专利名称：提高天然产生的细胞质雄性不育以及恢复雄性能育的方法和其在杂交作物生产中的应用的制作方法
背景技术：
(a)发明领域本发明涉及提高天然产生的细胞质雄性不育的方法以及恢复雄性能育的方法和其在杂交作物生产中的应用。
(b)现有技术的描述对于许多植物，由两种或多种不同植株杂交形成的杂种比亲本植株本身提供更高的产量。例如，在加拿大最重要的作物，蔓青(canda)(Brassica napus，campestris)，人工产生的杂种具有比其亲本系可高达50％的产率。这种称之为杂种优势的现象已被最成功地应用于玉米(Zea mays)中。杂交玉米占北美作物的约90％。
为了以商业规模生产杂交种子，必须防止杂交的种子亲本的自体受粉。这在玉米中为相对简单的事情，因为雄性或产生花粉的器官(雄蕊)位于植株不同于雌性或具种子器官(心皮)的部位，并且共同形成称之为雄穗的结构的雄蕊可很容易地通过人工从大量用于生产种子的操作的植物中去除。相反，在大多数作物种类中，如蔓青，雄蕊和心皮位于同一花结构中，大量植株的人工去雄是不可能的。因此，种子生产者需要其它受粉控制方法来在这些作物中产生杂种。开发用于此目的的技术的综述可见于The PBI Bulletinarticlen of Arnison P.(Arnison P.等，The PBI Bulletin，1997，1，1-11)。
另一种方法是使用特异性地杀死花粉的称之为杀配子剂的化学物质。这些化学物质通常价格昂贵并常常仅为部分有效。对于大多数作物，尤其对于象在长时期内开花的蔓青的那些，这种类型的受粉控制成本-效果比不佳。因此，几乎所有的杂交种子生产系统取决于受粉的遗传控制。遗传受粉控制机理分为三种类型自交不亲和性、“分子杂交”方法和细胞质雄性不育。
自交不亲和性(SI)产生于一些植物排斥其自身花粉的能力。表现出SI的植物可被用作产生杂种的雌性系，但由于这些植物通常排斥其自身的花粉，繁殖或保持这些植株系通常是困难且成本-效果不佳。此外，在大多数植物种类中未发现自交不亲和性。分子杂交方法是最近开发的。它们取决于由毒性蛋白在花粉形成细胞中的特定表达而导致的遗传改造的雄性不育。这些导入的毒素基因起显性雄性不育基因的作用并可被用来产生用于杂交种子生产的雌性系。如对于SI，这些雌性系的繁殖不简单且涉及植物材料的损失。这些方法的这些用途仍不清楚，并且目前它们被用于仅生产一些杂交变异体，并且这些未被广泛培育。
细胞质雄性不育(CMS)是广泛分布以及传统的非孟德尔特征。CMS植物不能自体受粉，因此当CMS系与雄性能育系并排种植时，在不育植物中形成的所有种子将是两个亲本的杂种。不象大多数特征，CMS是母本传递，即它仅通过种子亲本传给后代。该特性来自于这一事实，即决定CMS的基因或多个基因位于线粒体DNA(mtDNA)上；不象位于核DNA中的大多数基因，在大多数植物种类中，mtDNA中的基因仅通过雌性传递。作为母体传递这一特性的结果，可容易地通过用雄性能育系“保持”系受粉繁殖雌性CMS系，其中“保持”系在其核基因方面与CMS系相同，但由于缺乏导致CMS的mtDNA，它为雄性能育的。然而，又作为CMS的母体传递的结果，使用雌性CMS系产生的杂交植物还将为雄性不育的，因为它们带有传递雄性不育的mtDNA。这对于种子作物，如玉米或蔓青存在问题，它们需要产生花粉用于为被收集产物的种子形成。庆幸的是，在许多作物种类中，已确定了可抑制雄性不育现象并“恢复”到能育性F1杂种的称之为能育性恢复者“Rf”的特定的显性核基因。因此，CMS体系的成分由CMS系，保持系和恢复系组成，其中CMS系包含雄性不育(S)细胞质(或mtDNA)并为隐性或恢复基因的保持等位基因纯合，保持系包含能育或正常mtDNA(F)，但在核基因座与CMS系为同基因，并且恢复系通常包含雄性不育mtDNA，但对于显性核Rf基因为纯合的。这些成分在杂交种子的产生方案中的使用示于
图1中。
为了使用CMS产生不同组的杂种，必须获得足够数量的包含Rf基因的恢复系以及由CMS mtDNA导致的不育的“保持”系。通过常规遗传方法开发这些系是一个最少需要数年努力的缓慢过程。例如，为了开发一个新的恢复系，必须首先将受体系与现有的恢复系杂交以导入Rf等位基因。接着需要一系列的回交以恢复受体系的基因型。甚至在进行许多代回交后，与Rf基因连锁的一些供体DNA将保留称之为连锁阻碍的现象；该供体DNA可携带有有害的特性并损害受体植株的品质。
两个CMS系统被证实在杂交蔓青种子生产中具有一些有限的用途。Polima或pol细胞质能在许多蔓青栽培品种中传递雄性不育，并已确定在一个核恢复系基因座中具有显性等位基因的有效的恢复系。使用该系统生产杂种的成本-效果比受这一事实的限制，即pol诱导的雄性不育有可能是不完全的或“渗漏的”，尤其是当雌性系暴露于较温暖的生长条件下时。结果，pol杂交种子可能被由雌性系的自体授粉产生的CMS种子污染。由于这些CMS植株为雄性不育的并不能自发地结种，因此它们的存在可显著降低“杂交”混合物的总的产率。第二个CMS系统基于使用杂种细胞质，其中雄性不育决定子来自称之为Ogura或ogu的萝卜细胞质。由ogu细胞质传授的雄性不育是完全的。最近可获得通过将一个萝卜恢复基因(在本文称为Rfo)渐渗入蔓青中而开发的该系统的恢复系，但恢复系的开发受恢复基因与对种子质量具有副作用的基因之间的“连锁阻碍”所妨碍。
极其希望提供提高天然产生的细胞质雄性不育的方法以及恢复雄性能育的方法和其在杂交作物生产中的应用。
发明概述本发明的一个目的是提供提高天然产生的细胞质雄性不育的方法以及恢复雄性能育的方法和其在杂交作物生产中的应用。
根据本发明，提供一种在植物中提高天然产生的细胞质雄性不育的方法；它包括下面的步骤a)向植物细胞的细胞核中导入本质上由编码线粒体转运肽的序列组成的基因构建体，其中该序列在至少一个未改变形式的蔓青(Brassica napus)线粒体的atp6基因和orf224基因的上游和框内与其融合；b)选择具有步骤a)的基因构建体的植物细胞；和c)诱导选择的植物细胞再生以产生成熟的植物。
根据本发明，还提供一种将雄性能育恢复成细胞质雄性不育植物的方法；它包括下面步骤a)向植物细胞的细胞核中导入本质上由编码线粒体转运肽的序列组成的基因构建体，其中该序列在与异常CMS相关线粒体基因共转录的改变形式的正常线粒体基因的上游和框内与其融合；b)选择具有步骤a)的基因构建体的植物细胞；和c)诱导选择的植物细胞再生以产生成熟的植物。
优选的植物为蔓青(Brassica napus)。
优选地，使用植物转化载体，如pRD400进行b)。
根据本发明，还提供一种将雄性能育恢复成polima细胞质雄性不育蔓青的方法；它包括下面步骤a)向蔓青植物细胞的细胞核中导入本质上由编码线粒体转运肽的序列组成的基因构建体，其中该序列在改变形式的蔓青线粒体的atp6基因的上游和框内与其融合；b)选择具有步骤a)的基因构建体的植物细胞；和c)诱导选择的植物细胞再生以产生成熟的植物。
我们的结果推出pol CMS在生产杂交蔓青和其它芥属(Brassica)作物的实践中的应用。向pol CMS植物中导入使得能靶定改变形式的芥属atp6基因的产物于线粒体的遗传构建体代表了一种新型的方法，通过该方法恢复了雄性能育的植物可被恢复；这应使得能在通过植物转化的单一个步骤中产生新的pol CMS恢复系。这代表比目前生产且唯一可产生这些系的方法的常规植物育种方法在时间和费用上的显著的节约。此外，将能靶定未改变形式的atp6基因或orf224的产物的构建体导入线粒体中以产生具有提高的雄性不育植物代表了一种方法，通过该方法可有效地产生新的具有增强的维持雄性不育的pol CMS系；如上所述，pol雄性不育的渗漏程度是其在杂交蔓青生产中更广泛应用的主要障碍，并且没有克服它的有效方法。这些方法还可能代表用于生产提高CMS在其它CMS系统和其它植物种类中的维持或恢复的变种的更常用方法的实例。
附图简要说明图+1示细胞质雄性不育(CMS)在杂交种子生产中的应用；图2A-2J示能育，pol CMS和转基因蔓青载培品种(B.Napus CV.)Westar植物的花；图2A示pol CMS Westar(左)和用mas2’/A9-A6e构建体转化的pol CMSWestar的完整的花(注意转基因植物花瓣的增加的大小)；图2B示通过将AP3/A9-A6u导入Westar(nap)获得的部分雄性不育转基因植物(左)和雄性能育Westar(nap)的完整的花(注意转基因植物花瓣的减退的着色)；图2C示pol CMS Westar(左)和用mas2’/A9-A6e构建体转化的pol CMSWestar的除去花瓣和萼片的花；注意转基因植物增加的雄蕊大小和更加高度发育的花药；图2D示通过导入AP3/A9-A6u至Westar(nap)获得的部分雄性不育转基因植物(左)和雄性能育Westar(nap)的除去了花瓣和萼片的花(注意转基因植物花药大小的减小)；图2E示pol CMS Westar，通过导入AP3/A9-ORF构建体至雄性能育Westar(nap)获得的雄性不育转基因植物40-8和雄性能育Westar(nap)的完整的花(从左至右)；图2F示除去了花瓣和萼片的转基因植物40-8的花；注意四个内侧雄蕊转化为心皮；图2G示通过导入AP3/C4-ORF构建体至雄性能育Westar(nap)获得的部分能育转基因植物40-10(左)的完整的花；受体株Westar(nap)的花示于右侧(注意转基因植物的花瓣大小的减小)；图2H示除去了花瓣和萼片的转基因植物40-10和雄性能育Westar(nap)的花；图2I示pol CMS Westar(左)和通过导入AP3/A9-A6e构建体至pol CMSWestar获得的部分能育转基因植物40-10的完整的花(注意转基因植物的增加的花瓣大小)；图2J示pol CMS Westar(左)和通过导入AP3/A9-A6e构建体至pol CMSWestar获得的部分能育转基因植物的除去了花瓣和萼片的花(注意转基因植物的增加的雄蕊和花药大小)；图3A-3D示伴随pol CMS Westar中的mas2’驱动的A9-A6e的表达的表型变化；A转基因植物花序；蔓青pol CMS Westar花序；C整个转基因植物；Dpol CMS Westar植物(注意转基因植物增大的花序和营养节间大小)；图4示AP3/A9-A6e构建体作为显性能育恢复基因在蔓青中的应用；和图5示使用AP3/C4-ORF构建体增强蔓青的pol细胞质雄性不育。
发明详述本发明提供一种通过遗传工程开发保持系和恢复系的方法。本发明特别涉及蔓青(Brassica napus，campestris)的pol CMS系统。然而，该方法原则上可被用来改变这些系对蔓青中的其它CMS系统和大量其它作物中的CMS系统的花粉产生能力。
本发明基于1987年至1993年在我的实验室进行的蔓青(Brassica mapusL.)的细胞质显性不育的分子基础的研究。对蔓青线粒体基因组结构和表达的分析表明蔓青CMS的polima或pol形式与包含嵌合基因orf224的线粒体基因区的表达相关，其中orf224与正常的线粒体基因atp6共转录(Singh，M.P.和Brown，G.G.(1991)。植物细胞3，1349-1362；Bonen，L.和Brown，G.G.(1993)。加拿大植物学杂志71，645-660)。我们推测pol CMS是由于线粒体膜的功能异常，其中该功能异常来自于(i)线粒体膜中ORF224蛋白的存在或(ii)来自于可能由atp翻译中orf224的干扰导致的可能的ATP6蛋白的缺乏。
线粒体蛋白具有双重的遗传来源一些蛋白，可能为10％左右，包括确定CMS的那些编码在mtDNA中；其它编码在核DNA中。mtDNA编码的蛋白在线粒体核糖体中合成并保留在线粒体中。核编码的线粒体蛋白以前体的形式合成，该前体通常在N末端包含被称为转运肽或前序列的另外的氨基酸链。这种转运肽起将蛋白定向于线粒体的作用；一旦蛋白位于线粒体内，则它被蛋白酶除去。如果通常被编码在mtDNA中的蛋白的DNA序列与线粒体转运肽的DNA序列融合，并且产生的构建体被导入并在核中表达，则产生的前体肽可被运至线粒体内，最终产物可以与线粒体产生的形式相同的方式起作用。
我们总结出如果假设(i)正确，那么我们能通过表达DNA构建体将雄性不育授予雄性能育植物，其中该DNA构建体使得核编码的细胞质翻译的ORF224蛋白被靶定于线粒体。类似的，我们总结如果假设(ii)正确，我们能通过表达DNA构建体使pol CMS植物恢复雄性能育，其中该DNA构建体使得核编码的细胞质翻译形式的ATP6蛋白被靶定于线粒体。如果构建体改变雄性不育/能育，那么orf224转基因可被认为是合成的雄性不育的保持系，而atp6转基因可被认为是合成的雄性能育的恢复系。对这些假设的进一步完善来自于观察到如大多数植物线粒体转录物一样，orf224和atp6转录物被改变(Stahl R.等(1994)核酸研究22，2109-2113)。植物线粒体转录物的改变包括将mRNA分子中的特定的C残基转变为改变了被编码蛋白的氨基酸序列的U残基(改变的mRNA编码功能形式的蛋白)。atp6和orf224转录物在一个位点改变。在某种情况下导致氨基酸序列的一个改变。由于在细胞核中DNA构建体的表达，其中该DNA构建体能在转基因烟草植物中将未改变的小麦ATP9蛋白靶定为线粒体授予雄性不育(Hernould，M.等(1993).Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90，2370-2374)，看来未改变的蔓青ATP6蛋白的表达/靶定也可导致雄性不育并起合成恢复基因的作用。
这种类型的合成恢复系原则上可被用来通过基因转化产生新的恢复系。这将避免目前开发这些系的长时间和昂贵的植物育种过程。合成的保持基因的可获得性可使得能通过可完全保持pol不育性的植物转化产生这些系。这些系目前不存在，因此该技术将有效地通过基于pol的蔓青杂种除去提高产率的最后障碍。最后，类似的方法甚至也可能被用来产生非蔓青的作物的合成的恢复系和保持系，因此可开发全球性的用于CMS遗传改造的保持和恢复的方法。
ATP6和ORF224蛋白的细胞核编码的线粒体靶定形式可分别起合成的恢复和保持基因的作用的证据为了开始研究这些可能性，我们将对应于atp6编码序列的改变(A6e)和未改变(A6u)形式的DNA与编码两种线粒体靶定前序列，酵母COX4(C4)或Neurospora ATP9(A9)之一的DNA融合。通过将相同的前序列与未改变形式的orf224(ORFu)融合制备类似的构建体。这些序列在其5’末端与mas2’启动子连接(van der Leegt-Plegt，L.M.等(1992)植物细胞报道11，20-24)和在其3’末端与花椰菜花叶病毒35S RNA的聚腺苷酸化信号连接。通过土壤杆菌介导的转化将产生的构建体导入蔓青的子叶中(Moloney，M.等(1989)植物细胞报道8，238-242)。我们不能再生ORFu被导入其中的植物。在将A9/A6u构建体导入能育的蔓青后我们收获的三种转基因植物为部分雄性不育的，而在将A9/A6e构建体导入不育pol CMS蔓青后我们收获的一种植物是部分雄性能育的。这表明表明未改变形式的atp6的构建体起雄性诱导或保持基因的作用，而改变形式起pol能育恢复系的作用。不幸的是，我们未能从表达任一构建体的植物中收获种子，因此未能表明能育/不育的变化可被遗传转至随后的植物世代中或证实表型来自转基因的表达。
最近的研究集中在构建体的组装，其中来自拟南芥的APETALA3(AP3)基因的发育调节启动子(Jack，T.等(1994)细胞76，703-716)被用来驱动atp6和orf224构建体的表达。由于其在雄蕊(以及花瓣)发育的极早期表达，AP3被选择作为组织特异性启动子。以前的数据表明与pol CMS相关的花粉发育的抑制是成熟前的，因此仅在雄蕊发育的早期发生；我们因此认为为了补偿或模拟pol CMS表型，必须在雄蕊发育的早期表达构建体。已完成或目前正构建的随后的构建体包括“组成型”mas2’启动子被用于表达那个。所有的构建体被插入至双转化载体pRD400中，其中该载体被优化用于在蔓青中的有效转化并通过子叶转化方法导入植物中。我们组装的构建体的总结和我们收获的转基因植物的表型示于下面表1中。
表1遗传构建体和转基因植物的相应表型构建体1导入 KanR收获 证实的 证实的转基因植物的表型的植物 转基因2AP3/C4-ORF3能育17 12 从几乎完全不育(2株植物)Westar 至完全能育(大多数植株)的(nap) 可变的雄性不育；一些植株在花器官数目、形态学和同一性方面显示出改变。AP3/A9-ORF ″ 21 7从几乎完全不育(1株植物)至完全能育(大多数植株)的可变的雄性不育；一些植株在花器官、形态学和同一性方面显示出改变。AP3/A9-A6e 雄性不 9 7所有植物为部分雄性不育；育 雄蕊和花瓣大小处于能育Westar Westar(nap)和estar(pol)CMS(pol) 植物之间。AP3/A9-A6u 能育20 9大多数植物为雄性能育，一Westar 些花部分不育；一些植物显(nap) 示减小的雄蕊；淡黄色花瓣；轮同一性和/或器官数目变化。mas2/A9-A6e 雄性不2216大多数植物为部分雄性能育育；雄蕊和花瓣大小位于能Westar育westar(nap)和Westar(pol) (pol)CMS植物之间；一些植物显示花轮同一性的变化；延长的花序和营养节间。AP3/GUS Westar139 与Westar(nap)相同；如所期(nap) 望的，在花瓣和雄蕊基部观察到GUS表达。
1序列中存在的构建体元件启动子/编码前序列的序列AP3，Arabidopsis APETELA3启动子，C4，酵母COX4前序列；A9，Neurospora ATP9前序列；ORF，改变的orf224编码序列；A6e，改变的atp6编码序列；A6u，未改变的atp6编码序列。
2通过使用来自NPTII基因的探针的Southern印迹分析所证实的。
3与A9前序列融合的表位标记改变的atp6编码序列。
4改变的atp6编码序列，无靶定的前序列。
表2的数据表明各种构建体诱导转基因植物中的雄性不育或能育变化的频率。在转基因植物中观察到的雄性能育/不育以及花结构的一些变化示于图2中。
示于图2A左侧和图2B右侧的花分别来自pol CMS Westar和能育Westar(nap)植物。其各自下面的图(分别为2C和2D)显示来自除去了花瓣和萼片的相同植物的花。如这些图中所示，pol CMS植物的雄蕊和花瓣大大小于Westar(nap)花的雄蕊和花瓣。在控制的生长条件下，我们采用(20℃，16小时光照，15℃，8小时黑暗)，在幼嫩的pol CMS植物1花中形成的雄蕊比雌蕊的高度的一半小很多，不完全发育形成花药，仅释放少量的花粉。
表2具有改进的雄性能育/不育性的转基因植物的数目构建体 受体植物 能育1半能育2半不育3不育3AP3/A9-ORF Westar(nap) 631AP3/C4-ORF Westar(nap) 552AP3/A9-A6e PolCMS Westar 52AP3/A9-A6u Westar(nap) 9 6Mas2’/A9-A6e PolCMS Westar 18101与Westar(nap)不能区分。
2与Westar(nap)相比减少的花粉释放；自交获得的饱满的种子荚果。
3最少的花粉释放；自交获得的差的结实4自交几乎或完全没有得到种子；一些mas2’/A9-A6e植物产生显著的花粉，但未结种，因此看来为雌性和雄性不育。
如表1和2所示，在我们发现的约一半的转基因植物中，与任一靶定前序列融合的改变的orf224编码序列的AP-3驱动的表达证实能降低Westar(nap)植物的雄性能育以及诱导花的形态学变化。如通过在新开花的花粉中可见的花粉的数量所评价的不育性的程度以及其它花异常的性质在不同程度上在不同的转基因植物和有时在更小的程度上在各个植物的不同花序支上发生变化。在COX4(C4)和ATP9(A9)前序列构建体之间在授予的表型或诱导雄性不育的频率上没有显著的不同。对所获表型的一些说明示于图2E-H中，其显示来自从中观察到花粉产生发生变化的转基因植物的花。与Westar(nap)相比，在这些植物中，花瓣和雄蕊的大小以及产生的花粉的量减少，虽然未到达它们在pol CMS植物中的减少程度。在转基因植物40-8，A9-ORF转化体(图2E和2F)观察到大多数极端的表型在这些花中，四片内侧的雄蕊转化为心皮样结构；在两个外侧雄蕊上形成的花药保持淡黄色并仅释放极少量的花粉。
我们将各个植物自花受粉结种的能力评价为对其雄性/雌性能育性的实际测定方法。对于自交植物，我们通常将一个杂交袋放在花序的上面并轻轻地拍打以促进受粉。在正常的雄性能育植物的情况下，袋中的所有种子荚将被完全填满；在这些条件下，pol CMS植物不产生或产生极少的种子。当我们设法以这种方式让表达AP3-A9-ORF构建体的转基因植物自交时，我们发现在一种情况下没有获得种子(转基因植物40-8，图2)，其它一些情况下，仅获得一些种子。在结种方面显示明显减少，但保留了产生一些花粉的能力的那些植物被称为“半不育”(表2)。通过该试验，22株转基因ORF植物中总共3株被证实为半不育。
当通过AP3启动子驱动时，与ATP9前序列融合的atp6基因的未改变形式的表达还证实能降低Westar(nap)植物的能育性(表1)。稍少于一半的收获的表达该构建体的转基因植物显示雄性能育的降低(表2)。然而，根据结种的能力雄性不育性的降低通常比ORF构建体更显著；显示表型的所有转基因植物被分类为半不育。具有降低的能育性的大多数植物还也具有小的淡黄色花瓣。由一株AP3/A9-A6u植物显示的半不育表型示于图2B和D中。我们还发现这种类型的构建体以及ORF构建体和第三种类型的AP3/A9-A6构建体，AP3/A9-A6ep可增强pol CMS植物的不育性，其中在AP3/A9-A6ep中ATP6编码序列被编码小肽的序列打断。pol CMS植物通常产生少量花粉；表达AP3-A9-A6u的pol CMS植物不释放花粉。
如图2I和J所示，pol CMS植物的改变的atp6构建体的AP3驱动的表达导致表型的变化，其与它起合成恢复基因的作用的预测一致。这些转基因植物的花具有pol CMS和能育Westar(nap)植物之间大小的花瓣和雄蕊。这些花的花药发育成产生显著量的花粉的小的黄色花药，虽然不如雄性能育Westar(nap)植物多(表1)。所有转基因植物显示改变的表型(表2)，虽然植物与植物之间产生的花粉的量发生略微的变化。这些植物在给花序套袋时均能产生种子；两个植物仅产生少量种子，同时剩余五株植物产生饱满的荚果而未进行套袋或其它类型的干扰。因此后五株植物可被认为是在完全具有功能的意义上被恢复能育性。
我们还评价了当使用“组成型”启动子mas2’表达时，A9-A6e构建体诱导pol CMS植物雄性能育性的能力。我们收获的六株转基因植物具有实质上与通过AP3/A9-A6e植物产生的那些的相同的花(图1A和1C)。其余植物产生较少量的花粉或几乎不产生花粉。仅一株产生花粉的植物能形成显著量的种子而不被人工受粉，这表明mas2’/A9-A6e植物的雌性能育性通常被降低。这与以前的使用这种类型的构建体的结果一致，其中我们收获了具有不能结种的能育花的植物。我们收获的植物的第二个特性还与我们预先的结果一致从mas2’启动子表达A9-A6e的所有植物显示营养性生长的改变。尤其是，营养性和花序节间段比Westar(nap)或pol CMS Westar植物的那些长(图3)；在一些转基因植物中，叶的形态学也被改变。在任何采用AP3启动子用于表达的植物中未观察到类似的变化。因此，雌性能育性和其它异常的减少都来自从mas2’启动子的融合蛋白的一般性表达。
对多种独立转化的植物中的类似类型的不育性改变的观察为我们最初的假设提供非常强的支持，即(i)使得ORF224或未改变的ATP6多肽靶定于线粒体的构建体可为雄性能育植物授予不育性，因此起合成的保持基因的作用；和(ii)使得改变的ATP6多肽靶定于线粒体的构建体可起合成的恢复基因的作用。数据还表明为了避免对营养生长和雌性能育性的有害作用，必须使用组织特异性或可诱导启动子表达这些构建体。对C4-ORF表达植物40-8所RO植物(从转化-再生方法获得的植物)的R1后代的分析(见上文)提供了令人信服的证据，即观察到的表型是可遗传的并且是由于转基因的原因。我们将20株这种植物培育至成熟。花表型的范围显著，从亲本植物的极其异常，其中仅两个为极其不育花药形式，其余四个花药转化为雌蕊样器官，至在许多表达该构建体的RO植物中观察到变化雄性能育性。所有R1后代植物包含转基因，这表明原有的40-8 RO植物可能具有多于一个的基因拷贝。这进一步表明表达的不育性程度取决于基因剂量。该基因剂量作用提供另一种改变由转基因植物表达的不育性程度的方法。
总之，我们的实验代表第一种情况，其中雄性不育性通过同源宿主植物中线粒体ORF产物(orf224和未改变的atp6)的靶定来诱导，芥属基因首次被用于此目的。我们的结果还强有力地表明A9-A6e构建体的AP3驱动的表达可起pol CMS的不育性恢复基因的作用。这是我们注意到的第一种情况，其中CMS的天然形式被合成基因构建体抑制。
我们的结果与其它研究者进行的实验一致，这些研究者发现大豆CMS相关的ORF(He，S.等(1996).Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.93，11763-11768)或为改变的小麦ATP9基因(Hernould，M.等(1993).Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90.2370-2374)在异源受体植物烟草中的蛋白产物的表达/靶定可诱导雄性不育。令人感兴趣的是，使用来自玉米和矮牵牛的CMS相关的ORF进行的类似类型的实验导致获得雄性不育植物(Chaumont，F.等(1995)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 92，1167-1171；Wintz H.等(1995)植物分子生物学28，83-92)。我们恢复雄性不育植物的频率高于对大豆ORF所观察到的，并难于与使用未改变的小麦ATP9基因的结果比较。
通过参考下面提供的用来说明本发明而非限制其范围的实施例更容易理解本发明。
实施例I使用AP3/A9-A6e构建体作为蔓青的显性能育恢复基因在本实施例中，通过基因转化将图4所示的A9/A6e构建体导入一品种，如通常通过(pol)细胞质不育的Westar的基因组中。将基因导入pol细胞质系中，获得的产生的转基因作为被期望为部分雄性能育。结种将该系自花受粉以产生A9/A6e转基因纯合的部分雄性能育的恢复系。接着可将该系与不同的pol CMS系杂交以产生恢复能育的F1杂种。
实施例II使用AP3/C4-ORF构建体以增强蔓青的pol细胞质雄性不育通过pol细胞质对大多数蔓青基因型诱导的不育是不完全的，尤其是在较高温度下。在杂交种子产生操作中，剩余花粉的产生导致可变化水平的CMS系的自花受粉。从这些种子培育的植物不是杂种并将具有降低的自身结种的能力。这些因素在一起可显著程度地降低“杂交”种子分批的产率。在本实施例中，采用图5所示的C4-ORF的显性传递不育的特性以降低或消除CMS系中剩余花粉的产生，从而提高获得的杂交种子的百分数，并因此提高杂交种子分批的产率。提高遗传转化将C4-ORF构建体导入完全显性能育Westar(nap)系中以产生包含C4-ORF转基因的部分显性能育系。接着让该系自花受粉以产生部分显性能育保持系，并也与相同细胞核基因型但具有pol细胞质的未转化系杂交以产生C4-ORF杂合的完全不育的polCMS系。
让它与C4-ORF部分显性能育保持系回交以产生C4-ORF纯合的完全雄性不育pol CMS系。当与pol恢复系杂交时，该CMS系产生能育F1杂种。通过将其作为雌性与nap细胞质部分雄性能育转基因C4-ORF保持系杂交来繁殖完全不育的pol CMS系。
虽然我们描述了使用AP3/C4-ORF构建体提高pol CMS作为不育性的方法，AP3/A9-A6a和AP3/A9-A6ep构建体也可被用于此目的，因为所有这些构建体的表达导致完全雄性不育pol CMS转基因植物。
虽然结合其具体的实施方案描述了本发明，但应理解它能被进一步修改，通常根据本发明的原则，本申请将覆盖本发明的任何改变，应用或修改，它们包括脱离本发明公开，落在本发明涉及的现有技术的已知或常规实践中，并可适用本文提出的必要技术特征，落入所附权利要求的范围内的那些。
权利要求
1.一种在植物中提高天然产生的细胞质雄性不育的方法；它包括下面的步骤a)向植物细胞的细胞核中导入本质上由编码线粒体转运肽的序列组成的基因构建体，其中该序列在至少一个未改变形式的Brassica napus线粒体的atp6基因和orf224基因的上游和框内与其融合；b)选择具有步骤a)的基因构建体的植物细胞；和c)诱导选择的植物细胞再生以产生成熟的植物。
2.根据权利要求1的方法，其中植物为Brassica napus。
3.根据权利要求1的方法，其中使用植物转化载体进行步骤b)。
4.一种将雄性能育恢复成细胞质雄性不育植物的方法；它包括下面步骤a)向植物细胞的细胞核中导入本质上由编码线粒体转运肽的序列组成的基因构建体，其中该序列在与异常CMS相关线粒体基因共转录的改变形式的正常线粒体基因的上游和框内与其融合；b)选择具有步骤a)的基因构建体的植物细胞；和c)诱导选择的植物细胞再生以产生成熟的植物。
5.权利要求4的方法，其中植物为Brassica napus。
6.权利要求4的方法，其中使用植物转化载体进行步骤b)。
7.一种将雄性能育恢复成polima细胞质雄性不育B.napus的方法；它包括下面步骤a)向B.napus植物细胞的细胞核中导入本质上由编码线粒体转运肽的序列组成的基因构建体，其中该序列在改变形式的B.napus线粒体的atp6基因的上游和框内与其融合；b)选择具有步骤a)的基因构建体的植物细胞；和c)诱导选择的植物细胞再生以产生成熟的植物。
全文摘要
本发明涉及提高天然发生的细胞质雄性不育的方法以及恢复雄性能育的方法和其在杂交作物生产中的应用。还公开了一种将雄性能育恢复成细胞质雄性不育植物的方法;它包括下面步骤:a)向植物细胞的细胞核中导入本质上由编码线粒体转运肽的序列组成的基因构建体,其中该序列在改变形式的正常线粒体基因上游和框内与其融合,该正常线粒体基因与非常规CMS相关的线粒体基因共转录;b)选择具有步骤a)的基因构建体的植物细胞;和c)诱导选择的植物细胞再生以产生成熟的植物。
文档编号C12N15/29GK1265151SQ98807637
公开日2000年8月30日 申请日期1998年5月26日 优先权日1997年5月30日
发明者格雷戈里·G·布朗 申请人:麦吉尔大学