用前生命期细菌控制家畜肠出血性大肠杆菌0157∶h7的制作方法

专利名称：用前生命期细菌控制家畜肠出血性大肠杆菌0157∶h7的制作方法
关于联邦政府资助的研究和开发的陈述下面的发明的研究工作部分在美国农业部No.97-433基金的资助下完成的。在此发明中，美国政府享有一定的权利。
发明的背景据报告，引起出血性结肠炎和溶血性尿毒综合症的一种重要的人类病原体大肠杆菌(E.coli)O157H7在过去十年中作为人类疾病的病因频率日增(综述见Bell，P.B.等(1994)JAMA 2721349-1353；Griffin，P.M.等(1991)Epidemiol.Rev.1360-98；Padhye，N.Y.等(1992)J.Food Prot.55555-565)。家畜(特别是年轻的的动物)已被视作大肠杆菌O157H7的主要贮主，以未煮熟的放在地上的牛肉为食物传播性爆发流行的主要媒介。而且，近年来与水果、果汁、蔬菜(生菜)和水(包括娱乐性湖泊)有关的爆发流行次数令人瞩目地增加。
USDA国家动物卫生监测系统最近的全国性调查揭示，1.6％饲养场家畜粪便排出大肠杆菌O157H7，0.4％排出大肠杆菌O157NM(Dagatz，D.(1995)USDAAPHISVS，流行病学和动物卫生中心，Fort Collins，CO(个人通讯))。一项对牛奶场小牛的主要研究揭示，在刚断奶和4个月之间的小牛有1.5％粪便中排出大肠杆菌O157H7(Zhao T.等(1995)Appl.Environ.Microbiol.611290-1293)。用大肠杆菌O157H7对小牛和成年牛的实验性感染，在同一年龄组的动物中差异很大，但小牛比成年牛持续时间长，并且以前的感染并不预防同一株大肠杆菌O157H7的再感染(Cray，CW.等(1995)Appl.Environ.Microbiol.611585-1590)。其它动物(如鸡、鹿和绵羊)也被测得具有长时间携带大肠杆菌O157H7的能力。
关于食物的大肠杆菌O157H7污染已引起很多公共卫生关注。这样的关注因大肠杆菌O157H7异乎寻常的耐酸性而提高。恰当的烹饪是杀死食物中大肠杆菌O157H7的有效方法。然而，在制备食物中的不卫生习惯常导致食物传播的疾病，因此需要有降低或消除大肠杆菌O157H7在家畜中携带的方法，以减少公众对食物和环境中病原体的接触(Wang，G.等(1996)Appl.Environ.Microbiol.622567-2570)。
疫苗是防止家畜携带有害细菌的常规手段。然而，大肠杆菌O157H7并不粘附或感染家畜。大肠杆菌O157H7定位于小牛的主要部位是瘤胃和结肠。瘤胃似乎是大肠杆菌O157H7长时间携带的最重要的部位，可能系结肠中所见细菌的来源(Brown，C.等(1995)Vet.Pathol.32587)。结肠组织的组织学检查未揭示大肠杆菌O17H7附着于结肠组织的证据。因此，结肠中大肠杆菌O157H7的存在看来是一个暂时的状态，细菌从结肠通过，而非定居于结肠。疫苗在降低家畜携带和排出大肠杆菌O157H7的量上不象是有效的。
小牛所携带的大肠杆菌O157H7的量可能受营养和管理实践的影响。Rasmussen等((1993)FEMS Microbiol.Lett.11479-84)从禁食小牛收集到的瘤胃液中测得大肠杆菌O157H7无限制生长。
某些大肠杆菌株可产生体外抑制致泻性大肠杆菌株(包括血清型O157H7株)的大肠杆菌素(Bradley，D.E.等(1991)Can J.Microbiol.3797-104；Murinda，S.E.等(1996)Appl.Environ.Microbiol.623196-3202)。Murinda等检测了24种产大肠杆菌素的大肠杆菌株，确定所有测试的大肠杆菌O157H7株在含丝裂霉素C的琼脂上均对Col E1-E8、K和N敏感，在Luria琼脂上也对Col G、Col.H和MccB17敏感。大肠杆菌素敏感和耐药的方式已被用于菌株鉴定。尚未获得按其对细菌素敏感性对菌株进行生物控制。然而，Doyle等的美国专利5,302,388揭示了通过给予能与空肠弯曲菌竞争家禽盲肠定居部位的选择性菌株可预防或抑制家禽空肠弯曲菌的移居和抑制空肠弯曲菌的生长。
发明的概述本发明包括特殊的前生命期的(probiotic)大肠杆菌，其分离、特性和预防或治疗反刍动物携带大肠杆菌O157H7的方法。“前生命期的”指具有如下性质的细菌它能阻止大肠杆菌O157H7在以前给过有效量所述前生命期细菌的反刍动物上定居。例如，先给小牛有效量的前生命期菌株，然后再给大肠杆菌O157H7，小牛不成为大肠杆菌O157H7的携带者，而只给大肠杆菌O157H7的小牛则持续携带该菌株数周，粪便中细菌排向环境。本研究中分离出的8株前生命期菌株中，4株被鉴定为“优性的”(dominant)，意思是接种动物在接种约28天后仍可从胃肠道内容物中再分离到它们。
优性前生命期细菌还证明能从以前接种过大肠杆菌O157H7并携带该病原体的小牛体内降低或消除大肠杆菌O157H7。
因此，本发明提供防止大肠杆菌O157H7被反刍动物携带的方法，即在接触大肠杆菌O157H7前对反刍动物给予有效量的前生命期细菌单株菌株或复合菌株。此方法对于在接触可能存在于环境中的大肠杆菌O157H7前处理早龄年轻反刍动物(如小公牛)特别有用。此方法还用于预防载运到饲养场的动物受饲养场污染。
本发明还提供降低或消除反刍动物体内大肠杆菌O157H7的方法，即给予有效量的前生命期细菌单一菌株或复合菌株。此方法用于维持畜群无大肠杆菌O157H7并在屠宰前减少大肠杆菌O157H7的携带。
前生命期细菌的给予是通过喂饲含有有效量前生命期细菌的食物补充剂或添加剂或对动物饮用水补充水处理添加剂或接种物来完成的。因此，本发明还提供含有前生命期细菌的食物补充剂组合物和含有前生命期细菌的水添加剂。
本发明还包括分离前生命期细菌的方法，包括筛选从粪便或肠中分离的菌株的生长上清液抑制大肠杆菌O157H7在琼脂上生长的能力。鉴定优性前生命期细菌的方法包括如下步骤给反刍动物接种前生命期细菌菌株混合物，然后在确定时间(如4周)后从动物分离该菌株。再分离的菌株是成功地在动物体内持续生长的菌株，因此是优性前生命期细菌。使用标记性状(无论是内源性的、选择的或基因工程的)使混合物中每一株均被鉴定和/或选择，可促进优性前生命期菌株的再分离和鉴定。
分离前生命期细菌的方法、分离优性前生命期细菌的方法、防止大肠杆菌O157H7携带的方法和治疗动物以减少或消除大肠杆菌O157H7的方法，除家畜外，均可用于其它动物，尤其是其它也被观察到携带大肠杆菌O157H7的反刍动物。目前，家畜是最大量的大肠杆菌O157H7携带者。分离和使用优性前生命期菌株的方法是通过用家畜进行的研究而完成的。大量菌株可从天然来源得到，它们可符合前生命期和优性前生命期细菌的标准。重复本说明书描述的分离方法可产生与本说明书相同或不同的菌株。这些菌株均落在如本说明书所述的前生命期和优性前生命期细菌的总范畴内。
附图的描述

图1显示仅给予大肠杆菌O157H7的小牛瘤胃液中大肠杆菌O157H7的最终归宿。箭头表示大肠杆菌O157H7的检出仅仅是一个富集的过程。
图2显示仅给予大肠杆菌O157H7的小牛粪便中大肠杆菌O157H7的最终归宿。箭头表示大肠杆菌O157H7的检出仅仅是一个富集的过程。
图3显示给予前生命期细菌和相继2天给予大肠杆菌O157H7的小牛瘤胃液中大肠杆菌O157H7的最终归宿。箭头表示大肠杆菌O157H7的检出仅仅是一个富集的过程。
图4显示给予前生命期细菌、相继2天给予大肠杆菌O157H7的小牛粪便中大肠杆菌O157H7的最终归宿。箭头表示大肠杆菌O157H7的检出仅仅是一个富集的过程。
图5显示仅给予大肠杆菌O157H7的小牛瘤胃液中大肠杆菌O157H7的最终归宿。箭头表示大肠杆菌O157H7的检出仅仅是一个富集的过程。
图6显示仅给予大肠杆菌O157H7的小牛粪便中大肠杆菌O157H7的最终归宿。箭头表示大肠杆菌O157H7的检出仅仅是一个富集的过程。
图7显示给予优性前生命期细菌、1-3天后再给予大肠杆菌O157H7的小牛瘤胃液中大肠杆菌O157H7的最终归宿。箭头表示大肠杆菌O157H7的检出仅仅是一个富集的过程。
图8显示给予优性前生命期细菌1-3天后再给予大肠杆菌O157H7的小牛粪便中大肠杆菌O157H7的最终归宿。箭头表示大肠杆菌O157H7的检出仅仅是一个富集的过程。
图9描绘了用脉冲电场凝胶电泳得到的优性前生命期细菌基因组DNA的Xbal酶切消化分布图。左、右泳道均为λ梯(48.5kb)。第1至第8为菌株271。
图10描绘了用脉冲电场凝胶电泳得到的优性前生命期细菌基因组DNA的Xbal酶切消化分布图。左、右泳道均为λ梯(48.5kb)。第1为菌株786，第2至第6为菌株797。
发明的详细描述结肠组织的组织学检查未揭示大肠杆菌O157H7附着于小公牛结肠组织的证据。瘤胃似乎是大肠杆菌O157H7长期携带的最重要部位。结肠中大肠杆菌O157H7的存在看来是暂时的状态，细菌从瘤胃通过，在粪便中排出。动物最初可通过摄食受污染的草、饲料或水而被感染。本研究的结果证明，大肠杆菌O157H7在单剂接种后长达30天持续存在于未受治疗的小牛的瘤胃中，并在同一时期全程从粪便中排出。因此，O157H7细菌与栖居于动物消化道的任何其它微生物株一起被家畜携带。为本发明的目的，其组织和粪便中可检出大肠杆菌O157H7的家畜和其它动物被说成携带大肠杆菌O157H7。动物携带的大肠杆菌O157H7的量可用各种方法测得，包括从各种组织取样。最方便的是可在粪便中测得大肠杆菌O157H7。这样的测定有其实际意义，因为粪便污染是肉类污染、也是其它动物再引入或感染的明显来源。如本说明书所示，粪便中大肠杆菌O157H7的量反映瘤胃中可测得的量。因此，粪便中大肠杆菌O157H7的量是动物携带量的度量。大肠杆菌O157H7的定量测定表示为每克粪便或每毫升瘤胃液的菌落形成单位(CFU)。
“前生命期的”在本说明书中用作形容词，描述从天然来源分离的、具有抑制大肠杆菌O157H7生长的性质的细菌。本说明书中所用的抑制试验是在固体培养基上的体外试验，在这试验中观察候选分离菌的培养上清液加到固体培养基表面时抑制大肠杆菌O157H7的性质。代表性的是，将浸渍了候选菌株培养上清液的园纸片放在接种了大肠杆菌O157H7的琼脂平板表面。前生命期细菌上清液在园片附近产生一个清晰的琼脂环，或减少生长密度的环，表明大肠杆菌O157H7受到抑制。可用或可设计其它抑制试验，包括直接生长竞争试验(体外或体内试验)，该试验可产生类似于此处所述的前生命期细菌系列。用任何这些试验鉴定的菌株均在如本说明书所用的术语“前生命期细菌”的范畴内。
术语“优性前生命期的”用于前生命期细菌，它持续存在于给过该细菌的动物体内，并可从该动物再分离。此处所述工作中使用的标准是接种后26天再分离。给小公牛喂饲18种前生命期菌株的混合物，然后在接种26天后从各种组织、消化内容物和粪便取样。4株菌株可回收，被定为优性前生命期菌株。其它标准也可使用，包括在接种和取样之间时间较长或较短。建议选择一个足够长的时间，以便优性前生命期菌株的持续生长可有效降低动物所携带的大肠杆菌O157H7量。
用本领域常用的技术、按照本说明书描述的原则和步骤，可进行优性前生命期细菌的分离。从家畜粪便和组织中分离出的1200个菌落中，18个是前生命期的，4个是优性前生命期的。因此，测试类似数目独立的分离物相当可能成功地得到优性前生命期细菌。用任何可能将微生物引入消化道的方法可完成优性前生命期细菌的给予。细菌可与载体混合，加到液体或固体饲料或饮水中。载体材料应当是对细菌和动物无毒的。载体最好包含促进储存中细菌生存力的成分。细菌还可配制成接种糊剂，直接注入动物口腔。制剂可包括改善口感、改善保存期、赋予营养价值等的附加成分。如果需要可重复的适度的剂量，可如此处所述通过瘤胃插管给予该细菌。拟给予的优性前生命期细菌的量由影响效能的因素控制。本研究中，单剂给予1010CFU。较低的剂量可以是有效的。当在饲料或饮水中给予时，剂量可分散于数天或甚至数周的时间。数天给予较低剂量的累积效应可大于1010CFU单剂剂量。监测给予优性前生命期细菌前、中和后的大便中大肠杆菌O157H7数目，本领域技术人员可容易地确定降低动物所携带大肠杆菌O157H7量需要的剂量水平。一株或几株优性前生命期细菌可同时给予。菌株联合给予可能是有益的，因为动物对于在个体中持续最长的菌株可有个体差异。
优性前生命期细菌可作为预防给予，以预防目前不携带大肠杆菌O157H7的动物通过与存在大肠杆菌O157H7的动物或环境接触而获得该菌株。准备转移到新地点(如饲养场)的年轻的小牛和成熟动物是预防给予的引人注目的候选者。通过将优性前生命期细菌给予已感染大肠杆菌O157H7的动物，可完成携带大肠杆菌O157H7动物的治疗，以降低或消除该动物所携带的大肠杆菌O157H7的量。已知粪便中排出大肠杆菌O157H7的动物或在已知存在大肠杆菌O157H7的地方饲养的动物是用优性前生命期细菌治疗的合适候选者。
无论预防或治疗，给予优性前生命期细菌的方法基本相同。因此，无须先测定动物是否携带大肠杆菌O157H7。对畜群的所有动物常规给予有效剂量，通过预防和治疗的联合作用可基本上减少或消除大肠杆菌O157H7污染的危险。
实施例实施例1 前生命期细菌的分离从家畜粪便或家畜胃肠组织(小肠和结肠)分离前生命期细菌。从经粪便测试确认大肠杆菌O157H7阴性的家畜收集粪便样本。用0.1M磷酸盐缓冲液(pH7.2)〔PBS〕对粪便样本作1∶10系列稀释，将每份稀释液取0.1m1在山梨醇MacConkey琼脂(SMA)平板上铺板。将平板于37℃培育16小时，直至随机选出10个菌落，将每个菌落转移到含10ml胰蛋白酶消化大豆肉汤(TSB)(BBL，Becton Dickinson，Cockeysville，MD)的试管中。培养液于37℃培育16小时。将组织样本(每份1g)于9,500rpm匀浆化1分钟(Ultra-Turrax T25匀浆器，Janke & Kunkel IKA-labortechnik，德国)，然后将每份0.1ml铺在SMA平板表面。平板于37℃培育16小时。直至10个菌落分别转移到含10ml TSB的试管中，37℃培育16小时。将从每个培养物中得到的上清液过滤除菌(0.2μm乙酸纤维素膜，Nalgene Co.，Rochester，NY)。
实施例2 筛选抗大肠杆菌O157H7性质的培养物用5株大肠杆菌O157H7混合物筛选抗大肠杆菌O157H7代谢物培养上清液，混合物包含932(人分离物)、C7927(人分离物)、E009(肉类分离物)、E0018(家畜分离物)和E0122(家畜分离物)。将每株大致等量约107个大肠杆菌O157H7在0.1ml中，在SMA和TSA双份平板上作表面铺板。每个SMA和TSA平板表面放置一个园片(直径12mm)，将单个培养物的过滤除菌上清液0.1ml加到园片表面。另外，将含70％乙醇的园片(阳性对照)和含PBS的园片(阴性对照)加到每个平板上。培养物于37℃培育18小时，观察抑制带。1mm以上的清晰带视作阳性反应。
实施例3 大肠杆菌O157H7培养物的制备使用上述同样的5株混合物。为了便于这些细菌分离物的计数，诱导这些菌株对萘啶酮酸(50μg/ml)的耐受性。将每株耐萘啶酮酸的大肠杆菌O157H7菌株转移到含萘啶酮酸(50μg/ml)的胰蛋白酶消化大豆肉汤(TSB)10ml中，于37℃震荡(150rpm)培育16-18小时。将每个分离物的2ml悬浮液转移到300ml TSB中。37℃培育16-18小时后，将细菌离心沉淀(4,000×g，20分钟)，用PBS洗涤3次。加PBS到沉淀的细菌中，其量为得到630nm处光密度(O.D.)0.5(108CFU/ml)所需之量。在临近小牛经口接种前，将5株大肠杆菌O157H7分离物(每株2×109CFU)的混合物混合在2％灭菌脱脂奶250ml中。在TSA和含萘啶酮酸的SMA(50μg/ml，SMA-NA)平板上计数，确定细菌的菌落数。
实施例4 前生命期细菌的制备为便于粪便中的计数，所有前生命期细菌分离物均作萘啶酮酸抗性(50μg/ml)选择。细菌分别在含萘啶酮酸(50μg/ml)的TSB 10ml中生长。每个分离物取1ml的一份转移到100ml TSB中。37℃培育16-18小时后，将细菌离心沉淀、洗涤，用上述方法调节成在630nm处O.D.为0.5。临小牛经口接种前，将18株前生命期细菌(1010CFU)混合在2％灭菌脱脂奶250ml中。在TSA和SMA-NA平板上作系列稀释液的双份计数，确定细菌的菌落数。
实施例5 小牛的准备15头单一来源的雄性牛奶场小牛在转送佐治亚大学前在牛奶替代机(milkreplacer)上饲养，6周龄时断奶。将小牛单独圈养在控制气候的BL-2混凝土房间中。每个房间有独立的排水地沟，每天清洁一次。小牛每天两次喂饲紫花苜蓿颗粒和甜食混合物，自由饮水。在2周空调期间，将所有小牛的粪便取样，经荧光抗体染色，检验对牛病毒性腹泻、冠状病毒、轮状病毒、大肠杆菌纤毛抗原和隐孢子虫阴性。进行肠道寄生虫粪便浮选和细菌沙门氏菌属和大肠杆菌O157H7培养，并测粪便pH。在2周预处理期后，对小牛手术放置瘤胃插管(柔性瘤胃插管)。在试验开始前至少有10天进行手术恢复和照料。
实施例6 瘤胃插管小牛禁食12小时。左腰旁窝(paralumbar fossa)剃毛，为标准的手术准备作消毒。用椎旁神经阻滞，反向“L”阻滞麻醉该窝，利多卡因，剂量略小于局部麻醉。作圆形切口，直径略小于插管直径，除去圆形皮片和表皮下及腹外斜肌。必要时结扎血管，作腹内斜肌、腹横肌和腹膜钝分离，并牵开，产生一个开口以暴露瘤胃壁。用两个大毛巾钳夹住瘤胃壁，用于牵引和外露瘤胃。然后以连续缝合的方式用#3肠线或插入肌层的vetafil将瘤胃缝在皮肤上。剪开瘤胃壁除去圆形瘤胃片，插入插管。手术后对小牛肌肉注射普鲁卡因青霉素G5天。每天用聚乙烯吡咯酮碘(betadine)溶液轻轻地清洁插管和瘤胃壁之间的区域。
实施例7 小牛的接种禁食12小时后，用含前生命期细菌的250ml脱脂奶经瘤胃插管对小牛进行接种。48小时后，经同一途径接种5株大肠杆菌O157H7混合物。对照组小牛仅以5株大肠杆菌O157H7混合物攻击。攻击后，每天检查小牛的临床症状，包括抑郁、发热、腹泻和厌食。对直肠粪便或从fiscular管收集的样本检测pH，计数大肠杆菌O157H7和前生命期细菌数。
细菌接种物的分离和计数每天在接种大肠杆菌O157H7后通过直肠回收或瘤胃插管收集10g粪便或瘤胃内容物样品。将样品放进保存于5℃的含15ml Cary-Blair转运培养基的试管中，转运到食品安全和质量强化中心作分析。用0.85％NaCl将含1g粪便的体积系列稀释(1；10)到10-6，每一稀释液取0.1ml在SMA-NA上作双份铺板。将尸检时收集的整个胃肠道组织样品保存于5℃直至进行分析。将每节段上各组织的内容分开、称量，组织用100mlPBS冲洗。冲洗后的组织加到9ml PBS中，用Ultra-Turrax组织匀浆器于9,500rpm匀浆化1分钟。将0.1ml组织或组织内容物悬浮液在SMA-NA板上作4分法接种，于37℃培育24小时，用于大肠杆菌O157H7或前生命期细菌的计数。如果用直接铺板方法未检出这些细菌，则进行选择富集法(17)(含50μg萘啶酮酸/ml的改良TSB)。将样品分别置于100ml选择富集培养基中，于37℃、150rpm震荡培育24小时。将培养物的稀释液在SMA-NA上铺板，选择分离物作进一步试验。将典型的大肠杆菌O157H7的菌落(山梨醇阴性)在SMA-NA上再铺板，用生化方法确定为大肠杆菌，用血清学方法确定为O157和H7。用脉冲电场凝胶电泳(PFGE)作DNA指纹分析确定为原核生物的细菌。
实施例8 细菌分离物的基因组指纹分析采用类似于前面所述方法的PFGE法(14)。细菌在10ml TSB中于37℃、200rpm震荡下生长24小时。离心沉淀细菌(4000×g，20分钟)，用含25mMEDTA的75mM NaCl pH 7.4(SE)洗涤3次，再悬浮于0.5ml SE中。将细菌悬浮液与0.5ml 2％(w/v)低熔点琼脂糖(在10mM Tris、10mM MgCl2和0.1mM EDTA(TME)组成的缓冲液中，pH 7.5)混合。将混合物分放到样品模中，琼脂糖塞用蛋白酶K(2mg蛋白酶K、50mM Tris、50mM EDTA、1％N-月桂酰sacosine/ml，pH 8.0)于56℃消化过夜。样品用10mM Tris、5mM EDTA pH 7.5(TE)洗涤，用50U Xbal消化。37℃培育过夜后，加入20μl 0.5M EDTA终止反应。用钳位均匀电场电泳仪(CHEF MAPPER，BioRad)在0.5×TBE缓冲液中的1.2％琼脂糖凝胶上对DNA样品进行电泳。在14℃、200V(脉冲时间5-50秒、线性倾斜、电场角度为120°)进行电泳24小时后，用溴化乙锭(3，-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶鎓)将凝胶染色，并用紫外透照仪使区带可视化和摄影。3株优性原核生物的菌株，271、786和797的结果见图9和图10。
实施例9 小牛的尸检静脉注射戊巴比妥钠将小牛处死。在食道和直肠处夹住胃肠道，整个取出。双重结扎4-6cm长的十二指肠、近端、中段和远端空肠、近端和远端回肠、近端和远端盲肠、升结肠的近端弯曲部分、螺状结肠(spiral colon)的向心转弯处和离心转弯处、横结肠，及降结肠，使各段均可在组织及内容物中取样作大肠杆菌O157H7和前生命期细菌计数而交叉污染为最小限度。还收集瘤胃、蜂窝胃、重瓣胃和皱胃的片段和内容物，肾、脾、肝、胆囊、空肠淋巴结、回肠淋巴结、盲肠淋巴结和扁桃体，用于大肠杆菌O157H7和/或前生命期细菌的培养和计数。所有这些部位的片段，及肩胛骨前淋巴结、骨骼肌、皮肤、扁桃体、甲状腺、胸腺、食道、心脏、胰腺、脐、肾上腺、膀胱和睾丸的片段也放在10％缓冲的福尔马林中，用于组织学检查。
实施例10 组织的组织病理学和免疫组织化学用标准方法将固定后的组织包埋在石蜡中，作5μm切片，用苏木精和曙红染色。选择的切片作Gram染色。选择组织学上显示大量表面或腔内细菌的切片，用碱性磷酸酶免疫染色法处理，以鉴定大肠杆菌O157H7。用二甲苯对组织脱石蜡10分钟，通过品级(graded)醇梯度水合，用PBS冲洗。将这些切片覆盖大肠杆菌O157H7特异抗体(Kirkegaad & Perry Laboratories，Inc.，Gaithersburg，MD)，在湿槽内室温(RT)培育30分钟。在PBS中漂洗10分钟后，于室温下，在湿槽内用以生物素标记的第二抗体覆盖玻片20分钟。玻片在PBS中漂洗10分钟后，回到湿槽内，用结合于碱性磷酸酶的链霉抗生物素蛋白覆盖组织切片。室温培育20分钟后，将玻片在PBS中漂洗10分钟，放入湿槽，用底物溶液覆盖15分钟。将玻片在PBS中漂洗10分钟，以Mayer’s苏木精复染3分钟，用水性介质封固，再用非水性介质封固，作显微镜检查。
实施例11 在无或有前生命期细菌的携带情况下大肠杆菌O157H7的量分泌抑制大肠杆菌O157H7的代谢物的潜在前生命期细菌的体外筛选从家畜组织和粪便分离出的1,200个菌落中18个在体外抑制大肠杆菌O157H7。其中，5个菌落从大便分离出，5个菌落从小肠分离出，8个从结肠分离出。18个菌落中17个被鉴定为大肠杆菌，另一个为奇异变形杆菌。全部作志贺氏菌外毒素(Shiga毒素)产生试验，无一产生Shiga毒素。PFGE基因组DNA指纹分析揭示18中分离物中有13种不同的分布型。
前生命期细菌在小牛上的定居先给一头小牛喂饲一株前生命期细菌(大肠杆菌1010CFU)。小牛看来是正常的，实验结束时(12天)用富集方法仅从回肠和盲肠回收到大肠杆菌。然后给2头小牛喂饲完整的18株前生命期细菌混合物(大体相同的浓度，每种5×108CFU)(每头小牛喂1010CFU)。小牛粪便连续正常，细菌定居胃肠道达27天(研究结束时结束为50-200CFU/克粪便)。
用PFGE测定优性前生命期细菌菌株接种后第26天，从扁桃体、重瓣胃、蜂窝胃、瘤胃、近端回肠、远端盲肠、升结肠近端弯曲部分、横结肠及粪便中分离出21个菌落，用PFGE分析。有4种DNA分布型的分离物是优性，所有均是大肠杆菌。在21个菌落中，9个是#797株，7个是#786株，3个是#271株，2个是#1019株。
前生命期细菌在小牛中所致的病理改变虽然尸检时从胃肠道不同部位的组织标本中回收到所接种细菌的某些株，但在受检的任何组织样本中均无病理改变。
前生命期细菌减少小牛携带大肠杆菌O157H7的效能9头仅给予大肠杆菌O157H7的小牛中全部保持健康，无发热或腹泻症状。接种后3周内，从所有动物的瘤胃液中分离出大肠杆菌O157H7(图1)。整个实验过程中(平均28天)粪便中持续排出不同量的大肠杆菌O157H7(图2)。尸检时，10头小牛中8头的瘤胃内容物、10头小牛中10头的结肠中分离出大肠杆菌O157H7。在任何受检组织样品中均未观察到病理变化。
在用大肠杆菌O157H7处理前2天给予前生命期细菌的所有小牛均保持健康，无发热或腹泻症状。通过fistula管收集的瘤胃样本中检出大肠杆菌O157H7的情况是2头动物达9天，1头动物达16天，2头动物达17天，1头动物达29天(图3)。从粪便中检出大肠杆菌O157H7达11、15、17、18、19和29天(实验结束时)的各为1头动物(图4)。尸检时(平均30天)，从这6头动物的任何一头瘤胃样本中均未回收到大肠杆菌O157H7；但是，从6头动物中1头的结肠回收到这些细菌。该大肠杆菌O157H7阳性动物在研究中接种后两次禁食各2天时间(第16、17天和第23、24天)。6头前生命期处理动物中的4头按此计划禁食。
实施例12 优性前生命期细菌作为治疗手段对家畜减少/消除大肠杆菌O157H7的效应优性前生命期细菌的制备为了便于粪便中的计数，将前面确定为抑制大肠杆菌O157H7的4株大肠杆菌(271、797、786和1019)作萘啶酮酸抗性(50μg/m1)选择。将这4株菌各株大致相等量混合(总量1010)到50ml 2％灭菌脱脂奶中，给家畜服用。大肠杆菌O157H7量用TSA和SMA-NA板双重计数加以确定。
小牛接种共使用16头小牛。禁食24小时后，通过插管对每头小牛给予5株大肠杆菌O157H7在50ml 2％灭菌脱脂奶中的混合物(1010CPU)。给予大肠杆菌O157H7后1天，2头小牛通过插管用前生命期细菌(1010CFU)处理。给予大肠杆菌O157H73天后，再用前生命期细菌(1010CFU)处理另外2头小牛。每天对通过插管收集的瘤胃样本和直肠粪便作大肠杆菌O157H7和前生命期细菌计数。
前生命期细菌处理在减少/消除小牛携带大肠杆菌O157H7上的效应在仅给予大肠杆菌O157H7作为阳性对照的12头小牛中，间隙地从瘤胃分离出O157，1头动物达2周，3头动物达3周，8头动物达4周(图5)。在整个研究中，12头小牛中11头的粪便中连续排出不同水平的大肠杆菌O157H7(图6)。尸检时，从12头小牛中9头的瘤胃内容物中、12头小牛中10头的结肠中分离出大肠杆菌O157H7。
4头小牛在给予大肠杆菌O157H7后1-3天用4株前生命期细菌(株271、株786、株797和株1019)的混合物进行处理。瘤胃样本中检出大肠杆菌O157H7的情况是1头动物达6天，2头动物达8天，1头动物达9天(图7)。粪便中检出大肠杆菌O157H7的情况是2头动物达10天，1头动物达11天，1头动物达15天(图8)。尸检时(2头在22天，2头在27天)，这4头动物中无一从瘤胃或结肠样本(组织或内容物)中回收到大肠杆菌O157H7。在研究结束时，从这4头动物仅回收到271、786和797前生命期细菌菌株。尸检时，这些动物无一检出1019株。
上述实施例阐述了对携带大肠杆菌O157H7的动物施用前生命期或优性前生命期细菌阻止和治疗大肠杆菌O157H7携带的原理和实践。大肠杆菌株271、786和797被分离并证明是优性前生命期细菌。从分离容易和所得菌株的数目，显然可见，其它优性前生命期菌株也可分离和用于接种家畜或其它动物以预防和治疗大肠杆菌O157H7的携带。根据动物的种属、品种、年龄、饮食、生活环境和管理方式，不同的菌株可能有益于不同的应用。分离出的和/或如本文所述用于有效地减少或消除动物携带的大肠杆菌O157H7量的所有这样的菌株均落在本发明的范围内。提供有效量前生命期或优性前生命期细菌的动物可能的施用方法包括用各种含该细菌制剂的本领域已知的各种喂饲、饮水和其它口服方法，它们均在本发明的范围内。根据或来自本说明书教导和公开内容的所有这些变更和修改都认为是在所附权利要求书的范围内。
下面的菌株按照37 CFR 1.801-1.809保藏在美国典型培养物保藏中心大肠杆菌271 ATCC保藏号No.202020，1997年8月13日大肠杆菌786 ATCC保藏号No.202018，1997年8月13日大肠杆菌797 ATCC保藏号No.202019，1997年8月13日。
权利要求
1.一种微生物，选自大肠杆菌271、大肠杆菌786、大肠杆菌797和大肠杆菌1019组成的一组优性前生命期细菌。
2.选择能抑制大肠杆菌O157H7生长的前生命期细菌的方法，包括以下步骤从动物组织液、消化内容物或粪便分离天然存在的菌株，产生分离株；在液体或固体培养基中培育分离株；从培养基中取出培育的菌株以产生培养物上清液；将每一培养物上清液施加于种有大肠杆菌O157H7的生长平板的特定部位，从而选出在邻近该部位以区带形式抑制大肠杆菌O157H7的优性前生命期细菌的上清液；将前生命期细菌作传代培养。
3.选择优性前生命期细菌的方法，包括给予动物一种或一种以上前生命期细菌菌株，在预定的时间从所述动物的消化内容物或粪便再分离任何可再分离的前生命期细菌，据此将可再分离的前生命期细菌鉴定为优性前生命期细菌。
4.如权利要求3所述的方法，其中提供具有可选择的标记性状的前生命期细菌。
5.如权利要求3所述的方法，其中用DNA限制性片段消化方法区别前生命期细菌。
6.如权利要求3所述的方法，其中动物为反刍动物。
7.如权利要求6所述的方法，其中动物为牛。
8.预防和治疗动物携带大肠杆菌O157H7的方法，包括对所述动物的消化道投用有效量的一种或几种优性前生命期细菌菌株。
9.如权利要求8所述的方法，其中优性前生命期细菌选自大肠杆菌271、大肠杆菌786或大肠杆菌797。
10.如权利要求8所述的方法，其中优性前生命期细菌以系列剂量与饮用水一起给予。
11.如权利要求8所述的方法，其中优性前生命期细菌以系列剂量与食物一起给予。
12.如权利要求8所述的方法，其中动物为反刍动物。
13.如权利要求12所述的方法，其中动物为牛。
14.一种接种组合物，包含一种或几种优性前生命期细菌和一种载体。
15.如权利要求14所述的组合物，其中载体包括水。
16.如权利要求14所述的组合物，其中载体包括可被家畜食用的物质。
17.如权利要求14所述的组合物，其中优性前生命期细菌选自大肠杆菌271、大肠杆菌786和大肠杆菌797。
全文摘要
分离出了优性前生命期菌株。将所分离的菌株喂饲反刍动物可预防病原体大肠杆菌0157:H7在动物体内的定居。接种动物在接种后28天可从胃肠道内容物再分离出该菌株。给予任何本发明的优性前生命期细菌可治疗以前感染了大肠杆菌0157:H7的动物,以减少或消除该病原体。
文档编号C12N1/20GK1266351SQ9880811
公开日2000年9月13日 申请日期1998年7月17日 优先权日1997年8月13日
发明者M·P·多伊尔, T·赵, B·G·哈蒙, C·A·布朗 申请人:佐治亚大学研究基金会股份有限公司