专利名称：编码ssx家族成员的分离的核酸分子及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及是“SSX”家族成员的基因的分离与克隆，以及其应用。
背景及现有技术现已非常明确许多病理症状如感染、癌症、自身免疫失调等，均特征在于某些分子的不适当表达，这些分子由此作为特定的病理或异常症状的“标志”。除了其用作诊断“靶”，即诊断这些异常症状的待鉴定物质之外，这种分子还可作为用于产生诊断剂和/或治疗剂的试剂。此用途一种非限制性例子是使用癌症标志以产生特异于特定标志的抗体。另一非限制性例子是使用与MHC分子复合的肽，以产生抗异常细胞的胞溶性T细胞。
当然如此物质的制备要以用于产生此的试剂的来源为先决条件。自细胞中提纯是一费力的远非把握的方法。另一优选的方法是分离编码特定标志的核酸分子，随后使用分离的编码分子表达所需分子。
目前有两种策略已用于检测这类抗原如人肿瘤中的抗原，这些策略被称作基因途径和生化途径。基因途径的例子参见如dePlaen etal.，Proc Natl Sci USA 852275(1988)，该文献引入本文作参考。在此途径中，几百个得自肿瘤cDNA文库的质粒库被转染至受体细胞如COS细胞，或转染至肿瘤细胞系的抗原阴性变体中。通过其刺激抗肿瘤的胞溶性T细胞克隆反应的能力，筛选表达肿瘤抗原的转染子。生物化学途径的例子参见如Mandelboim，et al.，Nature 36969(1994)，该文献引入本文作参考，其基于与肿瘤细胞MHC-I型分子结合的肽的酸性洗脱，随后进行反相高效液相层析(HPLC)。抗原肽在与抗原加工缺陷的突变体细胞系的空MHC-I类分子结合，并诱导与胸毒性T淋巴细胞的特异性反应之后被鉴别。这些反应包括CTL殖的诱导，TNF释放及靶细胞的溶解，其可在MTT释放分析或51Cr释放分析中测得。
抗原分子学鉴定的这两种途径具有以下不足首先，其非常不方便，费时且昂贵；其次其依赖于具有预定特性的胞毒T细胞系(CTL)的确立；再者其与疾病病理的进程的体内相关性还未被证实，这是由于相关的CTL不仅可以得自相关疾病的患者，也可根据其T细胞所有组分得自健康人。
这两种对抗原进行鉴别和分子鉴定的已知途径的固有问题由这两种方法在人肿瘤内均只成功确定极少数新抗原的事实加以明确证实。如见，van der Bruggen et al.，Science 2541643-1647(1991)；Brichardet al.，J.Exp.Med.178498-495(1993)；Coulie，et al.，J.Exp.Med.18035-42(1994)；Kawakami，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 913515-3519(1994)。
进一步地，所述方法学依赖于所针对的癌症类型的永久细胞系的可得性，从某些癌症类型中很难确立细胞系，如见Oettgen，et al.，Immunol.Allerg.Clin.North.Am.10607-637(1990)所示。也已知一些上皮细胞型癌症体外对CTLS不易感，妨碍了常规分析。这些问题已刺激本领域去研究另外的方法以鉴别癌症相关抗原。
Sahin et al.，Proc Natl Acad Sci USA 9211810-11913(1995)，该文献引入本文作参考，叙述了一种关键方法，同样参见美国专利申请系列号08/580,980及08/479,328(申请日分别为1995年6月7日及1996年1月3日)。这三项均并入本文作参考。概而言之，该方法包括在原核生物宿主内表达cDNA文库。(此文库可得自肿瘤样品)。然后将表达的文库用吸附且稀释的血清免疫筛选，以检测那些引起引高滴度体液应答的抗原，此方法已知为SEREX方法(经重组表达克隆对抗原的血清学鉴别)，此方法已被用于证实先前鉴别的肿瘤相关抗原的表达，以及检测新抗原。参见上述专利申请及Sahin.et al.，文献同上，及Crew，et al.，EMBO J 1442333-2340(1995)。
SEREX方法已被用于食道癌样品，且食道癌相关抗原目前已被鉴定，其编码核酸分子被分离及克隆，参见美国专利申请系列号08/725,182，申请日1996年10月3日。
某些肿瘤相关基因与三联体基因，已知为SSX基因，的关系正在研究之中，见Sahin，et al.，文献同上，Tureci，et al.，Cancer Res564766-4722(1996)。这些SSX基因之一，称作SSX2的基因，首先被鉴定为参与染色体转运事件(t(x；18)(p11.2；q11.2))中的两基因之一，其在70％滑膜肉瘤中存在。见Clark，et al.，Nature Genetics 7502-508(1994)；Crew et al.，EMBO J 142333-2340(1995)。后来发现其在许多肿瘤细胞中表达，目前被认为是肿瘤相关抗原，Tureci等，文献同上将其称作HOM-MEL-40，已在癌细胞及正常睾丸中观测到其表达。由于其只在癌症和睾丸细胞中表达，由此与肿癌抗原的“CT”家族其它成员相应。Crew等也分离并克隆了SSXl基因，其89％核苷酸序列与SSX2同源，见Crew et al.，文献同上。其它针对SSX基因的鉴别的研究工作鉴别了SSX3，如Deleeuw，et al.，Cytogenet.Genet73179-183(1996)所述。SSX与其它CT抗原平行出现的事实提示发明人其它SSX基因也可被分离。
应用上述SEREX方法的修改方法及其它技术克隆了两种另外的SSX基因，后文称作SSX4及SSX5，以及一种SSX4基因的可变剪接变体。具体地，SEREX方法利用自身血清，而前述方法使用同种异体血清，以下将阐述本发明的这一特点及其它特点。
优选实施方案的详述实施例1获得人睾丸cDNA表达文库，用称为MZ2的黑素瘤患者的血清筛选。参见例如美国专利申请系列号08/479,328及08/725,182；Sahin，etal.，Proc.Natl.Acad.Sci USA 9211810-11813(1995)。该血清已用这些文献中所述的方法处理，简而言之，血清以1∶10稀释，然后用转染的E coli裂解物预吸收。在预吸收后，以1∶10稀释吸收血清至终稀释度为1∶100。终稀释后，将样品用如前述文献的方法制备的含噬菌体噬斑的硝酸纤维素膜在室温温育过夜。冲洗硝酸纤维素膜，并与碱性磷酸酶缀合的山羊抗人Fcγ第二抗体保温，用底物5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸盐及氮蓝四唑观测反应。在第二次筛选中，任何编码人免疫球蛋白的噬菌粒被去除。
共筛选3.6×105pfu，得到8个阳性克隆。进行标准测序反应，并将序列与已知序列的序列库对比。
在8个克隆中，发现2个克隆编码已知的自身免疫疾病相关分子，即Golgin-95(Fritzler，et al.，J.Exp.Med 17849-62(1993))，及人上游结合因子(Chan，et al.，J.Exp.Med 1741239-1244(1991))。发现3个另外克隆编码在人组织中广泛表达的蛋白质，即核糖体受体，胶原VI型球蛋白功能域及纳巴霉素结合蛋白。剩下的3个序列中，一个序列与任何已知序列均无同源性，但在人组织中普遍表达(此经RT-PCR分析发现，本文没有详述)。余下2个序列发现与08/479,328中所述全长HOM-MEL-40相同，而第8个克隆发现与DeLeeuw，etal.，Cytogenet.Cell Genet 73179-183(1996)所述的“SSX3”几乎相同，它们之间在编码区内只有2个碱基对不同。这些差异可能是自然赝象；但该克隆也包括一43个碱基对的3’-非翻译区。
实施例2为进行如下的Southern印迹试验，用RT-PCR扩增SSX基因。
为此，用公布的SSX2序列制备2个引物，即MEL-40A5’-CACACAGGAT CCATGAACGG AGA(SEQ ID NO3)及MEL-40B5’-CACACAAAGC TTTGAGGGGA GTTACTCGTC ATC
(SEQ ID NO4)参见Crew et al.，EMBO J 142333-2340(1995)。然后用0.25U Taq聚合酶在25μl反应体积中，以60℃退火温度进行扩增。共进行35个循环。
实施例3在睾丸总RNA上进行前述RT-PCR方法，并将扩增产物用于Southern印迹试验。
从非癌性组织样品中提取基因组DNA，然后将其用限制性酶消化，在不同试验用BamHI，Eco RI或HindIII消化，接着在0.7％琼脂糖凝胶上分离，随后印迹在硝酸纤维素滤膜上。将前述扩增产物经已知技术用32P标记，并将标记物在高严格条件下(65℃，水性缓冲液)用作探针，然后以高严格条件洗，最后用0.2×SSC，0.2％SDS，65℃洗。
在每种情况下(即BamHI，EcoRI或HindIII消化)，Southern印迹呈多于10个条带，提示存在一含有多于三个预先鉴定的SSX基因的基因家族。通过此观测，设计一合并PCR克隆及限制图谱分析的方案以鉴定其它SSX基因。
实施例4当对比SSX1，2及3的序列时，发现它们共享高保守5’和3’区，这解释了为什么SEQ ID NOS3和4的寡核苷酸在所述条件下能扩增所有的三种序列，由此提示无论其大小，SSX基因家族均具有此同源性。因此SEQ ID NOS3和4的寡核苷酸足以扩增SSX基因家族的其它成员。
对SSX1，2和3序列的分析揭示SSX1，2含有SSX3不具备的BglII位点。相似地SSX3含有一其它基因不具备的EcoRV位点。
通过此信息，可使用前述SEQ ID NOS3和4扩增睾丸cDNA，然后用BglII消化。接着将任何BglII抗性序列克隆、测序，并与已知序列对比。
由此可以鉴别两个以前未鉴定的序列，后文称作SSX4和SSX5，本文为SEQ ID NOS1和2。GenBank数据库检索发现2个克隆，登录号为N24445及W00507鉴定，二者均由序列一标记衍生的cDNA节段组成，N24445克隆含有SSX4的3’-非翻译区及一部分编码序列，而W00507克隆含有SSX4的3’-非翻译区的较短片段及较长的编码序列。具体地，N24445由SSX4(SEQ ID NO1)的第334位碱基至3-末端加上终止密码3’的319个碱基组成。W00507序列由与SSX基因无同源性的99个碱基对序列以及随后的与SEQ IDNO1的第280位核苷酸至末端至SEQ ID NO1终止密码子3’的67个碱基相同的区域组成。
SSX4(SEQ ID NO1)的二种形式被鉴定。其一缺失第331-466位核苷酸，但其它与SEQ ID NO1所示的SSX4相同。如下所述，该较短形式是一可变剪接变体。
在下表1中，对比了5个已知SSX家族成员的核苷酸及氨基酸序列。表中水平线为核苷酸同源性，垂直线为氨基酸同源性。
表1SSX家族成员间核苷酸与氨基酸的同源性
氨基酸序列同源性(％)因此，SSX1与SSX3在核苷酸水平具有89.4％同源性，在氨基酸水平具有79.3％同源性。
当分析SSX4的截短形式时，其氨基酸序列与其它完全不同，这是由于可变剪接及下游开放读框的移码所致。推测的蛋白质有153个氨基酸，且42个羧基末端氨基酸示出与其它SSX蛋白质无同源性。
实施例5接下来研究SSX2基因的基因组结构，为此，用与前述Southern印迹研究中讨论的相同方法与探针，筛选人胎盘基因组文库(在λ噬菌体中)。通过两轮附加的克隆纯化任何阳性初级克隆。
分离多个阳性克隆，其中一个经部分测序且鉴定为SSX2的基因组克隆。随后进行一系列标准亚克隆及测序研究试验，以明确外显子一内含子边界。
此分析揭示SSX2基因含有6个外显子，并跨越至少8千碱基。发现所有确定边界均观测到外显子/内含子交界的共有序列，即GT/AG。
发现前述SSX4的可变剪接变体缺失编码区第5个外显子。这由将其与SSX2基因组克隆对比并从中获得其相互关系得出结论。
实施例6接下来检测各个SSX基因在正常及肿瘤组织中的表达。这要求基于已知序列构建下述特异引物，见SFQ ID NOS5-14。
表2用于各个SSX基因的基因特异性PCR引物序列SSX 1A(5’)5’-CTAAAGCATCAGAGAAGAGAAGC[nt.44-66]SSX 1B(3’)5’AGATCTCTTATTAATCTTCTCAGAAA [nt.440-65]SSX 2A(5’)5’-GTGCTCAAATACCAGAGAAGATC[nt.41-63]SSX 2B(3’)5’-TTTTGGGTCCAGATCTCTCGTG [nt.102-25]SSX 3A(5’)5’-GGAAGAGTGGGAAAAGATGAAAGT [nt.454-75]SSX 3B(3’)5’-CCCCTTTTGGGTCCAGATATCA [nt.458-79]SSX 4A(5’)5’-AAATCGTCTATGTGTATATGAAGCT [nt.133-58]SSX 4B(3’)5’-GGGTCGCTGATCTCTTCATAAAC[nt.526-48]SSX 5A(5’)5’-GTTCTCAAATACCACAGAAGATG[nt.39-63]SSX 5B(3’)5’-CTCTGCTGGCTTCTCGGGCG [nt.335-54]通过扩增预先鉴定的SSX1至SSX5的cDNA来证实克隆的特异性。SSX1和4在60℃使用Taq聚合酶，SSX2，3和5在65℃使用Taq聚合酶。除了发现SSX2引物扩增少量SSX3质粒DNA(少于1/20SSX2)之外，每套引物对都是特异的。
一旦证实了特异性，使用前述RT-PCT方法利用引物分析睾丸mRNA。
在所有5种情况下都发现预期的PCR产物，且用SSX4引物对扩增确实得到2个扩增产物，其与可变剪接变体一致。
然后研究SSX基因在培养的黑素细胞中的表达。使用前述方法进行RT-PCR，未发现有PCR产物。再扩增得到少量SSX4产物，包括二种可变形式，表明SSX4在培养的黑素细胞中的表达是不连贯的，且发生表达时是非常低水平的。
将此分析扩展为一组12个黑素瘤细胞系。结果示于下表表3经RT-PCR1检测的SSX在黑素瘤细胞系中的表达SSX1SSX2SSX3SSX4SSX5MZ2-Mel2.2 +++ +++ - - -MZ2-Mel3.1 +++ +++ - - -SK-MEL-13 - - - - -SK-MEL-19 - - - +/- -SK-MEL-23 - - - - -SK-MEL-29 - - - - -SK-MEL-30 +/- +/- - +/- -SK-MEL-31 - - - - -SK-MEL-33 - - - - -SK-MEL-37 +++ +++ - +++ +++SK-MEL-179 - +/- - +/- -M24-MET+/- - - - -11表达水平经溴乙锭染色的RT-PCR产物的强度表示，+++代表强扩增；+/-代表弱扩增；-代表无扩增。
前述实施例阐述了SSX4，SSX4剪接变体及SSX5基因的核酸分子的分离及克隆。前面已指出，这些基因在肿瘤细胞中表达，从而使本领域技术人员能利用这些基因以检定癌如黑素瘤。由于基因表达蛋白质，进而蛋白质激发体内抗体的产生，因而这些蛋白质也是本发明的一部分，特异于这些蛋白质的分离抗体也是本发明的一部分。
本发明的分离的核酸分子包括简并序列，其虽然不同于SEQ IDNO1，其剪接变体或SEQ ID NO2，但确实编码与这些序列所编码的相同的蛋白质。本发明另一方面是包括可操纵地与启动子连接的这些分子的表达载体，以及用这些载体或核酸分子本身转化或转染的细胞系或细胞株。这些都能用于制备蛋白质，例如产生相关序列的扩增拷贝。
同样，本发明再一方面是SEQ ID NOS5-14所示的核酸分子，含有它们的组合物，及其在分析一个或多个SSX基因表达中的应用。任何核酸杂交方法都可使用，包括如PCP方法。本发明的抗体也可用于分析，但在此情况下靶是SSX基因的表达产物。
本发明的其它特点本领域技术人员也将清楚，不在此复述。
本文所用术语及表达方式是用于阐述而非限制性，使用这些术语和表达方式无意排除所示或所述的特征的任何等价物或其部分，应理解在本发明范围内可做各种修改。(1)一般信息(i)申请人Gure，Ali O.；Tureci，Ozlem；Sahin，Ugur；Tsang，Solam；Scanlan，Matthew J.；Knuth Alexander；Pfreundschuh，Michael；Old，Lloyd J.；Chen，Yao-Tseng(ii)发明名称编码SSX家族成员的分离的核酸分子及其应用(iii)序列数2(iv)通讯地址(A)收信人Felfe & Lynch(B)街道805 Third Avenue(C)城市纽约(D)州纽约(F)ZIP10022(v)计算机可读形式(A)媒介类型3.5英寸软盘，1.44Mb(B)计算机IBM(C)操作系统PC-DOS(D)软件Wordperfect(vi)本申请资料(A)申请号(B)申请日(vii)在先申请资料(A)申请号08/851,138(B)申请日1997年5月5日(C)分类435(viii)律师/代理人信息(A)姓名Hanson，Norman D.
(B)注册号30,946(C)文档号LUD 5480-PCT(ix)电讯信息(A)电话(212)688-9200(B)传真(212)838-3884(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)长度576个核苷酸(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑学线性(xi)序列描述SEQ ID NO1ATGAACGGAG ACGACGCCTT TGCAAGGAGA CCCAGGGATG ATGCTCAAAT 50ATCAGAGAAG TTACGAAAGG CCTTCGATGA TATTGCCAAA TACTTCTCTA 100AGAAAGAGTG GGAAAAGATG AAATCCTCGG AGAAAATCGT CTATGTGTAT 150ATGAAGCTAA ACTATGAGGT CATGACTAAA CTAGGTTTCA AGGTCACCCT 200CCCACCTTTC ATGCGTAGTA AACGGGCTGC AGACTTCCAC GGGAATGATT 250TTGGTAACGA TCGAAACCAC AGGAATCAGG TTGAACGTCC TCAGATGACT 300TTCGGCAGCC TCCAGAGAAT CTTCCCGAAG ATCATGCCCA AGAAGCCAGC 350AGAGGAAGAA AATGGTTTGA AGGAAGTGCC AGAGGCATCT GGCCCACAAA 400ATGATGGGAA ACAGCTGTGC CCCCCGGGAA ATCCAAGTAC CTTGGAGAAG 450ATTAACAAGA CATCTGGACC CAAAAGGGGG AAACATGCCT GGACCCACAG 500ACTGCGTGAG AGAAAGCAGC TGGTGGTTTA TGAAGAGATC AGCGACCCTG 550AGGAAGATGA CGAGTAACTC CCCTCG576(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)长度576个核苷酸(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑学线性(xi)序列描述SEQ ID NO2ATGAACGGAG ACGACGCCTT TGTACGGAGA CCTAGGGTTG GTTCTCAAAT 50ACCACAGAAG ATGCAAAAGG CCTTCGATGA TATTGCCAAA TACTTCTCTG 100AGAAAGAGTG GGAAAAGATG AAAGCCTCGG AGAAAATCAT CTATGTGTAT 150ATGAAGAGAA AGTATGAGGC CATGACTAAA CTAGGTTTCA AGGCCACCCT 200CCCACCTTTC ATGCGTAATA AACGGGTCGC AGACTTCCAG GGGAATGATT 250TTGATAATGA CCCTAACCGT GGGAATCAGG TTGAACATCC TCAGATGACT 300TTCGGCAGGC TCCAGGGAAT CTTCCCGAAG ATCACGCCCG AGAAGCCAGC 350AGAGGAAGGA AATGATTCAA AGGGAGTGCC AGAAGCATCT GGCCCACAGA 400ACAATGGGAA ACAGCTGCGC CCCTCAGGAA AACTAAATAC CTCTGAGAAG 450GTTAACAAGA CATCTGGACC CAAAAGGGGG AAACATGCCT GGACCCACAG 500AGTGCGTGAG AGAAAGCAAC TGGTGATTTA TGAAGAGATC AGCGACCCTC 550CGGAAGATGA CGAGTAACTC CCCTCA57权利要求
1.编码蛋白质的分离的核酸分子，该蛋白质的氨基酸序列由SEQID NO1，SEQ ID NO2，或SEQ ID NO1的1-330位核苷酸与467-576位核苷酸的连接体所编码的氨基酸序列组成。
2.如权利要求1的分离的核酸分子，其中所述分离的核酸分子编码由SEQ ID NO1编码的蛋白质。
3.如权利要求1的分离的核酸分子，其中所述分离的核酸分子编码由SEQ ID NO2编码的蛋白质。
4.如权利要求1的分离的核酸分子，其中所述分离的核酸分子编码SEQ ID NO1的1-330位核苷酸与467-576位核苷酸的连接体所编码的蛋白质。
5.如权利要求1的分离的核酸分子，具有SEQ ID NO1的核苷酸序列。
6.如权利要求1的分离的核酸分子，具有SEQ ID NO2的核苷酸序列。
7.如权利要求1的分离的核酸分子，具有SEQ ID NO1的1-330位核苷酸与467-576位核苷酸的连接体所限定的核苷酸序列。
8.表达载体，包括可操纵地与启动子连接的权利要求1的分离的核酸分子。
9.用权利要求1的分离的核酸分子转化或转染的细胞系或细胞株。
10.用权利要求8的表达载体转化或转染的细胞系或细胞株。
11.由权利要求1的分离的核酸分子编码的分离的蛋白质。
12.由权利要求2的分离的核酸分子编码的分离的蛋白质。
13.由权利要求3的分离的核酸分子编码的分离的蛋白质。
14.由权利要求4的分离的核酸分子编码的分离的蛋白质。
15.用于检测样品中SSX基因表达的分离的核酸分子，所述分离的核酸分子由SEQ ID NO3，SEQ ID NO4，SEQ ID NO5，SEQ ID NO6，SEQ ID NO7，SEQ ID NO8，SEQ ID NO9，SEQID NO10，SEQ ID NO11，SEQ ID NO12，SEQ ID NO13，SEQ IDNO14所示核苷酸序列组成。
16.用于检测样品中SSX基因表达的组合物，包括(a)SEQ IDNO3和SEQ ID NO4，(b)SEQ ID NO5和SEQ ID NO6，(c)SEQ ID NO7和SEQ ID NO8，(d)SEQ ID NO9和SEQ ID NO10，(e)SEQ ID NO11和SEQ ID NO12及(f)SEQ ID NO13和SEQ ID NO14。
17.检测SSX基因在样品中表达的方法，包括将样品与至少一个种权利要求14的分离的核酸分子相接触，并检测所述分离的核酸分子与靶的杂交作为SSX基因在所述样品中表达的指示。
18.与权利要求11的分离的蛋白质特异结合的分离的抗体。
19.检测样品中SSX基因的表达产物存在的方法，包括将所述样品与权利要求17的分离的抗体接触，并检测所述抗体与靶的结合作为样品中SSX基因表达产物存在的指示。
全文摘要
本发明涉及SSX基因家族的成员及其应用。
文档编号C12N15/12GK1264424SQ98804801
公开日2000年8月23日 申请日期1998年2月25日 优先权日1997年5月5日
发明者阿里·O·古雷, 厄兹莱姆·图雷茨, 乌尔·沙欣, 索拉姆·曾, 马修·J·斯坎伦, 亚历山大·克努特, 米夏埃尔·普夫朗德斯奇邬, 劳埃德·J·奥尔德, 陈耀成 申请人:路德维格癌症研究所, 斯隆-凯特林癌症研究所, 科内尔研究基金会公司