专利名称：来自肺炎链球菌的降解人类补体c3的蛋白酶的制作方法
技术领域：
本发明是关于肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)，且特别的是本发明关于一种可降解人类补体蛋白质C3的肺炎链球菌蛋白质的鉴定。
背景技术：
本申请所请求的是于1997年8月24日申请且以“来自肺炎链球菌的降解人类补体C3的蛋白酶”为标题的一临时申请案(申请号60/044,316)所请求者。
受到肺炎链球菌(S.pneumoniae)的呼吸道感染造成每年估计有500,000个肺炎的案例及47,000个死亡案例。有细菌性肺炎感染的高危险性的那些人是两岁以下的婴孩及老人，在这些族群中，肺炎链球菌是为细菌性肺炎及脑膜炎的主要致病原因。此外，肺炎链球菌是所有年龄的儿童耳部感染的主要细菌性病因，在细菌形成菌落(colonization)、局部或全身性感染、或以纯化的多糖类免疫接种之后，儿童及老人都有合成对抗肺炎球菌荚膜多糖类的保护性抗体的缺陷。肺炎链球菌是感染人体免疫不全病毒(HIV)的成人及儿童中侵入性的细菌性呼吸道疾病之主要病因，且会在这些患者中产生造血的感染(Connor等；.Current Topicsin AIDS1987；1185-209 and Janoff等Ann.Intern.Med.1992；1117(4)314-324)。
证实为严重感染的高危险性的个体无法产生对抗目前荚膜多糖类疫苗的抗体，因此，目前有四种结合性(conjugate)疫苗用于临床试验，结合性疫苗是由与蛋白质载体或佐剂联结的肺炎球菌的荚膜多糖所组成以尝试追加抗体反应。但是，仍有其他目前用于临床试验中结合性疫苗的潜在问题存在，例如，最广泛存在于美国的肺炎球菌血清型与最常见于如以色列、西欧或斯堪的那为亚半岛地方的血清型不同，因此，可有效用于一地理区域的疫苗并不一定有效用于其他地区，改良目前可得的荚膜多糖类疫苗或发展荚膜疫苗的蛋白质结合物(conjugate)，以适合地理的血清型变化的潜在需求，造成过高的财务及技术复杂性。因而，寻找在全世界多种致命的血清型中有保守性(conserved)的免疫原、表面暴露的蛋白质在预防肺炎球菌感染以及广泛保护性的肺炎球菌疫苗上极为重要。此外，对盘尼西林(penicillin)及头孢霉素(cephalosporin)具抵抗性的肺炎球菌在全球的出现造成对有效性疫苗的急切需求(Baquero等J.Antimicrob.Chemother.1991；28S；31-8)。
一些肺炎球菌蛋白质已被提出与肺炎球菌荚膜多糖类结合或以单独的免疫原来刺激对抗肺炎链球菌的免疫性，表面蛋白质被报导为与肺炎链球菌对呼吸道上皮细胞的黏着性有关，包括PsaA，PspC/CBP 112，及IgAl蛋白酶(Sampson等Infect.Immun.1994；62319-324，Sheffield等Microb.Pathogen.1992；13261-9，以及Wani等Infect.Immun.1996；643967-3974)。对抗这些黏着素(adhesins)的抗体可抑制肺炎球菌结合至呼吸道上皮细胞，并因此降低其形成菌落。其他细胞溶解性肺炎球菌蛋白质，例如肺炎溶解素(pneumolysin)，自溶素(autolysin)，神经胺酸酶(neuraminidase)，或玻璃酸酶(hyaluronidase)，被提出作为疫苗抗原，因为于受到肺炎链球菌感染的患者中抗体可有效地阻断这些蛋白质的毒性效应。然而，这些蛋白质一般并非位于肺炎链球菌的表面上，而是当细胞溶解且死亡时会由细菌分泌或释放出来(Lee等Vaccine1994；12875-8以及Berry等Infect.Immun.1994；621101-1108)。虽然使用作为免疫原的这些细胞溶解性蛋白质可改良肺炎链球菌感染的最后结果，但抗这些蛋白质的抗体不会促进肺炎球菌的死亡，也不能预防最初或后续的肺炎球菌形成菌落。
被测试为肺炎球菌疫苗的原型(prototypic)表面蛋白质是为肺炎球菌的表面蛋白质A(PspA)，PspA是一种约70至140kDa的异源性蛋白质，PspA的结构包括在安基端的(螺旋体，接着一富含脯氨酸的序列，以及在唆基端11个结合胆硷的重复序列系列中止。虽然有许多关于PspA的结构资料，但是PspA在多种肺炎球菌血清型中不具有结构上的保守性(conserved)，且其作用完全为未知的(Yother等J.Bacteriol.1994；1762976-2985)。研究已确认PspA于动物体中的免疫生成性(McDaniel等Microb.Pathogen.1994；17323-337)，即使PspA有免疫生成性，但是PspA的异质性(heterogeniety)、其存在于四个结构群(或clades)中、以及其未定特性的功能使得其作为疫苗抗原的能力复杂化。
在无法产生抗类型专一性的多糖类荚膜的保护性抗体的患者中，补体的第三个成分C3以及替代补体路径的有关蛋白质是构成对抗肺炎链球菌感染的宿主防御第一线。因为补体蛋白质不能穿透肺炎链球菌的坚固细胞壁，故在肺炎球菌表面上调理性(opsonic)C3b的沉积是为清除肺炎球菌的主要介导物(mediator)。已知肺炎球菌与血浆C3的相互作用发生在肺炎球菌菌血症期间，当C3b(即C3的调理性活性片段)共价结合时，会使巨噬细胞的辨识及摄入开始(Johnson等J.Exp.Med1969；1291275-1290，Hasin HE，J.Immunol.1972；10926-31以及Hostetter等J.Infect.Dis.1984；150653-61)，C3b会沉积于肺炎球菌的荚膜上以及细胞壁上，此种控制肺炎链球菌感染的方法相当无效率，增强肺炎链球菌调理作用(opsonization)的方法可改善由此微生物所诱发的疾病过程，因此目前对限制肺炎链球菌感染的方法及疗法存在有强烈的需求。
本发明关于鉴定及使用由肺炎链球菌表现的降解人类补体C3蛋白。此蛋白质具有约24kDa至约34kDa的分子量，其是于10％SDS聚丙烯酰胺凝胶上所测定。本发明包括可由不同降解C3的肺炎链球菌菌株中分离出来的一些蛋白质。
在本发明的一方面，本发明关于一种包含至少与序列编号2(SEQ ID NO2)有80％序列相同性且可降解人类补体蛋白质C3的分离蛋白质。在一较佳具体实施例中，此蛋白质是由肺炎链球菌中分离出来，或者此蛋白质为一种重组蛋白质，较好的是此蛋白质会与人类补体蛋白质C3结合。在一个较佳具体实施例中，此蛋白质具有于10％SDS聚丙烯酰胺凝胶上所测定的约24kDa至约34kDa之分子量。本发明的一种较佳蛋白质为包括序列编号2的分离蛋白质。
本发明也关于来自本发明降解C3蛋白酶的肽类，以及较佳的是来自含有与序列编号2至少80％相同性序列且能降解人类补体蛋白质C3的分离蛋白质的至少15个连续氨基酸序列的骕类，且更佳是来自序列编号2的至少15个连续氨基酸序列的肽类。
根据权利要求9所述的蛋白质，为一种重组蛋白质。在本发明的另一方面，本发明关于来自序列编号2的至少15个连续氨基酸的肽类。
本发明的蛋白质可包含序列编号2，且较佳具有于10％聚丙烯酰胺凝胶所测定的约24kDa至约34kDa间的分子量，另外较佳的是该蛋白质可降解人类补体蛋白质C3。本发明的较佳蛋白质或多肽类包括一种包含序列编号2的氨基酸1至50的蛋白质以及一种包含
图1A的核酸1246至1863的核酸片段。
在本发明另一方面，本发明关于一种降解人类补体蛋白质C3的蛋白质，且其中编码该蛋白质的核酸可与序列编号1(SEQ ID NO1)杂交，此杂交条件是在6XSSC、5X Denhardt、0.5％ SDS以及100微克/毫升片段化且变性的鲑鱼精子DNA于65℃下杂交隔夜且以2X SSC、0.1％ SDS在室温下清洗一次约10分钟，接着在65℃下清洗一次约15分钟，再后续至少一次以0.2X SSC、0.1％ SDS于室温下清洗至少3至5分钟。
本发明也关于一种刺激免疫系统的组成物，其包含一有效量的刺激免疫系统的肽类或多肽类，此等肽类或多肽类包含与序列编号2至少80％相同性序列且能降解人类补体蛋白质C3的分离蛋白质的至少15个连续氨基酸序列。
较佳的是，该蛋白质可由肺炎链球菌中分离出来。在一个具体实施例中，刺激免疫系统的组成物进一步包含至少一种其他刺激免疫系统的来自肺炎链球菌的肽类、多肽类或蛋白质。
本发明进而关于一种可专一性与含有序列编号2至少80％相同性序列且能降解人类补体蛋白质C3的蛋白质结合的抗体。在一个具体实施例中，该抗体是一种单株抗体，且在另一个具体实施例中，此抗体为一种多株抗体，在另外的具体实施例中，此抗体是一个抗体片段，此抗体或抗体片段可得自一老鼠、大鼠、人类或兔子中。
本发明也关于一种可与序列编号1杂交的核酸片段，此杂交条件是在6X SSC、5X Denhardt、0.5％ SDS以及100微克/毫升片段化且变性的鲑鱼精子DNA于65℃下杂交隔夜且以2X SSC、0.1％SDS在室温下清洗一次约10分钟，接着在65℃下清洗一次约15分钟，再后续至少一次以0.2XSSC、0.1％ SDS于室温下清洗至少3至5分钟。在一个具体实施例中，此核酸片段是由肺炎链球菌基因组中分离出来，且在另一个具体实施例中，此核酸片段编码至少蛋白质的一部分。在一个具体实施例中，此蛋白质会降解人类补体C3，且在另一个具体实施例中，此核酸片段编码一种不会降解人类补体C3的蛋白质。
在另一具体实施例中，此核酸片段是在一种核酸载体上，且此载体可为一种能制造蛋白质至少一部分的表现载体。包括该核酸片段的细胞也涵盖于本发明中。在一个具体实施例中，此细胞是一细菌或真核细胞。
本发明进一步关于一种包含下列核酸序列的分离核酸片段gctccagtatgcgtactcgtaaggtagggaagaaaaaaactagctag在本发明的另一个具体实施例中，本发明关于一种在动物中对肺炎链球菌产生免疫反应的方法，其包括下列步骤施用一种包含一治疗上有效量的蛋白质至少一部分的组成物于动物体中，其中编码该蛋白质的核酸可与序列编号1杂交，此杂交条件是在6X SSC、5X Denhardt、0.5％ SDS以及100微克/毫升片段化且变性的鲑鱼精子DNA于65℃下杂交隔夜且以2X SSC、0.1％ SDS在室温下清洗一次约10分钟，接着在65℃下清洗一次约15分钟，再后续至少一次以0.2XSSC、0.1％ SDS于室温下清洗至少3至5分钟；以及得到对该蛋白质的免疫反应。在一个具体实施例中，此免疫反应是B细胞反应，且在另一具体实施例中，此免疫反应是T细胞反应。在一个较佳具体实施例中，此组成物是一种疫苗组成物，较佳的是此蛋白质的至少一部分是至少15个氨基酸长，且较佳的是此组成物进一步包含至少一种来自肺炎链球菌的其他蛋白质。在一具体实施例中，此蛋白质包含序列编号2的至少15个氨基酸。
在一另外的具体实施例中，本发明关于一种包含插入性突变(insertional mutation)的细菌，其中此插入性突变物是位于一个编码可降解人类补体C3的蛋白质的基因上。在一个具体实施例中，此细菌包含一插入性复制突变。
本发明进一步关于一种来自肺炎链球菌的能与人类补体C3结合并降解的约24kDa至约34kDa的蛋白质，以及关于一种抑制肺炎链球菌所介导的C3降解作用的方法，此方法包含步骤将肺炎链球菌与一抗体接触，此抗体能与具有序列编号2至少80％氨基酸序列相同性的蛋白质结合。本发明进一步关于一种包含序列编号1核酸序列的分离核酸片段，以及由包含序列编号1的双股DNA序列所转录的RNA片段。
以下结合附图进一步说明本发明的具体结构特征及目的。
附图简述图1A提供一种本发明降解C3蛋白酶的基因序列，且图1B提供提供一种本发明降解C3蛋白酶的氨基酸序列。
图2是一个根据本发明的插入性复制突变株的图示。
图3是一个来自本发明插入性复制突变株的插入物(insert)的限制酶分析图示。
较佳具体实施例详述本发明关于一种降解C3的蛋白酶的鉴定及分离，此蛋白酶具有于10％ SDS-PAGE凝胶上约29kDa(±5kDa)的分子量(基于序列编号1的约27.5kDa预测大小)，以及编码降解C3的蛋白酶的核酸。此蛋白质起初是以在浸泡C3的SDS-PAGE凝胶上的肺炎球菌溶解物(lysates)电泳而鉴别出来。已发现来自一些血清型的肺炎球菌的呈指数生长的培养物能够首先降解C3的β链且接着降解C3的α链而不会产生一定的C3裂解片段(Angel等J.Infect.Dis.170600-608，1994)，此种不会裂解的降解模式实质上与其他微生物产物不同，例如绿脓杆菌(Pseudomonasaeruginosa)的弹性蛋白酶及溶组织内阿米巴(Entamoeba histolytica)的半胱氨酸蛋白酶。根据本发明的编码降解C3蛋白质的基因序列(序列编号1)提供于图1A中，且该蛋白质的氨基酸序列(序列编号2)提供于图1B中。
在此使用的″降解″一词是指能够裂解蛋白质为氨基酸、肽类及/或多肽类片段的酵素。如在一聚丙烯酰胺凝胶上所观察，本发明的蛋白质会降解C3而不会产生特定的裂解片段。
约29kDa的降解C3的蛋白酶是由插入性阻断的肺炎球菌基因库(library)中分离出来，其是由鉴定与野生型肺炎链球菌相较有增加降解C3活性的转殖株(clone)。对于C3而言，至少较佳的是本发明降解C3的蛋白酶，举例而言，降解C3的蛋白酶不会大量降解其他的蛋白质(例如白蛋白)。进行插入性复制突变以及鉴定具有提高降解C3活性的转殖株的代表行方法提供于实例1中。
编码降解C3蛋白酶的基因是包含在一个包括四个开放译读框架(openreadingframe)的区域中，且其第三个开放译读框架受到同源性重组作用阻断而严重损害C3的降解作用。ORF3包括约726个核苷酸，且转译的蛋白质序列不具有与GenBank或SwissProt资料库中登录蛋白质的基本同质性。
使编码本发明降解C3的蛋白酶的基因全长插入于一种基因表现载体中以于大肠杆菌中表现。降解C3的重组蛋白酶是以叙述于实例中的方式被分离出来，一般熟悉此技术人士可了解到，若一特定的基因序列已知，例如提供于图1者，有许多表现载体可用于表现该基因。此外，有许多此技术上已知的方法可用于制造及分离本发明的重组蛋白质，且除了那些提供于实例中的表现系统以外，熟悉此类技术的人员将可决定一特定表现系统是否有功用，而不需要过度的实验。许多不同的分子及免疫技术可见于基础技术教科书中，例如Sambrook等人(Molecular Cloning，ALaboratoryManual，1989，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，NY)以及Harlow等人(AntibodiesALaboratory Manual.Cold Spring Harbor，NY；ColdSpringHarbor Laboratory Press，1988)所著。
编码本发明降解C3蛋白酶的基因是使用以得自CP 1200株的肺炎球菌基因组DNA片段所得到的质体库(library)而鉴定。虽然有许多不同方法已知用于得到一质体库，但以一较佳的策略，一质体库的建构是以来自肺炎球菌株CP 1200(得自D.A.Morrison，University oflllinois，Champagne-Urbana，Illinois，且叙述于Harvarstein LF，et al.Proc.Natl.Acad.Sci(USA)1995，9211140-11144)的Sau 3A所切割的肺炎球菌基因组DNA片段(0.5至4.0kb)，且插入整合的往返载体(shuttle vector)pVA 891(ermr，cmr；具有大肠杆菌的复制起点)的Bam HI位置中。此质体库由电击穿透法(electroporation)被转形至大肠杆菌DHL(MCR株，由电击穿透法(electroporation)总共得到14000个大肠杆菌转形细胞，一些随机选择的大肠杆菌转形细胞的质体提取物显示所有转形细胞皆含有重组质体。
质体库(library)DNA是由大肠杆菌转形细胞中提取，且用于以插入性突变同源性重组使CP 1200亲代肺炎球菌株转形。
肺炎球菌株CP 1200细胞是于CTM培养基中以HCl步骤使pH值改变而成为可胜任的(competent)，此胜任细胞是以小分量储存于-70℃下直到需要时，八千个肺炎球菌转形细胞以这些方法制造。
各肺炎球菌转形细胞是以ELISA基于其等降解C3能力的改变表现型特性来筛选。细菌培养物是以C3(每毫升培养物0.83微克C3)来培养约2小时至约4小时，且存留于样品中未降解的C3量是以使用对人类补体C3具专一性的结合HRP羊多株抗体的酵素结合免疫吸附分析(ELISA)来侦测。使此分析标准化以使包含未降解C3的凹槽(well)具有O.D.490＝～1.0，包含降解C3的凹槽由于结合抗-C3抗体的能力降低而具有降低的光学密度，突变株及亲代株的光学密度是与负对照组相比较，负对照组是含有不同浓度C3的培养基，降解C3活性的百分率是以样品相对于对照组的光学密度的比率而定。相较于由亲代株CP1200而来的约29kDa降解C3蛋白质的活性，四个突变株(SN3，SN4，SN5及SN6)被鉴定具有提高的降解C3活性(约2至2.2倍较高的活性)。此发现是由西方印渍分析(Western BlotAnalysis)而获得确认。
由突变株SN3，SN4，SN5及SN6而来的全部DNA被分离且用于电击穿透法送入大肠杆菌DH5(MCR中，肺炎球菌基因组(genome)内来自完整质体的质体DNA的低剪切率(excision rate)可产生少量的游离质体DNA，且在当此DNA转形入大肠杆菌时此DNA可被回复，此使得可进一步定出该质体的特徵，将该质体再次转形入肺炎球菌中证明原始突变株的表现型。
来自原本的降解C3蛋白质以及来自突变物SN3，SN4，SN5及SN6的蛋白质样品是以C3培养且在还原条件下于7.5％SDS-PAGE凝胶上被分离。降解C3的活性是使用抗C3的结合HRP抗体以西方印渍分析来评定，突变株SN4及突变株SN4-4G用于进一步的实验中。突变株SN4-4G是在使自SN4中得到的重组质体pLSN4a转形至CP1200后而鉴定。突变株SN4及突变株SN4-4G均在培养4小时后几乎完全降解C3，虽然原始的降解C3的蛋白质在经过4小时培养之后降解C3，但是与以突变株SN4及突变株SN4-4G相同培养下相较，其C3降解作用是不完全的。
编码来自突变株SN4蛋白质的质体被选择用于进一步的研究。质体pLSN4a(编码突变株SN4)用于再转形入野生型CP 1200株中，此得到48个具有提高降解C3活性的肺炎球菌突变株，以限制内核酸酶Hind III切割证实质体pLSN4a是约～7.8kb且包含一个约～2.3kb的插入物。
质体pLSN4a是作为南方杂交实验(southern hybridizationexperiment)中的杂交探针，以证明来自肺炎球菌突变物的染色体DNA样品中插入物的存在。此结果确认具有突变物SN3及SN4中插入物(pLSN4a)和插入物起点的载体被并入染色体DNA中。突变株SN3及突变株SN4均由两个约～2.2kb及约～5.8kb大小的杂交连接片段所组成，这些片段也存在于它们的亲代株CP1200中，另外有两个约～4.2kb及约～3.5kb大小的杂交片段且这两个片段总共为约～7.8kb(pLSN4a为～7.8kb)，这两个条带(band)也存在于具有插入样品的载体中，插入物及载体两者均包含EcoRI位置且代表重组质体。此分析显示基因复制是发生在SN4突变株中；因此，增进的C3降解活性可归因于SN4突变物中增加的降解C3蛋白质。
2338bp插入物的约1kb的序列是使用整个pLSN4a质体作为模板(template)而测得，以插入物(PCR产物)作为模板的剩下序列(约～1338kb)是以ICBR(佛罗里达大学)来定序，两个互补股被定序。此结果显示有相对位置的四个开放译读框架是提供于下列构图中
ORF1 ORF2 ORF3
(462bp) 144bp)(726bp)ORF4(358bp)5’___________________________________________________________________3”3’___________________________________________________________________5”在上述ORFs衍生的氨基酸序列及来自测试蛋白质资料库的蛋白质序列之间没有显著的同质性，编码本发明降解C3蛋白酶的ORF3核酸序列提供于图1A中且称为序列编号1(SEQ ID NO1)，此降解C3蛋白酶的氨基酸序列提供于图1B中且称为序列编号2(SEQ ID NO2)。
在插入物中四个开放译读框架(三个完整且一个部分)中，因为ORF3包含最大的插入物，故ORF3被选来进一步检测。ORF3(PCR产物)区域的一个620bp内部分(图1A中由核酸1246至核酸1863)被接合(ligated)至质体pVA891的Hind III位置，且此构筑体(construct)转形至CP 1200胜任细胞中以将蛋白酶活性去除。在使用西方印渍分析于SDS-PAGE上分离之后，测试转形细胞降解C3的能力，与其亲代株CP 1200相较，ORF3被破坏的突变株具有低活性。
ORF3基因(PCR产物)整个被转殖入pet-28b(+)的Nde I及BamH I位置中，载体在蛋白质N-端的位置有组氨酸标记(His-Tag)。在该质体构筑体被转形入大肠杆菌(BL21 DE3)蛋白质缺失株中以使蛋白质表现之前，其被转形至大肠杆菌(DHLαMCR)株以使其稳定。
包含此构筑体(具有ORF3的pet 28b(+))的BL 21 DE3株被诱导以使ORF3蛋白质表现，测试被诱导及未被诱导的培养物的总细胞蛋白质提取物的降解C3活性。来自不可溶蛋白质部分的被诱导样品中，于10％SDS-PAGE凝胶上表现的有His标记(His-tagged)的ORF3蛋白质为约～29ka(±5kDa)。
使来自诱导的BL21 DE3培养物的ORF3蛋白质溶解化，是通过将样品以下列方式处理而进行a)TES(50mM，1mM，1M)；b)6mM G-HCl+1mM DTT；c)6mMG-HCl+1mM DTT+1％Tween 20；以及d)6mM G-HCl+1mMDTT+1％TritonX-100。″c″处理是用来制造溶解化的重组降解C3蛋白质，以用于进一步的蛋白质研究中。
鸟嘌呤-HCl及DTT是由表现的有His标记(His-Tagged)的ORF3蛋白质样品中以透析法(dialysis)去除。将该蛋白质进行尼克氏管柱纯化(Nickel column)，且洗提出来的有His标记(His-Tagged)蛋白质可见于10％ SDS-PAGE凝胶上。
由ORF3所编码的分离蛋白质在PBS存在下于37℃以人类补体C3培养4小时。不含蛋白质样品的对照组样品作为负对照组以用于比较目的上，这些样品在还原条件下进行SDS-PAGE，并以西方印渍分析使用抗人类补体C3的多株抗体分析C3的结构。结果显示样品包括一种由ORF3区域所编码的蛋白质且此蛋白质会降解人类C3蛋白质，C3分子的α及β链均受到降解。在这些实验中，当α链完全被降解时，β链也会被降解，但至一较小的程度。
本发明降解C3的蛋白质称为CppA蛋白酶，且本发明的基因称为cppA。本发明的蛋白质于10％ SDS-聚丙烯酰胺凝胶上具有一明显分子量约29kDa(±5kD)，且最佳具有一分子量约24kDa至约34kDa。如上所述，实例5显示该蛋白酶在肺炎链球菌中具有保守性(conserved)，但是，一般熟悉该技术的人员将了解到氨基酸上的一些变化是可预期的，且此变化性并不应减少本发明的范围。举例而言，保守性突变(conserved mutations)不会减少本发明的范围，氨基酸序列相同性的变化也不会小于约80％氨基酸序列相同性且较佳约90％氨基酸序列相同性，其中此蛋白质可降解人类补体蛋白质C3，且特别是其中此蛋白质是由肺炎链球菌中分离出来或原先得到的。
因为有一些氨基酸的变化性，一些核酸序列的变化性被预期存于菌株间。保守性氨基酸取代在此技术中为已知的，且其包括例如使用来自与此氨基酸所属相同族的其他成员的氨基酸取代。举例而言，非极性(疏水性)氨基酸包括丙氨酸(alanine)、白氨酸(leucine)、异白氨酸、缬氨酸(valine)、脯氨酸(proline)、苯丙氨酸(phenylalanine)、色氨酸(tryptophan)以及酪氨酸(tyrosine)，极性的中性氨基酸包括甘氨酸(glycine)、丝氨酸(serine)、苏氨酸(threonine)、半胱氨酸(cysteine)、酪氨酸、天冬酰胺(asparagine)以及谷酰氨酸(glutamine)，带正电荷(碱性)的氨基酸包括精氨酸(arginine)、离氨酸(lysine)以及组织氨酸(histidine)，带负电荷(酸性)的氨基酸包括天冬氨酸(asparticacid)以及谷氨酸(glutamic acid)。这种改变不预期会影响以聚丙烯酰胺凝胶电泳或等电点所测定的明显分子量。特别较佳的保守性取代(conservative substitution)包括但非限于以Lys取代Arg及相反以保持一正电荷；以Glu取代Asp及相反以保持一负电荷；以Ser取代Thr以保持一游离的-OH；以及以Gln取代Asn以保持一游离的NH2。本发明的一个较佳蛋白质包括具有序列编号2的氨基酸序列的蛋白质，其他蛋白质包括那些降解人类补体蛋白质C3且具有编码在杂交条件下与序列编号1杂交的蛋白质的核酸序列的蛋白质，此杂交条件是在6X SSC、5X Denhardt、0.5％SDS以及100微克/毫升片段化且变性的鲑鱼精子DNA于65℃下杂交隔夜，且以2XSSC、0.1％ SDS在室温下清洗一次约10分钟，接着在65℃下清洗一次约15分钟，再后续至少一次以0.2X SSC、0.1％SDS于室温下清洗至少3至5分钟进行，且也涵盖于本发明中。该蛋白质的多肽类或肽类片段也可使用，且本发明的一较佳蛋白质包含序列编号2的氨基酸1至50。
本发明的蛋白质可分离或制备为重组蛋白质，也就是说，编码此蛋白质的核酸或此蛋白质部分的核酸可插入一表现载体中或插入一细胞的染色体中，以于细胞中表现此蛋白质。此蛋白质可由一细菌或其他细胞中纯化出来，较佳由一真核细胞以及更佳由一动物细胞中纯化，或者，此蛋白质可由表现此蛋白质的细胞(例如肺炎链球菌细胞)中分离出来。CppA蛋白酶的肽类也被包含于本发明中，该肽类较佳为至少15个氨基酸长，且较佳的肽类为具有来自序列编号2的至少15个氨基酸的肽类，另外较佳的蛋白质片段包括序列编号2的氨基酸1至50。
编码Cpp蛋白酶的核酸也是本发明的一部分。序列编号1是编码CppA蛋白酶的较佳核酸片段，一般熟悉该技术的人员将了解一些取代作用不会使CppA蛋白酶序列改变至CppA蛋白酶特性或本质有实质上改变的程度。举例而言，具有与序列编号1至少80％相同性的核酸也涵盖于本发明中。一种决定一特定核酸序列是否于本发明范围中的方法，是在于考虑是否有一特定核酸序列编码降解C3的蛋白酶及具有与序列编号1相较有至少80％的核酸相同性。其他编码CppA蛋白酶的核酸序列包括其中CppA有与序列编号2相同的序列或至少90％序列相同性的编码CppA的核酸，但其包括相关于核酸序列的简并性(degeneracy)。一个简并的密码子是表示有不同的三个字母的密码子用于界定相同的氨基酸，举例而言，此技术中已知下列RNA密码子(及因此相对的DNA密码子，其中一个T取代U)可互换以用于编码每一个特定的氨基酸
苯丙氨酸 (Phe或F) UUU或UUC白氨酸 (Leu或L) UUA，UUG，CUU，CUC，CUA或CUG异白氨酸 (Ile或I) AUU，AUC或AUA甲硫氨酸 (Met或M) AUG缬氨酸 (Val或V) GUU，GUC，GUA，GUG丝氨酸 (Ser或S) UCU，UCC，UCA，UCG，AGU，AGC脯氨酸 (Pro或P) CCU，CCC，CCA，CCG苏氨酸 (Thr或T) ACU，ACC，ACA，ACG丙氨酸 (Ala或A) GCU，GCG，GCA，GCC酪氨酸 (Tyr或Y) UAU或UAC组织氨酸 (His或H) CAU或CAC谷酰氨酸 (Gln或Q) CAA或CAG天冬酰胺 (Asn或N) AAU或AAC离氨酸 (Lys或K) AAA或AAG天冬氨酸 (Asp或D) GAU或GAC谷氨酸 (Glu或E) GAA或GAG半胱氨酸 (Cys或C) UGU或UGC精氨酸 (Arg或R) CGU，CGC，CGA，CGG，AGA，AGC甘氨酸 (Gly或G) GGU或GGC或GGA或GGG终止密码子 UAA，UAG或UGA此外，一特定的DNA序列可被修饰以使用较佳的密码子于一特定的细胞类型上，例如，用于大肠杆菌较佳的密码子为已知的，因为其为动物及人类较佳的密码子。这些改变对于一般熟知此技术人士而言为已知的，且因此这些基因序列被认为是本发明的一部分。其他核酸序列包括来自序列编号1的至少30个核酸长的核酸片段，或是其他至少30个核酸长的核酸片段，其中这些片段在杂交条件下与序列编号1杂交，此杂交条件是在6X SSC、5X Denhardt、0.5％SDS以及100微克/毫升片段化且变性的鲑鱼精子DNA于65℃下杂交隔夜，且以2X SSC、0.1％ SDS在室温下清洗一次约10分钟，接着在65℃下清洗一次约15分钟，再后续至少一次以0.2XSSC、0.1％ SDS于室温下清洗至少3至5分钟。
本发明的核酸片段可编码所有、无(如不能转录的片段、包含基因调节部分的片段、或类似物)或序列编号2的部分，以及较佳包括一个编码来自序列编号2的至少九个氨基酸的连续核酸片段。由于编码CppA蛋白酶一部分的核酸片段包含于本发明中，所以将了解的是并非所有的核酸片段会编码一具有降解C3蛋白酶的蛋白质、多肽类或肽类。此外，本发明的核酸可突变而使此蛋白质降解C3的活性去除或者失活，因此，上述符合杂交需求的不具有降解C3活性的片段也涵盖于本发明中。使核酸序列突变或者改变的方法于此技术中已被详细叙述，且可测试制造一免疫原性(immunogenic)但酵素活性失去的蛋白质的治疗效用，较佳的核酸片段包括gct ccc agtatg(权利要求34)。
本发明的核酸片段可被插入核酸载体中或稳定插入宿主基因组中以制造重组蛋白质，包括重组混杂性(chimeric)蛋白质。许多的核酸载体于此技术中为已知的，且包括一些商业上可获得的表现质体或病毒载体。这些载体的使用是在一般此技术所熟知的范围内，代表性载体被使用于实施例中，但是不应认为在限制本发明范围。
本发明也关于可专一性与来自肺炎链球菌约29kDa、且较佳为约24kDa至约34kDa的蛋白质结合的抗体，且其中该蛋白质可较佳地降解人类补体C3。多株抗体可制备为该蛋白质一部分或该蛋白质全部。类似地，单株抗体可制备为本发明降解C3约29kDa蛋白质的全部或骕类片段。制备抗蛋白质的抗体的方法是已知且已被详细叙述的，举例而言，如Harlow等(supra)所述。在一个较佳实施例中，抗体可源自于人类、大鼠、老鼠或兔子，结合蛋白质的抗体片段及混杂性片段是已知的且在本发明的范畴中。
本发明也关于刺激免疫的组成物的用途。″刺激免疫″或″刺激免疫系统″一词是指根据本发明的蛋白质或肽类组成物会活化至少一种细胞类型的免疫系统。免疫系统的较佳活化细胞包括吞噬细胞，例如巨噬细胞、以及T细胞及B细胞。包含本发明肽类、多肽类或蛋白质的刺激免疫组成物可用于在动物中制造抗体，例如大鼠、老鼠、兔子、人类或动物模型，以研究肺炎链球菌的感染。较佳的刺激免疫组成物包括一刺激免疫量的至少一种包含来自CppA蛋白酶至少15个氨基酸的酶类，刺激免疫组成物进一步包括于一医药上可接受的缓冲液中的其他蛋白质，例如PBS或此技术中认知的另一种缓冲液，适合及安全用于将蛋白质导入一宿主以刺激免疫系统。这种刺激免疫的组成物也可包括其他刺激免疫系统的蛋白质，例如佐剂或来自肺炎链球菌或其他生物的刺激免疫的蛋白质或肽类片段，举例而言，肽类片段的混合物(cocktail)可最有效用于控制肺炎链球菌感染。较佳的是，本发明蛋白质的一个或更多个片段被用于疫苗制剂中，以保护免于或限制肺炎链球菌形成菌落(colonization)或肺炎链球菌形成菌落的致病结果。
本发明也关于一种抑制肺炎链球菌所介导的C3降解作用的方法，其包括使肺炎链球菌与一蛋白质接触，该蛋白质例如可与来自肺炎链球菌的约24kDa至约34kDa分离蛋白质结合的抗体或其他蛋白质，可与约24kDa至约34kDa分离蛋白质结合的蛋白质可为一种抗体或其片段，或者该蛋白质可为一种包含来自抗体的抗体结合区域(例如可变区域)的混杂性蛋白质，该抗体可专一性确认来自肺炎链球菌且具有降解C3活性的约24kDa至约34kDa分离蛋白质。
本发明分离的肺炎链球菌蛋白质可被分离及纯化，且分离的蛋白质或其免疫原性片段可用于制造抗体。可测试不具降解C3活性的此蛋白质肽类片段或多肽片段对限制肺炎链球菌感染影响的能力。类似地，可改良本发明的蛋白质，例如经由突变来中断或使蛋白质降解C3的能力失活。分离的蛋白质可用于分析中以侦测抗肺炎链球菌的抗体，或作为用于肺炎链球菌疗法的疫苗一部分或是含有多价或多蛋白质或肽类的疫苗。
进一步考虑的是，本发明的蛋白质可表现于脊椎动物细胞表面上且用于降解C3，举例而言，其中补体沉积(或活化)成为一问题，例如于异种器官移植(xenotransplantation)或补体所介导的血管球性肾炎(glomerulonephritis)。举例而言，重组的蛋白质或其部分可并入异种移植细胞中且以一表面蛋白质表现，或作为一分泌蛋白质以预防或使补体沉积减至最少(及/或补体介导的发炎反应)。
实例1产生插入性复制突变株及由选择的突变株中回复重组质体在一个较佳实施例中，是利用插入性复制突变来分离编码本发明的来自肺炎链球菌降解C3蛋白酶的基因。一质体库是以最初得自伊利诺大学芝加哥分校的莫里森博士(Dr.Morrison)实验室的肺炎球菌株CPl200(RXl的衍生物；Morrison，D.A.等J.Bacteriol.，156281-290，1983)的0.5至4.0kb染色体片段而构成，且插入往返载体(shuttle vector)pVA891的BamHI位点(erm′，cm′，Marcina，F.L.等Gene 25145-150，1983，得自Virginia Commonwealth University，Richmond，VA的马西那博士(Dr.Marcina))。pVA891具有红霉素(erm)及氯霉素(cm)抗性标记，此载体具有大肠杆菌的复制起始点(origin of replication)，但该起始点在链球菌中为非复制性的。当重组质体经由同源性重组作用而并入肺炎球菌染色体DNA内时其可存活。
大肠杆菌DH5(MCR胜任细胞是根据Bio-Rad Laboratories manual(Richmond，CA)所提供的程序制得，且以Bio-Rad Gene Pulser装置(Bio-Rad Laboratories，Richmond，CA)将DNA库转形入胜任细胞中。
大肠杆菌细胞是于有10％甘油存在下的LB培养基中，以小量冷冻储存物在-80℃保存，细胞生长于含有适当抗体(红霉素200微克/毫升或氯霉素15或30微克/毫升或卡那霉素(kanamycin)30微克/毫升)的LB或TB培养液(broth)中或在LB琼脂培养基上。
电击穿透法(electroporation)是在1至2kV/cm电压及200(电流容量下于0.1公分的小管(cuvette)中进行。转形细胞是在含有氯霉素(cm，30微克/毫升)或红霉素(erm，300微克/毫升)或erm及cm的结合(200微克/毫升+15微克/毫升)的LB培养基上筛选。
由该资料库(library)中得到总共14000个大肠杆菌转形细胞，随机筛选的大肠杆菌转形细胞的质体抽取及限制酶分析显示重组质体的存在。
以聚乙二醇沉淀程序(Kreig，P.及Melton.D.，in Promega Protocol and Applicationsp.106，1985-86)或改良的碱性溶解少量制备步骤(Xiang，C.等，Biotechniques.1730-32，1994)或改良的碱性抽取程序(Bimboimm H C及J.Doly.，Nucl.Acids Res.71513-1523，1979)或CsCl-溴化乙锭(ethidium bormide)梯度方法或Qiagen套组(Kit)(Plasmidmidikit，Chartsworth，CA)由大肠杆菌株中抽取质体或重组质体。含有DNA的溶液是直接以GeneClean II套组(BIO 101，La Jolla，CA)或Qiagen套组(由凝胶中抽取DNA，Chartsorth，CA)由琼脂凝胶(agarose gel)中清洁。DNA是以Wizard DNA清洁套组(Promega Corp.，Madison，WI)，放大的基因产物也以Wizard PCR清洁套组(PromegaCorp.，Madison，WI)来清洁。
此等质体转形至肺炎球菌细胞中，肺炎球菌株一直于10％甘油存在下的THB中以小量冷冻储存物在-80℃保存，肺炎球菌细胞在CAT培养基(Morrison，D.A.，etal.，1983，supra)或THB培养基(培养液或琼脂)中生长而不须摇瓶。在转形实验上，使用完整转形(CTM)培养液(Morrison，D.A.等，1983)或THB+0.5％酵母菌培养液(Yeastbroth)(Yother Janet.等J.Bacteriol.1681463-1465，1986)，及在ELISA实验上，使用SMP，即一种合成培养基(参见表1)。使用红霉素(0.05微克/毫升)作为肺炎球菌突变株的选择性抗生素。
表1.SMP-合成培养基SMP溶液#1(最终体积2公升)NaCl 10.0克；NH4Cl 4.0克；KCl 0.8克；Na2HPO4 0.24克；MgSO4 0.048克；CaCl2 0.020克；FeSO4.7H2O 0.0001克；Tribase 9.68克；加入蒸馏水至1公升，pH值为7.55，且接着加入下列氨基酸L-精氨酸400毫克；L-天冬氨酸20毫克(单水合物22.8毫克)；甘氨酸240毫克；L-组织氨酸300毫克；L-异白氨酸13.10毫克；L-白氨酸13.10毫克；L-离氨酸840毫克；L-甲硫氨酸360毫克；(低甲硫氨酸2.6毫克)；L-缬氨酸11.70毫克；尿嘧啶2毫克，使得最后体积2毫升。
SMP溶液2(维生素)生物素(biotin)0.075毫克；胆碱(choline)25毫克；尼古丁酰胺(nicotinamide)3.0毫克；泛酸盐(pantothenate)12.0毫克；钉哆醛(pyridoxal)HCl 3.0毫克；核黄素(riboflavin)1.5毫克；维生素B1(thiamine)3.0毫克；L-半胱氨酸HCl 0.5克；L-谷酰氨酸0.1克；乙酰甲酸钠(Na pyruvate)4.0克；加入水且接着达到50毫升。
再组成SMP开始以 毫升溶液#1 100加入溶液#2 1溶液#3(25％葡萄糖) 1.6溶液#4(4％BSA) 2肺炎球菌株CP 1200细胞以″以pH变化的胜任性诱导(competence induction)″(得自Dr.Morrison的实验室，伊利诺州伊利诺大学芝加哥分校)于CTM培养基中成为胜任的，且胜任细胞是以小量冷冻于-70℃，直到需要时。在此程序中，加入1.20毫升的1M HCl(最终浓度9mM)及4毫升的0.2 O.D.(550nm)的冷冻肺炎球菌储存细胞于125毫升的CTM中。培养物是在37℃培养且培养物的O.D.数值是在培养3小时后开始的20分钟间隔读取，当培养物达到O.D.值0.156(550nm)时，1.2毫升的1NNaOH在37℃加入。在温和混合培养物之后，1毫升的培养物是以″0″时间点样品被移开、以100微升的甘油混合且保留在预冷却的金属块(block)上。相似地，10毫升样品是在每13、17、21及25分钟的时间点取出且每一个样品直接加入预冷却的1毫升甘油中，每一时间点的样品是以小量于-70℃冷冻。每一时间点的样品的相容性测试是通过加入1微克的DNA(约250毫微克)至100微升的细胞且培养于37℃ 25分钟以转形而进行。转形培养物被稀释且使其在选择性培养基(红霉素0.05微克/毫升)上生长，使用显示最高转形功效的时间点样品未来的转形实验。由大肠杆菌转形细胞抽取出来的重组质体资料库(library)被转形至肺炎球菌株CP1200中得到约8,000个肺炎球菌转形细胞，显示此质体经由同源性重组作用而插入CP 1200染色体中。
肺炎球菌染色体DNA的抽取是以伊利诺大学芝加哥分校的Dr.Donald A.Morrison实验室所使用的方法稍微改良而进行。肺炎球菌细胞生长于THB中使在550nm的O.D.值达到0.3至0.4间，接着快速冷却于冰上且加入0.5M EDTA至最后浓度为10mM，使细胞在4℃以10,000g旋转10分钟，且片状物(pellets)在1∶10体积的冷STE(50mM Tri-HCl(pH 8.0)，10mMEDTA(pH8.0)及0.1M NaCl)中再悬浮，在第二次离心之后，细胞在1/100体积的冷STE中再悬浮，以1％TritonX-100溶解，且在37℃培养5至10分钟以自我分解(autolysis)。在加入1％ SDS之后，细胞在50至60℃的水浴中旋转5分钟。RNase(100微克/毫升)及蛋白酶K(50微克/毫升)分别培养2小时及1小时连续加入。细胞以一个体积的酚/氯仿抽取两次，且以一个体积的氯仿抽取一次，并将上清液收集以进行乙醇沉淀，沉淀物以70％乙醇清洗两次，且收集片状物(pellet)并再悬浮于TE(10mM Tris-HCl pH 8.0，1mM EDTA)或如需要时水中。
质体资料库(library)DNA是由收集的大肠杆菌转形细胞中以聚乙二醇沉淀程序(Kreig.P.及Melton.D.1985 supra)来抽取，且依照得自伊利诺大学芝加哥分校的Dr.Morison的方法用于转形至CP 1200(即亲代肺炎球菌)。在肺炎球菌转形作用上，冷冻的肺炎球菌胜任细胞在冰上融解，且在100微升的这些胜任细胞中加入200毫微克至1000毫微克的质体库于一不同的离心小管中。此管在37℃于水浴中培养约25至35分钟，且混合物稀释1/10于CAT培养基中并进一步培养约1至1.7小时。在最后培养之后，混合物以覆盖(overlay)程序倾倒培养(方法得自Dr.Morison，伊利诺大学芝加哥分校)，此覆盖程序包含倾倒四种不同的琼脂层(THB或CAT)于一小培养基上，如下列a)第一或基底层3毫升的琼脂；b)第二或细胞层1.5毫升的琼脂及1.5毫升含有所需浓度的细菌细胞的培养液(broth)；c)第三层3毫升的琼脂；d)第四层或顶层3毫升含有4倍所需浓度的抗生素(红霉素，0.05微克/毫升x4＝6微克/毫升)的琼脂，这些培养基在37℃培养。以刺入接种将各别的转形细胞转移至含有100微升的THB及红霉素(0.05微克/毫升)的微量培养板(microtitre plates)的各别凹槽(well)中，在微量培养板中回复的转形细胞在SMP培养基中稀释1∶10且使其生长至早期的对数期，并以ELISA筛选其等降解C3的能力。
重组载体的自然切割是以低频率发生在这些类型的肺炎球菌突变株中，因此，这些突变株的染色体DNA制剂常包括低含量的质体DNA(Pearce B J.等，Mol.Microb.9(5)1037-1050，1993)。大肠杆菌的电击穿透法(electroporation)为一种分离大肠杆菌中质体构筑体的高效率方式以进一步研究，由有兴趣的各别肺炎球菌突变株中而来的染色体DNA(最终体积2微升中100毫微克至200毫微克)被电击穿透至大肠杆菌DH5(MCR胜任细胞中，以得到具有重组质体的大肠杆菌转形细胞。一个回复的重组质体(pLSN4a)(参见表2)以转形作用被重新导入野生型CP 1200肺炎球菌株中，再次以ELISA评估转形细胞SN4-4G降解C3的活性。
DNA片段是以含有Tris-硼酸盐EDTA(TBE)缓冲液或Tris-乙酸EDTA(TAE)缓冲液(Sambrook，J.E.Fritsch及T.Maniatis，1989)的琼脂糖凝胶(0.5％至1.0％)上水平式电泳(horizontal electrophoresis)来分析。使用来自GibcoBRL的1kb梯度(ladder)或来自Boehringer Mannheim的HindiIII或HindIII/EcoRI切割的(DNA作为分子量标准。
得自Gibco BRL Life Technology，Grand Island，N.Y.，Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN.，Promega Corp.，Madison，WI.，Bethesda Research Laboratories，Gaithersburg，MD.，或New England Biolabs.，Inc.，Beverly，MA.的限制内核酸酶、牛肠磷酸酶(phosphotase)及T4 DNA接合酶(ligase)是以制造商说明而使用。
DNA片段是以南方杂交法(Southern hybridization)来分析，DNA是由凝胶转移至MSI Magnagraph尼龙膜(Micron Separation，Inc.，Westboro，MA)上以进行杂交及使用Genius非辐射性DNA标记的侦测以及侦测套组(Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN)，其依照套组所提供的说明进行。来自肺炎球菌或大肠杆菌培养物的染色体或质体DNA是以先前段落所叙述的方式分离出来，约100毫微克至400毫微克的每一个样品是以所需的限制酵素切割且在0.7％琼脂糖凝胶上进行，并转印(transblotted)至Magnagraph-尼龙膜上隔夜，其余程序是以制造商所指示来进行。
使用于此实例及后续实例的细菌菌株及质体简述于以下表2中。
表2.细菌菌株以及质体构筑体宿主 质体或 大肠杆菌中回复的菌株或转形细胞 质体或构筑体的菌株 构筑体 重组质体代号(具有质体) 代号及变异体大肠杆菌DH5αMCR pVA891质体 DH-pVA89 pVA 891大肠杆菌DH5αMCRpVA891∷插入物3 LSN3 pLSN3大肠杆菌DH5αMCRpVA891∷插入物4 LSN4 pLSN4大肠杆菌DH5αMCRpVA891∷插入物5 LSN5a pLSN5大肠杆菌DH5αMCRpVA891∷插入物6a.b LSN6a.b pLSN6a-c大肠杆菌DH5αMCR pVA891∷ORF3a**DH-pVA/ORF3a**PVA-ORF3a**大肠杆菌DH5αMCR pET28(+)∷ORF3a*DH-pET/ORF3 PET-ORF3大肠杆菌BL 21 DE 3 PVA 891质体BL-pVA891 pVA891大肠杆菌BL 21 DE 3 pLSN4 BL-pLSN4 pLSN4大肠杆菌BL 21 DE 3 pET 28(+)∷ORF3*BL0pET/ORF3*pET-ORF3*肺炎球菌突变株 插入的重组质体 突变株代号回复的重组质体代号肺炎链球菌CP 1200 pVA891∷插入物3 SN3 pLSN3肺炎链球菌CP 1200 pVA891∷插入物4 SN4 pLSN4肺炎链球菌CP 1200 pVA891∷插入物5 SN5 pLSN5肺炎链球菌CP 1200 pVA891∷插入物6a.b SN6 pLSN6a-c肺炎链球菌CP 1200 pLSN4 SN4-4GpLSN4-4G肺炎链球菌CP 1200 pVA891∷ORF3a**SN4-S10a，这些是以肺炎球菌株CP1200的任意染色体片段构筑，接合至往返载体pVA891的Emr决定部位，且转形至CP1200，以作为插入性复制突变的目的。b，插入的质体是来自叙述于内文中有兴趣的肺炎链球菌突变株且于大肠杆菌中回复。参见表3中来自每一个肺炎链球菌突变株所回复的重组质体的不同变异物的详述。
*，cppA基因。*，620bp，一种cppA基因片段。
实例2具有改变降解C3活性的突变株的鉴定以ELISA筛选各别肺炎球菌转形细胞的改变降解C3活性，使肺炎球菌转形细胞各别生长于微量滴定平盘中存在红霉素(0.05微克/毫升)的THB中至达到对数期，且稀释1/0于SMP培养基(0.05微克的红霉素/毫升)中，此SMP细菌培养物生长至对数期且以C3(0.83微克C3/毫升培养物)来培养2至4小时，在以C3培养之后，100微升的每一个各别的转形细胞被转移至ELISA结合平盘上且在4℃培养隔夜，平盘以PBS(10(M磷酸缓冲溶液盐水+0.05％ Tween-20)清洗三次。100微升对于人类补体C3有专一性的HRP结合羊多株抗体(48毫克/毫升稀释1∶10000)被加入每一凹槽中，且平盘在37℃培养一至二小时，每一微量滴定平盘如上述以PBS清洗。100微升的30％OPD(于30毫升柠檬酸缓冲溶液(200mM Na2HPO4及100mM柠檬酸-pH 5.0)的12毫克O-次苯基二胺(Zymed，SouthSan Francisco，CA)及12微升的H2O2)加入每一个凹槽中，且平盘在黑暗中培养30分钟。反应是在加入50微升的2.5M H2SO4至每一凹槽中而停止，样品中所留存未降解C3的量是由对人类补体C3具专一性的结合HRP羊多株抗体来侦测。将此分析标准化以使含有为降解C3的凹槽具有O.D.490＝～1.0，含有降解C3的凹槽由于对抗C3抗体结合性的降低而具有降低的光学密度读值。将突变株及亲代株与负对照组(有不同浓度C3的培养基)的光学密度相比较来计算降解C3活性的百分率，四个具有提高降解C3活性(2.2倍-表3)的突变株SN3，SN4，SN5及SN6与亲代株CP 1200的活性比较，后续以对肺炎球菌突变株SN4的西方免疫印渍法来确认此发现，SN4-S10(具破坏的cppA基因)也是具有降低的降解C3活性的CP 1200突变株。
表3.以肺炎球菌亲代株及高活性突变株进行C3降解作用的ELISA结果菌株 在490毫微米的*每一个样品或对照组的ELISA读值 C3降解百分率**负对照组 0.608 0％CP1200(亲代) 0.30 51％SN3(突变株)0.20 67.2％SN4(突变株)0.162 73.4％SN5(突变株)0.23 60.0％SN5(突变株)0.23 60.0％*不同时间点进行最少四个各别实验的平均值**负样品是仅含有C3且不含细菌细胞的培养基(THB或SMP)使用ECL西方印渍步骤(Amersham Life Sciences，Arlington Heights，IL)进行免疫印渍法。有或无质体的肺炎球菌突变株或大肠杆菌培养物是来自冷冻储存培养物且生长于THB或LB直到达对数期，并以C3(0.83微克的C3/毫升)培养2至4小时。培养物经旋转离心(在4℃以3,500rpm离心15分钟)且收集上清液，在培养物以C3培养之前，小心监控培养物的光学密度且将样品平均化(equalized)，将相等量的所有收集到含有未降解C3的上清液在还原状况下施用于7.5％或10％的SDS-PAGE凝胶上，使凝胶转印(transblotted)至硝化纤维膜(75伏特；4℃)进行一小时，在此实例及在后续实例中蛋白质以Hoeffer转移装置于Towbin缓冲液(1公升体积pH 8.3的3.03克Tris，14.4克甘氨酸以及200毫升甲醇；Towbin等(1979)PNAS4350-4354))在70伏特进行1小时由凝胶被转移至硝化纤维膜，或凝胶以于50％甲醇及10％乙酸中制备的0.125％考马斯亮蓝(Coomassie BrilliantBlue)R-250(Pierce，Rockford，IL)来染色。
印渍(blot)是以轻微摇动培养于10％脱脂牛乳(脱脂牛乳粉)中1小时(室温)或隔夜(4℃)，将此印渍在TTBS(0.1％ Tween，20mM Tris，137mM盐水缓冲液)中清洗数次，且以轻微摇动培养于3X TTBS+3％BSA中制备的1∶1000稀释液的结合HRP羊抗人类C3多株抗体，IgG部分(ICN Pharmaceuticals/Cappel，Costa Mesa，CA)来培养，此培养的印渍再次于TTBS中清洗数次且在化学发光试剂(1∶1比例的2X胺基苯二酰胼(luminol)/促进剂及2X稳定的过氧化氢溶液，Pierce，Rockford，IL)中培养1分钟，此印渍在黑暗中暴露于底片且使底片显影。SDS-PAGE凝胶总是含有预染色的范围在200kd至19kd的高分子量标记(Bethesda Research laboratories，Life Sciences，GrandIsland，NY)，除非另外言明时，清洗及培养是在室温以轻微摇动进行。
将来自过度活性的肺炎球菌突变株SN3，SN4，SN5及SN6的染色体DNA电击穿透至大肠杆菌DH5(MCR胜任细胞，会得到具有回复重组质体的大肠杆菌转形细胞。大肠杆菌DH5(MCR转形细胞，LSN3，LSN4，LSN5，LSN6，LSN4G含有质体(由表2的肺炎球菌突变株，分别为SN3，SN4，SN5，SN6及SN4-4G突变株)，含有不同构筑体的大肠杆菌的详细资料列于表2中(supra)。限制分析(HimdIII)显示插入物确实为重组质体，不同大小的重组质体是得自每一个过度活性的肺炎球菌突变株。回复自突变株SN3及SN4的重组质体pLSN3及pLSN4为相同的大小(～7.8kb)且其等插入物大小为～2.4kb，得自肺炎球菌突变株SN5的～11kb的重组质体pLSN5的插入物大小为约5.6kb。第四个肺炎球菌突变株SN6得到两个分别具有1.1kb及5.1kb插入物的～6.5kb及～10.5kb的不同重组质体pLSN6a及pLSN6b。这些肺炎球菌突变株也以南方杂交法来检测，过度活性的肺炎球菌突变株SN4被选择来进一步研究C3的降解作用，且因此完全检查回复自(rescued)突变株SN4的重组质体pLSN4。
使用质体pLSN4作为一种对抗肺炎球菌突变株受到EcoRI切割的染色体DNA样品的探针，且此确认了突变株SN3及SN4中载体+插入物(pLSN4)的并入，SN3及SN4过度活性的突变株包括两个大小为～2.2kb及～5.8kb的杂交片段，该等两片段也存在于亲代株CP 1200中。两个其他的杂交载体/插入物连接片段为～4.2及～3.5kb且这两个片段一起总共为～7.8kb(pLSN4为～7.8kb)。这两个条带(bands)也存在于EcoRI切割的pLSN4 DNA样品中，插入物及载体两者均有EcoRI切点且代表重组质体。其他过度活性的突变株SN5及SN6的模式显示这些突变株可能在其等并入的重组质体中有不同插入物。
使用相同的质体pLSN4来转形至亲代肺炎球菌株CP1200中，以确认其有关过度活性(hyperactivity)。如所预期的，得到的突变株SN4-4G(表2)复制增进C3降解的表现型。
实例3降解C3基因的分离及鉴定进行对重组质体pLSN4插入部分的双股DNA序列分析。由于此插入物与降解C3的过度活性有关，故预期插入物可见于相对基因的调控区域或基因的复制上，但是，基于蛋白质资料基础搜寻，未显示调控区域中有插入，此建议基因复制的可能性。有三个完整的开放译读框架(ORFs)及一个部分开放译读框架在上述ORFs与GenBank，Blast and SwissProt资料库搜寻所提供的蛋白质的衍生氨基酸间不具有明显的同质性。初步资料(CathrynA S等，J.Inf.Dis.170600-608，1994)显示降解C3的蛋白酶可能与细胞壁相关(输出蛋白质)，且因而寻找讯息序列(signal sequence)，即富含脯氨酸区域或LPXTG域(motif)的存在。四个ORFs皆不具有这些序列模式，并选择ORF3(最大的ORF)以进一步分析。
使用CsCl梯度/溴化乙锭分离来制备质体pLSN4a的双股DNA，并作为模板(template)，寡核苷酸引子(primer)是以施用的Biosystems 391自动合成仪(Gibco BRL)或以Oligo 1000M DNA合成仪(Beckman Instruments Inc.La Brea，CA)来合成，使用双脱氧链中止方法(dideoxy chain terminatormethod)(Sanger F.等，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)821074-1078，1977)以及使用Sequenase2.0(U.S.Biochem)及[(-35]dATP(Amersham Life Sciences，ArlingtonHeights，IL)定序法，是以如Sequenaseversion 2.0(Amersham life sciences)所示的装置20110 Macrophor Electrophoresisunit(LKB Bromma)来进行。
回复自过度活性的肺炎球菌同源性重组突变株SN4的重组质体pLSN4中插入物(参见图3)在测试的20个酵素中似乎有Hinc II，Ntu I，EcoR I，Cla I，EcoR V及Hpa I的限制酶切点，且此数据与序列资料相关联。
在审视序列资料之后，cppA基因的内部片段620bp(插入物的ORF3)是由含有Hind III限制酶切点的基因放大法(参见表2的引子)产生。此片段被次转殖(subcloned)至载体pVA891的HindIII位点、电击穿透送至大肠杆菌中且测试此插入物的存在。最后，将次转殖体(subclone)转形至野生型CP 1200肺炎球菌胜任细胞中，以使野生型CP 1200中原来的cppA基因失活。
使用与所需DNA片段5′及3′端互补的引子(参见表4中引子序列及放大周期条件)的Hybaid Omnigene机器进行DNA放大作用，所有引子被构筑为两端上包含限制酶切点。放大反应(最终体积0.1毫升体积)使用10微升的10X vent缓冲液(最终浓度，1X包含10mM KCl，10mM(NH4)SO4，20mM Tris-HCl(pH8.8，25℃)，2mM MgSO4，0.1％ Triton X-100)，4微升的100mM MgSO4(最终浓度4mM)，3微升的10mMdNTPs(最终浓度300(M)，50毫微克的模板(template)，1(M引子(primer)以及1微升2000单位/毫升的vent聚合酶(最终浓度2单位；酵素是施用于10mM KCl，0.1MEDTA，10(M Tris-HCl(pH 7.4)，1mM DTT，0.1％Triton X-100)于加入水的最终体积100微升。Vent缓冲液，vent聚合酶酵素以及MgSO4是购自New England Biolabs，MA且dNTPs是购自Gibco BRL。
表4.引子的序列以及基因放大周期条件放大的基因片段及大小(kb) 引子的序列*pLSN4插入物(～2.338kb) PCR-1(LSN4a-L)CAG GAA GCT TGA TCT TGA AAT TTC TAT GAC TCC(SEQ ID NO3)PCR-1(LSN4a-R)CGA GAA GCT TGA TCC TGT CGA AAT CAA AGC AGG ACG(SEQ ID NO4)*ORF3a(～0.62kb)左PCR-2CAG GAA GCT TTG AAA CAA TTT ATA TTG AAA CCC(SEQ ID NO5)(cppA的内片段) 右PCR-2CGA GAA GCT TCA AGG AAG AAT TTT TCA GAC TTA GG(SEQ IDNO6)*ORF3(～0.726kb)左PCR-4GGG GAA TTC CAT ATG AAT GTA AAT CAG ATT GTA CGG(SEQ ID NO7)(cppA基因) 右PCR-4CGC CGC GGA TCC TCA TAC TTC TTC AAA CCA CAA TTC(SEQ ID NO8)放大周期的条件 pLSN4插入物(～2.338kb) ORF3a(～0.62kb) ORF3(～0.720kb)变性(Denaturing)98℃，3分钟，1个周期 98℃，3分钟，1个周期 98℃，3分钟，1个周期变性 94℃，30秒94℃，30秒黏接(Annealing)53℃，30秒3个周期 59℃，30秒3个周期延长(Extension)72℃，45秒72℃，54秒变性94℃，30秒 94℃，30秒94℃，30秒黏接(Annealing) 55℃，30秒5个周期 53℃，30秒3个周期 59℃，30秒3个周期延长(Extension) 72℃，45秒 72℃，45秒72℃，54秒完成维持72℃，5分钟，1个周期 72℃，5分钟，1个周期 72℃，5分钟，1个周期*pLSN4，一种回复自过度活性的肺炎链球菌突变株SN4的重组质体会参见前述的表及内文)；其为完全定序的；ORF3，称为cppA，是一种存在于pLSN4且编码降解C3蛋白酶的插入物的开放译读框架之一；ORF3a是cppA(ORF3)基因的内部分，其用来在亲代肺炎球菌株CP1200中破坏cppA(ORF3)基因。
其他序列是以Applied Biosystems Model 373a DNA定序仪(sequencer)(DNASequencing Core Facility，Interdiseiplinary Center for Biotechnology Research(ICBR)，University of Florida，Gainesville，FL)经由萤光定序法来产生。Robotlo Workstation(ABI Catalyst 800)以及Perkin Elmer-CetusPEC 9600热循环机(thermocycler)用于周期定序反应中。模板，即代表来自质体pLSN4a的全部插入物的放大基因产物，是在其用于自动化定序之前以Qiagen套组(kit)直接由0.7％琼脂凝胶上洗涤。定序分析是根据GCG软体组package中可知的计划(fasta，blast及其他计划)来进行。
实例4降解C3蛋白质的分离及研究过度活性的突变株及其等亲代株的对数期培养物以C3培养2至4小时，且培养物的悬浮液于还原条件下在7.5％ SDS-PAGE凝胶上进行电泳，并使用对抗C3的结合HRP多株抗体的免疫印渍法来检测其等降解C3的活性。此实验结果证实突变株SN4及SN4-4G(以回复自SN4的重组质体pLSN4再转形至CP 1200中而得)具有比亲代株CPl200有降解C3更高的活性。在突变株培养4小时后C3的(及(链两者几乎完全被降解，而亲代株的降解作用则不完全。CppA蛋白质似乎较佳降解C3的α链。
cppA基因的620bp内部分被接合至pVA891的Hind III切点上，且构筑体被转形至CP 1200胜任细胞中。测试所得到转形细胞降解C3的能力，是通过SDS-PAGE及西方印渍分析与亲代株CP 1200比较，发现ORF3突变株具有不良的活性，C3分子的α链被降解而β链则降解较少。突变株中的活性降低而非活性完全丧失显示突变株有另一个编码对另外降解C3蛋白酶具完全功能的基因存在的可能性。
全部的cppA基因被放大且转殖入pet-28b(+)的NdeI及BamHI切点(Novagen，Inc.Madison，WI)上，并将其N端区域的组织氨酸标记(His-Tag)并入此基因中。如以序列分析来确认，全部基因在载体上的边缘位置(in frame)，使质体构筑体转形至大肠杆菌DH5α MCR株以使其稳定化，且插入物的存在是在该载体及插入物转形至大肠杆菌BL21 D3 (Novagen)蛋白酶缺失株中表现之前确认，含有该质体构筑物的菌落是在含有卡那霉素(kanamycin，30微克/毫升)的LB培养基上选择。
蛋白质的分离是根据Pet System Manual(Madison，WI)以小规模或大规模制备。含有此构筑体(pet 28b(+)∷ORF3(cppA基因))的BL21 DE3菌株是以IPTG诱导，且表现蛋白质CppA被溶解。为进行溶解作用(solubilization)，将被诱导的细胞培养物离心且片状物(pellet)再悬浮于TES(50mM Tris；1mM EDTA；100mM NaCl)中，使此再悬浮液于冰上进行超音波振荡(6×15秒脉冲，于高输出设定约50瓦特)，且快速使之旋转以收集片状物，此片状物在TES(50mM Tris；lmM EDTA；100mM NaCl)中清洗两次，并在最后以6mM G-HCl+1mM DTT+1％Tween-20于4C处理此片状物3小时。
被溶解的蛋白质于TTS(1％Tween，50mM Tris，0.7M NaCl)中稀释1∶10对TTS(1％ Tween，50mM Tris，0.7M NaCl)进行透析，以去除G-HCl、DTT及EDTA。使用Pet系统手册说明(Novagen，INC.Madison，WI)，透析后的CppA蛋白质是以尼克氏(Nickel)管柱层析来纯化。倾倒尼克氏(Nickel)管柱(2.5毫升)，且在去除G-HCl、DTT及EDTA后，将表现的有组织氨酸标记(His-Tagged)的CppA蛋白质施用于Nickel管柱上以纯化。洗提(eluted)出来的部分是由10％SDS-PAGE凝胶及考马斯亮蓝(Coomassie Brilliant Blue)R-250染色来测试His-Tagged CppA蛋白质。在需要之前，该蛋白质保存于4℃冰上或以小量冷冻于-80℃。
CppA蛋白质(反应混合物中约600毫微克/毫升)是以人类补体C3(每毫升反应混合物中0.83微克的C3)在37℃及PBS存在下培养4小时，并同时设定不含蛋白质的负对照组，样品在还原条件下于7.5％或10％SDS-PAGE凝胶上及西方印渍法(ECL西方印渍程序-Amersham Life Sciences，ArlingtonHeights，IL)分析。
如上所述，所有ORF3基因的PCR产物被次转殖到氨基端位置内有组织氨酸标记(His-tag)的pet载体pET28b(+)(Novagen，Madison，WI)中，且此构筑体在大肠杆菌DH5(MCR中稳定化后被导入蛋白酶缺失株大肠杆菌BL21 DE3(表2)。使具有此构筑体的大肠杆菌BL21 DE3受到IPTG的诱导。测试被诱导及未被诱导的培养物的总细胞蛋白质抽取物，于10％SDS-PAGE凝胶上鉴定出表现的有组织氨酸标记(His-tagged)的ORF3蛋白质(～29kd)于该被诱导蛋白质样品的不可溶部分中。
稳定作用上，是使用下列试剂在4℃进行三小时或室温进行一小时TES(50mMTris，1mM EDTA，1 MNaCl)；(b)6mM G-HCl+1mM DTT；(c)6mM G-HCl+1mM DTT+1％ Tween 20；(d)6mMG-HCl+1mM DTT+1％ TritonX-100。″c″及″d″两种处理使在10％SDS-PAGE凝胶上观察到表现的蛋白质为可溶性。选择以″c″试剂的处理为后续大规模的制备，溶解的蛋白质被透析，接着经由Nickel管柱被纯化，且检测其对抗C3的功能。
对用于此实例及上述中的SDS-PAGE凝胶而言，总细胞蛋白质或可溶性蛋白质部分是根据Pet系统手册(Madison，WI)而抽取。这些蛋白质是由Laemmli的非连续系统(Laemmli，U.K.，Nature 227680-685，1970)中的SDS-PAGE凝胶(7.5％或10％或15％解析凝胶(resolving gel)及4.5％堆积凝胶(stacking gel))来分离。简而言之，样品与装载缓冲液(样品中最终浓度为7.57毫克/毫升的Tris，2％SDS，10％甘油及1.25毫克/毫升的溴酚蓝，±5％β-巯基乙醇(mercaptoethanol)结合，且使之煮沸5分钟或直接装载于解析凝胶上。预染色的高分子量标准物(standard)(蛋白质标记(kd)溶酶体(lysosome)，14,300；β-乳球蛋白(lactoglobulin)，18,400；碳化酐酶(carbonicanhydrase)，29,000；卵白蛋白，43,000；牛血清白蛋白，68,000；磷酸酶B，97,400；肌凝蛋白(myosin)，200,00(Bethesda research laboratories，lifesciences，GrandLand，NY)包含于凝胶上。大的SDS-PAGE凝胶是在15mA进行14小时或是在10mA进行20小时电泳，小型凝胶是在一恒定电压(100-150伏特)进行电泳约2至3小时。
表现的蛋白质是以C3来培养，且C3的量是以西方免疫印渍法来测定。
免疫印渍分析显示含有表现蛋白质的样品会降解C3分子，未降解的C3是由对人类补体C3具专一性的多株抗体来侦测，且若为负样品时可清楚地见于显影的底片上。与不包括任何ORF3蛋白质的负对照组相较，C3分子的(及(链两者似乎易受到ORF3蛋白质的活性作用；但是，在ORF样品中，α链几乎完全被降解，而β链则是部分降解。
实例5临床分离株中降解C3基因的转换为检测基因cppA的转换(conversion)，以cppA的内部片段作为一探针以经由南方杂交法来测定不同肺炎球菌分离株的临床型(血清型)以Eco RI切割的基因组DNA中基因cppA的存在。在相同实验中，也包括肺炎球菌亲代株CP 1200以及过度活性的突变株SN4及SN4-4G(两个突变株含有相同的质体-参见表2)来确认在突变株中cppA基因的复制。南方杂交法是使用非放射性的DIG标记的该基因内部片段作为探针来进行。临床分离株，第1型、第3型、第14F型及致病型23F，显示出约2.3kb的杂交条带(band)，其亦出现于对照组肺炎球菌株CP 1200及SN4突变株中，此共同的条带表示cppA基因出现于所有测试的分离株中。SN4突变株也包括大小约3.5kb的第二条带，表示基因复制的存在。此3.5kb大小是与质体pLSN4具有两个对EcoRI限制内核酸酶位点(一个在插入物区域且第二个在载体中)所观察到者一致，因此，以Eco RI切割会自该重组质体产生两个片段约4.175kb(载体3.531kb+插入物0.649kb)以及3.539kb(插入物的～1.67kb+载体的约1.869kb)。cppA基因是位于插入物1.67kb部分，因而重组质体的～3.539kb限制酶切割片段包含cppA基因，且只有此条带可与作为探针的cppA基因内部片段杂交；因此对于具有复制cppA基因的突变株，在～3.5kb的第二个杂交条带代表复制的cppA基因。
权利要求
1.一种分离的蛋白质，其特征在于包含与序列编号2(SEQ ID NO2)至少80％序列相同性且可降解人类补体蛋白质C3。
2.根据权利要求1所述的蛋白质，其特征在于该蛋白质是分离自肺炎链球菌(S.pneumoniae)。
3.根据权利要求1所述的蛋白质，其特征在于该蛋白质与人类补体蛋白质C3结合。
4.根据权利要求1所述的蛋白质，其特征在于该蛋白质为一种重组蛋白质。
5.根据权利要求1所述的蛋白质，其特征在于该蛋白质为一种分离蛋白质。
6.根据权利要求1所述的蛋白质，其特征在于具有在10％聚乙烯酰胺凝胶上所测定介于24kDa至约34kDa的分子量。
7.一种肽类，其特征在于包含来自权利要求1所述蛋白质的至少15个连续氨基酸。
8.一种分离蛋白质，其特征在于包含序列编号2(SEQ ID NO2)的分离蛋白质。
9.一种肽类，其特征在于包含来自序列编号2(SEQ ID NO2)的至少15个连续氨基酸。
10.一种包含序列编号2(SEQ ID NO2)的蛋白质，其特征在于该蛋白质具有于10％聚乙烯酰胺凝胶上测定介于约24kDa至约34kDa的分子量。
11.根据权利要求10所述的蛋白质，其特征在于该蛋白质是由肺炎链球菌中分离出来。
12.根据权利要求10所述的蛋白质，其特征在于该蛋白质是一种重组蛋白质。
13.根据权利要求10所述的蛋白质，其特征在于该蛋白质会降解人类补体蛋白质C3。
14.一种蛋白质，其特征在于包含序列编号2(SEQ ID NO2)的氨基酸1至50。
15.一种核酸片段，其特征在于包含图1A中的核酸1246至1863。
16.一种降解人类补体蛋白质C3的蛋白质，其特征在于编码该蛋白质的核酸可与序列编号1(SEQ ID NO1)杂交，此杂交条件是在6X SSC、5X Denhardt、0.5％ SDS以及100微克/毫升片段化且变性的鲑鱼精子DNA于65℃下杂交隔夜且以2XSSC、0.1％SDS在室温下清洗一次约10分钟，接着在65℃下清洗一次约15分钟，再后续至少一次以0.2X SSC、0.1％ SDS于室温下清洗至少3至5分钟进行。
17.一种刺激免疫系统的组成物，其包含一有效量的刺激免疫系统的肽类或多肽，其特征在于该肽类或多肽包含来自与含序列编号2(SEQ ID NO2)至少80％序列相同性且可降解人类补体蛋白质C3的蛋白质的至少15个氨基酸。
18.根据权利要求17所述的组成物，其特征在于该蛋白质可由肺炎链球菌中分离出来。
19.根据权利要求15所述的刺激免疫系统的组成物，其特征在于还包含至少一种来自肺炎链球菌的其他刺激免疫系统的肽类、多肽或蛋白质。
20.一种抗体，其特征在于可与含序列编号2(SEQ ID NO2)至少90％序列相同性且可降解人类补体蛋白质C3的蛋白质专一性结合。
21.根据权利要求20所述的抗体，其特征在于该抗体是一种单株抗体。
22.根据权利要求20所述的抗体，其特征在于该抗体是一种抗体片段。
23.根据权利要求20所述的抗体，其特征在于该抗体是一种多株抗体。
24.根据权利要求20所述的抗体，其特征在于该抗体是得自老鼠、大鼠、人类或兔子。
25.一种可与序列编号1(SEQ ID NO1)杂交的核酸片段，其杂交条件是在6XSSC、5X Denhardt、0.5％ SDS以及100微克/毫升片段化且变性的鲑鱼精子DNA于65℃下杂交隔夜且以2XSSC、0.1％ SDS在室温下清洗一次约10分钟，接着在65℃下清洗一次约15分钟，再后续至少一次以0.2X SSC、0.1％ SDS于室温下清洗至少3至5分钟进行。
26.根据权利要求25所述的核酸，其特征在于是由肺炎链球菌基因组中分离出来。
27.根据权利要求25所述的核酸，其特征在于该核酸片段编码一蛋白质的至少一部分。
28.根据权利要求27所述的核酸，其特征在于该蛋白质会降解人类补体C3。
29.根据权利要求27所述的核酸，其特征在于该核酸片段编码一种不会降解人类补体C3的蛋白质。
30.根据权利要求25所述的核酸，其特征在于位于核酸载体上。
31.根据权利要求30所述的核酸，其特征在于该载体是一种可产生一蛋白质至少一部分的表现载体。
32.一种细胞，其特征在于，含有权利要求25所述之核酸。
33.根据权利要求32所述的细胞，其特征在于该细胞是一种细菌或真核细胞。
34.一种分离的核酸片段，其特征在于包含下列核酸序列gctcccagtatgcgtactcgtaaggtagagggaagaaaaaaactagctag。
35.一种于动物中产生对肺炎链球菌免疫反应的方法，其特征在于，包含步骤施用一种包含一治疗有效量的蛋白质至少一部分的组成物于一哺乳动物中，其中编码该蛋白质的核酸可与序列编号1(SEQ ID NO1)杂交，其杂交条件是在6X SSC、5XDenhardt、0.5％ SDS以及100微克/毫升片段化且变性的鲑鱼精子DNA于65℃下杂交隔夜且以2XSSC、0.1％ SDS在室温下清洗一次约10分钟，接着在65℃下清洗一次约15分钟，再后续至少一次以0.2XSSC、0.1％ SDS于室温下清洗至少3至5分钟进行；以及得到对该蛋白质的免疫反应。
36.根据权利要求35所述的方法，其特征在于该免疫反应是B细胞反应。
37.根据权利要求35所述的方法，其特征在于该免疫反应是T细胞反应。
38.根据权利要求35所述的方法，其特征在于该蛋白质的至少一部分为至少15个氨基酸长。
39.根据权利要求35所述的方法，其特征在于该组成物进一步包含至少一种来自肺炎链球菌的其他蛋白质。
40.根据权利要求35所述的方法，其特征在于该蛋白质包含序列编号2(SEQ IDNO2)的至少15个氨基酸。
41.一种包含一插入性突变的细菌，其特征在于该插入性突变是在一个编码可降解人类补体C3蛋白质的基因上。
42.根据权利要求41的细菌，其特征在于该细菌包含一插入性复制突变。
43.一种来自肺炎链球菌的约24kDa至约34kDa的分离蛋白质，其特征在于可结合并降解人类补体C3。
44.一种抑制肺炎链球菌所介导的C3降解作用的方法，其特征在于，包含步骤使肺炎链球菌与抗体接触，该抗体可与具有序列编号2(SEQ ID NO2)的氨基酸序列的蛋白质结合。
45.一种分离核酸片段，其特征在于包含序列编号1(SEQ ID NO1)的核酸序列。
46.一种RNA片段，其特征在于由包含序列编号1(SEQ ID NO1)的双股DNA序列所转录。
全文摘要
本发明涉及肺炎链球菌所表现降解人类补体C3的蛋白酶一族的监定及使用。该蛋白酶具有于10%SDS聚丙烯醯胺凝胶上所测定的约24kD至约34kD的分子量。本发明的一个较佳蛋白酶包括序列编号2(SEQ ID NO:2)的氨基酸序列。
文档编号C12N5/10GK1253589SQ98804470
公开日2000年5月17日 申请日期1998年4月24日 优先权日1997年4月24日
发明者马格列特·K·霍斯泰特, 盖瑞·唐尼, 拉克施米·S·南狄瓦答 申请人:美国明尼苏达州大学