时，与底物加至25uM时相比转变为产物的百分比下降(见下文)。这些数据表明具有不同底物特异性的脱氢酶能在一种异源系统中表达，并能用于产生PUFAs。
表2显示了用从携带了指示的质粒的酵母酿酒酵母菌株334抽提的总脂的百分数表示的感兴趣脂肪酸。在生长培养基中没有葡萄糖。亲和气相色谱被用来分离相应的脂。进行GC/MS来验证产物的均一性。向诱导的酵母培养物中加入外源的底物亚油酸时，检测到了欧洲油菜Δ15脱氢酶的预期产物α-亚麻酸。这个发现证明一种脱氢酶基因的酵母表达在当前的培养条件下能产生有功能的酶和具有可检测数量的产物。虽然长链PUFA---二同-γ-亚麻酸(203)与亚油酸(182)相比，在以游离形式加入诱导的酵母培养物时，掺入酵母的略少，两种外源加入的底物都能被酵母摄取。当酿酒酵母334(pCGR-5)的表达和诱导中存在亚油酸时，可检测到γ-亚麻酸。这种PUFA的存在证明了来自pCGR-5的Δ6脱氢酶活性。从酿酒酵母334(pCGR-7)表达物抽提的脂中鉴定的亚油酸将来高山被孢霉的cDNA MA648分类为Δ12脱氢酶。
表2.从酵母中提取的总脂类的脂肪酸百分比
添加100μl底物
*181是酵母中的内源脂肪酸表的说明181＝油酸182＝亚油酸α-183＝α-亚麻酸γ-183＝γ-亚麻酸18；4＝stearidonic acid203＝二同-γ-亚麻酸204＝花生四烯酸实施例7在植物中表达Δ5脱氢酶在叶中表达本实验被设计来确定叶表达的Ma29(用Northern测定)是否能将外源加入的DGLA(203)转变为ARA(204)。
Ma29脱氢酶cDNA用PCR修饰来引入便于克隆的限制内切酶位点。脱氢酶编码区已用标准的方法(见USPN5,424,200和USPN5,106,739)插入了一个d35盒，并置于用于在芸苔叶中表达的双35S启动子的控制之下(pCGN5525)。含有pCGN5525的转基因芸苔植物按照标准的方法(见USPN5,188,958和USPN5,463,174)制备。
在第一个实验中，使用三种植物一个对照、LP004-1和两个转基因植物---5525-23和5525-29。LP004是一种低亚麻酸芸苔变种。选择每种植物的叶子进行三种处理中的一种水、GLA或DGLA。GLA和DGLA均以钠盐的形式购自NuChek Prep并按1mg/ml溶解于水。在N2下分装密封，并贮存于-70℃。在上表面滴加50ul处理叶，用戴手套的手指温和地将其涂开以覆盖整个表面。在光周期结束前共处理大约30分钟以减少所加脂肪酸的任何光氧化。处理6天后，每个处理收集一片叶，沿中脉切成两半。一半用水洗涤以除去未掺入的脂肪酸。将叶样品冻干过夜，用气相色谱(GC)测定脂肪酸组成。结果示于表3。
表3Ma29转基因芸苔属植株叶的脂肪酸分析
<p>表3-续Ma29转基因芸苔属植株叶的脂肪酸分析
<p>用GLA处理的叶含有1.56至2.4wt％的GLA。脂肪酸分析显示，对照和转基因叶的脂肪酸组成基本上相同。用DGLA处理的对照植物的叶含有1.2-1.9w％的DGLA和背景数量的ARA(.26-.27wt％)。转基因植物叶仅含有.2-.7wt％的DGLA，但ARA的水平提高(.74-1.1wt％)，这表明在这些叶中DGLA转变为ARA。在种子中表达本实验的目的是确定一种带有种子特异性napin启动子的结构是否能在种子中表达。
使用下面的引物，用PCR对Ma29 cDNA进行修饰，来分别在起始和终止密码子的上游和下游引入一个Xho I克隆位点。
Madxho-正向5’-CUACUACUACUACTCGAGCAAGATGGGAACGGACCAAGG(SEQ IDNO25)Madxho-反向5’-CAUCAUCAUCAUCTCGAGCTACTCTTCCTTGGGACGGAG (SEQ ID NO26)使用CloneAmp系统(GIBCOBRL)将PCR产物亚克隆到pAMP1(GIBCOBRL)，产生pCGN5522，Δ5脱氢酶序列用两条链测序进行验证。
为进行种子特异性表达，将Ma29编码区以一个Xho I片段的形式从pCGN5522中切出，并插入到napin表达盒---pCGN3223的Sal I位点，产生pCGN5528。将含有napin 5’调节序列、Ma29编码区和napin3’调节序列的pCGN5528 Hind III片段插入到pCGN1557的Hind III位点，产生pCGN5531。将两个拷贝的napin转录单位顺序插入。此顺序结构能允许每个遗传位点的脱氢酶高表达。通过农杆菌介导的转化将pCGN5531导入欧洲油菜cv.LP004。
成熟T2种子的20个种子混合物的脂肪酸组成用GC进行分析。表4显示用独立的转化品系与非转化的LP004种子进行比较获得的结果。含有pCGN5531的转基因种子含有两种在对照种子中不存在的脂肪酸，根据它们相对于油酸和亚油酸的洗脱，实验鉴定为taxoleicacid(5，9-182)和pinoleic acid(5，9，12-183)。它们是油酸和亚油酸的Δ5去饱和的预期产物。在转基因植物中没有发现其他的脂肪酸组成不同。
表4T2混合种子的组成
对植物进行Northern分析来鉴定表达Ma29的植物。在开花后大约25天或当napin启动子被诱导时分离正在发育的胚，并按实施例7中的介绍浸入含有GLA或DGLA的溶液。然后按照实施例7中用于叶的方法用GC对胚进行脂肪酸分析来确定DGLA转变为ARA的量。接着按实施例7用GC分析评价ARA被内源性芸苔属乙酰转移酶掺入三酰甘油的数量。
实施例8在欧洲油菜中表达高山被孢霉Δ6脱氢酶使用下列引物用PCR修饰Ma524 cDNA来导入克隆位点Ma524PCR-1(SEQ ID NO27)5’-CUACUACUACUATCTAGACTCGAGACCATGGCTGCTGCTCCAGTGTGMa524PCR-2(SEQ ID NO28)5’-CAUCAUCAUCAUAGGCCTCGAGTTACTGCGCCTTACCCAT这些引物允许扩增整个编码区，并在5’末端加入Xba I和Xho I位点，在3’末端加入Xho I和Stu I位点。使用CloneAmp系统(GIBCOBRL)将PCR产物亚克隆到pAMP1(GIBCOBRL)中产生pCGN5535，Δ6脱氢酶序列用两条链测序验证。
为进行种子特异性表达，将Ma524编码区以一个Xho I片段的形式从pCGN5535中切出，并插入到napin表达盒---pCGN3223的Sal I位点，产生pCGN5536。将含有napin 5’调节序列、Ma524编码区和napin 3’调节序列的pCGN5536 Not I片段插入到pCGN1557的Not I位点，产生pCGN5538。通过农杆菌介导的转化将pCGN5538导入欧洲油菜cv.LP004。
从在温室中进行的6个独立转化事件收获成熟的T2种子。用GC分析单一种子的脂肪酸组成。表5显示了对照LP004种子和6个5538品系的结果。除了#8所有的5538品系都产生含有GLA的种子。GLA的存在在这些种子中分离，正如对T2自交种子群体所预期的。除了GLA，高山被孢霉Δ6脱氢酶还能产生184(stearidonic)和另一种据信为6，9-182的脂肪酸。
上述结果显示，具有三种不同底物特异性的脱氢酶能在一种异源系统中表达，并能用于产生多不饱和长链脂肪酸。其例子为从前体203(DGLA)产生ARA(204)、从182底物产生GLA(183)和将181底物转变为182，后者是GLA的前体。
表5Ma524转基因Brassica植物种子的脂肪酸分析SPL 160161180 181 6，9 182182 183ga 183184 201220 221 240 241# ％ ％ ％ ％ ％ ％ ％ ％ ％ ％ ％ ％ ％LP004-14.33 0.21 3.78 72.49 013.970 1.701.34 0.710.020.580.27-24.01 0.16 3.09 73.59 014.36 0.01 1.401.43 0.660.02 0.5 0.2-34.12 0.19 3.56 70.25 017.2801.5701.28 0.50.020.39 0.2-44.22 0.2 2.7 70.25 017.8601.6101.31 0.530.02 0.40.24-54.02 0.16 3.41 72.91 014.45 0.011.4501.37 0.70.020.510.26-64.22 0.18 3.23 71.47 015.92 0.011.5201.32 0.690.020.510.27-7 4.1 0.16 3.47 72.06 015.2301.5201.32 0.630.030.490.23-94.01 0.17 3.71 72.98 013.97 0.011.4101.45 0.740.030.580.23-10 4.04 0.16 3.57 70.03 017.460 1.501.33 0.610.030.360.245538-1-14.61 0.2 3.48 68.12 1.3710.68 7.481.04 0.331.19 0.490.020.330.13-24.61 0.22 3.46 68.84 1.3610.28 7.041.01 0.311.15 0.480.020.39 0-34.78 0.24 3.24 65.86 021.3601.4901.08 0.460.020.380.22-44.84 0.3 3.89 67.64 1.67 9.9 6.971.02 0.361.14 0.530.02 0.50.18-54.64 0.2 3.5864.5 3.61 8.8510.140.95 0.481.19 0.470.010.330.12-64.91 0.27 3.44 66.51 1.4811.14 7.741.15 0.331.08 0.490.020.340.13-74.87 0.22 3.24 65.78 1.2711.92 8.38 1.201.12 0.470.020.370.16
表5Ma524转基因Brassica植物种子的脂肪酸分析SPL 160 161 180 181 6，9 182 182 183ga 183 184 201 220 221 240 241# ％ ％ ％ ％ ％ ％ ％ ％ ％ ％ ％ ％ ％％-84.59 0.223.4 70.77 0 16.71 0 1.35 01.14 0.48 0.02 0.39 0.15-94.63 0.23 3.51 69.66 2.01 8.777.24 0.97 01.18 0.52 0.020.3 0.11-10 4.56 0.19 3.55 70.68 0 16.89 0 1.37 01.22 0.54 0.02 0.22 0.035538-3-14.74 0.21 3.43 67.52 1.29 10.917.77 1.03 0.281.110.5 0.02 0.35 0.14-24.72 0.21 3.24 67.42 1.63 10.37 8.4 0.99 01.12 0.49 0.02 0.36 0.15-34.24 0.21 3.52 71.31 0 16.53 0 1.33 01.12 0.45 0.020.4 0.14-44.64 0.21 3.45 67.92 1.65 9.917.97 0.91 0.331.14 0.47 0.02 0.37 0.14-54.91 0.25 3.31 67.19 0 19.920.01 1.39 01.05 0.48 0.02 0.37 0.14-64.67 0.21 3.25 67.07 1.23 11.328.35 0.99 01.16 0.47 0.02 0.33 0.16-74.53 0.19 2.94 64.8 4.94 8.459.95 0.93 0.441.13 0.37 0.01 0.27 0.12-84.66 0.22 3.68 67.33 0.71 126.991.1 0.241.18 0.48 0.03 0.36 0.17-94.65 0.24 3.11 67.42 0.64 12.716.93 1.16 0.251.08 0.45 0.02 0.32 0.17-10 4.88 0.27 3.33 65.75 0.86 12.89 7.71.1 0.241.08 0.46 0.01 0.34 0.165538-4-14.65 0.243.8 62.41 0 24.68 01.6 0.010.99 0.45 0.02 0.33 0.13-25.37 0.31 3 57.98 0.38 18.0410.5 1.41 00.99 0.48 0.020.3 0.19-34.61 0.22 3.07 63.620.3 16.467.671.2 01.18 0.45 0.02 0.29 0.14
表5Ma524转基因Brassica植物种子的脂肪酸分析SPL160 161 180 181 6，9 182 182 183ga 183 184 201 220 221 240 241# ％ ％ ％％ ％ ％ ％ ％ ％ ％ ％ ％ ％-4 4.39 0.19 2.93 65.97 0 22.360 1.45 0 1.17 0.41 0.03 0.32 0.15-5 5.22 0.29 3.8562.1 2.35 10.2511.39 0.93 0.41 1.040.6 0.02 0.47 0.17-6 4.66 0.18 2.85 66.79 0.5 13.03 7.66 0.97 0.22 1.28 0.42 0.02 0.31 0.14-7 4.85 0.26 3.03 57.43 0.26 28.04 0.01 2.59 0.01 1.13 0.56 0.020.4 0.23-8 5.43 0.28 2.9454.8 1.84 13.7915.67 1.36 0.531.1 0.55 0.02 0.35 0.19-9 4.88 0.24 3.3262.3 0.58 14.86 9.04 1.34 0.29 1.13 0.52 0.02 0.37 0.19-10 4.53 0.22.7364.2 0.07 24.150 1.52 0 1.09 0.39 0.02 0.27 0.175538-5-14.5 0.15 3.35 66.71 0.8811.7 8.38 1.040.3 1.24 0.49 0.02 0.29 0.17-2 4.77 0.23 3.06 62.67 0.6815.2 8.8 1.31 0.28 1.15 0.46 0.020.3 0.19-3 4.59 0.22 3.61 64.35 2.299.9510.57 1.01 0.45 1.21 0.48 0.02 0.26 0.16-4 4.86 0.263.4 67.69 0.65 12.24 6.61 1.09 0.23 1.07 0.45 0.02 0.32 0.14-5 4.49 0.213.3 69.25 0.04 16.51 2.181.2 0 1.11 0.44 0.02 0.33 0.16-64.5 0.21 3.47 70.48 0.0814.9 2.19 1.22 0 1.13 0.49 0.02 0.33 0.16-7 4.39 0.21 3.44 67.59 2.389.24 8.98 0.89 0 1.18 0.44 0.02 0.28 0.14-8 4.52 0.22 3.17 68.33 0.01 18.91 0.73 1.32 0.01 1.08 0.45 0.02 0.29 0.17-9 4.680.2 3.05 64.03 1.93 11.0311.41 1.02 0.01 1.15 0.39 0.02 0.21 0.15
表5Ma524转基因Brassica植物种子的脂肪酸分析SPL 160 161 180 181 6，9 182 182 183ga 183 184 201 220 221 240 241# ％ ％ ％％ ％ ％ ％ ％ ％ ％ ％ ％ ％-10 4.570.23.1 67.21 0.61 12.627.68 1.07 0.25 1.14 0.43 0.02 0.25 0.155538-8-1 4.95 0.26 3.14 64.04 0 23.38 0 1.54 0 0.99 0.42 0.02 0.38 0.17-2 4.91 0.26 3.71 62.33 0 23.97 0 1.77 0 0.95 0.53 0.02 0.42 0.19-3 4.73 0.25 4.04 63.83 0 22.360.01 1.73 0 1.05 0.55 0.02 0.45 0.16-4 5.1 0.353.8 60.45 0 24.450.01 2.13 0 1.07 0.65 0.03 0.53 0.24-5 4.980.3 3.91 62.48 0 23.44 0 1.77 0 1.01 0.51 0.01 0.43 0.21-6 4.62 0.21 3.99 66.14 0 20.38 0 1.48 0 1.15 0.53 0.02 0.48 0.19-7 4.64 0.22 3.55 64.6 0 22.65 0 1.38 0 1.09 0.45 0.02 0.41 0.19-8 5.65 0.38 3.18 56.6 0 30.830.02 0.02 0 0.98 0.55 0.03 0.39 0.26-9 8.53 0.636.9 51.76 0 26.01 0 0.01 0 1.41 1.21 0.07 0.96 0.33-10 5.520.4 3.97 57.92 0 28.95 0 0.02 0 0.95 0.52 0.02 0.41 0.165538-10- 4.44 0.193.5 68.42 0 19.51 0 1.32 0 1.14 0.45 0.02 0.31 0.161-2 4.57 0.21 3.07 66.08 0 21.990.01 1.36 0 1.12 0.41 0.02 0.31 0.16-3 4.63 0.21 3.48 67.43 0 20.270.01 1.32 0 1.12 0.46 0.02 0.21 0.08-4 4.69 0.19 3.22 64.62 0 23.16 0 1.35 0 1.08 0.46 0.02 0.330.2-5 4.580.23.4 66.75 0 20.170.01 0.02 01.1 0.45 0.02 0.34 0.17
表5Ma524转基因Brassica植物种子的脂肪酸分析SPL160161 180181 6，9 182182 183ga183 184 201 220 221 240241# ％ ％ ％ ％ ％ ％ ％ ％ ％ ％ ％ ％ ％-8 4.55 0.21 073.550.0514.912.76 1.21 0.07 1.24 0.51 0.020.190-9 4.58 0.21 3.2866.19 021.55 0 1.35 0 1.12 0.43 0.020.33 0.16-10 4.52 0.23.468.37 019.330.01 1.3 0 1.13 0.46 0.020.35 0.18
实施例9在欧洲油菜中表达高山被孢霉Δ12脱氢酶使用下列引物用PCR修饰Ma648 cDNA来导入克隆位点Ma648PCR-for(SEQ ID NO29)5’-CUACUACUACUAGGATCCATGGCACCTCCCAACACTMa648PCR-rev(SEQ ID NO30)5’-CAUCAUCAUCAUGGTACCTCGAGTTACTTCTTGAAAAAGAC这些引物允许扩增整个编码区，并在5’末端加入BamH I位点，在3’末端加入Kpn I和Xho I位点。使用CloneAmp系统(GIBCOBRL)将PCR产物亚克隆到pAMP1(GIBCOBRL)中产生pCGN5540，Δ12脱氢酶序列用两条链测序验证。
为进行种子特异性表达，将Ma648编码区以一个BamHI/XhoI片段的形式从pCGN5540中切出，并插入到napin表达盒---pCGN3223的Bgl II和Xho I位点之间，产生pCGN5542。将含有napin 5’调节序列、Ma648编码区和napin 3’调节序列的pCGN5541 Asp718片段插入到pCGN5138的Asp718位点，产生pCGN5542。通过农杆菌介导的转化将pCGN5542导入两种欧洲油菜变种。使用商业化的油菜变种SP30021和一种低亚麻酸品系LP30108。
从在温室中生长的19个独立的LP30108转化事件和一种非转化对照中收获成熟的自交T2种子。预期这些种子将产生Δ12脱氢酶转基因的分离。用GC分析20-种子合并物的脂肪酸组成。结果示于表6。所有的转化品系都含有水平提高的182，后者是Δ12脱氢酶的产物。在这些植物中183的水平没有明显的提高。事件#11和16显示了182在合并的种子中的最大积累。为研究182水平在T2种子中的分离，并为确定将用于接着产生后代的单个植株，进行半种子分析。种子在暗处在30度在浸水滤纸上发芽过夜。切下外子叶进行GC分析，将其余的苗种入土壤。这些分析的一些结果示于表7。含有高山被孢霉Δ12脱氢酶的单个T2种子在种子中积累182至60％。样品97xx1116#59是一种无分离的例子。即使是在最高182积累的种子中，183的水平也仅略微提高。将这些和其他单个选择的T2植株在温室中和在大田中种植以产生T3种子。
从在温室中生长的20个独立的SP30021转化事件和一种非转化对照中收获成熟的自交T2种子。预期这些种子将产生Δ12脱氢酶转基因的分离。用GC分析20-种子合并物的脂肪酸组成。数据列于表8。所有的转化品系都含有水平提高的182，后者是Δ12脱氢酶的产物。与低亚麻酸的LP30108品系一样，183的水平没有明显的提高。事件#4和12显示了182在合并的种子中的最大积累。为研究182水平在T2种子中的分离，并为确定将用于接着产生后代的单个植株，进行半种子分析。种子在暗处在30度在浸水滤纸上发芽过夜。切下外子叶进行GC分析，将其余的苗种入土壤。这些分析的一些结果示于表9。样品97xx1157#88和#18分别是5542-SP30021-4和5542-SP30021-12的无分离例子。将这些和其他单个选择的T2植株在温室中和在大田中种植以产生T3种子。
表6循环号SPL号 株号 160 161 180 181 182 183 200 201 202 22097XX1098 45 5542-LP30108-167.04 0.43 1.12 18.01 66.36 4.760.5 0.840.30.4497XX1098 22 5542-LP30108-165.17 0.29 2.11 22.01 65.18 3.15 0.63 0.75 0.210.3697XX1098 40 5542-LP30108-164.990.2 2.05 23.91 63.133.3 0.73 0.85 0.230.4997XX1098 28 5542-LP30108-164.47 0.19 1.75 26.7 62.39 2.46 0.58 0.850.20.3297XX1098 2 5542-LP30108-164.54 0.21 1.66 26.83 61.892.9 0.55 0.82 0.180.3397XX1098 58 5542-LP30108-166.05 0.31 1.36 24.11 61.363.8 0.72 1.13 0.260.5897XX1098 83 5542-LP30108-165.13 0.17 2.03 27.05 60.93 2.620.7 0.71 0.14 0.497XX1098 34 5542-LP30108-164.12 0.19 1.44 29.35 60.54 2.53 0.43 0.89 0.170.2597XX1116 37 5542-LP30108-11 4 0.14 2.43 23.29 63.992.6 0.58 0.69 0.711.1197XX1116 88 5542-LP30108-11 3.8 0.18 2.04 23.59 63.93 2.95 0.54 0.81 0.990.8297XX1116 36 5542-LP30108-114.150.2 1.51 25.94 62.14 2.74 0.47 0.87 0.790.8197XX1116 31 5542-LP30108-116.29 0.35 1.04 24.14 60.91 4.02 0.55 0.91 0.750.7297XX1116 10 5542-LP30108-116.970.4 3.36 18.9 60.66 4.681.20.7 0.531.7197XX1116 32 5542-LP30108-113.96 0.16 2.61 26.73 60.54 3.38 0.66 0.870.20.6297XX1116 55 5542-LP30108-114.26 0.22 0.98 28.57 59.94 3.240.4 0.68 0.710.7597XX1116 12 5542-LP30108-114.17 0.23 1.42 28.61 59.52 3.26 0.51 0.95 0.290.67
表6循环号SPL号 株号160 161 180 181 182 183 200 201 202 22097XX1116 86 5542-LP30108-114.230.3 1.09 28.34 59.2 3.95 0.48 0.91 0.55 0.7197XX1116 61 5542-LP30108-114.13 0.16 1.92 30.18 58.67 2.65 0.56 0.88 0.25 0.4197XX1116 60 5542-LP30108-114.42 0.26 1.61 28.77 58.6 3.26 0.53 0.85 0.68 0.7597XX1116 91 5542-LP30108-117.82 0.67 2.37 17.97 58.43 4.85 0.94 0.86 3.87 1.7197XX1116 59 5542-LP30108-113.560.21.6 65.5 23.03 2.23 0.52 1.54 0.49 0.69
表7160161180181182 183 200 201202220％ ％ ％ ％ ％ ％ ％ ％ ％ ％5542-LP30108-1 4.6 0.15 1.9350.4438.54 2.06 0.65 1.11 0.09 0.375542-LP30108-24.63 0.17 1.7841.1147.53 2.46 0.62 1.02 0.14 0.385542-LP30108-34.96 0.18 2.0748.1640.01 2.17 0.73 1.13 0.1 0.395542-LP30108-44.36 0.15 1.9446.5142.57 1.95 0.64 1.06 0.11 0.355542-LP30108-54.45 0.14 2.1949.5439.13 2.14 0.72 1.14 0.11 0.385542-LP30108-64.97 0.16 1.8649.23 39.2 2.170.7 1.12 0.11 0.415542-LP30108-74.46 0.13 2.72 39.648.65 2.02 0.81 0.96 0.13 0.45542-LP30108-84.63 0.18 1.7847.86 41 2.31 0.62 1.09 0.11 0.365542-LP30108-94.64 0.16 1.75 42.546.572.2 0.61 1 0.13 0.355542-LP30108-10 4.46 0.15 2.3743.6145.29 1.77 0.71 1.02 0.12 0.365542-LP30108-11 4.58 0.25 1.8837.0850.95 2.94 0.64 0.96 0.16 0.425542-LP30108-12 4.46 0.18 1.6943.6245.36 2.44 0.59 1.09 0.14 0.345542-LP30108-13 4.45 0.15 2.33 5137.71 1.91 0.75 1.12 0.09 0.45542-LP30108-144.3 0.16 2.0445.9342.78 2.46 0.66 1.07 0.14 0.375542-LP30108-15 4.18 0.16 2.1743.79 45.2 2.14 0.68 1.04 0.15 0.365542-LP30108-16 5.04 0.18 1.8932.3255.78 2.68 0.63 0.84 0.2 0.36
表7160161180181182 183 200 201202220％ ％ ％ ％ ％ ％ ％ ％ ％ ％5542-LP30108-18 4.2 0.14 2.2350.6338.51 1.79 0.72 1.15 0.1 0.375542-LP30108-194.63 0.18 1.8152.5136.26 2.12 0.68 1.19 0.1 0.45542-LP30108-204.77 0.15 2 7839.7648.06 2.25 0.75 0.91 0.13 0.36LP30108 contol 4.31 0.22 2.0566.1522.59 1.87 0.771.3 0.07 0.44
表8株号160161 180 181182183 2002012022205542-SP30021-14.37 0.172.17 40.2639.4311.06 0.74 1.14 0.14 0.425542-SP30021-24.33 0.181.51 43.0736.0312.57 0.57 1.21 0.14 0.335542-SP30021-3 5.2 0.22 3.1 43.737.04 8.03 0.92 1.06 0.13 0.485542-SP30021-44.37 0.151.94 34.2645.1212.040.6 0.96 0.17 0.35542-SP30021-54.15 0.171.73 48.9831.1311.41 0.63 1.26 0.13 0.355542-SP30021-64.52 0.171.92 38.142.3910.53 0.67 1.04 0.18 0.395542-SP30021-74.58 0.181.66 41.8737.52 11.8 0.62 1.14 0.15 0.365542-SP30021-84.46 0.171.59 42.6936.9311.88 0.59 1.14 0.14 0.355542-SP30021-94.63 0.191.69 39.8939.7511.48 0.62 1.09 0.15 0.385542-SP30021-10 4.74 0.161.79 39.1940.5111.42 0.63 0.99 0.13 0.345542-SP30021-11 4.57 0.161.71 38.13 4211.15 0.62 1.04 0.18 0.365542-SP30021-12 4.05 0.162.04 35.4443.4712.45 0.62 1.07 0.21 0.335542-SP30021-13 4.37 0.151.79 38.7441.2811.36 0.62 1.04 0.16 0.355542-SP30021-14 4.32 0.161.47 42.3237.17 12.3 0.54 1.16 0.16 0.325542-SP30021-15 4.25 0.181.65 44.9634.2812.39 0.59 1.13 0.14 0.32
表8株号 160 161 180 181 182 183 200 201 202 2205542-SP30021-16 4.53 0.17 1.91 42.13 38.32 10.51 0.67 1.12 0.14 0.385542-SP30021-17 4.16 0.191.7 50.65 29.3 11.4 0.61 1.29 0.11 0.365542-SP30021-18 4.24 0.17 1.68 44.47 35.46 11.52 0.6 1.19 0.14 0.345542-SP30021-194.1 0.181.8 46.67 33.87 10.86 0.63 1.24 0.13 0.375542-SP30021-204.3 0.17 1.64 39.6 40.39 11.53 0.57 1.12 0.16 0.32SP30021 4.38 0.21 1.47 56.51 22.59 12.04 0.62 1.45 0.11 0.39
表9循环号SPL号 株号160 161 180 181 182 183 200 201 202 22097XX1156 96 5542-SP30021-43.71 0.13 1.36 29.29 51.74 11.57 0.41 0.85 0.18 0.4697XX1156 50 5542-SP30021-42.95 0.11 1.33 28.78 50.97 13.83 0.3 0.99 0.28 0.3297XX1158 10 5542-SP30021-44.05 0.16 2.47 31.18 50.88 8.77 0.67 0.89 0.22 0.3397XX1158 32 5542-SP30021-43.56 0.15 1.44 30.73 50.1 11.86 0.47 0.91 0.21 0.2297XX1158 56 5542-SP30021-44.44 0.19 3.09 30.64 49.71 9.39 0.83 0.79 0.20.497XX1157 80 5542-SP30021-44.05 0.18 1.32 27.41 49.59 14.81 0.53 1.19 0.290.497XX1158 39 5542-SP30021-44.04 0.15 2.98 28.62 49.52 12.28 0.69 0.86 0.31 0.2797XX1156 17 5542-SP30021-43.65 0.15 2.43 29.38 49.42 12.3 0.52 0.92 0.67 0.3597XX1156 60 5542-SP30021-43.75 0.17 1.7 30.03 49.13 12.87 0.51 1.01 0.27 0.3597XX1157 83 5542-SP30021-44.150.2 1.77 29.72 49.08 12.22 0.66 1.21 0.16 0.5297XX1157 86 5542-SP30021-4 3.6 0.14 1.12 27.65 49.01 16.05 0.48 1.21 0.33 0.0897XX1158 77 5542-SP30021-44.14 0.17 1.58 31.98 48.82 10.72 0.65 1 0.28 0.4497XX1157 88 5542-SP30021-43.36 0.15 1.22 56.42 21.63 13.78 0.58 1.85 0.06 0.65
表9循环号SPL号 株号 160 161 180 181 182 183 200 201 202 22097XX1157 39 5542-SP30021-122.84 0.04 1.84 29.6 53.16 9.52 0.57 1.32 0.350.4897XX1157 55 5542-SP30021-123.28 0.1 2.18 30.36 52.27 9.26 0.63 1.15 0.220.4197XX1157 10 5542-SP30021-12 3.5 0.06 1.51 29.78 50.98 11.13 0.64 1.45 0.40.2697XX1157 41 5542-SP30021-123.31 0.08 1.64 30.18 50.51 11.59 0.57 1.27 0.240.4197XX1157 35 5542-SP30021-123.31 0.09 1.57 30.36 50.1 12.170.5 1.15 0.230.3597XX1157 1 5542-SP30021-123.45 0.11 2.88 32.11 49.45 8.69 0.82 1.22 0.270.6397XX1157 16 5542-SP30021-122.91 0.09 1.52 29.35 48.88 14.26 0.58 1.39 0.15 0.397XX1157 50 5542-SP30021-123.29 0.09 2.13 33.23 48.78 9.87 0.67 1.06 0.180.4797XX1157 25 5542-SP30021-122.83 0.051.4 33.22 48.52 11.220.5 1.33 0.260.4297XX1157 57 5542-SP30021-122.94 0.13 1.46 32.85 47.58 12.21 0.57 1.31 0.270.4797XX1157 56 5542-SP30021-123.01 0.07 1.63 31.53 47 14.02 0.59 1.31 0.280.2397XX1157 6 5542-SP30021-12 3.9 0.131.5 32.43 46.98 12.45 0.52 1.11 0.210.4997XX1157 18 5542-SP30021-123.88 0.16 1.73 57.94 22.33 10.51 0.74 1.68 0.110.64
实施例10在欧洲油菜中同时表达高山被孢霉Δ6和Δ12脱氢酶为表达来自同一T-DNA的高山被孢霉Δ6和Δ12脱氢酶，制备下列用于种子特异性表达的结构。
将含有napin 5’调节序列、Ma524编码区和napin 3’调节序列的pCGN5536 Not I片段插入到pCGN5542的Not I位点，产生pCGN5544。将表达组件正确定向，使Ma524和Ma648的转录和nptII标记的方向相同。
通过农杆菌介导的转化将pCGN5544导入欧洲油菜cv.LP30108。从在温室中生长的16个独立的LP30108转化事件和一种非转化对照中收获成熟的自交T2种子。预期这些种子将产生Δ6+Δ12脱氢酶转基因的分离。用GC分析20-种子合并物的脂肪酸组成。结果示于表10。除了一个(5544-LP30108-3)外所有的品系与对照相比都显示改变的油组成。除了三个品系外(-3、-4、-11)都产生GLA。三个没有GLA的品系中有两个(-4、-11)显示182增加，这表示Δ12脱氢酶的表达。从组来看，在含有双Δ6+Δ12结构(pCGN5544)的植物中观察到的GLA水平比含有pCGN5538(单独的Δ6)的植物的GLA水平高。此外，Δ6，9182的水平在含有Δ12+Δ6的植物中比单独含有Δ6脱氢酶的植物中大大降低。因此，在一个T-DNA上组合Δ6和Δ12脱氢酶比单独表达Δ6脱氢酶能导致更多的GLA积累和较少的副产物。为研究GLA水平在T2种子中的分离，并为确定将用于接着产生后代的单个植株，进行半种子分析。种子在暗处在30度在浸水滤纸上发芽过夜。切下外子叶进行GC分析，将其余的苗种入土壤。这些分析的一些结果示于表11。如同对T2群体所预期的，GLA和182的水平在单个的种子中是分离的。在单个的种子中观察到GLA含量占到总脂肪酸的60％。选择单个的事件在温室和大田中种植来产生T3种子。
转基因植物包括表达本发明结构的芸苔、大豆、红花、玉米、亚麻和向日葵可以是GLA的优良原料。
GLA的典型原料例如琉璃苣最高产生25％的GLA。相比之下，表10中的植物含有高至30％的GLA。表11中显示的单个种子含有高至60％的GLA。
表10160 161 180 181 182 182 183 183 184 200 201 220Δ6，9 Δ9，12 Δ6，9，12 Δ9，12，15％％％％％ ％ ％ ％ ％ ％％ ％5544-LP30108-14.54 0.17 1.91 49.96 0 30.987.971.85 0.11 0.68 1.170.415544-LP30108-24.69 0.19 2.15 38.49 0 33.94 16.211.73 0.25 0.72 0.960.415544-LP30108-34.26 0.2 1.97 66.68 0 22.130.081.96 0.01 0.73 1.330.425544-LP30108-44.59 0.24 1.76 44.21 0 44.540.022.19 0.01 0.62 1.08 0.45544-LP30108-5 4.5 0.18 2.28 47.57 0 26.41 14.421.71 0.22 0.78 1.10.435544-LP30108-64.51 0.16 2.12 31.95 0.01 26.9429.81.410.5 0.81 1.020.515544-LP30108-74.84 0.21 1.68 38.24 0 32.27 18.211.87 0.33 0.66 1.040.435544-LP30108-10 5 0.28 1.86 41.17 0 46.540.362.58 0.020.6 0.910.375544-LP30108-11 4.57 0.2 1.74 47.29 0 41.490.032.22 0.01 0.64 1.17 0.45544-LP30108-12 4.87 0.18 2.65 34.53 0 30.37 23.121.46 0.36 0.83 0.950.455544-LP30108-13 4.41 0.16 2.32 40.82 0.1126.8 21.051.53 0.37 0.77 1.060.425544-LP30108-14 4.38 0.2 2.21 29.91 0.16 28.01 30.621.46 0.59 0.76 0.970.475544-LP30108-15 4.79 0.22 2.23 23.42 0.02 28.73 35.681.51 0.77 0.87 0.890.565544-LP30108-16 4.54 0.18 1.78 40.81 0 35.24 12.831.95 0.27 0.68 1.020.435544-LP30108-17 4.63 0.18 2.28 46.96 0 31.0610.6 1.7 0.14 0.76 1.060.425544-LP30108-20 4.87 0.29 1.44 31.81 0.15 23.51 32.851.64 0.69 0.89 0.960.67
表10160 161 180181 182182183183184200201220Δ6，9 Δ9，12 Δ6，9，12 Δ9，12，15％ ％ ％ ％ ％ ％ ％ ％ ％ ％ ％ ％LP30108对照3.890.25 1.1967.73 0 22.46 0.1 1.970 0.54 1.32 0.44
表11循环号 SPL号 株号 160 161 180 181 182_Δ6，9 182_Δ9，12 183_Δ6，9，183_Δ9，12， 184 200 20112 1597XX133364 5544-LP30108-20 6.53 0.15 0.98 23.33 0.01 21.1 43.3 1.34 0.84 0.52 0.9797XX133365 5544-LP30108-206.9 0.29 1.17 8.89 0.03 15.07 60.5 1.12 2.23 0.98 0.8697XX133366 5544-LP30108-20 8.150.23.6 16.87 0.11 16.0548.231.1 1.18 1.71 0.6697XX133367 5544-LP30108-20 8.85 0.351.2 14.49 0.01 25.6643.981.8 1.03 0.65 0.7697XX133368 5544-LP30108-20 6.05 0.16 1.27 17.85 0.16 16.1353.16 1.14 1.25 0.71 0.8597XX133369 5544-LP30108-20 7.16 0.21 1.33 11.51 0.09 17.4256.13 1.41 1.58 0.93 0.6897XX133370 5544-LP30108-20 3.46 0.04 1.76 18.38 0.03 22.5548.55 1.22 1.04 0.83 0.9597XX133371 5544-LP30108-20 3.71 0.05 1.74 16.11 0.01 26.9345.79 1.47 1.02 0.89 197XX133372 5544-LP30108-203.5 0.04 1.76 23.74 0.02 35.3830.82 1.87 0.58 0.65 0.8597XX133373 5544-LP30108-20 4.67 0.11 1.87 17.98 0.04 22.4747.89 1.17 0.89 0.93 0.8897XX133374 5544-LP30108-20 4.52 0.09 1.86 13.77 0.03 20.952.96 1.31 1.19 1.03 0.8897XX133375 5544-LP30108-20 5.26 0.13 1.64 16.46 0.05 21.7549.42 1.25 1.08 0.83 0.8697XX133376 5544-LP30108-20 7.61 0.21 1.44 12.49 0.331755.31 1.18 1.59 0.88 0.7497XX133377 5544-LP30108-20 6.42 0.15 1.51 10.79 0.09 15.9658.77 1.12 1.53 0.98 0.8597XX133378 5544-LP30108-20 4.59 0.16 0.93 12.1 0.08 15.9460.15 1.12 1.69 0.74 0.8897XX133379 5544-LP30108-20 5.24 0.09 1.94 14.08 0.21 19.7953.58 1.05 1.03 0.96 0.84
表11循环号 SPL号 株号 160 161 180 181 182_Δ6，9 182_Δ9，12 183_Δ6，9， 183_Δ9，12， 184 200 20112 1597XX133380 5544-LP30108-204.380.08 1.66 22.25 0 30.7935.49 2.160.72 0.66 0.8497XX133381 5544-LP30108-204.050.05 1.44 24.16 0.04 24.8640.89 1.420.79 0.63 0.8497XX133382 5544-LP30108-203.290.051.9 19.66 0 23.8346.48 1.270.87 0.78 0.8197XX133383 5544-LP30108-204.820.08 1.99 17.27 0.1 20.6949.73 1.221.06 0.98 0.8297XX133384 5544-LP30108-205.33 0.1 1.77 13.6 0.03 21.4451.74 1.521.21 0.98 0.9397XX133385 5544-LP30108-20 3.30.051.2 68.23 0 22.09 0.01 2.27 0 0.57 1.5797XX133386 5544-LP30108-203.230.05 1.54 28.15 0.01 36.425.91 1.990.43 0.59 0.9797XX133387 5544-LP30108-204.38 0.1 1.16 60.94 2.85 8.3517.61 1.260.69 0.54 1.3997XX133388 5544-LP30108-20 4.40.09 1.34 38.42 0.02 34.7416.61 2.120.32 0.53 0.8297XX127816 5544-LP30108-153.620.11 1.22 27.23 0 30.932.87 1.410.48 0.46 0.9797XX127817 5544-LP30108-153.680.13 1.26 45.29 0 44.79 0.72 1.770.01 0.43 1.2497XX127818 5544-LP30108-154.080.15 1.49 22.34 0 28.3739.37 1.220.64 0.55 0.8897XX127819 5544-LP30108-153.51 0.1 1.01 35.44 0 44.12 11.7 1.720.15 0.36 1.1497XX127820 5544-LP30108-153.660.12 1.21 27.44 0 30.232.37 1.490.53 0.49 1.1597XX127821 5544-LP30108-153.580.11 1.51 29.81 0 30.7230.65 1.16 0.40.5 0.9697XX127823 5544-LP30108-153.690.11 1.42 30.05 0 32.2827.41 1.650.38 0.54 1.1997XX127824 5544-LP30108-153.560.11 1.31 30.25 0 28.6431.46 1.430.48 0.48 1.11
表11循环号 SPL号株号 160 161 180 181 182_Δ6，9 182_Δ9，12 183_Δ6，9， 183_Δ9，12， 184 200 201121597XX127825 5544-LP30108-154.410.222.08 15.05 0 23.7749.51 1.180.96 0.87 0.8597XX127826 5544-LP30108-153.750.141.59 23.55 0 27.91 38.8 1.390.61 0.59 0.9797XX127827 5544-LP30108-153.670.11 1.9 26.07 0 31.133.16 1.080.49 0.65 0.9797XX127828 5544-LP30108-153.820.111.54 21.27 0 29.0739.69 1.47 0.7 0.58 0.8697XX127829 5544-LP30108-153.650.141.27 45.38 0 43.381 2.330.02 0.42 1.2797XX127830 5544-LP30108-153.590.121.19 30.41 0 30.6830.37 1.24 0.4 0.37 0.9997XX127831 5544-LP30108-153.740.121.26 38.98 0 50.53 0.98 2.120.02 0.39 1.1497XX127832 5544-LP30108-153.860.111.46 26.38 0 28.935.41 1.01 0.5 0.54 0.97
实施例11在欧洲油菜中同时表达高山被孢霉Δ5和Δ6脱氢酶为在转基因菜籽油中产生花生四烯酸(ARA)，需要导入Δ5和Δ6两种脱氢酶活性。为便于下游分析和育种，优选在一个单一的T-DNA上编码两种活性。下面的实施例说明Δ5和Δ6脱氢酶的同时表达。
将含有napin 5’调节序列、Ma29编码区和napin 3’调节序列的pCGN5528 Asp718片段插入到pCGN5138的Asp718位点，产生pCGN5545。将含有napin 5’调节序列、Ma524编码区和napin 3’调节序列的pCGN5536 Not I片段插入到pCGN5545的Not I位点，产生pCGN5546。将表达组件正确定向，使Ma524和Ma29的转录和nptII标记的方向相同。
通过农杆菌介导的转化将pCGN5546导入欧洲油菜cv.LP30108。从在温室中生长的30个独立的LP30108转化事件中收获成熟的自交T2种子。用GC分析20-种子合并物的脂肪酸组成。结果示于表12。所有的品系显示两种脱氢酶的表达，其证据为存在Δ5，9182(如在pCGN5531植物中所见)和Δ6，9182及GLA(如在pCGN5538植物中所见)。
表12来自5546-LP30108事件的成熟T2种子的20种子合并物的脂肪酸分析株号 160 161 180 181 182_Δ5，9 182_Δ6，9 182_Δ9，12 183_Δ6，9，183_Δ9，12， 184 200 20112155546-LP30108-14.88 0.33 2.28 57.2 4.68 6.08 7.36 12.291.38 0.85 0.84 1.225546-LP30108-24.01 0.14 2.22 66.04 2.73 1.33 12.6 6.451.41 0.32 0.75 1.25546-LP30108-34.29 0.15 2.55 68.89 0.44 0.58 16.97 1.66 1.6 0.11 0.88 1.225546-LP30108-44.24 0.14 2.6 70.48 0.73 0.52 14.28 2.611.42 0.14 0.96 1.265546-LP30108-53.52 0.15 2.01 60.3 1.72 0.95 16.92 9.881.66 0.39 0.68 1.265546-LP30108-64.05 0.17 2.24 61.29 1.98 0.4 18.87 6.28 2 0.34 0.7 1.245546-LP30108-74.74 0.21 2.49 64.5 2.25 1.18 10.03 9.731.35 0.52 0.97 1.285546-LP30108-84.24 0.14 2.82 63.92 1.9 1.5 11.67 9.291.44 0.43 0.89 1.195546-LP30108-9 3.8 0.13 2.15 65.75 2.3 0.16 14.92 6.321.57 0.24 0.75 1.355546-LP30108-10 4.28 0.17 1.55 58.8 1.1 0.12 22.95 5.972.24 0.22 0.6 1.355546-LP30108-11 4.25 0.15 1.82 63.68 1.01 0.22 19.42 4.961.81 0.2 0.67 1.235546-LP30108-12 3.95 0.14 2.36 66.9 1.12 0.01 19.42 1.591.77 0.04 0.8 1.215546-LP30108-13 4.18 0.16 2.17 66.91 1.36 0.02 18.84 1.991.74 0.05 0.77 1.155546-LP30108-14 4.74 0.26 1.82 65.29 1.25 0.27 16.77 5.31.59 0.25 0.71 1.325546-LP30108-154.3 0.23 2.54 65.65 1.67 0.59 13.15 7.221.54 0.36 0.88 1.35546-LP30108-16 4.05 0.17 2.75 64.13 2.56 2.8 9.56 9.311.34 0.53 0.92 1.28
表12来自5546-LP30108事件的成熟T2种子的20种子合并物的脂肪酸分析株号 160 161 180 181 182_Δ6，9 183_Δ6，9 182_Δ9，12 183 Δ6，9，183_Δ9，12，184 200 20112155546-LP30108-17 4.060.13 2.85 65.76 2.09 1.92 9.65 9.1 1.23 0.45 0.92 1.225546-LP30108-18 4.160.25 2.14 60.68 1.43 0.02 24.02 2.62 2.11 0.09 0.69 1.265546-LP30108-19 5.770.37 2.15 56.11 1.6 0.33 19.34 9.16 2.37 0.46 0.73 1.055546-LP30108-20 5.030.36 2.34 61.05 1.55 0.35 17.21 6.96 2.24 0.39 0.77 1.225546-LP30108-23 4.280.22 2.44 66.19 0.93 0.11 17.03 4.37 1.67 0.17 0.82 1.255546-LP30108-24 4.920.33 2.68 62.6 1.32 0.36 16.89 5.82 2.05 0.3 0.95 1.195546-LP30108-25 5.420.72 3.15 47.47 2.66 4.21 13.51 16.31 2.14 0.99 1.18 1.375546-LP30108-26 3.850.22 2.78 65.02 1.05 0.05 18.35 4.36 1.67 0.12 0.82 1.185546-LP30108-27 3.860.15 2.76 65.17 1.11 0.78 16.24 5.21 1.53 0.25 0.93 1.35546-LP30108-28 5.290.42 1.81 49.12 1.07 0.09 30.52 5.21 3.57 0.44 0.67 1.235546-LP30108-294.4 0.2 2.38 65.95 1.05 0.28 16.31 4.85 1.64 0.19 0.85 1.265546-LP30108-30 3.990.19 2.55 67.47 0.83 0.11 17.02 3.18 1.68 0.13 0.83 1.23
实施例12在欧洲油菜中同时表达高山被孢霉Δ5、Δ6和Δ12脱氢酶为在转基因菜籽油中产生最多的花生四烯酸(ARA)，除了Δ5活性外，还需要Δ6和Δ12两种脱氢酶活性的存在。为便于下游分析和育种，优选在一个单一的T-DNA上编码这些活性。下面的实施例说明Δ5、Δ6和Δ12脱氢酶的同时表达。
将含有napin 5’调节序列、Ma29编码区和napin 3’调节序列的pCGN5528 Hind III片段插入到pCGN5544的Hind III位点，产生pCGN5547。将表达组件正确定向，使Ma29、Ma524和Ma648的转录和nptII标记的方向相同。
通过农杆菌介导的转化将pCGN5547导入欧洲油菜cv.LP30108。从在温室中生长的30个独立的LP30108转化事件中收获成熟的自交T2种子。用GC分析20-种子合并物的脂肪酸组成。结果示于表13。27个品系显示明显的GLA积累，一般来说，观察到的GLA水平比在不含Δ12脱氢酶的5546植物中观察到的要高。Δ12脱氢酶在多数品系中似乎是有活性的，其证据是在多数植物中缺少可检测到的Δ6，9-182以及提高的182水平。在5547植物中观察到了少量的Δ5，9-182，虽然其水平一般比在5546植物中观察到的要少。这可能是因为Δ12脱氢酶的存在，Δ12脱氢酶能在Δ5位置去饱和之前有效地将181转变为182。
表13来自5547-LP30108事件的成熟T2种子的20种子合并物的脂肪酸分析株号120 160 161 180 181 182_Δ5，182_Δ6，9 182_Δ9，12 183_Δ6，9，183_Δ9，12，184 200 201 221 222912155547-LP30108-1 0.0 5.38 0.3 2.23 64.12 0.010 22.67 0.442.17 0.07 0.82 1.11 0.03 05547-LP30108-2 0.1 4.45 0.13 2.29 51.57 0.160 33.85 3.181.74 0.03 0.78 1.02 0.03 0.025547-LP30108-3 0.0 4.18 0.12 2.03 59.61 0.030 29.44 0.441.64 0 0.75 1.15 0.03 0.015547-LP30108-4 0.0 4.35 0.15 2.29 50.59 0.12 0.01 37.31 0.851.86 0.02 0.78 1.02 0.02 0.015547-LP30108-5 0.0 4.59 0.14 1.8349 0.25 0.01 31.65 8.161.86 0.13 0.68 1.04 0.02 05547-LP30108-6 0.0 4.11 0.15 2.53 44.3 0.130 28.1215.891.94 0.28 0.82 1.13 0 05547-LP30108-7 0.0 4.27 0.15 2.55 39.18 0.12 0.022721.721.87 0.45 0.89 1.08 0 05547-LP30108-8 0.0 4.3 0.14 2.92 42.83 0.260 30.8114.511.49 0.22 0.89 1.06 0 05547-LP30108-9 0.0 4.46 0.17 3.13 44.51 00 30.1212.871.76 0.22 0.98 1.12 0.01 05547-LP30108-10 0.0 4.28 0.11 2.62 41.44 0.280 30.8916.281.45 0.21 0.82 1.06 0 05547-LP30108-11 0.0 4.47 0.17 2.43 26.96 0.480 34.4425.012.14 0.63 0.84 0.99 0 05547-LP30108-12 0.0 4.36 0.16 2.68 42.2 0.170 29.7815.931.83 0.27 0.88 1.06 0 05547-LP30108-13 0.0 4.87 0.19 2.81 21.7 0.530 32.8330.542.040.81 0.89 0.02 0.015547-LP30108-14 0.0 4.61 0.25 2.654 00 32.98 0.52.46 0.03 0.86 1.14 0 05547-LP30108-15 0.0 4.07 0.14 2.98 37.09 0.14 0.01 29.0121.551.66 0.38 1.06 1.11 0 0
表13来自5547-LP30108事件的成熟T2种子的20种子合并物的脂肪酸分析株号 120 160 161 180 181 182_Δ5， 182_Δ6，9 182_Δ9，12 183_Δ6，9， 183_Δ9，12， 184 200 201 221 2229 12 155547-LP30108-16 0.0 3.63 0.13 2.12 64.69 0 024.21 0.15 2.04 0 0.82 1.56 0.02 05547-LP30108-17 0.0 3.85 0.18 2.22 67.22 0.01 021.25 0 2.27 0 0.83 1.53 0 05547-LP30108-18 0.0 5.46 0.19 2.87 41.830.10.0422.76 21.45 1.720.48 1.06 1.23 0 05547-LP30108-19 0.0 4.33 0.12 2.73 50.31 0.07 024.77 12.72 1.620.21 1.04 1.29 0 0.015547-LP30108-20 0.0 4.22 0.12 2.91 46.33 0.25 026.87 14.65 1.610.22 0.98 1.18 0 05547-LP30108-21 0.0 4.38 0.17 2.37 55.37 0 032.59 0.53 1.850.03 0.83 1.23 0 05547-LP30108-22 0.0 5.5 0.18 2.71 41.930.10.1924.19 20.14 1.760.45 0.94 1.21 0 05547-LP30108-23 0.0 4.03 0.16 2.17 68.44 0 020.09 0 2.190.02 0.83 1.46 0 05547-LP30108-24 0.0 4.19 0.17 2.72 49.31 0 030.38 8.64 1.850.13 0.86 1.16 0 05547-LP30108-25 0.0 4.04 0.172.1 70.48 0 018.04 0.05 2.09 0 0.86 1.54 0 05547-LP30108-26 0.0 4.74 0.223.2 26.74 0.33 030.05 28.95 2.020.78 1.08 0.99 0 05547-LP30108-27 0.0 4.29 0.18 2.23 52.49 0 028.48 7.36 1.910.13 0.87 1.37 0 05547-LP30108-28 0.0 4.36 0.17 3 44.350.2 029.59 13.39 1.910.23 0.96 1.17 0 05547-LP30108-29 0.0 4.32 0.17 2.94 52.53 0.05 033.88 0.91 2.340.01 0.97 1.23 0 05547-LP30108-30 0.0 4.07 0.14 2.89 45.13 0.01 029.06 13.96 1.71 0.2 0.941.2 0.01 0
实施例13Δ6去饱和油的立体专一性分布本实验被设计来研究Δ6去饱和油在表达pCGN5538(Ma524cDNA)的种子中的立体专一性分布。使用三种种子样品1)未转化的欧洲油菜cv.LP004种子(对照)2)pCGN5538-LP004-19的分离T2种子3)pCGN5538-LP004-29的分离T2种子使用下面的程序进行分析1.种子油的抽提将50个种子置于一个12×32mm的小瓶中，用一个玻璃棒磨碎。加入1.25ml己烷，并将混合物涡旋振荡。将种子在一个摇床上抽提过夜。然后将抽提物滤过一个粘附在一只1cc注射器上的0.2微米滤膜。然后在氮气下将抽提物干燥。所获得的油用于全油样品的消化和衍生。
2.消化A.液体油消化将贮存的脂酶(来自无根根霉，Sigma，L4384)稀释至约600,000单位/mL，来获得50％的TAG消化。将贮存的脂酶保持在4℃，并置于冰上。反应试剂的数量按照要消化的油的量进行调整。
下面的数量基于2.0mg的抽提的油样品。在一个12×32mm的带螺旋盖的小瓶中加入以下物质2.0mg的油、200uL的0.1M trisHClpH7、40uL的2.2w/v％CaCl22H2O、和100uL的0.05w/v％胆盐。将上述物质涡旋振荡，并超声波处理使油分散。加入20uL稀释的脂酶，并将混合物继续在室温下涡旋振荡1.0分钟。形成一种白色沉淀。加入100uL的6M HCl并涡旋使反应终止。加入500uL的CHCl3∶CH3OH(2∶1)，并将混合物涡旋振荡，在冰上放置进行剩余的消化。将样品再次涡旋振荡，并短暂离心使层分明。用一个巴斯德吸管取出含有消化产物的下层，并置于一个12×32mm的波形盖小瓶。然后用300uL CHCl3对上述物质进行再抽提，涡旋振荡，离心，并与下层合并。尽量在冰上保持消化产物。在消化至最少乙酰迁移后立即进行HPLC分离。
B.固体脂肪消化按照上面介绍的液体油消化的程序，除了向2.0mg固体脂肪中加入20ul 110甲酯。
3.HPLC分离将消化产物在氯仿中干燥至约200uL，然后将每个样品转入一个8×40mm壳形瓶的输入管中，注入30uL用于HPLC分析。
高效液相色谱系统装置有一个Varex ELSD IIA挥发光散射检测器(管的温度为105℃，氮气流速为40mL/min)、一个Waters 712Wi sp自动取样器、三个Beckman 114M Solvent Delivery Module、一个Beckman 421A控制器、一个Rheodyne气动气流分离器和一个Gilson微分馏器。色谱柱为220×4.6mm，填充有5微克Brownlee的正常相硅柱。
使用的三种溶剂为A＝己烷∶甲苯1∶1B＝甲苯∶乙酸乙酯3∶1C＝乙酸乙酯中5％的甲酸梯度图谱如下
在己烷∶甲苯1∶1中制备了一个含有以下成分的色谱标准混合物0.2mg/mL三酰甘油1602.0mg/mL 160游离脂肪酸0.2mg/mL混合的二160异构体(1，2-二乙酰甘油和1，3-二乙酰甘油)0.2mg/mL 3-单乙酰甘油1600.2mg/mL 2-单乙酰甘油160对于每一个样品，通过控制时间事件延迟的方法自动收集含有2-mag峰的部分。一个时间延迟用于使检测器与收集器的发射口同步。收集2-mag峰，并将该部分在室温下蒸发过夜。
sn-2组成结果依赖于减少乙酰迁移的减少。在色谱中出现1-单乙酰甘油和/或3-单乙酰甘油峰意味着乙酰迁移发生。
4.衍生化为衍生全部的油，称量1.0mg抽提的全油加入一个12×32mm带螺旋盖的小瓶中，然后加入1mL的甲苯。然后将样品涡旋振荡，取50uL小份用于衍生化。在干燥的2-mag样品中加入50uL甲苯。在全油和2-mag部分两者中加入105uL H2SO4/CH3OH@8.76wt％。将盖紧紧盖上，将样品在95℃回流1 小时。使样品冷却，加入500uL的10w/v％溶于水的NaCl和60uL庚烷。取出有机层并插入一个12×32mm的螺旋盖小瓶。
5.GLC分析按如下为毛细柱建立一套安装有一个分离/非分离的毛细入口、FID检测器、6890系列自动加样器和3392A Alpha Omega积分仪的Hewlett Packard model 6890 GCA.Supelco Omegawax 250，30m长，0.25mm id，0.25um胶片厚度注射口260C检测器270C起始温度 170C起始时间 1.5分钟速率 30deg/min最后温度 245C最后时间 6.5分钟注射体积 1.5uL前部压力 25psi分离率30载气 He组成气N2FID气 H+空气脂肪酸甲酯的百分比组成按摩尔百分数进行计算。对于长度少于12的碳链来说，在面积百分比计算时需要使用理论或经验的反应因子。
6.计算计算每个sn-1和sn-3位置的每种酰基基团的平均分布。
平均sn-1和sn-3组成＝(3 WO comp-MAG comp)/2WO＝全油MAG＝单酰基甘油此分析的结果示于表14。GLA和Δ6，9182均匀分布在sn-2和sn-1，3位置之间。此分析不能区分sn-1对sn-3位置的脂肪酸。
表14
实施例14转基因植物的脂肪酸组成分析Δ5和Δ6转基因植物的脂肪酸含量。
下面的程序用于油抽提1.对每个样品重复称取约400mg种子2.将种子在一个臼和杵中磨碎。臼和杵用3ml(2∶1)(v∶v)的CHCl3∶CH3OH/MeOH漂洗两次。在20ml玻璃瓶中加入另外6ml(2∶1)(在12ml全2∶1中抽提的油)。
3.将样品涡旋振荡，在定轨摇床上放置2小时，并间或涡旋振荡。
4.在每个样品中加入5ml 1M的NaCl。将样品涡旋振荡，然后在2000rpm离心5分钟。使用巴斯德吸管将下层相吸出。
5.用另外5ml对上层相进行再抽提。将样品涡旋振荡，然后在2000rpm离心5分钟。使用巴斯德吸管将下层相吸出，并加入到前面的下层相中。
6.使用蒸发冷却在氮气下使CHCl3∶CH3OH/MeOH挥发。含有抽提的油的小瓶在氮气下密封。每个样品抽提到120mg-160mg的油。
为进行GC-MS分析，将脂肪酸甲酯溶解在合适体积的己烷中，并用装有一个30m×0.32mm i.d.Omegawax 320融合的硅毛细柱(Supelo，Bellefonte，PA)和一个Hewlett-Packard 5972系列质量选择检测器的Hewlett-Packard 5890 Series II Plus气相色谱仪(Hewlett-Packard，Palo Alto，CA)进行分析。质谱使用MS ChemStation(#G1036A)(Hewlett-Packard)通过与NIST/EPA/NIH化学结构数据库中的质谱进行比较来解读。
对转基因品系5531-6进行了重复(A，B)分析，并与对照品系LP004-6进行了比较。脂肪酸谱的结果示于表15。
对转基因品系5538-19进行了重复(A，B)分析，并与对照品系LP004-6进行了比较。脂肪酸谱的结果示于表16。
表15脂肪酸谱
<p>表15脂肪酸谱
表16脂肪酸谱
<p>表16脂肪酸谱
<p>实施例15通过杂交完成Δ6和Δ12脱氢酶在欧洲油菜中的组合表达将含有Δ6或Δ12脱氢酶的植物杂交，并用GC分析单个F1半种子的脂肪酸组成。来自这样一种杂交的数据示于表17。杂交的亲本为5538-LP004-25-2-25(Δ6表达者)和5542-SP30021-10-16(Δ12表达者)。进行回交，每次的25个单独种子的结果在表中示出。在介绍杂交时，第一个指出的亲本为雌性。两套杂交都给出了基本上相同的结果。与亲本相比较，Δ6，9182降低，GLA增加。Δ9，12182水平在多数F1中也提高。应当注意，这些种子是F1种子，仅含有一套每种脱氢酶。通过将来的传代和选择对每种脱氢酶纯合的事件，所获得的F2的GLA水平可能会更高。
通过杂交来组合性状在某些场合可能比在一个T-DNA上组合性状要优选。特别是当两种基因由相同的启动子驱动时(在本发明中为napin)，启动子静默的结果将使该过程优于将多个cDNA置于同一个结构。
此外，在某些场合，将多个cDNA组合在一个T-DNA上可能是一种选择方法。结果示于表17。
表17株号 160 161 180 181 182_Δ6，9 182_Δ9，12 183_Δ6，9，183_Δ9，12，184 200 20112 115538-LP004-25-2-25 4.23 0.13 2.4 61.78 8.77 6.3411.58 0.92 0 0 05542-SP30021-10-16 4.09 0.1 2.03 38.40 41.880 11.06 0.02 0.75 1.03(5538-LP004-25-2-25X5542-SP30021-10-16) 3.9 0.04 2.31 38.58 0 27.9120.94 2.67 0.65 0.92 1.28(5538-LP004-25-2-25X5542-SP30021-10-16) 3.5 0.04 1.88 36.24 0 28.6822.54 3.36 0.85 0.78 1.32(5538-LP004-25-2-25X5542-SP30021-10-16) 3.51 0.03 1.98 38.360 29.4819.95 3.06 0.68 0.79 1.38(5538-LP004-25-2-25X5542-SP30021-10-16) 3.95 0.04 1.86 38.650 28.0820.81 2.92 0.75 0.76 1.42(5538-LP004-25-2-25X5542-SP30021-10-16) 4.26 0.05 2.44 40.25 0.01 28.8118.08 2.74 0.53 0.88 1.24(5538-LP004-25-2-25X5542-SP30021-10-16) 4.13 0.04 2.33 34.480 26.73 26.2 2.32 0.75 0.9 1.27(5538-LP004-25-2-25X5542-SP30021-10-16) 3.8 0.04 2.15 38.340 28.9520.64 2.63 0.65 0.81 1.3(5538-LP004-25-2-25X5542-SP30021-10-16) 3.96 0.05 1.59 36.430 29.0521.85 3.47 0.86 0.68 1.32(5538-LP004-25-2-25X5542-SP30021-10-16) 4.04 0.04 2.5 37.750 27.2322.89 1.95 0.55 0.99 1.26(5538-LP004-25-2-25X5542-SP30021-10-16) 3.53 0.04 1.8 34.880 29.1723.42 3.420.9 0.74 1.3(5538-LP004-25-2-25X5542-SP30021-10-16) 3.43 0.04 1.89 37.120 29.5220.91 3.350.8 0.79 1.35(5538-LP004-25-2-25X5542-SP30021-10-16) 3.58 0.03 2.55 39.540 28.8119.34 2.44 0.54 0.98 1.34(5538-LP004-25-2-25X5542-SP30021-10-16) 3.53 0.03 2.33 39.260 29.07 19.5 2.61 0.59 0.91 1.37(5538-LP004-25-2-25X5542-SP30021-10-16) 3.4 0.02 2.41 45.530 28.9413.71 2.51 0.37 0.91 1.44
表17株号 160 161 180 181 182_Δ6，9 182_Δ9，12 183_Δ6，9， 183_Δ9，12， 184 200 20112 11(5538-LP004-25-2-25X5542-SP30021-10-16) 3.49 0.03 2.57 40.95 0 28.52 17.97 2.630.58 0.99 1.43(5538-LP004-25-2-25X5542-SP30021-10-16) 3.65 0.04 2.11 38.02 0 29.13 20.53 2.850.66 0.86 1.33(5538-LP004-25-2-25X5542-sP30021-10-16) 3.97 0.03 1.99 34.95 0.01 27.15 25.71 2.380.79 0.81 1.38(5538-LP004-25-2-25X5542-SP30021-10-16) 3.81 0.05 1.46 38.3 0 31.51 17.67 3.830.75 0.61 1.33(5538-LP004-25-2-25X5542-SP30021-10-16) 3.98 0.05 2.03 37.14 0 30.09 20.28 2.790.72 0.8 1.36(5538-LP004-25-2-25X5542-SP30021-10-16) 4.03 0.04 2.52 42.9 0 27.79 16.66 2.640.54 0.9 1.29(5538-LP004-25-2-25X5542-sP30021-10-16) 4.03 0.04 2.27 40.72 0 29.37 17.56 2.530.53 0.86 1.35(5538-LP004-25-2-25X5542-SP30021-1 0-16) 3.98 0.04 2.61 39.91 0 28.06 19.15 2.69 0.6 0.96 1.26(5538-LP004-25-2-25X5542-SP30021-10-16) 3.73 0.03 1.89 40.22 0 29.44 18.2130.67 0.73 1.39(5538-LP004-25-2-25X5542-SP30021-10-16) 4.02 0.04 2.14 42.58 0 30.36 15.18 2.430.42 0.821.3(5542-SP30021-10-16X5538-LP004-25-2-25) 4.14 0.06 2.23 30.67 0 30.38 25.47 3.120.91 0.9 1.29(5542-SP30021-10-16X5538-LP004-25-2-25) 4.05 0.071.7 37.03 0.04 32.1 15.97 5.380.96 0.69 1.28(5542-SP30021-10-16X5538-LP004-25-2-25) 4.01 0.07 1.58 38.02 0.05 33.65 13.92 5.150.89 0.66 1.28(5542-sP30021-10-16X5538-LP004-25-2-25) 4.07 0.06 2.01 31.63 0.05 31.13 23.09 3.94 1.1 0.83 1.28(5542-SP30021-10-16X5538-LP004-25-2-25) 4.03 0.05 1.94 31.88 0 30.98 23.71 3.450.99 0.821.3(5542-SP30021-10-16X5538-LP004-25-2-25) 3.92 0.06 1.71 35.77 0.03 33.15 16.39 5.280.98 0.68 1.32(5542-SP30021-10-16X5538-LP004-25-2-25) 4.09 0.08 1.57 34.6 0.03 33.73 16.73 5.480.99 0.66 1.28
表17株号 160 161 180 181 182_Δ6，9 182_Δ9，12 183_Δ6，9，183_Δ9，12，184 200 2011211(5542-SP30021-10-16X5538-LP004-25-2-25) 3.94 0.07 1.59 34.03 0.04 31.35 19.76 5.29 1.22 0.67 1.28(5542-SP30021-10-16X5538-LP004-25-2-25) 4.13 0.06 1.85 31.44 0.06 31.28 23.77 3.52 1.04 0.79 1.22(5542-SP30021-10-16X5538-LP004-25-2-25) 4.14 0.06 1.96 31.11 0.04 31.88 23.33.6 1.01 0.82 1.27(5542-SP30021-10-16X5538-LP004-25-2-25) 3.98 0.07 1.58 35.060 32.06 18.1 5.33 1.12 0.67 1.28(5542-SP30021-10-16X5538-LP004-25-2-25) 3.89 0.06 1.59 32.51 0.05 29.44 22.91 5.33 1.54 0.67 1.25(5542-SP30021-10-16X5538-LP004-25-2-25) 4 0.07 1.69 32.1 0.05 30.49 22.77 4.66 1.32 0.75 1.26(5542-SP30021-10-16X5538-LP004-25-2-25) 4.06 0.05 1.93 30.77 0.07 28.37 27.21 3.37 1.19 0.84 1.25(5542-SP30021-10-16X5538-LP004-25-2-25) 4.1 0.06 1.9 31.77 0.05 32.33 22.03 3.92 0.98 0.78 1.27(5542-SP30021-10-16X5538-LP004-25-2-25) 3.94 0.07 1.67 34.74 0.03 33.63 17.1 5.16 0.99 0.68 1.26(5542-SP30021-10-16X5538-LP004-25-2-25) 3.71 0.06 1.65 33.050 33.22 19.734.7 1.07 0.68 1.39(5542-SP30021-10-16X5538-LP004-25-2-25) 3.84 0.06 1.71 34.16 0.04 34.52 16.74 5.18 0.97 0.68 1.34(5542-SP30021-10-16X5538-LP004-25-2-25) 4 0.07 1.66 34.97 0.07 33.08 17.07 5.27 1.1 0.67 1.28(5542-SP30021-10-16X5538-LP004-25-2-25) 4.16 0.06 1.99 35.44 0.05 31.89 18.95 3.68 0.89 0.81 1.29(5542-SP30021-10-16X5538-LP004-25-2-25) 4.05 0.08 1.46 33.490 31.96 18.816.2 1.32 0.61 1.28(5542-SP30021-10-16X5538-LP004-25-2-25) 4.2 0.06 1.93 35.06 0.06 33.69 17.38 4 0.66 0.78 1.21(5542-SP30021-10-16X5538-LP004-25-2-25) 4.07 0.06 1.74 36 0.06 32.18 17.86 4.32 0.96 0.73 1.27(5542-SP30021-10-16X5538-LP004-25-2-25) 4.11 0.05 2.24 29.64 0.04 28.64 27.94 3.06 1.12 0.97 1.26
实施例16在大豆中表达高山被孢霉脱氢酶高山被孢霉可通过使用下面的表达结构在大豆中驱动GLA和其他PUFAs的产生。使用两种方法可将外源DNA插入到大豆基因组中，它们是农杆菌感染或微粒枪。微粒枪转化在U.S.专利5,503,998中公开。植物可用一种glyphosate抗性标记进行选择(4,971,908)。大豆的农杆菌转化对本领域的技术人员来说非常熟悉。
为进行种子特异性表达，将脱氢酶cDNA的编码区置于Glycine max的α型β伴大豆球蛋白贮藏蛋白基因的5’调节区的控制之下，可以使用的特殊区域是gi 169928的核苷酸78-921(Doyle，J.J.，Schuler，M.A.，Godette，W.D.，Zenger，V.，Beachy，R.N.，和Slightom，J.L.，1986，J.Biol.Chem.261(20)，9228-9238)。可以使用的3’调节区来自豌豆核酮糖1，5二磷酸羧化酶/氧化酶小亚基(rbcS)基因，使用的特殊序列是gi 169145的核苷酸1-645(Hunt，A.G.1988，DNA 7329-336)。
因为大豆种子比芸苔含有更多的182，并可能含有更多的Δ12脱氢酶活性。被孢霉Δ12脱氢酶对获得最高水平的GLA的影响可按下面的方法进行检测。可以使用一个含有Δ6 cDNA的结构来观察Δ5，9182是否伴随GLA产生。可以使用一个含有Δ12 cDNA的结构来观察182的量在大豆中是否增加。可以使用含有Δ6和Δ12脱氢酶两者的结构来产生最高水平的GLA。此外，当需要将基因组合时，含有每种单一脱氢酶的植物可进行杂交。
可以制备相似的结构来单独或与Δ6和/或Δ12脱氢酶组合来表达Δ5脱氢酶。
实施例17人脱氢酶基因序列根据人cDNA序列与高山被孢霉脱氢酶基因序列的同源性，分离了可能参与长链多不饱和脂肪酸生物合成的人脱氢酶基因序列。发现了已知在膜结合脱氢酶中为保守的三个保守的“组氨酸盒”。与某些其他的膜结合脱氢酶一样，最后一个HXXHH组氨酸盒基元被发现为QXXHH。可能的人脱氢酶的氨基酸序列显示与高山被孢霉Δ5、Δ6、Δ9和Δ12脱氢酶同源。
使用高山被孢霉Δ5脱氢酶和Δ6脱氢酶cDNA序列来对IncytePharmaceuticls，Inc.，Palo Alto，California 94304的LifeSeq数据库进行检索。Δ5脱氢酶序列被分为以下片段1)氨基酸no.1-150，2)氨基酸no.151-300，和3)氨基酸no.301-446。Δ6脱氢酶序列被分为三个片段1)氨基酸no.1-150，2)氨基酸no.151-300，和3)氨基酸no.301-457。使用“tblastn”算法用这些多肽片段对数据库进行检索。这种算法将一个蛋白查询序列与一个在所有六种阅读框(两条链)动态翻译的核苷酸序列数据进行比较。
高山被孢霉Δ5和Δ6的多肽片段与列于表18的CloneID序列具有同源性。该CloneID表示一个来自Incyte LifeSeq数据库的单个序列。在回顾了“tblastn”结果后，用缺省的设置Strigency＞＝50和Productscore＜＝100来在Clone Information中检索不同的CloneID号码。显示信息的CloneID Information结果包括ClusterID、CloneID、Library、HitID、Hit Description。在选择时，ClusterID号显示属于该ClusterID的所有克隆的克隆信息。集合命令将集合所有包含该ClusterID的CloneID。下面的缺省设置用于GCG(Genetics Computer Croup，University of WisconsinBiotechnology Center，Madison，Wisconsin 53705)集合Word Size 7Minimum Overlap14Stringency 0.8Minimum Identity 14Maximum Gap10Gap Weight 8Length Weight2GCG集合结果显示了以CloneID中的信息为基础产生的重叠群。一种重叠群是以这些序列的同源区为基础进行的DNA序列列队。在一种重叠群中以排列的DNA序列为基础产生了一个新的序列(共有序列)。鉴定了含有CloneID的重叠群，并以CloneID的列队(SEQ IDNO31-35)为基础对共有序列的两可性位点进行了编辑，以产生可能性最大的序列。对表18中列出的所有6个CloneID重复了这个过程。这产生了5个独特的重叠群。将5个重叠群的经过编辑的共有序列输入Sequencher软件程序(Gene Codes Corporation，Ann Arbor，Michigan 48 105)。将这些共有序列组合。重叠群2511785与重叠群3506132重叠，而这个新的重叠群被称为2535(SEQ ID NO37)。将来自Sequencher程序的重叠群拷贝到GCG的序列分析软件包中。
将每个重叠群按所有6个阅读框翻译成蛋白序列。使用FastAsearch(一种用于在一个查询序列和一组相同类型(核酸或蛋白质)的序列中检索相似性的Pearson and Lipman检索)将高山被孢霉Δ5(MA9)和Δ6(MA524)序列与每个翻译的重叠群进行比较。这些序列之间的同源性揭示了每个重叠群的开放阅读框。高山被孢霉Δ5和Δ6与重叠群2535和3854933之间的同源性被用来产生一个最后的重叠群，它被称为253538a。图9是最后的重叠群253538a与MA29的FastA匹配，图10是最后的重叠群253538a与MA524的FastA匹配。各重叠群的DNA序列示于SEQ ID NO31-SEQ ID NO37。各多肽序列示于SEQ ID NO38-SEQ ID NO44。
虽然开放阅读框是通过两个重叠群融合而来，重叠群2535显示在其开始处有一个与重叠群3854933不匹配的独特序列。因此，可能这些重叠群是从独立的脱氢酶样人基因产生的。
重叠群253538a含有一个编码432个氨基酸的开放阅读框。它由谷氨酰胺(CAG)开始，由终止密码子(TGA)结束。重叠群253538与高山被孢霉Δ5和Δ6序列都对应，说明它可能是两种脱氢酶之一，或是其他已知的相互之间具有同源性的脱氢酶。表18中列出的单个重叠群以及中间重叠群2535和最终重叠群253538a可用于分离编码人脱氢酶的全基因。
人脱氢酶的用途这些人序列可使用前面实施例中介绍的程序在酵母和植物中表达。对于在哺乳动物细胞和转基因动物中表达，这些基因可提供优越的密码子偏性。此外，这些序列可用于从其他有机体中分离相关的脱氢酶基因。
表18<
>实施例18高山被孢霉Δ5和Δ6脱氢酶同源物的鉴定使用Ma29的氨基酸100-446作为查询序列通过在NCBI用TBLASTN检索表达的序列标记数据鉴定了一个编码一种可能的Δ5脱氢酶的核苷酸序列。Ma29序列的剪短部分被用来避免挑选出基于脱氢酶N末端的细胞色素b5部分的同源序列。来自盘基网柄菌(登记号#C25549)的一个est的推导氨基酸序列显示与Ma29明显的同源性，并显示与Ma524较少但仍然明显的同源性。此DNA序列列于SEQID NO45。氨基酸序列示于SEQ ID NO46。
实施例19其他产PUFA有机体中高山被孢霉Δ5和Δ6的同源物的鉴定为寻找参与PUFA产生的脱氢酶，用分离自三角褐指藻的总RNA构建了一个cDNA文库。使用一种商业化的试剂盒(GIBCO-BRL)按照厂商的指示在pSPORT1(GIBCO-BRL)中构建了一个以质粒为基础的cDNA文库。对随机cDNA克隆进行测序，通过数据库的BLAST检索和与Ma29和Ma524序列比较，鉴定编码可能的Δ5或Δ6脱氢酶的核酸序列。
从褐指藻文库中鉴定了一个与Ma29和Ma524具有同源性的克隆，它被称为144-011-B12。此DNA序列示于SEQ ID NO47。氨基酸序列示于SEQ ID NO48。
实施例20其他产PUFA有机体中高山被孢霉Δ5和Δ6同源物的鉴定为寻找参与PUFA产生的脱氢酶，用分离自Schizochytrium种的总RNA构建了一个cDNA文库。使用一种商业化的试剂盒(GIBCO-BRL)按照厂商的指示在pSPORT1(GIBCO-BRL)中构建了一个以质粒为基础的cDNA文库。对随机cDNA克隆进行测序，通过数据库的BLAST检索和与Ma29和Ma524序列比较，鉴定编码可能的Δ5或Δ6脱氢酶的核酸序列。
从Schizochytrium文库中鉴定了一个与Ma29和Ma524具有同源性的克隆，它被称为81-23-C7。此克隆含有一个约1kb的插入子。使用通用的正向和反向测序引物从该克隆的每端获得了部分序列。来自正向引物的DNA序列示于SEQ ID NO49，多肽序列示于SEQID NO50。来自反向引物的DNA序列示于SEQ ID NO51，来自反向引物的氨基酸序列示于SEQ ID NO52。
实施例21营养组合物可将前面实施例中的PUFAs用于各种营养保健品、婴儿配方食品、营养替代品和其它营养液。
I.婴儿配方食品A.含有铁的Isomil大豆配方食品用途作为供对牛奶过敏或敏感的婴儿、幼儿和成年人的饮料，供患有应避免使用乳糖的疾病的患者使用的食物，所述疾病为乳糖酶缺陷型、不耐乳糖和半乳糖血症。
特征●大豆蛋白提取物，可以避免对牛奶蛋白过敏或敏感的症状。
●无乳糖制剂，可以避免与乳糖相关的腹泻。
●低渗透压(240mOsm/kg水)，可以降低渗透压腹泻的危险。
●双重碳水化合物(玉米糖浆和蔗糖)设计，可以提高碳水化合物的吸收并降低超过受损伤肠道的吸收能力的危险。
●每100卡路里1.8mg铁(硫酸亚铁)，有助于避免缺铁。
●推荐含量的维生素和矿物质。
●植物油，用于提供推荐含量的必需脂肪酸。
●乳白色，乳样稠度和宜人的芳香。
成分(Pareve，)85％水、4.9％玉米糖浆、2.6％糖(蔗糖)、2.1％大豆油、1.9％大豆蛋白提取物、1.4％椰子油、0.15％柠檬酸钙、0.11％三碱价磷酸钙、柠檬酸钾、单碱价磷酸钾、氯化钾、甘油一酯和二酯、大豆卵磷酯、角叉菜聚糖、抗坏血酸、L-甲硫氨酸、氯化镁、二碱价磷酸钾、氯化钠、氯化胆碱、牛黄酸、硫酸亚铁、m-肌醇、α-生育酚乙酸酯、硫酸锌、L-肉碱、烟酰胺、泛酸钙、硫酸铜、维生素A棕榈酸酯、盐酸氯化硫胺素、核黄素、盐酸吡哆醇、叶酸、硫酸锰、碘化钾、叶绿醌、生物素、亚硒酸钠、维生素D3和氰钴胺素。
B.用于腹泻的IsomilDF大豆配方食品用途作为对婴儿和儿童进行腹泻饮食控制的短期食物。
特征●最初的婴儿配方食品，含有源于大豆纤维的、添加的食用纤维，特别适用于腹泻治疗。
●临床上证实，在婴儿中度至重度腹泻期间，能降低腹泻、水样大便的持续时间。
●营养能完全满足婴儿的营养需要。
●添加了L-甲硫氨酸的大豆蛋白提取物，能满足或超过婴儿对全部必需氨基酸的需要。
●无乳糖制剂，可以避免与乳糖相关的腹泻。
●低渗透压(240mOsm/kg水)，可以降低渗透性腹泻的危险。
●双重碳水化合物(玉米糖浆和蔗糖)设计，可以提高碳水化合物的吸收并降低超过受损伤的肠道的吸收能力的危险。
●满足或超过由美国儿科学营养委员会推荐的维生素和矿物质水平，并满足婴儿配方食品条例的要求。
●每100卡路里1.8mg铁(硫酸亚铁)，有助于避免缺铁。
●植物油，用于提供推荐含量的必需脂肪酸。
成分(Pareve，)86％水、4.8％玉米糖浆、2.5％糖(蔗糖)、2.1％大豆油、2.0％大豆蛋白提取物、1.4％的椰子油、0.77％大豆纤维、0.12％柠檬酸钙、0.11三碱价磷酸钙、0.10％柠檬酸钾、氯化钾、单碱价磷酸钾、甘油一酯和二酯、大豆卵磷酯、角叉菜聚糖、氯化镁、抗坏血酸、L-甲硫氨酸、二碱价磷酸钾、氯化钠、氯化胆碱、牛黄酸、硫酸亚铁、m-肌醇、α-生育酚乙酸酯、硫酸锌、L-肉碱、烟酰胺、泛酸钙、硫酸铜、维生素A棕榈酸酯、盐酸氯化硫胺素、核黄素、盐酸吡哆醇、叶酸、硫酸锰、碘化钾、叶绿醌、生物素、亚硒酸钠、维生素D3和氰钴胺素。
C.含有铁的IsomilSF无蔗糖大豆配方食品。
用途作为对牛奶蛋白过敏或敏感的或不耐受蔗糖的婴儿、幼儿和成年人的饮料。作为患有避免使用乳糖和蔗糖的疾病的患者的食物。
特征●大豆蛋白提取物，可以避免牛奶蛋白过敏或敏感的症状。
●无乳糖制剂，可以避免与乳糖相关的腹泻(碳水化合物源是Polycose葡萄糖聚合物)。
●不含蔗糖，用于不能耐蔗糖的患者。
●低渗透压(180mOsm/kg水)，可以降低渗透压性腹泻的危险。
●每100卡路里1.8mg铁(硫酸亚铁)，有助于避免缺铁。
●推荐含量的维生素和矿物质。
●植物油，用于提供推荐含量的必需脂肪酸。
●乳白色，乳样稠度和宜人的芳香。
成分(Pareve，)75％水、11.8％水解玉米淀粉、4.1％大豆油、4.1％大豆蛋白提取物、2.8％椰子油、1.0％改性玉米淀粉、0.38％三碱价磷酸钙、0.17％柠檬酸钾、0.13％氯化钾、甘油一酯和二酯、大豆卵磷酯、氯化镁、抗坏血酸、L-甲硫氨酸、碳酸钙、氯化钠、氯化胆碱、角叉菜聚糖、牛黄酸、硫酸亚铁、m-肌醇、α-生育酚乙酸酯、硫酸锌、L-肉碱、烟酰胺、泛酸钙、硫酸铜、维生素A棕榈酸酯、盐酸氯化硫胺素、核黄素、盐酸吡哆醇、叶酸、硫酸锰、碘化钾、叶绿醌、生物素、亚硒酸钠、维生素D3和氰钴胺素。
D.含有即时可食用的铁的Isomil20大豆配方食品，20Cal/floz。
用途在需要大豆喂养时使用。
成分(Pareve，)85％水、4.9％玉米糖浆、2.6％糖(蔗糖)、2.1％大豆油、1.9％大豆蛋白提取物、1.4％椰子油、0.15％柠檬酸钙、0.11％三碱价磷酸钙、柠檬酸钾、单碱价磷酸钾、氯化钾、甘油一酯和二酯、大豆卵磷酯、角叉菜聚糖、抗坏血酸、L-甲硫氨酸、氯化镁、二碱价磷酸钾、氯化钠、氯化胆碱、牛黄酸、硫酸亚铁、m-肌醇、α-生育酚乙酸酯、硫酸锌、L-肉碱、烟酰胺、泛酸钙、硫酸铜、维生素A棕榈酸酯、盐酸氯化硫胺素、核黄素、盐酸吡哆醇、叶酸、硫酸锰、碘化钾、叶绿醌、生物素、亚硒酸钠、维生素D3和氰钴胺素。
E.Similac婴儿配方食品用途当需要婴儿配方食品时当在1周岁之前决定终止母乳喂养时，当需要对母乳喂养进行补充时或当母乳喂养不合适时作为一种日常喂养。
特征●适于良好生长的适当质量和数量的蛋白；加热变性，这样可以降低与奶相关的肠失血的危险。
●来自混合植物油的脂肪(双重匀化)，提供容易吸收的必需亚油酸。
●诸如乳糖的碳水化合物，其比例类似于人乳的比例。
●低的肾溶质负担，以降低对发育中的器官的压力。
●粉状、浓缩液体和可立即喂养形式。
成分(-D)水、无脂奶粉、乳糖、大豆油、椰子油、甘油一酯和二酯、大豆卵磷酯、抗坏血酸、角叉菜聚糖、氯化胆碱、牛黄酸、m-肌醇、α-生育酚乙酸酯、硫酸锌、烟酰胺、硫酸亚铁、泛酸钙、硫酸铜、维生素A棕榈酸酯、盐酸氯化硫胺素、核黄素、盐酸吡哆醇、叶酸、硫酸锰、碘化钾、叶绿醌、生物素、亚硒酸钠、维生素D3和氰钴胺素。
F.SimilacNeocare含铁早产婴儿配方食品用途用于满足出院后早产婴儿的特殊营养需求。SimilacNeocare是生产的一种全营养的配方食品，用于为早产婴儿提供所需的额外的卡路里、蛋白、维生素和矿物质，以改善其同步生长并支持发育。
特征●降低对补充卡路里和维生素的需要。比标准配方食品(20Cal/fl oz)更多的卡路里(22 Cal/fl oz)。
●含有中等-链甘油三酯(MCT油)的高效吸收的脂肪混合物，有利于满足早产婴儿特殊的消化需要。
●每100卡路里具有更高含量的蛋白、维生素和矿物质，以便延长始于医院的营养支持。
●更多的钙和磷有利于骨骼矿物化。
成分-D玉米糖浆固体、无脂奶粉、乳糖、乳蛋白浓缩物、大豆油、高油酸红花油、分离过的椰子油(中等链甘油三酯)、椰子油、柠檬酸钾、三碱价磷酸钙、碳酸钙、抗坏血酸、氯化镁、氯化钾、氯化钠、牛黄酸、硫酸亚铁、m-肌醇、氯化胆碱、抗坏血酸棕榈酸酯、L-肉碱、α-生育酚乙酸酯、硫酸锌、烟酰胺、混合生育酚、柠檬酸钠、泛酸钙、硫酸铜、盐酸氯化硫胺素、维生素A棕榈酸酯、β胡萝卜素、核黄素、盐酸吡哆醇、叶酸、硫酸锰、叶绿醌、生物素、亚硒酸钠、维生素D3和氰钴胺素。
G.即用型Similac天然保健低铁人乳强化剂，24Cal/fl oz。
用途被设计用于与人乳混合或与人乳交替喂养低出生体重婴儿。
成分-D水、无脂奶粉、水解玉米淀粉、乳糖、分离过的椰子油(中等链甘油三酯)、乳蛋白浓缩物、大豆油、椰子油、三碱价磷酸钙、柠檬酸钾、氯化镁、柠檬酸钠、抗坏血酸、碳酸钙、甘油一酯和二酯、大豆卵磷脂、角叉菜聚糖、氯化胆碱、m-肌醇、牛黄酸、烟酰胺、L-肉碱、α-生育酚乙酸酯、硫酸锌、氯化钾、泛酸钙、硫酸亚铁、硫酸铜、核黄素、维生素A棕榈酸酯、盐酸氯化硫胺素、盐酸吡哆醇、生物素、叶酸、硫酸锰、叶绿醌、亚硒酸钠、维生素D3和氰钴胺素。
可以用本发明的各种PUFAs取代和/或添加上述婴儿配方食品，以及本领域中公知的其它婴儿配方食品。
II.营养制剂A.ENSURE用途ENSURE是一种被设计成主要用作口服营养保健品的低残留物液体食品，用于在就餐时服用或在两餐之间服用，或以适当的量取代食物。ENSURE是不含乳糖和谷蛋白的，并适用于改进的饮食，包括低胆甾醇饮食。不过它主要是作为一种口服保健品，可以通过饲管喂饲。
患者症状●用于改变了饮食的患者●用于有营养危险的老年性患者
●用于不随意的体重减轻的患者●用于病后或手术后恢复的患者●用于需要低残留饮食的患者成分-D水、糖(蔗糖)、麦芽糖糊精(玉米)、酪蛋白酸钙和钠、高油酸红花油、大豆蛋白提取物、大豆油、菜籽油、柠檬酸钾、三碱价磷酸钙、柠檬酸钠、氯化镁、二碱价磷酸镁、人工香精、氯化钠、大豆卵磷脂、氯化胆碱、抗坏血酸、角叉菜聚糖、硫酸锌、硫酸亚铁、α-生育酚乙酸酯、吉兰胶、烟酰胺、泛酸钙、硫酸锰、硫酸铜、维生素A棕榈酸酯、盐酸氯化硫胺素、盐酸吡哆醇、核黄素、叶酸、钼酸钠、氯化铬、生物素、碘化钾、硒酸钠。
D.ENSURE棒用途ENSURE棒是全面、均衡营养的，用于作为两餐之间的补充或与食物一起使用。它可以作为替代其它快餐的美味、营养丰富的替代品。ENSURE棒的每一个棒含有低于1克的乳糖，并且巧克力FudgeBrownie香料不含谷蛋白。(Honey Graham Crunch香料含有谷蛋白)。
患者症状●用于需要额外卡路里、蛋白、维生素和矿物质的患者●特别适用于为摄取足够卡路里和养分的人●用于有咀嚼和吞咽能力的人●任何对豌豆过敏或对坚果有任何类型过敏的人都不能食用成分Honey Graham Crunch--高果糖玉米糖浆、大豆蛋白提取物、红糖、蜜、麦芽糖糊精(玉米)、松脆大米(研磨过的大米)，糖[蔗糖]，盐[氯化钠]和麦芽、燕麦麸皮、部分氢化的棉籽油和大豆油、大豆多糖、甘油、乳清蛋白浓缩物、聚葡萄糖、果糖、酪蛋白酸钙、可可粉、人工香精、菜籽油、高油酸红花油、无脂奶粉、乳清粉、大豆卵磷脂和玉米油。在加工坚果的设备中生产。
维生素和矿物质三碱价磷酸钙、二碱价磷酸钾、氧化镁、盐(氯化钠)、氯化钾、抗坏血酸、正磷酸铁、α-生育酚乙酸酯、烟酰胺、氧化锌、泛酸钙、葡糖酸铜、硫酸锰、核黄素、β胡萝卜素、盐酸吡哆醇、一硝酸硫胺素、叶酸、生物素、氯化铬、碘化钾、硒酸钠、钼酸钠、叶绿醌、维生素D3和氰钴胺素。
蛋白Honey Graham Crunch-蛋白来源是大豆蛋白提取物和乳蛋白的混合物。
大豆蛋白提取物74％乳蛋白26％脂肪Honey Graham Crunch-脂肪来源是部分氢化的棉籽油和大豆油、菜籽油、高油酸红花油、和玉米油、以及大豆卵磷脂的混合物。
部分氢化的棉籽油和大豆油 76％菜籽油 8％高油酸红花油 8％玉米油 4％大豆卵磷脂 4％碳水化合物Honey Graham Crunch-碳水化合物源是高果糖玉米糖浆、红糖、麦芽糖糊精、蜜、松脆大米、甘油、大豆多糖、和燕麦麸皮的混合物。
高果糖玉米糖浆 24％红糖 21％麦芽糖糊精 12％蜜 11％松脆大米 9％甘油 9％大豆多糖 7％燕麦麸皮 7％C.ENSURE高蛋白用途ENSURE高蛋白是一种为在其饮食中需要额外卡路里、蛋白、维生素和矿物质的人设计的浓缩的、高蛋白液体食品。可将其用作口服营养保健品，与食物一起食用或在两餐之间食用，或者以适当的量作为食物的替代品。ENSURE高蛋白是不含乳糖和谷蛋白的，并适合一般手术或髋关节骨折后恢复的人使用，并适于有压力型溃疡危险的患者使用。
患者症状
●用于需要额外卡路里、蛋白、维生素和矿物质的患者，如一般手术或髋关节骨折后恢复的患者、有压力型溃疡危险的患者、和需要低胆甾醇饮食的患者。
特征-●饱和脂肪含量低●每1份含有6克总脂肪和低于5毫克的胆甾醇●味道丰满、奶油味●是蛋白、钙和其它必需维生素和矿物质的优良来源●用于低胆甾醇饮食●不含乳糖，容易消化成分Vanilla Suppreme--D水、糖(蔗糖)、麦芽糖糊精(玉米)、酪蛋白酸钙和钠、高油酸红花油、大豆蛋白提取物、大豆油、菜籽油、柠檬酸钾、三碱价磷酸钙、柠檬酸钠、氯化镁、二碱价磷酸镁、人工香精、氯化钠、大豆卵磷脂、氯化胆碱、抗坏血酸、角叉菜聚糖、硫酸锌、硫酸亚铁、α-生育酚乙酸酯、吉兰胶、烟酰胺、泛酸钙、硫酸锰、硫酸铜、维生素A棕榈酸酯、盐酸氯化硫胺素、盐酸吡哆醇、核黄素、叶酸、钼酸钠、氯化铬、生物素、碘化钾、硒酸钠、叶绿醌、维生素D3和氰钴胺素。
蛋白蛋白来源是两种高生物学价值蛋白酪蛋白和大豆蛋白的混合物。
酪蛋白酸钠和钙 85％大豆蛋白提取物 15％脂肪脂肪来源是三种油的混合物高油酸红花油、菜籽油、和大豆油。
高油酸红花油40％菜籽油 30％大豆油 30％ENSURE高蛋白中的脂肪含量满足美国心脏协会(AHA)的规定。ENSURE高蛋白中的6克脂肪相当于24％的总卡路里，其中2.6％的脂肪来自饱和脂肪酸，7.9％的脂肪来自多不饱和脂肪酸。以上数字在AHA规定的范围之内来自脂肪的总卡路里≤30％，＜10％的卡路里来自饱和脂肪酸，≤10％的总卡路里来自多不饱和脂肪酸。
碳水化合物ENSURE高蛋白含有麦芽糖糊精和蔗糖的组合物。适中的甜度和各种风味(香草味、巧克力味、野浆果味、和香蕉味)，加上大胡桃、樱桃、草莓、柠檬、和橙的VARI-FLAVORSOFlavor Pacs有助于避免产生对味道的麻木，并有助于患者接受。
香草和其它非巧克力风味蔗糖 60％麦芽糖糊精 40％巧克力蔗糖 70％麦芽糖糊精 30％D.ENSURELIGHT用途ENSURE LIGHT是一种被设计用作口服营养保健品的低脂肪液体食品，与食物一起使用或在两餐之间使用。ENSURE LIGHT不含乳糖和谷蛋白，适用于改变的饮食，包括低胆甾醇饮食。
患者症状●用于正常体重或肥胖患者，这种患者需要在一种保健品中有额外的营养，这种保健品所含脂肪比ENSURE低50％，所含的卡路里比ENSURE少20％。
●用于因为饮食不正常而需要额外营养的健康成年人特征●脂肪和饱和脂肪含量低●每1份含有3克总脂肪和低于5毫克的胆甾醇●味道丰满、奶油味●是钙和其它必需维生素和矿物质的优良来源●用于低胆甾醇饮食●不含乳糖，容易消化成分法国香草-D水、麦芽糖糊精(玉米)、糖(蔗糖)、酪蛋白酸钙、高油酸红花油、菜籽油、氯化镁、柠檬酸钠、柠檬酸钾、二碱价磷酸钾、二碱价磷酸镁、天然和人工香精、三碱价磷酸钙、纤维素凝胶、氯化胆碱、大豆卵磷脂、角叉菜聚糖、盐(氯化钠)、抗坏血酸、纤维素胶、硫酸亚铁、α-生育酚乙酸酯、硫酸锌、烟酰胺、硫酸锰、泛酸钙、硫酸铜、盐酸氯化硫胺素、维生素A棕榈酸酯、盐酸吡哆醇、核黄素、氯化铬、叶酸、钼酸钠、生物素、碘化钾、硒酸钠、叶绿醌、维生素D3和氰钴胺素。
蛋白蛋白来源是酪蛋白酸钙。
酪蛋白酸钙 100％脂肪脂肪来源是两种油的混合物高油酸红花油和菜籽油。
高油酸红花油70％菜籽油 30％ENSURE LIGHT中的脂肪含量符合美国心脏协会(AHA)的规定。ENSURE LIGHT中的3克脂肪相当于13.5％的总卡路里，其中1.4％的脂肪来自饱和脂肪酸，2.6％的脂肪来自多不饱和脂肪酸。以上数字在AHA规定的范围之内来自脂肪的总卡路里≤30％，＜10％的卡路里来自饱和脂肪酸，≤10％的总卡路里来自多不饱和脂肪酸。
碳水化合物ENSURE LIGHT含有麦芽糖糊精和蔗糖的组合物。巧克力风味的还含有玉米糖浆。适中的甜度和各种风味(法国香草味、巧克力王、草莓旋风)，加上大胡桃、樱桃、草莓、柠檬、和橙的VARI-FLAVORSOFlavor Pacs有助于避免产生对味道的麻木，并有助于患者接受。
香草和其它非巧克力风味蔗糖 51％麦芽糖糊精 49％巧克力蔗糖 47.0％玉米糖浆 26.5％麦芽糖糊精 26.5％维生素和矿物质1份8-fl-oz的ENSURE LIGHT至少能提供24种重要的维生素和矿物质的25％的RDIs。
咖啡因巧克力香味含有2.1毫克咖啡因/8fl ozE.ENSURE PLUS用途ENSURE PLUS是一种高卡路里、低残留液体食品，用于在需要额外的卡路里和营养，但需要正常浓度的蛋白时使用。它主要被设计成一种口服营养保健品，用于在就餐时使用或在两餐之间使用，或者以合适的量作为食物的替代品。ENSURE PLUS不含乳糖和谷蛋白。不过，它主要是一种口服营养保健品，可以通过饲管喂饲。
患者症状●用于在有限的体积中需要额外卡路里和营养，但需要正常浓度的蛋白的患者●用于需要到达或维持健康体重的患者特征●味道丰满，奶油味●是必需维生素和矿物质的良好来源成分香草-D水、玉米糖浆、麦芽糖糊精(玉米)、玉米油、酪蛋白酸钠和钙、糖(蔗糖)、大豆蛋白提取物、氯化镁、柠檬酸钠、柠檬酸钾、三碱价磷酸钙、大豆卵磷脂、天然和人工香精、柠檬酸钠、氯化钾、氯化胆碱、抗坏血酸、角叉菜聚糖、硫酸锌、硫酸亚铁、α-生育酚乙酸酯、烟酰胺、泛酸钙、硫酸锰、硫酸铜、盐酸氯化硫胺素、盐酸吡哆醇、核黄素、维生素A棕榈酸酯、叶酸、生物素、氯化铬、钼酸钠、碘化钾、亚硒酸钠、叶绿醌、氰钴胺素和维生素D3。
蛋白蛋白来源是两种高生物学价值蛋白的混合物酪蛋白和大豆蛋白。
酪蛋白酸钠和钙 84％大豆蛋白提取物 16％脂肪脂肪来源是玉米油。
玉米油 100％碳水化合物ENSURE PLUS含有麦芽糖糊精和蔗糖的组合物。适中的甜度和多种风味(香草味、巧克力味、草莓味、咖啡味、黄油大胡桃、和鸡蛋酒味)，加上大胡桃、樱桃、草莓、柠檬、和橙的VARI-FLAVORSOFlavorPacs，有助于避免产生对味道的麻木，并有助于患者接受。
香草、草莓、黄油大胡桃、和咖啡味玉米糖浆 39％麦芽糖糊精38％蔗糖 23％巧克力和鸡蛋酒味玉米糖浆 36％麦芽糖糊精34％蔗糖 30％维生素和矿物质1份8fl oz ENSURE PLUS至少可提供25种重要维生素和矿物质的15％的RDIs。
咖啡因巧克力味含有3.1毫克咖啡因/8fl oz。咖啡味含有微量的咖啡因。
F.ENSURE PLUSHN用途ENSURE PLUS HN是一种全营养高卡路里、高氮液体食品，是为需要较多卡路里和蛋白或具有有限的体积承受能力的人设计的。可将其用于口服补充或通过饲管进行全营养支持。ENSURE PLUS HN不含乳糖和谷蛋白。
患者症状●用于需要较多卡路里和蛋白的患者，如手术或受伤后的患者●用于具有有限的体积承受能力和提前产生饱满感的患者特征●用于补充或全营养●用于口服或饲管喂养● 1.5CaVmL●高氮●卡路里稠密成分香草-D水、麦芽糖糊精(玉米)、酪蛋白酸钠和钙、玉米油、糖(蔗糖)、大豆蛋白提取物、氯化镁、柠檬酸钾、三碱价磷酸钙、大豆卵磷脂、天然和人工香精、柠檬酸钠、氯化胆碱、抗坏血酸、牛黄酸、L-肉碱、硫酸锌、硫酸亚铁、α-生育酚乙酸酯、烟酰胺、角叉菜聚糖、泛酸钙、硫酸锰、硫酸铜、盐酸氯化硫胺素、盐酸吡哆醇、核黄素、维生素A棕榈酸酯、叶酸、生物素、氯化铬、钼酸钠、碘化钾、亚硒酸钠、叶绿醌、氰钴胺素和维生素D3。
G.ENSURE粉用途ENSURE粉(用水重配)是一种低残留液体食品，主要被设计用作口服营养保健品，用于就餐时使用或在两餐之间使用。ENSURE粉不含乳糖和谷蛋白，因此，适用于改变了的饮食，包括低胆甾醇饮食。
症状●用于饮食改变了的患者●用于有营养危险的老年患者●用于病后/手术后恢复的患者●用于需要低残留饮食的患者特征●方便、容易混合●饱和脂肪含量低●每1份含有9克总脂肪和低于5毫克的胆甾醇●维生素和矿物质含量高●用于低胆甾醇饮食●不含乳糖，容易消化成分-D玉米糖浆、麦芽糖糊精(玉米)、糖(蔗糖)、玉米油、酪蛋白酸钠和钙、大豆蛋白提取物、人工香精、柠檬酸钾、氯化镁、柠檬酸钠、三碱价磷酸钙、氯化钾、大豆卵磷脂、抗坏血酸、氯化胆碱、硫酸锌、硫酸亚铁、α-生育酚乙酸酯、烟酰胺、泛酸钙、硫酸锰、盐酸氯化硫胺素、硫酸铜、盐酸吡哆醇、核黄素、维生素A棕榈酸酯、叶酸、生物素、钼酸钠、氯化铬、碘化钾、硒酸钠、叶绿醌、维生素D3和氰钴胺素。
蛋白蛋白来源是两种高生物学价值蛋白的混合物酪蛋白和大豆蛋白酪蛋白酸钠和钙 84％大豆蛋白提取物 16％脂肪脂肪来源是玉米油。
玉米油100％碳水化合物ENSURE粉含有玉米糖浆、麦芽糖糊精和蔗糖的混合物。适中甜度的ENSURE粉加上大胡桃、樱桃、草莓、柠檬、和橙的VARI-FLAVORSOFlavor Pacs有助于避免产生对味道的麻木，并有助于患者接受。
香草玉米糖浆35％麦芽糖糊精 35％蔗糖30％H.ENSURE布丁用途ENSURE布丁是一种富含营养的保健品，以非液体形式提供均衡的营养，用于在就餐时使用或在两餐之间使用。它适用于稠度改变了的饮食(例如软的、果泥的、或全液体的饮食)或用于患有吞咽障碍的人。ENSURE布丁不含谷蛋白。
患者症状●适用于食用稠度改变了的饮食(例如软的、果泥的、或全液体的饮食)的患者●用于有吞咽障碍的患者特征●丰富和奶油味的良好味道●必需维生素和矿物质的良好来源●方便需要，无须冷藏●不含谷蛋白每5盎司的营养分布卡路里250，蛋白10.9％、全脂肪34.9％，碳水化合物54.2％
成分香草-D无脂奶、水、糖(蔗糖)、部分氢化的大豆油、改性食用淀粉、硫酸镁、硬脂酰乳酸钠、二碱价磷酸钠、人工香精、抗坏血酸、硫酸锌、硫酸亚铁、α-生育酚乙酸酯、氯化胆碱、烟酰胺、硫酸锰、泛酸钙、FD&amp;C Yellow#5、柠檬酸钾、维生素A棕榈酸酯、盐酸氯化硫胺素、盐酸吡哆醇、核黄素、FD&amp;C Yellow#6、叶酸、生物素、叶绿醌、维生素D3和氰钴胺素。
蛋白蛋白来源是无脂奶。
无脂奶 100％脂肪脂肪来源是氢化大豆油。
氢化大豆油 100％碳水化合物ENSURE布丁含有蔗糖和改性食用淀粉的混合物。适中的甜度和多种风味(香草味、巧克力味、奶油硬糖味、和木薯味)有助于防止对味道的麻木。每1份该产品含有9.2克乳糖。
香草和其它非巧克力味蔗糖 56％乳糖 27％改性食用淀粉 17％巧克力蔗糖 58％乳糖 26％改性食用淀粉 16％I.含纤维的ENSURE用途含纤维的ENSURE是一种含纤维的全营养的液体食品，这种食品被设计用于可以通过提高饮食的纤维和养分而受益的人。含纤维的ENSURE适用于不需要低残留饮食的人。可以口服或通过饲管喂饲，并可用作常规饮食的营养保健品，或以合适的量用作食物的替代品。含纤维的ENSURE不含乳糖和谷蛋白，因此，适用于改变了的饮食，包括低胆甾醇饮食。
患者症状
●用于能通过提高饮食的纤维和养分而受益的患者特征●新开发的配方食品饱和脂肪酸含量低，维生素和矿物质含量较高●每1份含有6克总的脂肪和小于5毫克的胆甾醇●丰富、奶油味的味道●良好的纤维来源●必需维生素和矿物质的优良来源●用于低胆甾醇饮食●不含乳糖和谷蛋白成分香草-D水、麦芽糖糊精(玉米)、糖(蔗糖)、酪蛋白酸钠和钙、燕麦纤维、高油酸红花油、菜籽油、大豆蛋白提取物、玉米油、大豆纤维、三碱价磷酸钙、氯化镁、柠檬酸钾、纤维素凝胶、大豆卵磷脂、二碱价磷酸钾、柠檬酸钠、天然和人工香精、氯化胆碱、磷酸镁、抗坏血酸、纤维素胶、氯化钾、角叉菜聚糖、硫酸亚铁、α-生育酚乙酸酯、硫酸锌、烟酰胺、硫酸锰、泛酸钙、硫酸铜、维生素A棕榈酸酯、盐酸氯化硫胺素、盐酸吡哆醇、核黄素、叶酸、氯化铬、生物素、钼酸钠、碘化钾、硒酸钠、叶绿醌、维生素D3和氰钴胺素。
蛋白蛋白来源是两种高生物学价值蛋白的混合物酪蛋白和大豆蛋白酪蛋白酸钠和钙 80％大豆蛋白提取物 20％脂肪脂肪来源是三种油的混合物高油酸红花油、菜籽油、和玉米油。
高油酸红花油40％菜籽油 40％玉米油 20％含纤维的ENSURE中的脂肪含量符合美国心脏协会(AHA)的规定。含纤维的ENSURE中的6克脂肪相当于22％的总的卡路里，其中2.01％的脂肪来自饱和脂肪酸，而6.7％的脂肪来自多不饱和脂肪酸。这些数字在AHA规定的范围之内来自脂肪的总卡路里≤30％，＜10％的卡路里来自饱和脂肪酸，≤10％的总卡路里来自多不饱和脂肪酸。
碳水化合物含纤维的ENSURE含有麦芽糖糊精和蔗糖的组合物。适中的甜度和和多种风味(香草味、巧克力味、和黄油大胡桃味)，加上大胡桃、樱桃、草莓、柠檬、和橙的VARI-FLAVORSFlavor Pacs有助于避免产生对味道的麻木，并有助于患者接受。
香草及其它非巧克力味麦芽糖糊精 66％蔗糖25％燕麦纤维7％大豆纤维2％巧克力麦芽糖糊精 55％蔗糖36％燕麦纤维7％大豆纤维2％纤维用于含纤维的ENSURE的纤维混合物包括燕麦纤维和大豆多糖。该混合物能为每8-fl-oz的罐装食物提供大约4克的总的饮食纤维。不可溶性纤维和可溶性纤维的比例为95∶5。
上述各种营养保健品及本领域技术人员已知的其它保健品可以用本发明的PUFAs取代和/或补充。
J.OxepaTM营养制品Oxepa是低碳水化合物、卡路里密集的肠道营养制品，是为了患有或处于ARDS危险期的患者的饮食管理而设计的。它具有特殊的成分组合，包括一种专利油混合物，该混合物含有二十碳五烯酸(源于鱼油的EPA)，γ-亚麻酸(源于琉璃苣油的GLA)，和较高的抗氧化剂含量。
卡路里分布●卡路里密度高达1.5Cal/mL(355Cal/8fl oz)，以降低满足能量需求所需要的体积。
●Oxepa中的卡路里分布如表7所示
脂肪●每1份8-fl oz的Oxepa含有22.2克脂肪(93.7g/L)。
●脂肪来源是一种油类混合物31.8％的菜籽油，25％的中等链甘油三酯(MCTs)，20％的琉璃苣油，20％的鱼油和3.2％的大豆卵磷脂。在表8中示出了Oxepa的典型脂肪酸特征。
●如表10所示，Oxepa能提供均衡量的多不饱和脂肪酸、单饱和脂肪酸和饱和脂肪酸。
●中等链甘油三酯(MCTs)--占脂肪混合物的25％--有助于肠道排空，因为它能被肠道吸收而不会被胆酸乳化。
●OxepaTM营养制品中的各种脂肪酸成分可以用本发明的PUFAs取代和/或补充。
脂肪酸大约相当于总脂肪的95％表9
碳水化合物●每1份8-fl oz的服用量的碳水化合物的含量为25.0克(105.5g/L)。
●碳水化合物来源是45％的麦芽糖糊精(一种复合碳水化合物)和55.5％的蔗糖(单糖)，这两种碳水化合物都容易消化和吸收。
●Oxepa的高脂肪和低碳水化合物含量是为了降低二氧化碳的产生而设计的。高二氧化碳含量会使通风机-依赖性患者的不良习惯戒断复杂化。低含量碳水化合物还可被用于出现了由紧张诱导的高血糖的患者。
●Oxepa不含乳糖。
饮食中的碳水化合物、来自蛋白的氨基酸、和脂肪的甘油组分在体内可转化成葡萄糖。通过这一过程，可以满足葡萄糖依赖型组织(如中枢神经系统和红血细胞)对碳水化合物的需要。不过，不含碳水化合物的饮食会导致酮病、组织蛋白的过度分解代谢和失去体液和电解质。如果卡路里摄取适度的话，通过每天摄取50-100克的可消化的碳水化合物可避免上述后果。如果满足了能量需求的话，Oxepa中的碳水化合物含量还足于降低葡糖异生作用。
蛋白●每1份8-fl oz的Oxepa含有14.8克的蛋白(62.5g/L)。
●总的卡路里/氮的比例(150∶1)满足胁迫患者的需要。
●Oxepa能提供足够的蛋白，以促进合成代谢并维持苗条的体形，而不会产生呼吸问题。高蛋白摄取是呼吸不足患者所关心的问题。不过，蛋白对二氧化碳的产生具有很少的影响，高蛋白饮食可提高通风器的动力。
●Oxepa的蛋白来源是86.8％的酪蛋白酸钠和13.2％的酪蛋白酸钙。
●如表11所示，Oxepa中的蛋白系统的氨基酸谱满足或超过国家科学院制订的优质蛋白标准。
●Oxepa不含谷蛋白。
在本说明书中所提到的所有公开文献和专利申请是本发明领域技术人员技术水平的指标。所有公开文献和专利申请在本文中以相同的程度收作参考文献，就如同每一份公开文献或专利申请被专门和单独地指明为收作参考文献一样。
现在已对本发明作了全面说明，对本领域普通技术人员来说，显而易见的是，在不脱离所附权利要求书的实质或范围的前提下可以作出各种改变或改进。
序列表(1)一般信息(i)发明人KNUTZON，DEBORAHMURKERJI，PRADIPHUANG，YUNG-SHENGTHURMOND，JENNIFFERCHAUDHARY，SUNITALEONARD，AMANDA(ii)发明题目在植物中合成长链多不饱和脂肪酸的方法和组合物(iii)序列数52(iv)联系地址(A)联系人LIMBACH &amp; LIMBACH L.L.P.
(B)街道2001 FERRY BUILDING(C)城市SAN FRANCISCO(D)州CA(E)国家USA(F)ZIP94111(v)计算机可读形式(A)介质类型软盘(B)计算机IBM PC兼容(C)操作系统PC-DOS/MS-DOS(D)软件Microsoft Word(vi)本申请数据(A)申请号(B)申请日(C)分类(vii)先前申请数据(A)申请号US08/834,033(B)申请日1997年4月11日(vii)先前申请数据
(A)申请号US08/833,610(B)申请日1997年4月11日(viii)律师/代理人信息(A)姓名MICHAEL R.WARD(B)登记号38,351(C)参考/登记号CGAB-320(ix)电信信息(A)电话(415)433-4150(B)传真(415)433-8716(C)电传N/A(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)长度1617碱基对(B)类型核酸(C)线型单链(D)拓扑学线形(ii)分子类型DNA(基因组)(xi)序列描述SEQ ID NO1CGACACTCCT TCCTTCTTCT CACCCGTCCT AGTCCCCTTC AACCCCCCTC TTTGACAAAG 60ACAACAAACC ATGGCTGCTG CTCCCAGTGT GAGGACGTTT ACTCGGGCCG AGGTTTTGAA120TGCCGAGGCT CTGAATGAGG GCAAGAAGGA TGCCGAGGCA CCCTTCTTGA TGATCATCGA180CAACAAGGTG TACGATGTCC GCGAGTTCGT CCCTGATCAT CCCGGTGGAA GTGTGATTCT240CACGCACGTT GGCAAGGACG GCACTGACGT CTTTGACACT TTTCACCCCG AGGCTGCTTG300GGAGACTCTT GCCAACTTTT ACGTTGGTGA TATTGACGAG AGCGACCGCG ATATCAAGAA360TGATGACTTT GCGGCCGAGG TCCGCAAGCT GCGTACCTTG TTCCAGTCTC TTGGTTACTA420CGATTCTTCC AAGGCATACT ACGCCTTCAA GGTCTCGTTC AACCTCTGCA TCTGGGGTTT480GTCGACGGTC ATTGTGGCCA AGTGGGGCCA GACCTCGACC CTCGCCAACG TGCTCTCGGC540TGCGCTTTTG GGTCTGTTCT GGCAGCAGTG CGGATGGTTG GCTCACGACT TTTTGCATCA600CCAGGTCTTC CAGGACCGTT TCTGGGGTGA TCTTTTCGGC GCCTTCTTGG GAGGTGTCTG660CCAGGGCTTC 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(D)拓扑构型线形(ii)分子类型肽(xi)序列描述SEQ ID NO8Val Thr Leu Tyr Thr Leu Ala Phe Val Ala Ala Asn Ser Leu Gly Val1 5 10 15Leu Tyr Gly Val Leu Ala Cys Pro Ser Val Xaa Pro His Gln Ile Ala20 25 30Ala Gly Leu Leu Gly Leu Leu Trp Ile Gln Ser Ala Tyr Ile Gly Xaa35 40 45Asp Ser Gly His Tyr Val Ile Met Ser Asn Lys Ser Asn Asn Xaa Phe50 55 60Ala Gln Leu Leu Ser Gly Asn Cys Leu Thr Gly Ile Ile Ala Trp Trp65 70 75 80Lys Trp Thr His Asn Ala His His Leu Ala Cys Asn Ser Leu Asp Tyr85 90 95Gly Pro Asn Leu Gln His Ile Pro100(2)SEQ ID NO9的信息(i)序列特征(A)长度252氨基酸(B)类型氨基酸(C)线型不相关(D)拓扑构型线形(ii)分子类型肽(xi)序列描述SEQ ID NO9Gly Val Leu Tyr Gly Val Leu Ala Cys Thr Ser Val Phe Ala His Gln1 5 10 15Ile Ala Ala Ala Leu Leu Gly Leu Leu Trp Ile Gln Ser Ala Tyr Ile20 25 30Gly His Asp Ser Gly His Tyr Val Ile Met Ser Asn Lys Ser Tyr Asn35 40 45Arg Phe Ala Gln Leu Leu Ser Gly Asn Cys Leu Thr Gly Ile Ser Ile50 55 60Ala Trp Trp Lys Trp Thr His Asn Ala His His Leu Ala Cys Asn Ser65 70 75 80Leu Asp Tyr Asp Pro Asp Leu Gln His Ile Pro Val Phe Ala Val Ser85 90 95Thr Lys Phe Phe Ser Ser Leu Thr Ser Arg Phe Tyr Asp Arg Lys Leu100 105 110Thr Phe Gly Pro Val Ala Arg Phe Leu Val Ser Tyr Gln His Phe Thr115 120 125Tyr Tyr Pro Val Asn Cys Phe Gly Arg Ile Asn Leu Phe Ile Gln Thr130 135 140Phe Leu Leu Leu Phe Ser Lys Arg Glu Val Pro Asp Arg Ala Leu Asn145 150 155 160Phe Ala Gly Ile Leu Val Phe Trp Thr Trp Phe Pro Leu Leu Val Ser165 170 175Cys Leu Pro Asn Trp Pro Glu Arg Phe Phe Phe Val Phe Thr Ser Phe180 185 190Thr Val Thr Ala Leu Gln His Ile Gln Phe Thr Leu Asn His Phe Ala195 200 205Ala Asp Val Tyr Val Gly Pro Pro Thr Gly Ser Asp Trp Phe Glu Lys210 215 220Gln Ala Ala Gly Thr Ile Asp Ile Ser Cys Arg Ser Tyr Met Asp Trp225 230 235 240Phe Phe Gly Gly Leu Gln Phe Gln Leu Glu His His245 250(2)SEQ ID NO10的信息(i)序列特征(A)长度125氨基酸(B)类型氨基酸(C)线型不相关(D)拓扑构型线形(ii)分子类型肽(xi)序列描述SEQ ID NO10Gly Xaa Xaa Asn Phe Ala Gly Ile Leu Val Phe Trp Thr Trp Phe Pro1 5 10 15Leu Leu Val Ser Cys Leu Pro Asn Trp Pro Glu Arg Phe Xaa Phe Val20 25 30Phe Thr Gly Phe Thr Val Thr Ala Leu Gln His Ile Gln Phe Thr Leu35 40 45Asn His Phe Ala Ala Asp Val Tyr Val Gly Pro Pro Thr Gly Ser Asp50 55 60Trp Phe Glu Lys Gln Ala Ala Gly Thr Ile Asp Ile Ser Cys Arg Ser65 70 75 80Tyr Met Asp Trp Phe Phe Cys Gly Leu Gln Phe Gln Leu Glu His His85 90 95Leu Phe Pro Arg Leu Pro Arg Cys His Leu Arg Lys Val Ser Pro Val100 105 110Gly Gln Arg Gly Phe Gln Arg Lys Xaa Asn Leu Ser Xaa115 120 125(2)SEQ ID NO11的信息(i)序列特征(A)长度131氨基酸(B)类型氨基酸(C)线型不相关(D)拓扑构型线形(ii)分子类型肽(xi)序列描述SEQ ID NO11Pro Ala Thr Glu Val Gly Gly Leu Ala Trp Met Ile Thr Phe Tyr Val1 5 10 15Arg Phe Phe Leu Thr Tyr Val Pro Leu Leu Gly Leu Lys Ala Phe Leu20 25 30Gly Leu Phe Phe Ile Val Arg Phe Leu Glu Ser Asn Trp Phe Val Trp35 40 45Val Thr Gln Met Asn His Ile Pro Met His Ile Asp His Asp Arg Asn50 55 60Met Asp Trp Val Ser Thr Gln Leu Gln Ala Thr Cys Asn Val His Lys65 70 75 80Ser Ala Phe Asn Asp Trp Phe Ser Gly His Leu Asn Phe Gln Ile Glu85 90 95His His Leu Phe Pro Thr Met Pro Arg His Asn Tyr His Xaa Val Ala100 105 110Pro Leu Val Gln Ser Leu Cys Ala Lys His Gly Ile Glu Tyr Gln Ser115 120 125Lys Pro Leu130(2)SEQ ID NO12的信息(i)序列特征(A)长度87氨基酸(B)类型氨基酸(C)线型不相关(D)拓扑构型线形(ii)分子类型肽(xi)序列描述SEQ ID NO12Cys Ser Pro Lys Ser Ser Pro Thr Arg Asn Met Thr Pro Ser Pro Phe1 5 10 15Ile Asp Trp Leu Trp Gly Gly Leu Asn Tyr Gln Ile Glu His His Leu20 25 30Phe Pro Thr Met Pro Arg Cys Asn Leu Asn Arg Cys Met Lys Tyr Val35 40 45Lys Glu Trp Cys Ala Glu Asn Asn Leu Pro Tyr Leu Val Asp Asp Tyr50 55 60Phe Val Gly Tyr Asn Leu Asn Leu Gln Gln Leu Lys Asn Met Ala Glu65 70 75 80Leu Val Gln Ala Lys Ala Ala85(2)SEQ ID NO13的信息(i)序列特征(A)长度143氨基酸(B)类型氨基酸
(C)线型不相关(D)拓扑构型线形(ii)分子类型肽(xi)序列描述SEQ ID NO13Arg His Glu Ala Ala Arg Gly Gly Thr Arg Leu Ala Tyr Met Leu Val1 5 10 15Cys Met Gln Trp Thr Asp Leu Leu Trp Ala Ala Ser Phe Tyr Ser Arg20 25 30Phe Phe Leu Ser Tyr Ser Pro Phe Tyr Gly Ala Thr Gly Thr Leu Leu35 40 45Leu Phe Val Ala Val Arg Val Leu Glu Ser His Trp Phe Val Trp Ile50 55 60Thr Gln Met Asn His Ile Pro Lys Glu Ile Gly His Glu Lys His Arg65 70 75 80Asp Trp Ala Ser Ser Gln Leu Ala Ala Thr Cys Asn Val Glu Pro Ser85 90 95Leu Phe Ile Asp Trp Phe Ser Gly His Leu Asn Phe Gln Ile Glu His100 105 110His Leu Phe Pro Thr Met Thr Arg His Asn Tyr Arg Xaa Val Ala Pro115 120 125Leu Val Lys Ala Phe Cys Ala Lys His Gly Leu His Tyr Glu Val130 135 140(2)SEQ ID NO14的信息(i)序列特征(A)长度186氨基酸(B)类型氨基酸(C)线型不相关(D)拓扑构型线形(ii)分子类型肽(xi)序列描述SEQ ID NO14Leu His His Thr Tyr Thr Asn Ile Ala Gly Ala Asp Pro Asp Val Ser1 5 10 15Thr Ser Glu Pro Asp Val Arg Arg Ile Lys Pro Asn Gln Lys Trp Phe20 25 30Val Asn His Ile Asn Gln His Met Phe Val Pro Phe Leu Tyr Gly Leu35 40 45Leu Ala Phe Lys Val Arg Ile Gln Asp Ile Asn Ile Leu Tyr Phe Val50 55 60Lys Thr Asn Asp Ala Ile Arg Val Asn Pro Ile Ser Thr Trp His Thr65 70 75 80Val MetPhe Trp Gly Gly Lys Ala Phe Phe Val Trp Tyr Arg Leu Ile85 90 95Val Pro Leu Gln Tyr Leu Pro Leu Gly Lys Val Leu Leu Leu Phe Thr100 105 110Val Ala Asp Met Val Ser Ser Tyr Trp Leu Ala Leu Thr Phe Gln Ala115 120 125Asn Tyr Val Val Glu Glu Val Gln Trp Pro Leu Pro Asp Glu Asn Gly130 135 140Ile Ile Gln Lys Asp Trp Ala Ala Met Gln Val Glu Thr Thr Gln Asp145 150 155 160Tyr Ala His Asp Ser His Leu Trp Thr Ser Ile Thr Gly Ser Leu Asn165 170 175Tyr Gln Xaa Val His His Leu Phe Pro His180 185(2)SEQ ID NO15的信息(i)序列特征(A)长度5氨基酸(B)类型氨基酸(C)线型不相关(D)拓扑构型线形(ii)分子类型肽(xi)序列描述SEQ ID NO15His Xaa Xaa His His1 5(2)SEQ ID NO16的信息(i)序列特征(A)长度446氨基酸(B)类型氨基酸(C)线型不相关(D)拓扑构型线形(ii)分子类型肽(xi)序列描述SEQ ID NO16Met Ala Ala Gln Ile Lys Lys Tyr Ile Thr Ser Asp Glu Leu Lys Asn1 5 10 15His Asp Lys Pro Gly Asp Leu Trp Ile Ser Ile Gln Gly Lys Ala Tyr20 25 30Asp Val Ser Asp Trp Val Lys Asp His Pro Gly Gly Ser Phe Pro Leu35 40 45Lys Ser Leu Ala Gly Gln Glu Val Thr Asp Ala Phe Val Ala Phe His50 55 60Pro Ala Ser Thr Trp Lys Asn Leu Asp Lys Phe Phe Thr Gly Tyr Tyr65 70 75 80Leu Lys Asp Tyr Ser Val Ser Glu Val Ser Lys Val Tyr Arg Lys Leu85 90 95Val Phe Glu Phe Ser Lys Met Gly Leu Tyr Asp Lys Lys Gly His Ile100 105 110Met Phe Ala Thr Leu Cys Phe Ile Ala Met Leu Phe Ala Met Ser Val115 120 125Tyr Gly Val Leu Phe Cys Glu Gly Val Leu Val His Leu Phe Ser Gly130 135 140Cys Leu Met Gly Phe Leu Trp Ile Gln Ser Gly Trp Ile Gly His Asp145 150 155 160Ala Gly His Tyr Met Val Val Ser Asp Ser Arg Leu Asn Lys Phe Met165 170 175Gly Ile Phe Ala Ala Asn Cys Leu Ser Gly Ile Ser Ile Gly Trp Trp180 185 190Lys Trp Asn His Asn Ala His His Ile Ala Cys Asn Ser Leu Glu Tyr195 200 205Asp Pro Asp Leu Gln Tyr Ile Pro Phe Leu Val Val Ser Ser Lys Phe210 215 220Phe Gly Ser Leu Thr Ser His Phe Tyr Glu Lys Arg Leu Thr Phe Asp225 230 235 240Ser Leu Ser Arg Phe Phe Val Ser Tyr Gln His Trp Thr Phe Tyr Pro245 250 255Ile Met Cys Ala Ala Arg Leu Asn Met Tyr Val Gln Ser Leu Ile Met260 265 270Leu Leu Thr Lys Arg Asn Val Ser Tyr Arg Ala Gln Glu Leu Leu Gly275 280 285Cys Leu Val Phe Ser Ile Trp Tyr Pro Leu Leu Val Ser Cys Leu Pro290 295 300Asn Trp Gly Glu Arg Ile Met Phe Val Ile Ala Ser Leu Ser Val Thr305 310 315 320Gly Met Gln Gln Val Gln Phe Ser Leu Asn His Phe Ser Ser Ser Val325 330 335Tyr Val Gly Lys Pro Lys Gly Asn Asn Trp Phe Glu Lys Gln Thr Asp340 345 350Gly Thr Leu Asp Ile Ser Cys Pro Pro Trp Met Asp Trp Phe His Gly355 360 365Gly Leu Gln Phe Gln Ile Glu His His Leu Phe Pro Lys Met Pro Arg370 375 380Cys Asn Leu Arg Lys Ile Ser Pro Tyr Val Ile Glu Leu Cys Lys Lys385 390 395 400His Asn Leu Pro Tyr Asn Tyr Ala Ser Phe Ser Lys Ala Asn Glu Met405 410 415Thr Leu Arg Thr Leu Arg Asn Thr Ala Leu Gln Ala Arg Asp Ile Thr420 425 430Lys Pro Leu Pro Lys Asn Leu Val Trp Glu Ala Leu His Thr435 440 445(2)SEQ ID NO17的信息(i)序列特征(A)长度359氨基酸(B)类型氨基酸(C)线型不相关(D)拓扑构型线形
(ii)分子类型肽(xi)序列描述SEQ ID NO17Met Leu Thr Ala Glu Arg Ile Lys Phe Thr Gln Lys Arg Gly Phe Arg1 5 10 15Arg Val Leu Asn Gln Arg Val Asp Ala Tyr Phe Ala Glu His Gly Leu20 25 30Thr Gln Arg Asp Asn Pro Ser Met Tyr Leu Lys Thr Leu Ile Ile Val35 40 45Leu Trp Leu Phe Ser Ala Trp Ala Phe Val Leu Phe Ala Pro Val Ile50 55 60Phe Pro Val Arg Leu Leu Gly Cys Met Val Leu Ala Ile Ala Leu Ala65 70 75 80Ala Phe Ser Phe Asn Val Gly His Asp Ala Asn His Asn Ala Tyr Ser85 90 95Ser Asn Pro His Ile Asn Arg Val Leu Gly Met Thr Tyr Asp Phe Val100 105 110Gly Leu Ser Ser Phe Leu Trp Arg Tyr Arg His Asn Tyr Leu His His115 120 125Thr Tyr Thr Asn Ile Leu Gly His Asp Val Glu Ile His Gly Asp Gly130 135 140Ala Val Arg Met Ser Pro Glu Gln Glu His Val Gly Ile Tyr Arg Phe145 150 155 160Gln Gln Phe Tyr Ile Trp Gly Leu Tyr Leu Phe Ile Pro Phe Tyr Trp165 170 175Phe Leu Tyr Asp Val Tyr Leu Val Leu Asn Lys Gly Lys Tyr His Asp180 185 190His Lys Ile Pro Pro Phe Gln Pro Leu Glu Leu Ala Ser Leu Leu Gly195 200 205Ile Lys Leu Leu Trp Leu Gly Tyr Val Phe Gly Leu Pro Leu Ala Leu210 215 220Gly Phe Ser Ile Pro Glu Val Leu Ile Gly Ala Ser Val Thr Tyr Met225 230 235 240Thr Tyr Gly Ile Val Val Cys Thr Ile Phe Met Leu Ala His Val Leu245 250 255Glu Ser Thr Glu Phe Leu Thr Pro Asp Gly Glu Ser Gly Ala Ile Asp260 265 270Asp Glu Trp Ala Ile Cys Gln Ile Arg Thr Thr Ala Asn Phe Ala Thr275 280 285Asn Asn Pro Phe Trp Asn Trp Phe Cys Gly Gly Leu Asn His Gln Val290 295 300Thr His His Leu Phe Pro Asn Ile Cys His Ile His Tyr Pro Gln Leu305 310 315 320Glu Asn Ile Ile Lys Asp Val Cys Gln Glu Phe Gly Val Glu Tyr Lys325 330 335Val Tyr Pro Thr Phe Lys Ala Ala Ile Ala Ser Asn Tyr Arg Trp Leu340 345 350Glu Ala Met Gly Lys Ala Ser355(2)SEQ ID NO18的信息(i)序列特征(A)长度365氨基酸(B)类型氨基酸(C)线型不相关(D)拓扑构型线形(ii)分子类型肽(xi)序列描述SEQ ID NO18Met Thr Ser Thr Thr Ser Lys Val Thr Phe Gly Lys Ser Ile Gly Phe1 5 10 15Arg Lys Glu Leu Asn Arg Arg Val Asn Ala Tyr Leu Glu Ala Glu Asn20 25 30Ile Ser Pro Arg Asp Asn Pro Pro Met Tyr Leu Lys Thr Ala Ile Ile35 40 45Leu Ala Trp Val Val Ser Ala Trp Thr Phe Val Val Phe Gly Pro Asp50 55 60Val Leu Trp Met Lys Leu Leu Gly Cys Ile Val Leu Gly Phe Gly Val65 70 75 80Ser Ala Val Gly Phe Asn Ile Ser His Asp Gly Asn His Gly Gly Tyr85 90 95Ser Lys Tyr Gln Trp Val Asn Tyr Leu Ser Gly Leu Thr His Asp Ala100 105 110Ile Gly Val Ser Ser Tyr Leu Trp Lys Phe Arg His Asn Val Leu His115 120 125His Thr Tyr Thr Asn Ile Leu Gly His Asp Val Glu Ile His Gly Asp130 135 140Glu Leu Val Arg Met Ser Pro Ser Met Glu Tyr Arg Trp Tyr His Arg145150 155 160Tyr Gln His Trp Phe Ile Trp Phe Val Tyr Pro Phe Ile Pro Tyr Tyr165 170 175Trp Ser Ile Ala Asp Val Gln Thr Met Leu Phe Lys Arg Gln Tyr His180 185 190Asp His Glu Ile Pro Ser Pro Thr Trp Val Asp Ile Ala Thr Leu Leu195 200 205Ala Phe Lys Ala Phe Gly Val Ala Val Phe Leu Ile Ile Pro Ile Ala210 215 220Val Gly Tyr Ser Pro Leu Glu Ala Val Ile Gly Ala Ser Ile Val Tyr225 230 235 240Met Thr His Gly Leu Val Ala Cys Val Val Phe Met Leu Ala His Val245 250 255Ile Glu Pro Ala Glu Phe Leu Asp Pro Asp Asn Leu His Ile Asp Asp260 265 270Glu Trp Ala Ile Ala Gln Val Lys Thr Thr Val Asp Phe Ala Pro Asn275 280 285Asn Thr Ile Ile Asn Trp Tyr Val Gly Gly Leu Asn Tyr Gln Thr Val290 295 300His His Leu Phe Pro His Ile Cys His Ile His Tyr Pro Lys Ile Ala305 310 315 320Pro Ile Leu Ala Glu Val Cys Glu Glu Phe Gly Val Asn Tyr Ala Val325 330 335His Gln Thr Phe Phe Gly Ala Leu Ala Ala Asn Tyr Ser Trp Leu Lys340 345 350Lys Met Ser Ile Asn Pro Glu Thr Lys Ala Ile Glu Gln355 360 365(2)SEQ ID NO19的信息(i)序列特征(A)长度35碱基对(B)类型核酸(C)线型单链
(D)拓扑学线形(ii)分子类型其他核酸(xi)序列描述SEQ ID NO19CCAAGCTTCT GCAGGAGCTC TTTTTTTTTT TTTTT 35(2)SEQ ID NO20信息(i)序列特征(A)长度32碱基对(B)类型核酸(C)线型单链(D)拓扑学线形(ii)分子类型其他核酸(A)描述/disc＝“合成的寡核苷酸”(ix)特征(A)名称/关键词misc_feature(B)位置21(D)其他信息/数目＝1/注释＝“N＝肌苷或胞苷”(ix)特征(A)名称/关键词misc_feature(B)位置27(D)其他信息/数目＝2/注释＝“N＝肌苷或胞苷”(xi)序列描述SEQ ID NO20CUACUACUAC UACAYCAYAC NTAYACNAAY AT 32(2)SEQ ID NO21信息(i)序列特征(A)长度27碱基对(B)类型核酸(C)线型单链(D)拓扑学线形
(ii)分子类型其他核酸(A)描述/disc＝“合成的寡核苷酸”(ix)特征(A)名称/关键词misc_feature(B)位置13(D)其他信息/数目＝1/注释＝“N＝肌苷或胞苷”(ix)特征(A)名称/关键词misc_feature(B)位置19(D)其他信息/数目＝2/注释＝“N＝肌苷或胞苷”(xi)序列描述SEQ ID NO21CAUCAUCAUC AUNGGRAANA RRTGRTG 27(2)SEQ ID NO22的信息(i)序列特征(A)长度33碱基对(B)类型核酸(C)线型单链(D)拓扑学线形(ii)分子类型其他核酸(xi)序列描述SEQ ID NO22CUACUACUAC UAGGAGTCCT CTACGGTGTT TTG 33(2)SEQ ID NO23的信息(i)序列特征(A)长度33碱基对(B)类型核酸(C)线型单链(D)拓扑学线形(ii)分子类型其他核酸
(xi)序列描述SEQ ID NO23CAUCAUCAUC AUATGATGCT CAAGCTGAAA CTG 33(2)SEQ ID NO24的信息(i)序列特征(A)长度5氨基酸(B)类型氨基酸(C)线型不相关(D)拓扑构型线形(ii)分子类型肽(xi)序列描述SEQ ID NO24Gln Xaa Xaa His His1 5(2)SEQ ID NO25的信息(i)序列特征(A)长度39碱基对(B)类型核酸(C)线型单链(D)拓扑学线形(ii)分子类型其他核酸(xi)序列描述SEQ ID NO25CUACUACUAC UACTCGAGCA AGATGGGAAC GGACCAAGG 39(2)SEQ ID NO26的信息(i)序列特征(A)长度39碱基对(B)类型核酸(C)线型单链
(D)拓扑学线形(ii)分子类型其他核酸(xi)序列描述SEQ ID NO26CAUCAUCAUC AUCTCGAGCT ACTCTTCCTT GGGACGGAG 39(2)SEQ ID NO27的信息(i)序列特征(A)长度47碱基对(B)类型核酸(C)线型单链(D)拓扑学线形(ii)分子类型其他核酸(xi)序列描述SEQ ID NO27CUACUACUAC UATCTAGACT CGAGACCATG GCTGCTGCTC CAGTGTG 47(2)SEQ ID NO28的信息(i)序列特征(A)长度40碱基对(B)类型核酸(C)线型单链(D)拓扑学线形(ii)分子类型其他核酸(xi)序列描述SEQ ID NO28CAUCAUCAUC AUAGGCCTCG AGTTACTGCG CCTTACCCAT 40(2)SEQ ID NO29的信息(i)序列特征(A)长度37碱基对(B)类型核酸
(C)线型单链(D)拓扑学线形(ii)分子类型其他核酸(xi)序列描述SEQ ID NO29CUACUACUA CUAGGATCCA TGGCACCTCC CAACACT37(2)SEQ ID NO30的信息(i)序列特征(A)长度42碱基对(B)类型核酸(C)线型单链(D)拓扑学线形(ii)分子类型其他核酸(xi)序列描述SEQ ID NO30CAUCAUCAU CAUGGTACCT CGAGTTACTT CTTGAAAAAG AC42(2)SEQ ID NO31的信息(i)序列特征(A)长度1219碱基对(B)类型核酸(C)线型单链(D)拓扑学线形(ii)分子类型其他核酸(编辑的重叠群2692004)(xi)序列描述SEQ ID NO31GCACGCCGAC CGGCGCCGGG AGATCCTGGC AAAGTATCCA GAGATAAAGT CCTTGATGAA 60ACCTGATCCC AATTTGATAT GGATTATAAT TATGATGGTT CTCACCCAGT TGGGTGCATT120TTACATAGTA AAAGACTTGG ACTGGAAATG GGTCATATTT GGGGCCTATG CGTTTGGCAG180TTGCATTAAC CACTCAATGA CTCTGGCTAT TCATGAGATT GCCCACAATG CTGCCTTTGG240CAACTGCAAA GCAATGTGGA ATCGCTGGTT TGGAATGTTT GCTAATCTTC CTATTGGGAT300TCCATATTCA ATTTCCTTTA AGAGGTATCA CATGGATCAT CATCGGTACC TTGGAGCTGA360TGGCGTCGAT GTAGATATTC CTACCGATTT TGAGGGCTGG TTCTTCTGTA CCGCTTTCAG420AAAGTTTATA TGGGTTATTC TTCAGCCTCT CTTTTATGCC TTTCGACCTC TGTTCATCAA480CCCCAAACCA ATTACGTATC TGGAAGTTAT CAATACCGTG GCACAGGTCA CTTTTGACAT540TTTAATTTAT TACTTTTTGG GAATTAAATC CTTAGTCTAC ATGTTGGCAG CATCTTTACT600TGGCCTGGGT TTGCACCCAA TTTCTGGACA TTTTATAGCT GAGCATTACA TGTTCTTAAA660GGGTCATGAA ACTTACTCAT ATTATGGGCC TCTGAATTTA CTTACCTTCA ATGTGGGTTA720TCATAATGAA CATCATGATT TCCCCAACAT TCCTGGAAAA AGTCTTCCAC TGGTGAGGAA780AATAGCAGCT GAATACTATG ACAACCTCCC TCACTACAAT TCCTGGATAA AAGTACTGTA840TGATTTTGTG ATGGATGATA CAATAAGTCC CTACTCAAGA ATGAAGAGGC ACCAAAAAGG900AGAGATGGTG CTGGAGTAAA TATCATTAGT GCCAAAGGGA TTCTTCTCCA AAACTTTAGA960TGATAAAATG GAATTTTTGC ATTATTAAAC TTGAGACCAG TGATGCTCAG AAGCTCCCCT 1020GGCACAATTT CAGAGTAAGA GCTCGGTGAT ACCAAGAAGT GAATCTGGCT TTTAAACAGT 1080CAGCCTGACT CTGTACTGCT CAGTTTCACT CACAGGAAAC TTGTGACTTG TGTATTATCG 1140TCATTGAGGA TGTTTCACTC ATGTCTGTCA TTTTATAAGC ATATCATTTA AAAAGCTTCT 1200AAAAAGCTAT TTCGCCAGG1219(2)SEQ ID NO32的信息(i)序列特征(A)长度655碱基对(B)类型核酸(C)线型单链(D)拓扑学线形(ii)分子类型其他核酸(编辑的重叠群2153526)(xi)序列描述SEQ ID NO32TTACCTTCTA CGTCCGCTTC TTCCTCACTT ATGTGCCACT ATTGGGGCTG AAAGCTTCCT 60GGGCCTTTTC TTCATAGTCA GGTTCCTGGA AAGCAACTGG TTTGTGTGGG TGACACAGAT120GAACCATATT CCCATGCACA TTGATCATGA CCGGAACATG GACTGGGTTT CCACCCAGCT180CCAGGCCACA TGCAATGTCC ACAAGTCTGC CTTCAATGAC TGGTTCAGTG GACACCTCAA240CTTCCAGATT GAGCACCATC TTTTTCCCAC GATGCCTCGA CACAATTACC ACAAAGTGGC300TCCCCTGGTG CAGTCCTTGT GTGCCAAGCA TGGCATAGAG TACCAGTCCA AGCCCCTGCT360GTCAGCCTTC GCCGACATCA TCCACTCACT AAAGGAGTCA GGGCAGCTCT GGCTAGATGC420CTATCTTCAC CAATAACAAC AGCCACCCTG CCCAGTCTGG AAGAAGAGGA GGAAGACTCT480GGAGCCAAGG CAGAGGGGAG CTTGAGGGAC AATGCCACTA TAGTTTAATA CTCAGAGGGG540GTTGGGTTTG GGGACATAAA GCCTCTGACT CAAACTCCTC CCTTTTATCT TCTAGCCACA600GTTCTAAGAC CCAAAGTGGG GGGTGGACAC AGAAGTCCCT AGGAGGGAAG GAGCT 655(2)SEQ ID NO33的信息(i)序列特征(A)长度304碱基对(B)类型核酸(C)线型单链(D)拓扑学线形(ii)分子类型其他核酸(编辑的重叠群3506132)(xi)序列描述SEQ ID NO33GTCTTTTACT TTGGCAATGG CTGGATTCCT ACCCTCATCA CGGCCTTTGT CCTTGCTACC 60TCTCAGGCCC AAGCTGGATG GCTGCAACAT GATTATGGCC ACCTGTCTGT CTACAGAAAA120CCCAAGTGGA ACCACCTTGT CCACAAATTC GTCATTGGCC ACTTAAAGGG TGCCTCTGCC180AACTGGTGGA ATCATCGCCA CTTCCAGCAC CACGCCAAGC CTAACATCTT CCACAAGGAT240CCCGATGTGA ACATGCTGCA CGTGTTTGTT CTGGGCGAAT GGCAGCCCAT CGAGTACGGC300AAGA 304(2)SEQ ID NO34的信息(i)序列特征(A)长度918碱基对
(B)类型核酸(C)线型单链(D)拓扑学线形(ii)分子类型其他核酸(编辑的重叠群3854933)(xi)序列描述SEQ ID NO34CAGGGACCTA CCCCGCGCTA CTTCACCTGG GACGAGGTGG CCCAGCGCTC AGGGTGCGAG 60GAGCGGTGGC TAGTGATCGA CCGTAAGGTG TACAACATCA GCGAGTTCAC CCGCCGGCAT120CCAGGGGGCT CCCGGGTCAT CAGCCACTAC GCCGGGCAGG ATGCCACGGA TCCCTTTGTG180GCCTTCCACA TCAACAAGGG CCTTGTGAAG AAGTATATGA ACTCTCTCCT GATTGGAGAA240CTGTCTCCAG AGCAGCCCAG CTTTGAGCCC ACCAAGAATA AAGAGCTGAC AGATGAGTTC300CGGGAGCTGC GGGCCACAGT GGAGCGGATG GGGCTCATGA AGGCCAACCA TGTCTTCTTC360CTGCTGTACC TGCTGCACAT CTTGCTGCTG GATGGTGCAG CCTGGCTCAC CCTTTGGGTC420TTTGGGACGT CCTTTTTGCC CTTCCTCCTC TGTGCGGTGC TGCTCAGTGC AGTTCAGGCC480CAGGCTGGCT GGCTGCAGCA TGACTTTGGG CACCTGTCGG TCTTCAGCAC CTCAAAGTGG540AACCATCTGC TACATCATTT TGTGATTGGC CACCTGAAGG GGGCCCCCGC CAGTTGGTGG600AACCACATGC ACTTCCAGCA CCATGCCAAG CCCAACTGCT TCCGCAAAGA CCCAGACATC660AACATGCATC CCTTCTTCTT TGCCTTGGGG AAGATCCTCT CTGTGGAGCT TGGGAAACAG720AAGAAAAAAT ATATGCCGTA CAACCACCAG CACARATACT TCTTCCTAAT TGGGCCCCCA780GCCTTGCTGC CTCTCTACTT CCAGTGGTAT ATTTTCTATT TTGTTATCCA GCGAAAGAAG840TGGGTGGACT TGGCCTGGAT CAGCAAACAG GAATACGATG AAGCCGGGCT TCCATTGTCC900ACCGCAAATG CTTCTAAA 918(2)SEQ ID NO35的信息(i)序列特征(A)长度1686碱基对(B)类型核酸(C)线型单链(D)拓扑学线形(ii)分子类型其他核酸(编辑的重叠群2511785)(xi)序列描述SEQ ID NO35GCCACTTAAA GGGTGCCTCT GCCAACTGGT GGAATCATCG CCACTTCCAG CACCACGCCA 60AGCCTAACAT CTTCCACAAG GATCCCGATG TGAACATGCT GCACGTGTTT GTTCTGGGCG120AATGGCAGCC CATCGAGTAC GGCAAGAAGA AGCTGAAATA CCTGCCCTAC AATCACCAGC180ACGAATACTT CTTCCTGATT GGGCCGCCGC TGCTCATCCC CATGTATTTC CAGTACCAGA240TCATCATGAC CATGATCGTC CATAAGAACT GGGTGGACCT GGCCTGGGCC GTCAGCTACT300ACATCCGGTT CTTCATCACC TACATCCCTT TCTACGGCAT CCTGGGAGCC CTCCTTTTCC360TCAACTTCAT CAGGTTCCTG GAGAGCCACT GGTTTGTGTG GGTCACACAG ATGAATCACA420TCGTCATGGA GATTGACCAG GAGGCCTACC GTGACTGGTT CAGTAGCCAG CTGACAGCCA480CCTGCAACGT GGAGCAGTCC TTCTTCAACG ACTGGTTCAG TGGACACCTT AACTTCCAGA540TTGAGCACCA CCTCTTCCCC ACCATGCCCC GGCACAACTT ACACAAGATC GCCCCGCTGG600TGAAGTCTCT ATGTGCCAAG CATGGCATTG AATACCAGGA GAAGCCGCTA CTGAGGGCCC660TGCTGGACAT CATCAGGTCC CTGAAGAAGT CTGGGAAGCT GTGGCTGGAC GCCTACCTTC720ACAAATGAAG CCACAGCCCC CGGGACACCG TGGGGAAGGG GTGCAGGTGG GGTGATGGCC780AGAGGAATGA TGGGCTTTTG TTCTGAGGGG TGTCCGAGAG GCTGGTGTAT GCACTGCTCA840CGGACCCCAT GTTGGATCTT TCTCCCTTTC TCCTCTCCTT TTTCTCTTCA CATCTCCCCC900ATAGCACCCT GCCCTCATGG GACCTGCCCT CCCTCAGCCG TCAGCCATCA GCCATGGCCC960TCCCAGTGCC TCCTAGCCCC TTCTTCCAAG GAGCAGAGAG GTGGCCACCG GGGGTGGCTC 1020TGTCCTACCT CCACTCTCTG CCCCTAAAGA TGGGAGGAGA CCAGCGGTCC ATGGGTCTGG 1080CCTGTGAGTC TCCCCTTGCA GCCTGGTCAC TAGGCATCAC CCCCGCTTTG GTTCTTCAGA 1140TGCTCTTGGG GTTCATAGGG GCAGGTCCTA GTCGGGCAGG GCCCCTGACC CTCCCGGCCT 1200GGCTTCACTC TCCCTGACGG CTGCCATTGG TCCACCCTTT CATAGAGAGG CCTGCTTTGT 1260TACAAAGCTC GGGTCTCCCT CCTGCAGCTC GGTTAAGTAC CCGAGGCCTC TCTTAAGATG 1320TCCAGGGCCC CAGGCCCGCG GGCACAGCCA GCCCAAACCT TGGGCCCTGG AAGAGTCCTC 1380CACCCCATCA CTAGAGTGCT CTGACCCTGG GCTTTCACGG GCCCCATTCC ACCGCCTCCC 1440CAACTTGAGC CTGTGACCTT GGGACCAAAG GGGGAGTCCC TCGTCTCTTG TGACTCAGCA 1500GAGGCAGTGG CCACGTTCAG GGAGGGGCCG GCTGGCCTGG AGGCTCAGCC 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CTTCCTCCTC TGTGCGGTGC TGCTCAGTGC AGTTCAGCAG480GCCCAAGCTG GATGGCTGCA ACATGATTAT GGCCACCTGT CTGTCTACAG AAAACCCAAG540TGGAACCACC TTGTCCACAA ATTCGTCATT GGCCACTTAA AGGGTGCCTC TGCCAACTGG600TGGAATCATC GCCACTTCCA GCACCACGCC AAGCCTAACA TCTTCCACAA GGATCCCGAT660GTGAACATGC TGCACGTGTT TGTTCTGGGC GAATGGCAGC CCATCGAGTA CGGCAAGAAG720AAGCTGAAAT ACCTGCCCTA CAATCACCAG CACGAATACT TCTTCCTGAT TGGGCCGCCG780CTGCTCATCC CCATGTATTT CCAGTACCAG ATCATCATGA CCATGATCGT CCATAAGAAC840TGGGTGGACC TGGCCTGGGC CGTCAGCTAC TACATCCGGT TCTTCATCAC CTACATCCCT900TTCTACGGCA TCCTGGGAGC CCTCCTTTTC CTCAACTTCA TCAGGTTCCT GGAGAGCCAC960TGGTTTGTGT GGGTCACACA GATGAATCAC ATCGTCATGG AGATTGACCA GGAGGCCTAC 1020CGTGACTGGT TCAGTAGCCA GCTGACAGCC ACCTGCAACG TGGAGCAGTC CTTCTTCAAC 1080GACTGGTTCA GTGGACACCT TAACTTCCAG ATTGAGCACC ACCTCTTCCC CACCATGCCC 1140CGGCACAACT TACACAAGAT CGCCCCGCTG GTGAAGTCTC TATGTGCCAA GCATGGCATT 1200GAATACCAGG AGAAGCCGCT ACTGAGGGCC CTGCTGGACA TCATCAGGTC CCTGAAGAAG 1260TCTGGGAAGC TGTGGCTGGA CGCCTACCTT CACAAATGAA GCCACAGCCC 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Val Ala Gln Val Thr Phe Asp Ile170 175 180Leu Ile Tyr Tyr Phe Leu Gly Ile Lys Ser Leu Val Tyr Met Leu185 190 195Ala Ala Ser Leu Leu Gly Leu Gly Leu His Pro Ile Ser Gly His200 205 210Phe Ile Ala Glu His Tyr Met Phe Leu Lys Gly His Glu Thr Tyr215 220 225Ser Tyr Tyr Gly Pro Leu Asn Leu Leu Thr Phe Asn Val Gly Tyr230 235 240His Asn Glu His His Asp Phe Pro Asn Ile Pro Gly Lys Ser Leu245 250 255Pro Leu Val Arg Lys Ile Ala Ala Glu Tyr Tyr Asp Asn Leu Pro260 265 270His Tyr Asn Ser Trp Ile Lys Val Leu Tyr Asp Phe Val Met Asp275 280 285Asp Thr Ile Ser Pro Tyr Ser Arg Met Lys Arg His Gln Lys Gly290 295 300Glu Met Val Leu Glu *** Ile Ser Leu Val Pro Lys Gly Phe Phe305 310 315Ser Lys Thr Leu Asp Asp Lys Met Glu Phe Leu His Tyr *** Thr320 325 330*** Asp Gln *** Cys Ser Glu Ala Pro Leu Ala Gln Phe Gln Ser335 340 345Lys Ser Ser Val Ile Pro Arg Ser Glu Ser Gly Phe *** Thr Val350 355 360Ser Leu Thr Leu Tyr Cys Ser Val Ser Leu Thr Gly Asn Leu ***365 370 375Leu Val Tyr Tyr Arg His *** Gly Cys Phe Thr His 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His Tyr Ala Gly Gln Asp Ala Thr Asp Pro Phe Val50 55 60Ala Phe His Ile Asn Lys Gly Leu Val Lys Lys Tyr Met Asn Ser65 70 75Leu Leu Ile Gly Glu Leu Ser Pro Glu Gln Pro Ser Phe Glu Pro80 85 90Thr Lys Asn Lys Glu Leu Thr Asp Glu Phe Arg Glu Leu Arg Ala95 100 105Thr Val Glu Arg Met Gly Leu Met Lys Ala Asn His Val Phe Phe110 115 120Leu Leu Tyr Leu Leu His Ile Leu Leu Leu Asp Gly Ala Ala Trp125 130 135Leu Thr Leu Trp Val Phe Gly Thr Ser Phe Leu Pro Phe Leu Leu140 145 150Cys Ala Val Leu Leu Ser Ala Val Gln Ala Gln Ala Gly Trp Leu155 160 165Gln His Asp Phe Gly His Leu Ser Val Phe Ser Thr Ser Lys Trp170 175 180Asn His Leu Leu His His Phe Val Ile Gly His Leu Lys Gly Ala185 190 195Pro Ala Ser Trp Trp Asn His Met His Phe Gln His His Ala Lys200 205 210Pro Asn Cys Phe Arg Lys Asp Pro Asp Ile Asn Met His Pro Phe215 220 225Phe Phe Ala Leu Gly Lys Ile Leu Ser Val Glu Leu Gly Lys Gln230 235 240Lys Lys Lys Tyr Met Pro Tyr Asn His Gln His Xxx Tyr Phe Phe245 250 255Leu Ile Gly Pro Pro Ala Leu Leu Pro Leu Tyr Phe Gln Trp Tyr260 265 270Ile Phe Tyr Phe Val Ile Gln Arg Lys Lys Trp Val Asp Leu Ala275 280 285Trp Ile Ser Lys Gln Glu Tyr Asp Glu Ala Gly Leu Pro Leu Ser290 295 300Thr Ala Asn Ala Ser Lys305(2)SEQ ID NO42的信息(i)序列特征(A)长度566氨基酸(B)类型氨基酸(C)线型单链(D)拓扑构型线形(ii)分子类型氨基酸(重叠群2511785的翻译)
(xi)序列描述SEQ ID NO42His Leu Lys Gly Ala Ser Ala Asn Trp Trp Asn His Arg His Phe1 5 10 15Gln His His Ala Lys Pro Asn Ile Phe His Lys Asp Pro Asp Val20 25 30Asn Met Leu His Val Phe Val Leu Gly Glu Trp Gln Pro Ile Glu35 40 45Tyr Gly Lys Lys Lys Leu Lys Tyr Leu Pro Tyr Asn His Gln His50 55 60Glu Tyr Phe Phe Leu Ile Gly Pro Pro Leu Leu Ile Pro Met Tyr65 70 75Phe Gln Tyr Gln Ile Ile Met Thr Met Ile Val His Lys Asn Trp80 85 90Val Asp Leu Ala Trp Ala Val Ser Tyr Tyr Ile Arg Phe Phe Ile95 100 105Thr Tyr Ile Pro Phe Tyr Gly Ile Leu Gly Ala Leu Leu Phe Leu110 115 120Asn Phe Ile Arg Phe Leu Glu Ser His Trp Phe Val Trp Val Thr125 130 135Gln Met Asn His Ile Val Met Glu Ile Asp Gln Glu Ala Tyr Arg140 145 150Asp Trp Phe Ser Ser Gln Leu Thr Ala Thr Cys Asn Val Glu Gln155 160 165Ser Phe Phe Asn Asp Trp Phe Ser Gly His Leu Asn Phe Gln Ile170 175 180Glu His His Leu Phe Pro Thr Met Pro Arg His Asn Leu His Lys185 190 195Ile Ala Pro Leu Val Lys Ser Leu Cys Ala Lys His Gly Ile Glu200 205 210Tyr Gln Glu Lys Pro Leu Leu Arg Ala Leu Leu Asp Ile Ile Arg215 220 225Ser Leu Lys Lys Ser Gly Lys Leu Trp Leu Asp Ala Tyr Leu His230 235 240Lys *** Ser His Ser Pro Arg Asp Thr Val Gly Lys Gly Cys Arg245 250 255Trp Gly Asp Gly Gln Arg Asn Asp Gly Leu Leu Phe *** Gly Val260 265 270Ser Glu Arg Leu Val Tyr Ala Leu Leu Thr Asp Pro Met Leu Asp275 280 285Leu Ser Pro Phe Leu Leu Ser Phe Phe Ser Ser His Leu Pro His290 295 300Ser Thr Leu Pro Ser Trp Asp Leu Pro Ser Leu Ser Arg Gln Pro305 310 315Ser Ala Met Ala Leu Pro Val Pro Pro Ser Pro Phe Phe Gln Gly320 325 330Ala Glu Arg Trp Pro Pro Gly Val Ala Leu Ser Tyr Leu His Ser335 340 345Leu Pro Leu Lys Met Gly Gly Asp Gln Arg Ser Met Gly Leu Ala350 355 360Cys Glu Ser Pro Leu Ala Ala Trp Ser Leu Gly Ile Thr Pro Ala365 370 375Leu Val Leu Gln Met Leu Leu Gly Phe Ile Gly Ala Gly Pro Ser380 385 390Arg Ala Gly Pro Leu Thr Leu Pro Ala Trp Leu His Ser Pro ***400 405 410Arg Leu Pro Leu Val His Pro Phe Ile Glu Arg Pro Ala Leu Leu415 420 425Gln Ser Ser Gly Leu Pro Pro Ala Ala Arg Leu Ser Thr Arg Gly430 435 440Leu Ser *** Asp Val Gln Gly Pro Arg Pro Ala Gly Thr Ala Ser445 450 455Pro Asn Leu Gly Pro Trp Lys Ser Pro Pro Pro His His *** Ser460 465 470Ala Leu Thr Leu Gly Phe His Gly Pro His Ser Thr Ala Ser Pro475 480 485Thr *** Ala Cys Asp Leu Gly Thr Lys Gly Gly Val Pro Arg Leu490 495 500Leu *** Leu Ser Arg Gly Ser Gly His Val Gln Gly Gly Ala Gly505 510 515Trp Pro Gly Gly Ser Ala His Pro Pro Ala Phe Pro Gln Gly Val520 525 530Leu Arg Ser Lys Ile Leu Glu Gln Ser Asp Pro Ser Pro Lys Ala535 540 545Leu Leu Ser Ala Gly Gln Cys Gln Pro Ile Pro Gly His Leu Ala550 555 560Pro Gly Asp Val Gly Pro Xxx565(2)SEQ ID NO43的信息(i)序列特征(A)长度619氨基酸(B)类型氨基酸(C)线型单链(D)拓扑构型线形(ii)分子类型氨基酸(重叠群2535的翻译)(xi)序列描述SEQ ID NO43Val Phe Tyr Phe Gly Asn Gly Trp Ile Pro Thr Leu Ile Thr Ala1 5 10 15Phe Val Leu Ala Thr Ser Gln Ala Gln Ala Gly Trp Leu Gln His20 25 30Asp Tyr Gly His Leu Ser Val Tyr Arg Lys Pro Lys Trp Asn His35 40 45Leu Val His Lys Phe Val Ile Gly His Leu Lys Gly Ala Ser Ala50 55 60Asn Trp Trp Asn His Arg His Phe Gln His His Ala Lys Pro Asn65 70 75Ile Phe His Lys Asp Pro Asp Val Asn Met Leu His Val Phe Val80 85 90Leu Gly Glu Trp Gln Pro Ile Glu Tyr Gly Lys Lys Lys Leu Lys95 100 105Tyr Leu Pro Tyr Asn His Gln His Glu Tyr Phe Phe Leu Ile Gly110 115 120Pro Pro Leu Leu Ile Pro Met Tyr Phe Gln Tyr Gln Ile Ile Met125 130 135Thr Met Ile Val His Lys Asn Trp Val Asp Leu Ala Trp Ala Val140 145 150Ser Tyr Tyr Ile Arg Phe Phe Ile Thr Tyr Ile Pro Phe Tyr Gly155 160 165Ile Leu Gly Ala Leu Leu Phe Leu Asn Phe Ile Arg Phe Leu Glu170 175 180Ser His Trp Phe Val Trp Val Thr Gln Met Asn His Ile Val Met185 190 195Glu Ile Asp Gln Glu Ala Tyr Arg Asp Trp Phe Ser Ser Gln Leu200 205 210Thr Ala Thr Cys Asn Val Glu Gln Ser Phe Phe Asn Asp Trp Phe215 220 225Ser Gly His Leu Asn Phe Gln Ile Glu His His Leu Phe Pro Thr230 235 240Met Pro Arg His Asn Leu His Lys Ile Ala Pro Leu Val Lys Ser245 250 255Leu Cys Ala Lys His Gly Ile Glu Tyr Gln Glu Lys Pro Leu Leu260 265 270Arg Ala Leu Leu Asp Ile Ile Arg Ser Leu Lys Lys Ser Gly Lys275 280 285Leu Trp Leu Asp Ala Tyr Leu His Lys *** Ser His Ser Pro Arg290 295 300Asp Thr Val Gly Lys Gly Cys Arg Trp Gly Asp Gly Gln Arg Asn305 310 315Asp Gly Leu Leu Phe *** Gly Val Ser Glu Arg Leu Val Tyr Ala320 325 330Leu Leu Thr Asp Pro Met Leu Asp Leu Ser Pro Phe Leu Leu Ser335 340 345Phe Phe Ser Ser His Leu Pro His Ser Thr Leu Pro Ser Trp Asp350 355 360Leu Pro Ser Leu Ser Arg Gln Pro Ser Ala Met Ala Leu Pro Val365 370 375Pro Pro Ser Pro Phe Phe Gln Gly Ala Glu Arg Trp Pro Pro Gly380 385 390Val Ala Leu Ser Tyr Leu His Ser Leu Pro Leu Lys Met Gly Gly400 405 410Asp Gln Arg Ser Met Gly Leu Ala Cys Glu Ser Pro Leu Ala Ala415 420 425Trp Ser Leu Gly Ile Thr Pro Ala Leu Val Leu Gln Met Leu Leu430 435 440Gly Phe Ile Gly Ala Gly Pro Ser Arg Ala Gly Pro Leu Thr Leu445 450 455Pro Ala Trp Leu His Ser Pro *** Arg Leu Pro Leu Val His Pro460 465 470Phe Ile Glu Arg Pro Ala Leu Leu Gln Ser Ser Gly Leu Pro Pro475 480 485Ala Ala Arg Leu Ser Thr Arg Gly Leu Ser *** Asp Val Gln 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Ser65 70 75Leu Leu Ile Gly Glu Leu Ser Pro Glu Gln Pro Ser Phe Glu Pro80 85 90Thr Lys Asn Lys Glu Leu Thr Asp Glu Phe Arg Glu Leu Arg Ala95 100 105Thr Val Glu Arg Met Gly Leu Met Lys Ala Asn His Val Phe Phe110 115 120Leu Leu Tyr Leu Leu His Ile Leu Leu Leu Asp Gly Ala Ala Trp125 130 135Leu Thr Leu Trp Val Phe Gly Thr Ser Phe Leu Pro Phe Leu Leu140 145 150Cys Ala Val Leu Leu Ser Ala Val Gln Gln Ala Gln Ala Gly Trp155 160 165Leu Gln His Asp Tyr Gly His Leu Ser Val Tyr Arg Lys Pro Lys170 175 180Trp Asn His Leu Val His Lys Phe Val Ile Gly His Leu Lys Gly185 190 195Ala Ser Ala ASn Trp Trp Asn His Arg His Phe Gln His His Ala200 205 210Lys Pro Asn Ile Phe His Lys Asp Pro Asp Val Asn Met Leu His
215 220 225Val Phe Val Leu Gly Glu Trp Gln Pro Ile Glu Tyr Giy Lys Lys230 235 240Lys Leu Lys Tyr Leu Pro Tyr Asn His Gln His Glu Tyr Phe Phe245 250 255Leu Ile Gly Pro Pro Leu Leu Ile Pro Met Tyr Phe Gln Tyr Gln260 265 270Ile Ile Met Thr Met Ile Val His Lys Asn Trp Val Asp Leu Ala275 280 285Trp Ala Val Ser Tyr Tyr Ile Arg Phe Phe Ile Thr Tyr Ile Pro290 295 300Phe Tyr Gly Ile Leu Gly Ala Leu Leu Phe Leu Asn Phe Ile Arg305 310 315Phe Leu Glu Ser His Trp Phe Val Trp Val Thr Gln Met Asn His320 325 330Ile Val Met Glu Ile Asp Gln Glu Ala Tyr Arg Asp Trp Phe Ser335 340 345Ser Gln Leu Thr Ala Thr Cys Asn Val Glu Gln Ser Phe Phe Asn350 355 360Asp Trp Phe Ser Gly His Leu Asn Phe Gln Ile Glu His His Leu365 370 375Phe Pro Thr Met Pro Arg His Asn Leu His Lys Ile Ala Pro Leu380 385 390Val Lys Ser Leu Cys Ala Lys His Gly Ile Glu Tyr Gln Glu Lys400 405 410Pro Leu Leu Arg Ala Leu Leu Asp Ile Ile Arg Ser Leu Lys Lys415 420 425Ser Gly Lys Leu Trp Leu Asp Ala Tyr Leu His Lys *** Ser His430 435 440Ser Pro Arg Asp Thr Val Gly Lys Gly Cys Arg Trp Gly Asp Gly445 450 455Gln Arg Asn Asp Gly Leu Leu Phe *** Gly Val Ser Glu Arg Leu460 465 470Val Tyr Ala Leu Leu Thr Asp Pro Met Leu Asp Leu Ser Pro Phe475 480 485Leu Leu Ser Phe Phe Ser Ser His Leu Pro His Ser Thr Leu Pro490 495 500Ser Trp Asp Leu Pro Ser Leu Ser Arg Gln Pro Ser Ala Met Ala505 510 515Leu Pro Val Pro Pro Ser Pro Phe Phe Gln Gly Ala Glu Arg Trp520 525 530Pro Pro Gly Val Ala Leu Ser Tyr Leu His Ser Leu Pro Leu Lys535 540 545Met Gly Gly Asp Gln Arg Ser Met Gly Leu Ala Cys Glu Ser Pro550 555 560Leu Ala Ala Trp Ser Leu Gly Ile Thr Pro Ala Leu Val Leu Gln565 570 575Met Leu Leu Gly Phe Ile Gly Ala Gly Pro Ser Arg Ala Gly Pro580 585 590Leu Thr Leu Pro Ala Trp Leu His Ser Pro *** Arg Leu Pro Leu595 600 605Val His Pro Phe Ile Glu Arg Pro Ala Leu Leu Gln Ser Ser Gly610 615 620Leu Pro Pro Ala Ala Arg Leu Ser Thr Arg Gly Leu Ser *** Asp625 630 635Val Gln Gly Pro Arg Pro Ala Gly Thr Ala Ser Pro Asn Leu Gly640 645 650Pro Trp Lys Ser Pro Pro Pro His His *** Ser Ala Leu Thr Leu655 660 665Gly Phe His Gly Pro His Ser Thr Ala Ser Pro Thr *** Ala Cys670 675 680Asp Leu Gly Thr Lys Gly Gly Val Pro Arg Leu Leu *** Leu Ser
685 690 695Arg Gly Ser Gly His Val Gln Gly Gly Ala Gly Trp Pro Gly Gly700 705 710Ser Ala His Pro Pro Ala Phe Pro Gln Gly Val Leu Arg Ser Lys715 720 725Ile Leu Glu Gln Ser Asp Pro Ser Pro Lys Ala Leu Leu Ser Ala730 735 740Gly Gln Cys Gln Pro Ile Pro Gly His Leu Ala Pro Gly Asp Val745 750 755Gly Pro Xxx(2)SEQ ID NO45的信息(i)序列特征(A)长度746核酸(B)类型核酸(C)线型不相关(D)拓扑学线形(ii)分子类型核酸(xi)序列描述SEQ ID NO45CGTATGTCAC TCCATTCCAA ACTCGTTCAT GGTATCATAA ATATCAACAC ATTTACGCTC 60CACTCCTCTA TGGTATTTAC ACACTCAAAT ATCGTACTCA AGATTGGGAA GCTTTTGTAA120AGGATGGTAA AAATGGTGCA ATTCGTGTTA GTGTCGCCAC AAATTTCGAT AAGGCCGCTT180ACGTCATTGG TAAATTGTCT TTTGTTTTCT TCCGTTTCAT CCTTCCACTC CGTTATCATA240GCTTTACAGA TTTAATTTGT TATTTCCTCA TTGCTGAATT CGTCTTTGGT TGGTATCTCA300CAATTAATTT CCAAGTTAGT CATGTCGCTG AAGATCTCAA ATTCTTTGCT ACCCCTGAAA360GACCAGATGA ACCATCTCAA ATCAATGAAG ATTGGGCAAT CCTTCAACTT AAAACTACTC420AAGATTATGG TCATGGTTCA CTCCTTTGTA CCTTTTTTAG TGGTTCTTTA AATCATCAAG480TTGTTCATCA TTTATTCCCA TCAATTGCTC AAGATTTCTA CCCACAACTT GTACCAATTG540TAAAAGAAGT TTGTAAAGAA CATAACATTA CTTACCACAT TAAACCAAAC TTCACTGAAG600CTATTATGTC ACACATTAAT TACCTTTACA AAATGGGTAA TGATCCAGAT TATGTTAAAA660AACCATTAGC CTCAAAAGAT GATTAAATGA AATAACTTAA AAACCAATTA TTTACTTTTG720ACAAACAGTA ATATTAATAA ATACAA 746(2)SEQ ID NO46的信息(i)序列特征(A)长度227氨基酸(B)类型氨基酸(C)线型不相关(D)拓扑构型线形(ii)分子类型肽(xi)序列描述SEQ ID NO46Tyr Val Thr Pro Phe Gln Thr Arg Ser Trp Tyr His Lys Tyr Gln1 5 10 15His Ile Tyr Ala Pro Leu Leu Tyr Gly Ile Tyr Thr Leu Lys Tyr20 25 30Arg Thr Gln Asp Trp Glu Ala Phe Val Lys Asp Gly Lys Asn Gly35 40 45Ala Ile Arg Val Ser Val Ala Thr Asn Phe Asp Lys Ala Ala Tyr50 55 60Val Ile Gly Lys Leu Ser Phe Val Phe Phe Arg Phe Ile Leu Pro65 70 75Leu Arg Tyr His Ser Phe Thr Asp Leu Ile Cys Tyr Phe Leu Ile80 85 90Ala Glu Phe Val Phe Gly Trp Tyr Leu Thr Ile Asn Phe Gln Val95 100 105Ser His Val Ala Glu Asp Leu Lys Phe Phe Ala Thr Pro Glu Arg110 115 120Pro Asp Glu Pro Ser Gln Ile Asn Glu Asp Trp Ala Ile Leu Gln125 130 135Leu Lys Thr Thr Gln Asp Tyr Gly His Gly Ser Leu Leu Cys Thr140 145 150Phe Phe Ser Gly Ser Leu Asn His Gln Val Val His His Leu Phe155 160 165Pro Ser Ile Ala Gln Asp Phe Tyr Pro Gln Leu Val Pro Ile Val170 175 180Lys Glu Val Cys Lys Glu His Asn Ile Thr Tyr His Ile Lys Pro185 190 195Asn Phe Thr Glu Ala Ile Met Ser His Ile Asn Tyr Leu Tyr Lys200 205 210Met Gly Asn Asp Pro Asp Tyr Val Lys Lys Pro Leu Ala Ser Lys215 220 225Asp Asp ***(2)SEQ ID NO47的信息(i)序列特征(A)长度494核酸(B)类型核酸(C)线型不相关(D)拓扑学线形(ii)分子类型核酸(xi)序列描述SEQ ID NO47TTTTGGAAGG NTCCAAGTTN ACCACGGANT NGGCAAGTTN ACGGGGCGGA AANCGGTTTT 60CCCCCCAAGC CTTTTGTCGA CTGGTTCTGT GGTGGCTTCC AGTACCAAGT CGACCACCAC120TTATTCCCCA GCCTGCCCCG ACACAATCTG GCCAAGACAC ACGCACTGGT CGAATCGTTC180TGCAAGGAGT GGGGTGTCCA GTACCACGAA GCCGACCTCG TGGACGGGAC CATGGAAGTC240TTGCACCATT TGGGCAGCGT GGCCGGCGAA TTCGTCGTGG ATTTTGTACG CGACGGACCC300GCCATGTAAT CGTCGTTCGT GACGATGCAA GGGTTCACGC ACATCTACAC ACACTCACTC360ACACAACTAG TGTAACTCGT ATAGAATTCG GTGTCGACCT GGACCTTGTT TGACTGGTTG420GGGATAGGGT AGGTAGGCGG ACGCGTGGGT CGNCCCCGGG AATTCTGTGA 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CTTTTCCCCA300CGGCGCCCCA GTTCCGTTTC AAGGAGATCA GCCCGCGCGT CGAGGCCCTC TTCAAGCGCC360ACGGTCTCCC TTACTACGAC ATGCCCTACA CGAGCGCCGT CTCCACCACC TTTGCCAACC420TCTACTCCGT CGGCCATTCC GTCGGCGACG CCAAGCGCGA CTAGCCTCTT TTCCTAGACC480TTAATTCCCC ACCCCACCCC ATGTTCTGTC TTCCTCCCGC 520(2)SEQ ID NO50的信息(i)序列特征(A)长度153氨基酸(B)类型氨基酸(C)线型不相关(D)拓扑构型线形(ii)分子类型肽(xi)序列描述SEQ ID NO50Met Glu Phe Val Trp Ile Ala Val Arg Tyr Ala Thr Trp Phe Lys1 5 10 15Arg His Gly Cys Ala Trp Val His Ala Gly Ala Val Val Gly His20 25 30Val Leu Val Arg Leu Trp Ser Arg Leu His Leu His Phe Ser Ala35 40 45Val Arg Arg Lys Ser His Pro Phe Ala Arg Glu Gln Pro Gly Gly50 55 60Ser Ala Ala Leu Ala Arg Val Arg Ala Asp His Thr Val Asn Ile65 70 75Ser Thr Lys Ser Trp Phe Val Thr Trp Trp Met Ser Asn Leu Asn80 85 90Phe Gln Ile Glu His His Leu Phe Pro Thr Ala Pro Gln Phe Arg95 100 105Phe Lys Glu Ile Ser Pro Arg Val Glu Ala Leu Phe Lys Arg His110 115 120Gly Leu Pro Tyr Tyr Asp Met Pro Tyr Thr Ser Ala Val Ser Thr125 130 135Thr Phe Ala Asn Leu Tyr Ser Val Gly His Ser Val Gly Asp Ala140 145 150Lys Arg Asp(2)SEQ ID NO51的信息(i)序列特征(A)长度429核酸(B)类型核酸(C)线型不相关(D)拓扑学线形(ii)分子类型核酸(xi)序列描述SEQ ID NO51ACGCGTCCGC CCACGCGTCC GCCGCGAGCA ACTCATCAAG GAAGGCTACT TTGACCCCTC 60GCTCCCGCAC ATGACGTACC GCGTGGTCGA GATTGTTGTT CTCTTCGTGC TTTCCTTTTG120GCTGATGGGT CAGTCTTCAC CCCTCGCGCT CGCTCTCGGC ATTGTCGTCA GCGGCATCTC180TCAGGGTCGC TGCGGCTGGG TAATGCATGA GATGGGCCAT GGGTCGTTCA CTGGTGTCAT240TTGGCTTGAC GACCGGTTGT GCGAGTTCTT TTACGGCGTT GGTTGTGGCA TGAGCGGTCA300TTACTGGAAA AACCAGCACA GCAAACACCA CGCAGCGCCA AACCGGCTCG AGCACGATGT360AGATCTCAAC ACCTTGCCAT TGGTGGCCTT CAACGAGCGC GTCGTGCGCA AGGTCCGACC420(2)SEQ ID NO52的信息(i)序列特征(A)长度125氨基酸(B)类型氨基酸(C)线型不相关(D)拓扑构型线形(ii)分子类型肽(xi)序列描述SEQ ID NO52Arg Val Arg Pro Arg Val Arg Arg Glu Gln Leu Ile Lys Glu Gly1 5 10 15Tyr Phe Asp Pro Ser Leu Pro His Met Thr Tyr Arg Val Val Glu20 25 30Ile Val Val Leu Phe Val Leu Ser Phe Trp Leu Met Gly Gln Ser35 40 45Ser Pro Leu Ala Leu Ala Leu Gly Ile Val Val Ser Gly Ile Ser50 55 60Gln Gly Arg Cys Gly Trp Val Met His Glu Met Gly His Gly Ser65 70 75Phe Thr Gly Val Ile Trp Leu Asp Asp Arg Leu Cys Glu Phe Phe65 70 75Tyr Gly Val Gly Cys Gly Met Ser Gly His Tyr Trp Lys Asn Gln80 85 90His Ser Lys His His Ala Ala Pro Asn Arg Leu Glu His Asp Val95 100 105Asp Leu Asn Thr Leu Pro Leu Val Ala Phe Asn Glu Arg Val Val110 115 120Arg Lys Val Arg Pro12权利要求
1.一种核酸结构，它包含一个或多个选自SEQ ID NO1、SEQ ID NO3和SEQ ID NO5的SEQ ID NO中描述的核苷酸序列，其中所说的一个或多个核苷酸序列与一个异源核苷酸序列连接。
2.一种核酸结构，它包含一个或多个选自SEQ ID NO1、SEQ ID NO3和SEQ ID NO5的SEQ ID NO中描述的核苷酸序列，其中所说的一个或多个核苷酸序列与一个在一种植物细胞中有功能的表达控制序列操纵连接。
3.权利要求2的核酸结构，其中所说的核苷酸序列具有小于约60％的A+T平均含量。
4.权利要求2的核酸结构，其中所说的核苷酸序列来自一种真菌。
5.权利要求4的核酸结构，其中所说的真菌属于被孢霉属。
6.权利要求5的核酸结构，其中所说的真菌属于高山被孢霉。
7.一种核酸结构，它包含编码一个包含SEQ ID NO2中所示氨基酸序列的多肽的核苷酸序列，其中所说的核苷酸序列与一个在一种植物细胞中有功能的转录或表达控制序列操纵连接，其中所说的核苷酸序列编码一种具有功能活性的多肽，该多肽能将一种脂肪酸分子在所说的脂肪酸分子的自羧基末端的碳6处去饱和。
8.一种核酸结构，它包含一种编码一个包含SEQ ID NO4中所示氨基酸序列的多肽的核苷酸序列，其中所说的核苷酸序列与一个在一种植物细胞中有功能的转录或表达控制序列操纵连接，其中所说的核苷酸序列编码一种具有功能活性的多肽，该多肽能将一种脂肪酸分子在所说的脂肪酸分子的自羧基末端的碳12处去饱和。
9.一种核酸结构，它包含一种编码一个包含SEQ ID NO6中所示氨基酸序列的多肽的核苷酸序列，其中所说的核苷酸序列与一个在一种植物细胞中有功能的转录或表达控制序列操纵连接，其中所说的核苷酸序列编码一种具有功能活性的多肽，该多肽能将一种脂肪酸分子在所说的脂肪酸分子的自羧基末端的碳5处去饱和。
10.一种核酸结构，它包含至少一种编码一种有功能活性的、具有选自SEQ ID NO2、SEQ ID NO4和SEQ ID NO6的SEQ ID NO中所示氨基酸序列的脱氢酶的核苷酸序列，其中所说的核苷酸序列与一种在植物细胞中有功能的启动子操纵连接。
11.权利要求10的核酸结构，其中所说的植物细胞是一种种子细胞。
12.权利要求11的核酸结构，其中所说的种子细胞是一种胚细胞。
13.一种重组植物细胞，它包含至少一个拷贝的编码至少一种有功能活性的高山被孢霉脂肪酸脱氢酶的DNA序列，该脱氢酶能导致一种多不饱和脂肪酸的产生，其中所说的脂肪酸脱氢酶含有选自SEQ ID NO2、SEQ ID NO4和SEQ ID NO6的SEQ ID NO中所示的氨基酸序列，其中所说的细胞用一种含有所说的DNA序列的载体转化，并且其中所说的DNA序列与一种表达控制序列操纵连接。
14.权利要求13的重组植物细胞，其中所说的多不饱和脂肪酸选自LA、ARA、GLA、DGLA、SDA和EPA。
15.权利要求13的重组植物细胞，其中所说的重组植物细胞富含选自181、182、183和184的一种脂肪酸。
16.权利要求15的重组植物细胞，其中所说的植物细胞选自芸苔、大豆、红花、玉米、亚麻和向日葵。
17.权利要求16的重组植物细胞，其中所说的表达控制序列对所说的植物细胞来说是内源性的。
18.由权利要求16所说的重组植物细胞表达的一种或多种植物油。
19.一种获得改变的长链多不饱和脂肪酸生物合成的方法，它包括以下步骤培养一种在细胞中含有一种转基因的植物，该转基因编码一种转基因表达产物，这种表达产物能够将一种脂肪酸分子在所说的脂肪酸分子的自羧基末端的碳5处去饱和，其中所说的转基因与一种表达控制序列操纵连接，培养在所说的转基因能够表达的条件下进行，由此所说的细胞中的长链多不饱和脂肪酸生物合成被改变。
20.一种获得改变的长链多不饱和脂肪酸生物合成的方法，它包括以下步骤培养一种在细胞中含有一种或多种来自一种真菌或藻类的转基因的植物，该转基因编码一种转基因表达产物，这种表达产物能够将一种脂肪酸分子在所说的脂肪酸分子的自羧基末端的选自碳5、碳6和碳12的一个碳位置去饱和，其中所说的一个或多个转基因与一种表达控制序列操纵连接，培养在所说的一个或多个转基因能够表达条件下进行，由此所说的细胞中的长链多不饱和脂肪酸生物合成被改变。
21.权利要求19或20的方法，其中所说的长链多不饱和脂肪酸选自LA、ARA、GLA、DGLA、SDA和EPA。
22.根据权利要求19或20的方法制备的一种植物油或其部分。
23.一种治疗或预防营养不良的方法，包括将权利要求22所说的植物油给予一个需要所说的治疗或预防的病人，所给予的数量足够产生所说的治疗或预防效果。
24.一种药物组合物，它包含权利要求22所说的植物油或其部分以及一种可药用的载体。
25.权利要求24的药物组合物，其中所说的药物组合物为一种固体或液体形式。
26.权利要求25的药物组合物，其中所说的药物组合物是一种胶囊或片剂形式。
27.权利要求24的药物组合物，它进一步包含至少一种选自维生素、矿物质、碳水化合物、糖、氨基酸、游离脂肪酸、磷脂、抗氧化剂和酚化合物的营养物质。
28.一种含有权利要求22所说的植物油或其部分的营养配方食品。
29.权利要求28的营养配方食品，其中所说的营养配方食品选自婴儿配方食品、保健食品和代用食品。
30.权利要求29的营养配方食品，其中所说的婴儿配方食品、保健食品或代用食品为液体或固体形式。
31.一种含有权利要求22所说的植物油或其部分的婴儿配方食品。
32.权利要求31的婴儿配方食品，它进一步含有至少一种选自椰子油、豆油、菜籽油、甘油单酯和甘油二酯、葡萄糖、食用乳糖、电渗析乳清、电渗析脱脂乳、乳清、豆蛋白和其他蛋白水解物的常量营养物。
33.权利要求32的婴儿配方食品，它进一步含有至少一种选自维生素A、C、D、E和B复合物的维生素，和至少一种选自钙、镁、锌、锰、钠、钾、磷、铜、氯、碘、硒和铁的矿物质。
34.一种含有权利要求22所说的植物油或其部分的保健食品。
35.权利要求34的保健食品，它进一步含有至少一种选自椰子油、豆油、菜籽油、甘油单酯和甘油二酯、葡萄糖、食用乳糖、电渗析乳清、电渗析脱脂乳、乳清、豆蛋白和其他蛋白水解物的常量营养物。
36.权利要求35的保健食品，它进一步含有一种选自维生素A、C、D、E和B复合物的维生素，和至少一种选自钙、镁、锌、锰、钠、钾、磷、铜、氯、碘、硒和铁的矿物质。
37.权利要求34或权利要求36的保健食品，其中所说的保健食品给予人或动物。
38.一种含有权利要求22所说的植物油或部分的代用食品。
39.权利要求38的代用食品，它进一步含有至少一种选自椰子油、豆油、菜籽油、甘油单酯和甘油二酯、葡萄糖、食用乳糖、电渗析乳清、电渗析脱脂乳、乳清、豆蛋白和其他蛋白水解物的常量营养物。
40.权利要求39的代用食品，它进一步含有至少一种选自维生素A、C、D、E和B复合物的维生素，和至少一种选自钙、镁、锌、锰、钠、钾、磷、铜、氯、碘、硒和铁的矿物质。
41.权利要求38或权利要求40的代用食品，其中所说的代用食品给予人或动物。
42.一种治疗患有由多不饱和脂肪酸摄取或合成不足导致的疾病的病人的方法，它包括将权利要求38所说的代用食品或权利要求34所说的保健食品给予所说的病人，给予的量足以产生所说的治疗效果。
43.权利要求42的方法，其中所说的代用食品或保健食品经肠道或不肠道给药。
44.一种含有权利要求22所说的植物油或其部分的化妆品。
45.权利要求44的化妆品，其中所说的化妆品在表面使用。
46.权利要求24的药物组合物，其中所说的药物组合物给予人或动物。
47.一种含有权利要求22所说的植物油或其部分的动物饲料。
48.一种包含选自SEQ ID NO38-SEQ ID NO44的核苷酸序列的分离核苷酸序列，其中所说的核苷酸序列在一种植物细胞中表达。
49.权利要求20的方法，其中所说的真菌是被孢霉属的种。
50.权利要求49的方法，其中所说的真菌是高山被孢霉。
51.一种选自SEQ ID NO49-SEQ ID NO50的分离核苷酸序列，其中所说的序列在一种植物细胞中表达。
全文摘要
本发明涉及在植物、植物部位和植物细胞例如叶、根、果实和种子中制备不饱和的长链脂肪酸的组合物和方法。编码脂肪酸脱氢酶包括△5－脱氢酶、△6－脱氢酶和△12－脱氢酶的核酸序列和结构被用于制备含有和表达一种或更多的编码一种或更多脱氢酶的转基因的转基因植物、植物部位和细胞。在植物系统中表达具有不同底物特异性的脱氢酶,能够使多不饱和长链脂肪酸如二十二碳六烯酸、二十碳五烯酸、α－亚麻酸、γ－亚麻酸、花生四烯酸等大量产生,从而改变植物、植物部分和组织的脂肪酸谱。对脂肪酸谱的操作能够生产具有商业规模的新型植物油和产品。
文档编号C12N15/82GK1253588SQ98804091
公开日2000年5月17日 申请日期1998年4月10日 优先权日1997年4月11日
发明者D·克努特宗, P·穆克尔吉, Y·S·黄, J·图尔蒙德, S·乔德哈赖, A·E·Y·勒安纳德 申请人:艾博特公司, 加利福尼亚基因公司