专利名称：制备抗氧化剂的方法
技术领域：
本发明涉及制备抗氧化剂的方法。
抗氧化剂防止、抑制或降低可氧化介质的氧化速率。具体地说，抗氧化剂用于食品保藏，特别是当所述食品是脂肪或包含脂肪时。典型的化学抗氧化剂包括芳香胺类、取代的酚类和硫化合物。用于食物成品的抗氧化剂的实例是聚乙烯聚吡咯烷酮、二硫苏糖醇、二氧化硫、合成γ-维生素E、δ-维生素E、L-抗坏血酸、L-抗坏血酸钠、L-抗坏血酸钙、抗坏血酸棕榈酸酯、没食子酸丙酯、没食子酸辛酯、没食子酸十二酯、卵磷脂、二苯胺乙氧喹和2，6-二叔丁基对甲酚。二种常用的抗氧化剂是GRINDOX 142(得自Danisco A/S)和GRINDOX1029(得自Danisco A/S)。
通常将抗氧化剂加入食品，例如饮料。
例如，抗氧化剂用于制备诸如啤酒、苹果汁、淡色啤酒等的酒精饮料。具体地说，抗氧化剂在制备葡萄酒中有广泛的用途。在此方面，Butzke和Bisson在Agro-Food-Industry HiTech(1996年7月/8月第26-30页)中发表了葡萄酒生产的综述。
按照Butzke和Bisson(出处同上)“葡萄酒是葡萄果汁或汁的自然发酵产物。在红葡萄酒的情况下，在初始发酵期间存在葡萄皮，以从葡萄皮中提取色素和重要的风味和香味成分。术语“果汁”指压碎的整葡萄。在生产白葡萄酒的情况下，在发酵前除去葡萄皮，仅仅汁液得以保留和加工。…从田间收获葡萄并直接送到葡萄酒厂。然后在葡萄酒厂压碎葡萄，将果汁或者转移至用于发酵的罐中(红葡萄酒)或者压榨以将汁液与葡萄皮和葡萄籽分离(白葡萄酒)。在后一种情况下，
然后将汁液转移至发酵罐中。所述罐或者用酵母菌属(Sacharomyces)的市售葡萄酒菌株接种，或者使其进行自然或未接种发酵。在自然发酵中，发酵开始时野生型(非酵母菌属)酵母和细菌的数量大大超过酵母菌属细胞。在所述发酵结束时，酵母菌属占支配地位，绝大多数情况下是唯一可以分离的生物体。用市售葡萄酒菌株或用发酵葡萄汁液或果汁接种改变了不同微生物数量的起始比例，使得酵母菌属更早地支配所述发酵。
葡萄酒中微生物的代谢活性导致产生香味和风味化合物，其中一些化合物对消费者是非常有害的，并且所有的这些化合物都与对所述葡萄酒的各种特性负责的化合物不同。…加入二氧化硫防止了化学氧化反应，在此意义上，二氧化硫是天然葡萄香味和风味的重要的稳定剂。可以将二氧化硫加入所述果汁或汁液以保持风味，不一定要做为抗微生物剂加入。但是，当选择将被遗传修饰以生产葡萄酒的菌株时，必须考虑二氧化硫的抗微生物活性。”因此，在葡萄酒生产中使用了潜在有害的化学物质，例如二氧化硫。
本发明寻求克服与用抗氧化剂制备食品的现有技术方法相关联的任何问题。
按照本发明的第一个方面，提供制备包含抗氧化剂和至少一种其它组分的介质的方法，所述方法包括在所述介质中原位制备所述抗氧化剂；并且其中通过使用重组DNA技术从葡聚糖制备所述抗氧化剂。
按照本发明的第二个方面，提供制备包含抗氧化剂和至少一种其它组分的介质的方法，所述方法包括在所述介质中原位制备所述抗氧化剂；并且其中通过使用重组葡聚糖裂合酶制备所述抗氧化剂。
按照本发明的第三个方面，提供通过按照本发明的方法制备的介质。
本发明的其它方面包括使用果糖酐(anhydrofructose)做为介质的抗氧化剂，所述介质包含至少一种其它组分，其中所述果糖酐在所述介质中原位制备。
使用果糖酐做为赋予或改进植物逆境耐性的手段，其中所述果糖酐在所述植物中原位制备。
使用果糖酐做为赋予或改进葡萄转化的手段，其中所述果糖酐在所述葡萄中原位制备。
使用果糖酐做为提高食品(优选为水果或蔬菜，更优选为新鲜水果或新鲜蔬菜)中抗氧化剂水平的手段，其中所述果糖酐在所述食品中原位制备。
使用果糖酐做为食品中的药物，其中所述果糖酐在所述食品中原位制备。
给予包含果糖酐的食品的方法，其中所述果糖酐处于药用可接受的量，并做为药物起作用；并且其中已在所述食品中原位制备所述果糖酐。
使用果糖酐做为食品中的营养药，其中所述果糖酐在所述食品中原位制备。
给予包含果糖酐的食品的方法，其中所述果糖酐处于营养药可接受的量，并做为营养药起作用；并且其中已在所述食品中原位制备所述果糖酐。
使用葡聚糖裂合酶做为赋予或改进植物逆境耐性的手段，其中所述葡聚糖裂合酶在所述植物中原位制备。
使用葡聚糖裂合酶做为赋予或改进葡萄转化的手段，其中所述葡聚糖裂合酶在所述葡萄中原位制备。
使用葡聚糖裂合酶做为提高食品(优选为水果或蔬菜，更优选为新鲜水果或新鲜蔬菜)中抗氧化剂水平的手段，其中所述葡聚糖裂合酶在所述食品中原位制备。
使用葡聚糖裂合酶制备食品中的药物，其中所述葡聚糖裂合酶在所述食品中原位制备。
给予包含抗氧化剂的食品的方法，其中所述抗氧化剂处于药用可接受的量，并做为药物起作用；并且其中已在所述食品中从葡聚糖裂合酶制备所述抗氧化剂。
使用葡聚糖裂合酶制备食品中的营养药，其中所述葡聚糖裂合酶在所述食品中原位制备。
给予包含抗氧化剂的食品的方法，其中所述抗氧化剂处于营养药可接受的量，并做为营养药起作用；并且其中已在所述食品中从葡聚糖裂合酶原位制备所述果糖酐。
使用编码葡聚糖裂合酶的核苷酸序列做为赋予或改进植物逆境耐性的手段，其中所述核苷酸序列在所述植物中原位表达。
使用编码葡聚糖裂合酶的核苷酸序列做为赋予或改进葡萄转化的手段，其中所述核苷酸序列在所述葡萄中原位表达。
使用编码葡聚糖裂合酶的核苷酸序列做为提高食品(优选为水果或蔬菜，更优选为新鲜水果或新鲜蔬菜)中抗氧化剂水平的手段，其中所述核苷酸序列在所述食品中原位表达。
使用编码葡聚糖裂合酶的核苷酸序列做为在食品中产生药物的手段，其中所述核苷酸序列在所述食品中原位表达。
给予包含抗氧化剂的食品的方法，其中所述抗氧化剂处于药用可接受的量，并做为药物起作用；并且其中已在所述食品中借助编码葡聚糖裂合酶的核苷酸序列制备所述抗氧化剂。
使用编码葡聚糖裂合酶的核苷酸序列做为在食品中产生营养药的手段，其中所述核苷酸序列在所述食品中原位表达。
给予包含抗氧化剂的食品的方法，其中所述抗氧化剂处于营养药可接受的量，并做为营养药起作用；并且其中已在所述食品中借助编码葡聚糖裂合酶的核苷酸序列制备所述抗氧化剂。
术语“营养药”指可以做为营养物质(即，它适于例如口服)起作用、又可以表现出药学效果和/或化妆品效果的化合物。
与加入抗氧化剂介质的常用方法相反(所述介质诸如食品)，我们现在发现可以在所述介质中原位制备特定的抗氧化剂。
原位制备抗氧化剂特别优越，因为需要向所述介质中加入较少的其它抗氧化剂或不需要加入其它抗氧化剂，所述介质诸如食品。
本发明由于提供改进植物逆境耐性的方法，因此也被认为是优越的。
由于本发明提供能生存发育的转化葡萄，因此也是优越。
本发明是更加优越的，因为它能得食品中的抗氧化剂水平提高。这可能具有有益的健康意义。在此方面，近期的报道(例如Biotechnology Newswatch 1997年4月21日“在咖啡中发现的与水果中同样有效的抗氧化剂”，Marjorie Shaffer)提出抗氧化剂例如在防止或抑制癌形成方面具有药物的益处。
以前Badiani等在Agro-Food-Industry Hi-Tech(1996年3月/4月，第21-26页)中以及综述了在植物中一般性原位制备抗氧化剂。但是注意到该综述没有提及从葡聚糖原位制备抗氧化剂，更不用说利用重组葡聚糖裂合酶原位制备抗氧化剂。
优选地，所述葡聚糖包含α-1，4键。
优选地，所述葡聚糖是淀粉或淀粉的单位。
优选地，所述葡聚糖是重组酶的底物，使得所述葡聚糖与所述重组酶的接触产生所述抗氧化剂。
优选地，所述酶是葡聚糖裂合酶。
优选地，所述酶是α-1，4葡聚糖裂合酶。
优选地，所述酶包含SEQ ID No 1-6所示序列的任何一个序列，或其变异体、同源物或片段。
优选地，所述酶是SEQ ID No 1-6所示序列的任何一个序列。
优选地，所述酶由包含SEQ ID No 7-12所示序列的任何一个序列的核苷酸序列或其变异体、同源物或片段编码。
优选地，所述酶由具有SEQ ID No 7-12所示序列的任何一个序列的核苷酸序列编码。
优选地，所述抗氧化剂是果糖酐。
优选地，所述抗氧化剂是1，5-D-果糖酐。
优选地，所述介质是食品，或用于制备食品。
优选地，所述食品是饮料。
优选地，所述饮料是酒精饮料。
优选地，所述饮料是葡萄酒。
优选地，所述抗氧化剂在所述组分中原位制备，然后释放进入所述介质中。
优选地，所述组分是植物或其一部分。
优选地，所述组分是谷类作物或水果的整体或一部分。
优选地，所述组分是葡萄的整体或其一部分。
所述介质可以用作食品或用于制备食品，所述食品包括饮料。或者，所述介质可以用于聚合物化学。在此方面，所述原位产生的抗氧化剂可以因此做为在例如聚合物合成的过程中的氧清除剂，所述聚合物的合成诸如生物可降解塑料的合成。
按照本发明，在所述介质中原位制备所述抗氧化剂(优选为果糖酐)。换言之，在所述介质中原位制备的所述抗氧化剂(优选为果糖酐)用作所述介质中的抗氧化剂。在一个实施方案中，在所述介质中原位制备的所述抗氧化剂(优选为果糖酐)用作所述介质中的主要的抗氧化剂。
本文使用的术语“在所述介质中原位”包括由所述组分表达的重组酶对葡聚糖的作用制备抗氧化剂，该葡聚糖是所述酶的底物。该术语亦包括通过由所述组分表达的重组酶对所述组分内的葡聚糖作用制备抗氧化剂和所述抗氧化剂的后续产生。该术语亦包括由所述组分表达所述重组酶并且然后将其释放进入所述介质中，该酶作用于存在于所述介质中的葡聚糖，以在所述介质中形成所述抗氧化剂，其中该葡聚糖是所述酶的底物。该术语亦包括在所述介质中存在另一组分或将另一组分加入所述介质，该组分然后表达重组核苷酸序列，导致所述介质的一部分或全部暴露于抗氧化剂，所述抗氧化剂可以是由另一组分表达和释放的重组酶或重组蛋白质，或可以是在已暴露于所述重组酶或重组蛋白质的介质中的葡聚糖的产物，该葡聚糖是所述酶的底物。
本文使用的术语“通过使用重组DNA技术”包括通过使用作用于所述葡聚糖的重组酶或重组蛋白质得到任何抗氧化剂。该术语亦包括通过使用作用于重组葡聚糖的酶或蛋白质得到的抗氧化剂。
与本发明相关的术语“淀粉”包括天然淀粉、降解淀粉、改性淀粉，包括其组分直链淀粉和支链淀粉以及其葡萄糖单位。
与所述酶相关的术语“变异体”、“同源物”或“片段”包括所述序列的一个(或多个)氨基酸的任何置换、变异、修饰、取代、缺失或添加，只要产生的氨基酸序列具有α-葡聚糖裂合酶活性，优选至少具有与如SEQ ID No 1-6所示酶的任何一个的相同的活性。具体地说，术语“同源物”包括结构和/或功能方面的同源性，只要产生的酶具有α-葡聚糖裂合酶活性。关于序列同源性，与SEQ ID No 1-6所示序列的任何一个的同源性优选地为至少75％，更优选为至少85％，更加优选为至少90％。与SEQ ID No 1-6所示序列的任何一个的同源性更加优选为至少95％，更加优选为至少98％。
与编码所述酶的核苷酸序列相关的术语“变异体”、“同源物”或“片段”包括所述序列的一个(或多个)核酸的任何置换、变异、修饰、取代、缺失或添加，只要产生的核苷酸序列编码具有α-葡聚糖裂合酶活性的酶，该酶优选至少具有与如SEQ ID No 1-6所示酶的任何一个的相同的活性。具体地说，术语“同源物”包括结构和/或功能方面的同源性，只要产生的核苷酸序列编码酶具有α-葡聚糖裂合酶活性的酶。关于序列同源性，与SEQ ID No 7-12所示序列的任何一个的同源性优选地为至少75％，更优选为至少85％，更加优选为至少90％。与SEQ ID No 7-12所示序列的任何一个的同源性更加优选为至少95％，更加优选为至少98％。
上述术语与所述序列的等位变异同义。
本发明亦包括可以与本发明的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。
与本发明相关的术语“核苷酸”包括cDNA。
按照本发明，因此提供了在可氧化介质中原位制备抗氧化剂的方法。在一个优选实施方案中，所述抗氧化剂是果糖酐，更优选是1，5-D-果糖酐。1，5-D-果糖酐已经被化学合成(Lichtenthaler，载于Tetrahedron Letters第21卷第1429-1432页)。在WO 95/10616、WO95/10618和GB-B-2294048中进一步讨论了1，5-D-果糖酐。
使用1，5-D-果糖酐做为抗氧化剂的主要优点是，它是一种天然产物、是不可代谢的、容易制造、是水溶性的，并且它一般无毒。
按照WO 95/10616、WO 95/10618和GB-B-2294048，可以通过利用α-1，4-葡聚糖裂合酶对基于α-1，4-葡聚糖的底物进行酶修饰而制备1，5-D-果糖酐。典型的基于α-1，4-葡聚糖的底物是淀粉。
目前，淀粉在工业中有广泛的用途，主要是因为它是廉价的原材料。在本领域中有许多有关淀粉的参考资料。例如，Salisbury和Ross在Plant Physiology(第4版，1991，Wadsworth PublishingCompany出版，特别是第11.7节)。然而，简言之，淀粉是植物主要的能量储备之一。常常在许多植物的无色质体(造粉体)中、在贮藏组织中和在叶绿体的基质中发现淀粉。淀粉是多糖碳水化合物。它包含二种主要成分直链淀粉和/或支链淀粉。直链淀粉和/或支链淀粉均由α(1，4)-连接的葡萄糖单位(即糖基残基)直链组成，但是支链淀粉还包含α(1，6)分枝的葡萄糖单位。
在WO 95/10616和WO 95/10618中讨论的适于从淀粉产生1，5-D-果糖酐的一些葡聚糖裂合酶以SEQ I.D.No 1-4显示。在GB-B-2294048中讨论的适于从淀粉产生1，5-D-果糖酐的一些葡聚糖裂合酶以SEQ I.D.No 5-6显示。
一些编码在WO 95/10616和WO 95/10618中讨论的适于从淀粉产生1，5-D-果糖酐的葡聚糖裂合酶的核苷酸序列如SEQ I.D.No 7-10所示。一些编码在GB-B-2294048中讨论的适于从淀粉产生1，5-D-果糖酐的葡聚糖裂合酶的核苷酸序列如SEQ I.D.No 11-12所示。
在WO 94/09122中讨论了再一种葡聚糖裂合酶。
可以从诸如真菌(优选为中肋羊肚菌(Morchella costata)或普通羊肚菌(Morchella vulgaris))的来源、或从真菌感染的藻类(优选为Gracilariopsis lemaneiformis)、或仅从藻类(优选为Gracilariopsislemaneiformis)克隆编码所述酶的重组核苷酸序列。
在一个优选实施方案中，通过用重组α-1，4-葡聚糖裂合酶处理α-1，4-葡聚糖制备α-1，5-果糖酐，所述葡聚糖裂合酶诸如SEQ I.D.No 1-6所示的任何一个。
可以在WO 95/10616、WO 95/10618和GB-B-2294048的叙述中找到怎样制备如SEQ I.D.No 1-6所示的酶的详细评述。同样，可以在WO 95/10616、WO 95/10618和GB-B-2294048的叙述中找到怎样分离和克隆核苷酸序列SEQ I.D.No 7-12的详细评述。
如果所述葡聚糖包含不同于α-1，4-键的键或者在α-1，4-键之外还有其它的键，则可以将所述重组α-1，4-葡聚糖裂合酶与可以打断这种其它键的合适的试剂联合使用，所述合适的试剂例如重组水解酶，它优选为重组葡聚糖水解酶。
在Sambrook，J.，Fritsch，E.F.，Maniatis T.(编辑)分子克隆实验指南，第二版，冷泉港实验室出版社，纽约1989中找到重组DNA技术的一般叙述。
为表达核苷酸序列，宿主生物可以是原核生物或真核生物。合适的原核生物宿主的实例包括大肠杆菌和枯草杆菌。原核宿主转化的叙述在本领域中已充分记载，例如参见Sambrook等(分子克隆实验指南，第二版，1989，冷泉港实验室出版社)。如果使用原核宿主，则在转化之前可能需适当修饰所述基因，例如通过除去内含子而修饰。
在一个实施方案中，宿主生物可以是曲霉属(Aspergillus)，例如黑曲霉(Aspergillus niger)。通过遵循Rambosek，J.和Leach，J.1987(丝状真菌的重组DNA进展和展望。CRC Crit.Rev.Biotechnol.6357-393)、Davis R.W.1994(曲霉属中的异源基因表达和蛋白分泌。载于Martinelli S.D.，Kinghorn J.R.(编辑)曲霉属50年。Progress inindustrial microbiology第29卷。Elsevier Amsterdam 1994.第525-560页)、Balance，D.J.1991(丝状真菌的转化系统和真菌基因结构总览。载于Leong，S.A.，Berka R.M.(编辑)分子工业真菌学.丝状真菌的系统和应用。Marcel Dekker Inc.New York 1991.第1-29页)和Turner G.1994(遗传操作载体。载于Martinelli S.D.，Kinghorn J.R.(编辑)曲霉属50年。Progress in industrial microbiology第29卷。ElsevierAmsterdam 1994.第641-666页)的叙述，可以制备转基因曲霉属。不过，以下评述提供了那些制备转基因曲霉属的叙述的概要。
近一个世纪以来，丝状真菌已广泛地应用于许多类型的工业中以生产有机化合物和酶。例如，传统日本酒曲和酱油的发酵就使用了曲霉属菌种(Aspergillus sp)。在本世纪，黑曲霉亦被用于生产有机酸，特别是柠檬酸，并用于生产在工业中使用的各种酶。
丝状真菌在工业中得到广泛的应用的原因主要有二个。首先，丝状真菌可以产生大量的胞外产物，例如酶和诸如抗生素或有机酸的有机化合物。其次，丝状真菌可以在低成本底物上生长，例如谷物、糠、甜菜粕等。同样的原因使得丝状真菌成为异源表达按照本发明的重组酶的宿主的有吸引力的生物。
为制备所述转基因曲霉属，通过将需要的核苷酸序列插入设计用于在丝状真菌中表达的构建物中，制备表达构建物。
已经开发了几种类型的用于异源表达的构建物。这些构建物可以包含一个在真菌中有活性的启动子。启动子的实例包括高度表达的胞外酶的真菌启动子，例如葡糖淀粉酶启动子或α-淀粉酶启动子。可以将所述核苷酸序列与信号序列融合，所述信号序列指导由所述核苷酸序列编码的蛋白的分泌。通常使用真菌来源的信号序列。在真菌中有活性的终止子位于表达系统末端。
在真菌中已开发了另一种类型的表达系统，其中可以将所述核苷酸序列融合至编码稳定蛋白的真菌基因的较小部分或较大部分。这样可以稳定由所述核苷酸序列编码的蛋白。在这种系统中，可以将特定蛋白酶识别的酶切位点导入所述真菌蛋白和由所述核苷酸序列编码的蛋白之间，使得可以由所述特定蛋白酶在该位置酶切产生的融合蛋白，由此释放由所述核苷酸序列编码的蛋白质。作为实例，可以导入由在至少一些曲霉属菌中发现的KEX-2样肽酶识别的位点。这种融合导致体内酶切，产生对所述表达产物的保护，而不是对较大的融合蛋白的保护。
已报道了几种编码细菌、真菌、脊椎动物和植物蛋白质的基因在曲霉属中的异源表达。如果所述核苷酸序列未与信号序列融合，则所述蛋白质可以在细胞内存储。这种蛋白将在细胞质中积累，并且通常不会糖基化，这对一些细菌蛋白是有利的。如果所述核苷酸序列配有信号序列，则所述蛋白质将在胞外累积。
对于产物稳定性和宿主菌株的修饰而言，一些异源蛋白质当分泌进入真菌培养液中时不是非常稳定。大多数真菌产生降解异源蛋白质的几种胞外蛋白酶。为避免这种问题，已经使用了几种降低了蛋白酶产生的特定真菌菌株做为异源生产的宿主。
为转化丝状真菌，已针对许多丝状真菌开发了几种转化方案(Ballance 1991，出处同上)。许多这些方案都是基于制备原生质体和使用PEG和Ca2+离子将DNA导入所述原生质体。然后再生所述转化的原生质体，并使用各种选择性标记选择所述转化的真菌。用于转化的标记之中有一些是营养缺陷标记(例如argB、trpC、niaD和pyrG)、抗生素抗性标记例如苯菌灵抗性、潮霉素抗性和腐草霉素抗性。常用的转化标记是构巢曲霉(A.nidulans)的amdS基因，其为高拷贝数，允许所述真菌以丙烯酰胺做为唯一氮源而生长。
在另一个实施方案中，所述转基因生物可以是酵母菌。在这方面，酵母菌也已被广泛地用作异源基因表达的载体。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)有长期的工业应用历史，包括其用于异源基因表达。Goodey等(1987，Yeast Biotechnology，D R Berry等编辑，第401-429页，Allen and Unwin，London)和King等(1989，酵母的分子和细胞生物学，E F Walton和G T Yarronton编辑，第107-133页，Blackie，Glasgow)已经综述了异源基因在酿酒酵母中的表达。
由于几个原因，酿酒酵母很适于异源基因表达。首先，它对人类无致病性，并且不会产生某些内毒素。其次，它有几个世纪的各种目的的商用使用的很长的安全使用历史。这使得它有广泛的公众接受性。第三，对该生物体的广泛商业应用和研究已经产生有关酿酒酵母的遗传学和生理学以及大规模发酵特征的大量知识。
E Hinchcliffe E Kenny(1993，“做为异源基因表达载体的酵母”，酵母，第5卷，Anthony H Rose和J Stuart Harrison编辑，第2版，Academic Press Ltd.)给出了在酿酒酵母中异源基因表达和基因产物分泌的原则的综述。
可以得到几种类型的酵母载体，包括整合型载体，其需要与宿主基因组重组以保持它们，还有自主复制型质粒载体。
为制备转基因酵母属菌，通过将所述核苷酸序列插入设计用于在酵母中表达的构建物中，制备表达构建物。已经开发了几种类型的用于异源表达的构建物。所述构建物包含融合至所述核苷酸序列的在酵母中有活性的启动子，通常使用酵母来源的启动子，例如GAL1启动子。通常使用酵母来源的信号序列，例如使用了编码SUC2信号肽的序列。在酵母中有活性的终止子位于所述表达系统末端。
已经开发了用于酵母转化的几种转化方案。例如，可以通过遵循Hinnen等所述(1978，Proceedings of the National Academy ofSciences of the USA 75，1929)；Beggs，J D(1978，Nature，London，275，104)；和Ito，H等(1983，J Bacteriology 153，163-168)制备转基因酵母属菌。
使用各种选择标记选择转化的酵母细胞。用于转化的标记之中有许多营养缺陷标记(诸如LEU2、HIS4和TRP1)，以及显性抗生素抗性标记例如氨基糖苷抗生素标记，例如G418。
另一种宿主生物是植物。在此方面，本领域有充实的制备转基因植物的参考资料。二个提供可以使用以制备转基因植物的技术类型的背景评述的文件是EP-B-0470145和CA-A-2006454，其一部分评述在下文提供。
遗传修饰植物构建的基本原则是，将遗传信息插入到所述植物的基因组中，使得可以稳定地保持插入的遗传物质。
有几种插入遗传信息的技术，二条主要的原则是直接导入所述遗传信息和通过使用载体系统导入所述遗传信息。可以在Potrykus(Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol42205-225)和Christou(Agro-Food-Industry Hi-Tech 1994年3/4月17-27)的文章中找到一般技术的综述。
因此，在一个方面，本发明涉及载体系统，该载体系统携带重组核苷酸序列并且可以将所述核苷酸序列导入诸如植物的生物体的基因组，其中所述核苷酸序列可以在原位产生抗氧化剂。
所述载体系统可以包含一个载体，但是它可以包含至少二个载体。在二个载体的情况下，通常将所述载体系统称为双载体系统。在Gynheung An等(1980)，双载体，Plant Molecular Biology Manual A3，1-19中进一步详细描述了双载体系统。
一种广泛使用的用指定启动子或核苷酸序列或构建物转化植物细胞的系统，基于使用源自根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的Ti质粒或源自毛根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)的Ri质粒(An等(1986)，Plant Physiol. 81，301-305和Butcher D.N.等(1980)，植物病理学家的组织培养方法，编辑D.S.Ingrams和J.P.Helgeson，203-208)。
已经构建了几种不同的Ti和Ri质粒，所述质粒适于构建上述植物或植物细胞构建物。
本发明的核苷酸序列应优选在T-DNA的边界序列之间或邻近T-DNA序列插入所述Ti质粒，以避免破坏紧接T-DNA边界的序列，因为看来这些区域中的至少一个对于将修饰的T-DNA插入植物基因组是必需的。
从上述解释可以理解，如果所述生物体是植物，则本发明的载体系统优选为包含感染植物所必需的序列(例如，vir区)，并且包含T-DNA序列的至少一个边界部分，所述边界部分与所述遗传构建物位于同一个载体上。优选地，所述载体系统是根癌农杆菌Ti-质粒或毛根农杆菌Ri-质粒或其衍生物，因为这些质粒在构建转基因植物方面是众所周知的并得到广泛应用的，许多现有的载体系统都是基于这些质粒或其衍生物。
在构建转基因植物时，本发明的核苷酸序列或构建物或载体可以首先在微生物中构建，在所述微生物中，在插入所述植物之前，所述载体可以复制并且所述微生物易于操作。有用的微生物的实例是大肠杆菌，但是也可以使用具有上述性质的其它微生物。当如上述定义的载体系统的载体已在大肠杆菌中构建后，如果需要，就将其转移进入合适的农杆菌菌株，例如根癌农杆菌。因此包含本发明的第一核苷酸序列或构建物的Ti-质粒优选地转移进入合适的农杆菌菌株，例如根癌农杆菌，以得到包含本发明的启动子或核苷酸序列或构建物的农杆菌细胞，所述DNA接着转移进入欲修饰的所述植物细胞。
如CA-A-2006454中所报道的，可以得到大量的克隆载体，它们含有大肠杆菌中的复制系统和允许选择转化的细胞的标记。所述载体包括例如pBR322、pUC系列、M13 mp系列、pACYC 184等。如此，本发明的启动子或核苷酸或构建物可以导入所述载体中的合适限制位置。所述包含的质粒用于转化大肠杆菌。将所述大肠杆菌细胞在合适的营养培养基中培养，然后收获和溶菌。然后回收所述质粒并且进行分析，例如通过以下技术的任何一种或多种进行分析序列分析、限制性分析、电泳和其它生化-分子生物学方法。在每次操作之后，可以将使用的DNA进行限制酶切或通过PCR计数选择性扩增，并且与下一个DNA序列连接。每个序列可以在同一质粒或不同的质粒中克隆。
遵循将按照本发明的核苷酸序列或构建物或载体导入植物的每个方法后，可能必需存在和/或插入其它DNA序列。如果，例如，使用Ti-或Ri-质粒转化植物细胞，则可以连接所述Ti-和Ri-质粒T-DNA的至少右边界、经常是右边界和左边界，做为导入基因的侧翼区域。已深入研究了使用T-DNA转化植物细胞，在EP-A-120516；Hoekema，载于双载体植物载体系统分支-drukkerij Kanters B.B.，Alblasserdam，1985，第5章；Fraley等，Crit.Rev.Plant Sci.，41-46；和An等，EMBO J.(1985)4277-284中进行了描述。
用农杆菌直接感染植物组织是简单的技术，该技术已被广泛使用，在Butcher D.N.等(1980)，植物病理学家的组织培养方法，编辑D.S.Ingrams和J.P.Helgeson，203-208进行了描述。对于这一主题的其它叙述请参见Potrykus(Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol42205-225)和Christou(Agro-Food-Industry Hi-Tech 1994年3/4月17-27)。使用这一技术，可以在所述植物的某一部分或组织进行植物的感染，即，在所述植物的叶、根、茎或其它部分的一部分上进行感染。
通常，使用携带所述第一核苷酸序列或构建物的农杆菌直接感染植物组织时，在欲感染的植物上制造创伤，例如，通过用刀片切割所述植物或用针头针刺所述植物或用摩擦性物质摩擦所述植物。然后用所述农杆菌接种伤口。然后让已接种的植物或植物部分在合适的培养基上生长。
当构建植物细胞时，按照众所周知的组织培养方法，在按照本发明的培养基中生长和可选地保持这些细胞，例如通过在添加了诸如氨基酸、植物激素、维生素等的必需生长因子的合适培养基中培养所述细胞，但是其中该培养基包含按照本发明的一种组分。所转化的细胞再生成为遗传修饰的植株可以通过使用从细胞或组织培养再生植株的方法完成，例如通过选择转化的苗并在含有适当营养物、植物激素等的培养基上继代培养所述苗。
可以在EP-A-0449375中找到植物转化的其它叙述。
甚至可以参考Spngstad等(1995 Plant Cell Tissue Organ Culture 40第1-15页)，因为这些作者提供了转基因植物构建的一般性概述。
在一个实施方案中，所述植物是葡萄藤。在本领域中有一些关于怎样制备转化葡萄藤的叙述。例如，可以参考Baribault等(J Exp Bot41(229)1990 1045-1050)、Baribault等(Plant Cell Rep 8(3)1989 137-140)、Scorza等(J Am Soc Horticultural Science 121(4)1996 616-619)、Kikkert等(Plant Cell Reports 15(5)1996 311-316)、Golles等(ActaHortic 1997第447卷号体外培养和育种的园艺生物技术第265-275页)、Gray和Scorza(WO-A-97/49277)和Simon Robinson等(“21世纪的生物技术-食品和健康”中提交的会议摘要和论文，Adelaide，澳大利亚，1998)。做为实例，Robinson等(出处同上)公开了转化葡萄藤的方法，其中在从另一种组织形成的愈伤组织上诱导体细胞胚，使用农杆菌感染将靶基因转移进所述胚组织。
可以进一步参考Andrew Walker在Nature Biotechnology(14卷，1996年5月，第582页)中的叙述，表述为“葡萄做为世界上最重要的水果植物之一，非常难以进行工程改造，因为它有高水平的鞣质和酚，它们干扰细胞培养和转化；所述化合物快速氧化并促使葡萄细胞腐烂。”在同一期Nature Biotechnology中，Perl等(第624-628页)报道了使用聚乙烯聚吡咯烷酮和二硫苏糖醇的组合改进农杆菌感染时葡萄转化的生存力。
由此，本发明提供了转化葡萄的替代方法。在此方面，按照本发明转化的葡萄原位产生的抗氧化剂改进了农杆菌感染时葡萄转化的生存力。
因此，按照本发明的一个方面，提供了原位制备的抗氧化剂用于有效转化葡萄的用途。
在一些情况下，需要使所述重组酶或蛋白质容易地分泌进入所述培养基以做为其中的抗氧化剂起作用或在其中产生抗氧化剂。在这种情况下，将编码所述重组酶的DNA融合至特别是源自选定宿主的合适的信号序列、适当的启动子和适当的终止子。
例如，为在黑曲霉中表达，将gpdA(源自构巢曲霉(Aspergillusnidulans)的甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因)启动子和信号序列融合至编码所述成熟裂合酶的DNA的5’末端。将源自黑曲霉trpC基因的终止子序列置于所述基因的3’(Punt，P.J.等，1991-(1991)J.Biotech.17，19-34)。将此构建物插入含有大肠杆菌复制起点和选择起点以及黑曲霉的选择标记的载体。黑曲霉的选择标记的实例是amdS基因、argB基因、pyrG基因、hygB基因、BmlR基因，它们都已被用于选择转化体。该质粒可以转化进入黑曲霉，可以从所述转化体的培养基中回收成熟的裂合酶。最终可以将此构建物转化进入蛋白酶缺陷型菌株，以降低所述裂合酶在培养基中的蛋白酶水解降解(Archer D.B.等1992-Biotechnol.Lett.14，357-362)。
另外，如上述表明的，除了使用黑曲霉做为宿主外，还有其它工业上重要的微生物可以用作表达系统。这些其它宿主的实例包括米曲霉(Aspergillus oryzae)、曲霉属菌种(Aspergillus sp.)、木霉属菌种(Trichoderma sp.)、酿酒酵母、克鲁维酵母属菌种(Kluyveromycessp.)、汉逊酵母属菌种(Hansenula sp.)、毕赤酵母属菌种(Pichia sp.)、枯草杆菌(Bacillus subtilis)、解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)、芽孢杆菌属菌种(Bacillus sp.)、链霉菌属菌种(Streptomyces sp.)或大肠杆菌。
按照本发明，可以将合适的标记或选择工具导入欲用所述核苷酸序列转化的宿主。合适的标记或选择工具的实例在以下文献中的任何一个中都有描述WO-A-93/05163、WO-A-94/20627、GB专利申请第9702591.0号(1997年2月7日申请)、GB专利申请地9702576.1号(1997年2月7日申请)、GB专利申请第9702539.9号(1997年2月7日申请)、GB专利申请地9702510.0号(1997年2月7日申请)和GB专利申请第9702592.8号(1997年2月7日申请)。
简言之，本发明涉及包括制备一种包含抗氧化剂和至少一种其它组分的介质的方法，该方法包括在所述介质中原位制备所述抗氧化剂；并且其中所述抗氧化剂通过使用重组DNA技术从葡聚糖制备和/或所述抗氧化剂通过使用重组葡聚糖裂合酶制备。
在一个优选实施方案中，本发明涉及制备包括抗氧化剂和至少一种其它组分的介质的方法，所述方法包括在所述介质中原位制备所述抗氧化剂；并且其中所述抗氧化剂通过使用重组葡聚糖裂合酶由葡聚糖制备。
在一个更优选的实施方案中，本发明涉及制备包含抗氧化剂和至少一种其它组分的介质的方法，所述方法包括在所述介质中原位制备所述抗氧化剂；其中所述抗氧化剂通过使用重组葡聚糖裂合酶由葡聚糖制备；并且其中所述抗氧化剂是果糖酐。
现在仅通过实施例描述本发明。转基因葡萄按照Perl等(出处同上)的叙述制备转基因葡萄，但是其中使用聚乙烯聚吡咯烷酮和二硫苏糖醇的组合是可选的。在这些研究中，用如SEQ ID No 7-12提出的任何一个核苷酸序列转化所述葡萄。所述转化导致原位制备1，5-D-果糖酐。由于前述的一个或多个理由，所述转化的葡萄是有益的。
这些研究的细节如下。转化研究的组织培养系统从葡萄优质无核栽培品种(Vitis vinifera CV Superior Seedless)的花药营养组织发育出长期体细胞胚发生(somatic embryogenic)愈伤组织培养物。先前描述了花药培养、诱导体细胞胚发生和胚胎培养物的保持方法(Perl等，1995，Plant Sci 104193-200)。简言之，将胚胎发生愈伤组织保持在固化(0.25％脱乙酰吉兰糖胶)MS培养基(Murashige和Skoog，1962，Physiol Plant 15473-497)上，该MS培养基添加了6％蔗糖、2mg/L 2，4-二氯苯氧基乙酸(2，4-D)、5mg/L吲哚-3-天冬氨酸(IASP)、0.2mg/L 6-苄基腺嘌呤(BAP)和1mg/L脱落酸(ABA)。将所述愈伤组织转移至添加了同样的植物激素但用2mg/L 2-萘氧基乙酸(NOA)取代了2，4-D的MS培养基上，诱导原胚发生愈伤组织。该阶段用于转化实验。农杆菌菌株为研究葡萄胚胎发生愈伤组织对存在不同农杆菌菌株的敏感性、或者为进行稳定转化实验，使用以下根癌农杆菌菌株尝试协同培养EHA 101-p492(Perl等1993，Bio/Technology 11715-718)；LBA4404-pGPTV(Becker等，1992，Plant Mol Biol 201195-1197)；和GVE3101-pPCV91(Vancanneyt等，1990，Mol Gen Genet 220245-250)。这些菌株带有分别赋予对卡那霉素(nptII)、basta(bar)和潮霉素(hpt)抗性的双载体，它们均在胭脂氨酸合酶(NOS)启动子和终止子的控制之下。将细菌在液体LB培养基中与抗生素一起于28℃、200rpm下培养24小时。协同培养为研究葡萄胚胎发生愈伤组织对不同农杆菌菌株的敏感性，从农杆菌菌株的过夜培养物制备具有不同光密度(于630nm时为0.1-0.7)的细菌培养物。将细菌于5000rpm离心5分钟，再悬浮于无抗生素McCown Woody植物培养基(WPM)(Lloyd和McCown，1981，Int PlantProp Soc Proc 30421-427)。将3克鲜重的胚胎发生愈伤组织(转移至含有NOA的培养基7天后)再悬浮于10ml过夜培养细菌悬浮液5分钟，吸干并转移至含有再生培养基[基础WPM培养基，添加噻苯隆(TDZ)(0.5mg/L)、玉米素核苷(ZR)(0.5mg/L)和蔗糖(3％)]的培养皿。用脱乙酰吉兰糖胶(0.25％w/v)固化所述再生培养基，所述愈伤组织在起始时排干多余的细菌后，于25℃于黑暗中协同培养不同的时间(从5分钟至7天)。对于稳定转化实验，从LBA 4404或GVE 3101的过夜培养物制备接种物(于630nm时OD 0.6)。将细菌于5000rpm离心5分钟，再悬浮于无抗生素WPM培养基中。将胚胎发生愈伤组织(3克鲜重)再悬浮于10ml细菌中5分钟，吸干并转移至含有固化(0.25％w/v)脱乙酰吉兰糖胶再生培养基的培养皿，该培养基添加了不同的抗氧化剂。所述愈伤组织于25℃于黑暗中协同培养48小时。选择性培养协同培养48小时后，将所述胚胎发生愈伤组织在含有抗氧化剂的再生培养基上于黑暗中保持7天。接着，将愈伤组织收集在无菌金属网上，在40μE/m2/s(白色荧光管)下于25℃转移至新鲜WPM再生培养基。所有的再生培养基都添加了400mg/L头孢噻肟、1.5g/L麦芽汁和不同的选择标记卡那霉素(50-500mg/L)、潮霉素(15mg/L)和Basta(1-10mg/L)。使用了潮霉素浓度的周期性增加。将推测的转化愈伤组织在添加了15mg/L潮霉素的再生培养基上培养。每二周将再生的愈伤组织转移至分别添加了20和25mg/L潮霉素的新鲜培养基上。亦将对照、未转化的葡萄愈伤组织在选择性培养基上培养，并周期性地暴露于升高的潮霉素浓度。将在选择性再生培养基上培养8-10周的愈伤组织上发育的绿色不定胚转移至发芽培养基。如所述(Perl等，1995，Plant Sci 104193-200)，在WPM上诱导胚胎发芽、生根和后续小植物的发育，所述WPM添加了25mg/L潮霉素或10mg/Lbasta。使用如所述(Perl等，1995，Plant Sci 104193-200)添加了0.1mg/L NAA的固化WPM培养基，得到玻璃化异常小植物向正常外表葡萄小植物的转化。转基因马铃薯可以在我们的共同未决的专利申请PCT/EP96/03053、PCT/EP96/03052和PCT/EP94/01082(每个的内容通过引用结合到本文中)中找到马铃薯转化的一般叙述。
对于目前的研究，采用了以下程序。质粒构建将含有辅助vir质粒pRAL4404(Hoekema等，1983 Nature 303第179-180页)的解除武装(disarmed)的根癌农杆菌菌株LBA 4404，在含有100mg l-1利福平和500mg l-1硫酸链霉素的YMB琼脂(K2HPO4.3H2O660mg l-1，MgSO4200mg l-1，NaCl 100mg l-1，甘露醇10g l-1，酵母膏400mg l-1，0.8％w/v琼脂，pH7.0)上培养。使用Holters等的冻融法(1978 Mol Gen Genet 163 181-187)，用pVICTOR IV GNG E35S nagBIV2’或pVICTOR IV GNG rbc nagB IV2’或pVICTOR IV GNG E35SnagB’(各对应于pVICTOR IV GNG E35S nagB IV2或pVICTOR IVGNG rbc nagB IV2或pVICTOR IV GNG E35S nagB，但是其中那些质粒的每一个亦含有与功能性启动子可操作地连接的如SEQ ID No 7-12所示的任何一个核苷酸序列)完成转化，将转化体在含有100mg l-1利福平和500mg l-1链霉素和50mg l-1硫酸庆大霉素的YMB琼脂上选择。植物转化将马铃薯Saturna栽培品种(Solanum tuberosum cv Saturna)的苗培养物在含有Murashige Skoog基础盐(Sigma M6899)(Murashige和Skoog，1965，Physiol Plant 15 473-497)、具有2μM硫代硫酸银和如Linsmaier和Skoog(1965 Physiol Plant 18 100-127)描述的营养物和维生素的LS琼脂上保持。以每日16小时光周期于25℃保持所述培养物。约40天后，进行继代培养，在此期间除去叶，将苗切成约8mm长的单节段。
将约40天成熟度(5-6cm高)的苗培养物切成8mm的节间段，将其放置在液体LS培养基中，该培养基含有用pVICTOR IV GNG E35SnagB IV2’或pVICTOR IV GNG rbc nagB IV2’或pVICTOR IV GNGE35S nagB’转化的根癌农杆菌(A660＝0.5，光程1cm)。于室温温育30分钟后，通过将所述节间段于无菌滤纸上吸干干燥，转移至含有2mg l-12，4-D和500μg l-1反式玉米素的LS琼脂(0.8％w/v)。用滤纸覆盖所述外植体，用LS培养基湿润，用纱布于25℃覆盖3天。该处理后，用含有800mg l-1羧苄青霉素的液体LS培养基洗涤所述节段，转移至含有1mg l-1反式玉米素、100μg l-1赤霉酸(GA3)、具有做为选择剂的蔗糖(例如7.5g l-1)和葡糖胺(例如2.5g l-1)的LS琼脂(0.8％w/v)。
每3-4周将所述节段继代培养至新鲜基质。在3-4周内，从所述节段发育出苗，新苗的形成持续3-4个月。再生苗生根将再生的苗转移至包含LS-基质、琼脂(8g/l)和羧苄青霉素(800mg/l)的生根基质。
通过按照Hodal，L.等所述(Pl.Sci.(1992)，87115-122)对共导入的β-葡糖醛酸酶基因进行GUS检测，可以确认转基因植物。
或者，通过进行NPTII检测(Radke，S.E.等，Theor.Appl.Genet.(1988)，75685-694)或通过按照Wang等所述(1993，NAR 21第4153-4154页)进行PCR分析，可以确认所述再生苗的转基因基因型。转移至土壤将新生根的植株(高度约2-3cm)从生根基质移植至土壤，置于生长室中(21℃，16小时光照200-400uE/m2/秒)。当所述植株已经确立后，将其转移至温室，它们在温室中生长至发育出块茎，并且植株上部衰老。收获约3个月后收获马铃薯。转基因玉米植株介绍自从1983年首次发表转基因植物的产生(Leemans，1993Biotechnology 11 s22)以来，有许多产生转基因植物的公告，包括特别是双子叶作物。
直至最近，几乎没有成功产生转基因单子叶作物的报道。单子叶植物的这种相对较慢的进展有二个原因。首先，直至二十世纪80年代早期，从单子叶植物的培养细胞和组织有效再生植株一直是非常困难的。通过将来自保留形态发生潜力的未成熟和胚胎发生组织的外植体在含有植物生长调节剂的营养培养基上培养，最终解决了这个问题。其次，单子叶植物不是根癌农杆菌的天然宿主，意味着在双子叶植物中使用它们的天然载体根癌农杆菌成功开发的技术多年来在单子叶植物中是不成功的。
不过，现在可以使用诸如以下的方法成功地转化并产生育性转基因玉米植株(1)碳化硅晶须；(2)粒子轰击；(3)PEG处理的原生质体摄入DNA；或(4)在组织电穿孔中摄入DNA。可以使用每个这些方法制备特别是按照本发明的转基因玉米，Thompson综述了这些方法(1995 Euphtytica 85第75-80页)。
具体地说，粒子枪方法已经成功地用于单子叶植物的转化。不过，EP-A-0604662报道了转化单子叶植物的不同方法。所述方法包括在去分化下或去分化后用含有使用潮霉素抗性基因做为选择性标记的超级双载体的农杆菌转化单子叶植物的培养组织。使用潮霉素选择证明转基因愈伤组织和植株的产生。可以使用该方法制备特别是按照本发明的转基因玉米。
在EP-A-0604662的方法之后，EP-A-0672752报道了非去分化的未成熟胚。在此方面，同时使用了潮霉素抗性和PPT抗性基因做为选择标记，PPT产生10％或更多的独立转化植株。可以使用该方法制备特别是按照本发明的转基因玉米。
迄今为止，看来可以从容易培育的变种-例如近交系A188成功地产生转基因玉米植株。在此方面，请参见Ishida等的叙述(1996 NatureBiotechnology 14第745-750页)。可以使用由这些研究工作者公开的方法制备特别是按照本发明的转基因玉米植株。
Vasil(1996 Nature Biotechnology 14 702-703页)发表了玉米转化的进一步的综述文章。尽管可以使用例如粒子枪介导的转化制备转化的玉米，但是对于本研究采用了以下的程序。质粒构建将含有辅助vir质粒pRAL4404(Hoekema等，1983 Nature 303 179-180页)的解除武装的根癌农杆菌菌株LBA 4404，在含有100mg l-1利福平和500mg l-1硫酸链霉素的YMB琼脂(K2HPO4.3H2O 660mg l-1，MgSO4200mg l-1，NaCl 100mg l-1，甘露醇10g l-1，酵母膏400mg l-1，0.8％w/v琼脂，pH7.0)上培养。使用Holters等的冻融法(1978 Mol GenGenet 163 181-187)，用pVICTOR IV GNG E35S nagB IV2’或pVICTOR IV GNG rbc nagB IV2’或pVICTOR IV GNG E35S nagB’完成转化，将转化体在含有100mg l-1利福平和500mg l-1链霉素和50mg l-1硫酸庆大霉素的YMB琼脂上选择。分离和协同培养外植体分离尺寸为1.5-2.5mm的例如玉米品系A188的未成熟胚，于25℃在光照下与N6-AS中的根癌农杆菌菌株LBA 4404协同培养2-3天。其后，用含有250mg/l的氨噻肟头孢霉素的无菌水洗涤所述胚，并将所述胚转移至LS培养基和250mg/l的氨噻肟头孢霉素和浓度高至100mg/l的葡糖胺(所述培养基此后称为LSS1)选择转基因植物的条件将所述外植体在LSS1培养基上培养3周，然后转移至含有葡糖胺和氨噻肟头孢霉素的LS培养基。在此培养基上3周后，分离绿色的苗。转化苗生根将转化的苗转移至含有2mg/l的MS培养基以生根。在此培养基上4周后，将小植株转移至装有无菌土壤的盆中驯化。转基因瓜尔豆植株按照Joersbo和Okkels所述(PCT/DK95/00221)，使用携带合适质粒的根癌农杆菌LBA4404转化瓜尔豆的子叶外植体。
按照本发明可以转化其它植物，诸如其它水果、其它蔬菜和其它诸如咖啡植物、茶树的植物等等。
对本发明的其它修饰对本领域技术人员是显而易见的。序列表(1)一般资料(i)申请人(A)姓名DANISCO A/S(B)街道LANGEBROGADE 1(C)城市COPENHAGEN(D)州COPENHAGENK(E)国家丹麦(F)邮政编码DK-1001(2)SEQ ID NO1的信息(i) 顺序特征(A)长度1088个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑学线性(ii) 分子类型蛋白质(xi) 顺序描述SEQ ID NO1Met Phe Ser Thr Leu Ala Phe Val Ala Pro Ser Ala Leu Gly Ala Ser1 5 10 15Thr Phe Val Gly Ala Glu Val Arg Ser Asn Val Arg Ile His Ser Ala20 25 30Phe Pro Ala Val His Thr Ala Thr Arg Lys Thr Asn Arg Leu Asn Val35 40 45Ser Met Thr Ala Leu Ser Asp Lys Gln Thr Ala Thr Ala Gly Ser Thr50 55 60Asp Asn Pro Asp Gly Ile Asp Tyr Lys Thr Tyr Asp Tyr Val Gly Val65 70 75 80Trp Gly Phe Ser Pro Leu Ser Asn Thr Asn Trp Phe Ala Ala Gly Ser85 90 95Ser Thr Pro Gly Gly Ile Thr Asp Trp Thr Ala Thr Met Asn Val Asn100 105 110Phe Asp Arg Ile Asp Asn Pro Ser Ile Thr Val Gln His Pro Val Gln115 120 125Val Gln Val Thr Ser Tyr Asn Asn Asn Ser Tyr Arg Val Arg Phe Asn130 135 140Pro Asp Gly Pro Ile Arg Asp Val Thr Arg Gly Pro Ile Leu Lys Gln145 150 155 160Gln Leu Asp Trp Ile Arg Thr Gln Glu Leu Ser Glu Gly Cys Asp 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权利要求
1.制备包含抗氧化剂和至少一种其它组分的介质的方法，该方法包括在所述介质中原位制备所述抗氧化剂；并且其中通过使用重组DNA技术从葡聚糖制备所述抗氧化剂。
2.按照权利要求1的方法，其中所述葡聚糖包含α-1，4键。
3.按照权利要求1或2的方法，其中所述葡聚糖是淀粉。
4.按照前述任何一项权利要求的方法，其中所述葡聚糖是重组酶的底物，使得所述葡聚糖与所述重组酶的接触产生所述抗氧化剂。
5.按照权利要求1-4的任何一项的方法，其中所述酶是葡聚糖裂合酶。
6.按照权利要求5的方法，其中所述酶是α-1，4-葡聚糖裂合酶。
7.按照权利要求6的方法，其中所述酶包含如SEQ ID No 1-6所示的任何一个序列或其变异体、同源物或片段。
8.按照权利要求7的方法，其中所述酶是如SEQ ID No 1-6所示的任何一个序列。
9.按照权利要求5-8的任何一项的方法，其中所述酶由包含如SEQ ID No 7-12所示的任何一个序列或其变异体、同源物或片段的核苷酸序列编码。
10.按照权利要求9的方法，其中所述酶由具有如SEQ ID No 7-12所示的任何一个序列的核苷酸序列编码。
11.按照前述权利要求的任何一项的方法，其中所述抗氧化剂是果糖酐。
12.按照权利要求11的方法，其中所述抗氧化剂是1，5-D-果糖酐。
13.按照前述权利要求的任何一项的方法，其中所述介质是食品或用于制备食品。
14.按照权利要求13的方法，其中所述食品是饮料。
15.按照权利要求14的方法，其中所述饮料是酒精饮料。
16.按照权利要求14的方法，其中所述饮料是葡萄酒。
17.按照前述权利要求的任何一项的方法，其中在所述组分中原位制备所述抗氧化剂并且然后释放进入所述介质。
18.按照前述权利要求的任何一项的方法，其中所述组分是植物或其部分。
19.按照权利要求18的方法，其中所述组分是谷物或水果的整体或一部分。
20.按照权利要求20的方法，其中所述组分是葡萄的整体或一部分。
21.制备包含抗氧化剂和至少一种其它其它组分的介质的方法，所述方法包括在所述介质中原位制备所述抗氧化剂；并且其中通过使用重组葡聚糖裂合酶制备所述抗氧化剂。
22.按照权利要求21的方法，其中所述葡聚糖裂合酶是在权利要求6-10任何一项中定义的葡聚糖裂合酶。
23.用按照任何一项前述权利要求的方法制备的介质。
24.果糖酐做为包含至少一种其它组分的介质的抗氧化剂的用途，其中所述果糖酐在所述介质中原位制备。
25.果糖酐做为在植物中赋予或改进逆境耐性的手段的用途，其中所述果糖酐在所述植物中原位制备。
26.果糖酐做为赋予或改进葡萄转化的手段的用途，其中所述果糖酐在所述葡萄中原位制备。
27.葡聚糖裂合酶做为在植物中赋予或改进逆境耐性的手段的用途，其中所述葡聚糖裂合酶在所述植物中原位制备。
28.葡聚糖裂合酶做为赋予或改进葡萄转化的手段的用途，其中所述葡聚糖裂合酶在所述葡萄中原位制备。
29.编码葡聚糖裂合酶的核苷酸序列做为在植物中赋予或改进逆境耐性的手段的用途，其中所述核苷酸序列在所述植物中原位表达。
30.编码葡聚糖裂合酶的核苷酸序列做为赋予或改进葡萄转化的手段的用途，其中所述核苷酸序列在所述葡萄中原位表达。
31.基本上如本文描述的方法或介质。
全文摘要
描述了制备抗氧化剂的方法。所述方法包括制备包含抗氧化剂和至少一种其它组分的介质。所述方法包括在所述介质中原位制备所述抗氧化剂。通过或者使用重组DNA技术从果糖酐制备所述抗氧化剂和/或者通过使用重组葡聚糖裂合酶制备所述抗氧化剂。
文档编号C12N9/88GK1261915SQ98806848
公开日2000年8月2日 申请日期1998年5月6日 优先权日1997年5月6日
发明者A·布克特－拉森, I·马库森 申请人:丹尼斯科有限公司