抗真菌植物和获得抗真菌植物的方法

专利名称：抗真菌植物和获得抗真菌植物的方法
技术领域：
本发明涉及编码赋予植物抗病性的蛋白的DNA、抗病植物以及获得这种植物的方法。更详细地讲，本发明涉及编码一种嵌合蛋白(嵌合受体)的DNA，该嵌合蛋白包括两个结构成其中一个结构域含有至少一个诱发剂(elicitor)受体的诱发剂结合位点，另一个结构域含有一个植物来源的抗性基因的信号转导基序；本发明还涉及转移入上述DNA的抗病性植物；以及获得该种植物的方法。
背景技术：
已知植物在应对致病性微生物感染时，合成并积累被称作植物抗毒素的抗生素物质[M.Yoshikawa(1978)Nature 257546]。在植物疫霉属(Phytophthora)中已发现诱发这种抗性反应的物质[N.T.Keen(1975)Sccience 18774]，并将其称作“诱发剂”。
现已知多种诱发剂，包括植物或真菌来源的水解酶产生的降解产物、真菌产生的蛋白类诱发剂以及真菌产生的Avr(无毒性)基因产物。植物来源降解产物的例子有由多聚半乳糖醛酸酶产生的多聚半乳糖醛酸。真菌来源降解产物的例子有由几丁质酶产生的几丁质(N-乙酰壳寡糖)寡糖，或由葡聚糖酶产生的葡聚糖。蛋白类诱发剂的例子有属于疫霉属真菌来源的诱发素(elicitin)。Avr基因产物的例子有来源于黄枝孢(Cladosporium fulvum)的Avr4和Avr9，或来源于黑麦喙孢(Rhynchosporium secalis)的nipl。这些诱发剂与包括植物质膜上的诱发剂受体在内的植物抗病基因产物进行特异性互作。通过这种互作，识别真菌等的入侵并产生信号。这些信号传至细胞核以引发多种抗性反应，从而阻止真菌侵入植物。这些反应被称作过敏反应，包括细胞死亡、过氧化氢的产生、PR蛋白的表达、脂氧化酶的表达和被称作植物抗毒素的抗性物质的产生[W.Knogge(1996)Plant Cell 81711；A.F.Bent(1996)Plant Cell 81757；K.E.Hammond-Kosack和J.D.G.Jones(1996)Plant Cell 81773]。
以植物抗毒素的合成和积累为例，人们认为，从病原体感染植物到植物中抗性诱导的生化过程如下进行首先，当病原体的菌丝体入侵植物细胞时，植物细胞中的葡聚糖酶发挥作用分解病原体菌丝体壁表面的多糖，从而释放诱发剂。诱发剂是由葡聚糖组成的多糖。它们是以β-1，6键相连或以β-1，3键相连的葡聚糖[J.K.Sharp等，(1984)J.Biol.Chem.25911321；M.Yoshikawa(1990)Plant CellEngineering，1.2695；Y.Okinaka等，(1995)Plant Physiol.109839]。如果这种诱发剂与植物细胞中的受体相结合，则产生发挥信号转导作用的第二信使。这种信号转导物质被引入植物细胞的细胞核中，并激活那些编码植物抗毒素合成酶的基因的转录，从而诱导植物抗毒素的合成。同时，植物抗毒素的降解系统被抑制。因此，植物抗毒素有效地积累在植物细胞中。例如，在大豆中，发挥重要的抗性作用的植物抗毒素被称作大豆抗毒素，其结构已经确定[M.Yoshikawa等，(1978)Physiol.Plant.Pathol.1273]。
所以，人们认为，来源于大豆致病性丝状真菌大雄疫霉大豆小种(Phytophthora megasperma f.sp.glycinea)的葡聚糖诱发剂特异性受体是一种在抗生素物质大豆抗毒素的合成和积累过程中发挥重要作用的受体蛋白质。Kakitani等已从大豆根的质膜组份中分离并纯化出这种葡聚糖诱发剂的特异性受体(日本未审查的专利公告第6-321995号)。另外，Umemoto等[N.Umemoto等，(1997)Proc.Natl.Sci.USA 941029]已克隆到编码该葡聚糖诱发剂受体的基因。
最近，有许多关于克隆植物来源的抗性基因的报道。在这些基因中，发现部分或全部涉及信号转导的特征性基序或结构域(例如富含亮氨酸的重复序列、亮氨酸拉链、核苷酸结合位点(P-噜扑)和丝氨酸/苏氨酸激酶结构域)。作为预期含有参与信号转导的这种基序或结构域的植物来源的抗病基因，例如已报道了以下基因来源于拟南芥(Arabidopsis thaliana)的抗性基因RPS2[M.Mindrinos等，(1994)Cell 781089；A.F.Bent等，(1994)Science 2651856]、来源于拟南芥的抗性基因RPM1[M.R.Grant等，(1995)Science 269843]、来源于烟草的抗性基因N[S.Whitham等，(1994)Cell 781101]、来源于亚麻的抗性基因L6[G.J.Lawrence等，(1995)Plant Cell 71195]、来源于番茄的抗性基因Pto[G.B.Martin等，(1993)Science 2621432]、来源于番茄的抗性基因Prf[J.M.Salmeron等，(1996)Cell 86123]、来源于番茄的抗性基因Cf-9[D.A.Jones等，(1994)Scence 266789]、来源于番茄的抗性基因Cf-2[M.S.Dixon等，(1996)Cell 84451]以及来源于水稻的抗性基因Xa21[W.Y.Song等，(1995)Science 2701804]。
另一方面，相对于植物细胞来源的受体，大多数报道基于来源于动物细胞的受体的克隆。同时，也有相当多的研究是关于由细胞外结构域和来源于异源受体的细胞内结构域组成的嵌合受体。例如，将识别特定受体配体的细胞外结构域用识别不同于上述配体的其它配体的细胞外结构域所置换，则后者，即新的细胞外结构域与可将信号传至细胞核的细胞内结构域相融合，由此制备嵌合受体。当这种受体在细胞中表达时，据报道该嵌合受体识别新的细胞外结构域所识别的配体，由此在细胞中传导信号[H.Riedel等，(1986)Nature32468，J.Lee等，(1989)EMBO J.8167；H.Lehvaslaiho等，(1989)EMBO J.8159，S.Lev等，(1990)Mol.Cell.Biol.106064]。另外，还报道，即使将编码动物细胞受体的基因转入异源的动物细胞中并在其中表达，该基因仍以类似方式发挥功能；例如，据报道当来源于人的GM-CSF受体在小鼠3T3细胞中表达时，观察到促生长信号的传递[S.Watanabe等，(1993)Mol.Cell.Biol.13144]。
但是，就本发明人所知，尚无任何报道涉及植物中的嵌合报告物。另外，也无报道提示这种嵌合报告物在植物中的功能。
本发明的说明书上述葡聚糖诱发剂受体没有在植物来源的抗性基因中发现的参与信号转导的特征性基序或特征性结构域。因此，这暗示，一种可能是这种葡聚糖诱发剂受体可能缺少信号转导域。用来自动物细胞的受体进行嵌合受体研究，本发明人考虑到下述情况如果将识别特定配体的结构域和来源于不同蛋白质(包括受体)的参与信号转导的结构域融合而获得嵌合受体，将该嵌合受体转移入植物细胞并在该植物细胞中表达，则该配体可被识别且可完成信号转导。本发明人还考虑到，即使嵌合受体在其中表达的细胞和参与信号转导的结构域从其来源细胞并不属于相同的植物种，信号转导也可以类似的方式进行。换句话说，本发明人已经考虑到不论何种植物物种，如果可以在植物中合成并表达编码嵌合受体的基因，其中在所述嵌合受体中诱发剂受体结合于植物来源受体的细胞内信号转导域，或者诱发剂受体结合于由植物来源的抗性基因(例如来源于拟南芥的抗性基因RPS2或RPM1，来源于烟草的抗性基因N，来源于亚麻的抗性基因L6，来源于番茄的抗性基因Pto，来源于水稻的抗性基因Xa21)编码的并预期参与细胞内信号转导的结构域，则与诱发剂受体单独表达的情况相比，可以提高信号转导的效率。结果，就有可能产生对致病性真菌有明显强抗性的植物，还可提高农产品的产量。另外，将有望从减少使用农药和降低环境污染方面产生经济效益。
本发明旨在提供编码嵌合蛋白的DNA，该嵌合蛋白包括一个含有至少一个诱发剂受体的诱发剂结合位点的结构域和一个含有植物来源抗性基因的信号转导基序的结构域；其中转移入上述DNA的抗病性植物；以及产生这种植物的方法。
作为解决上述问题的深入和广泛研究的结果，本发明人已经通过下述方法，成功地赋予植物抗病性合成编码嵌合受体的基因，该嵌合受体由一个来自植物的抗性基因所编码的并预期参与信号转导的结构域和一个含有至少一个诱发剂受体的诱发剂结合位点的结构域组成；将该基因转入拟南芥植株和烟草植株中；并在这些植物中表达该基因。由此，完成本发明。
本发明涉及编码嵌合蛋白的DNA，该嵌合蛋白包括一个含有至少一个诱发剂受体的诱发剂结合位点的结构域和一个含有至少一个可赋予植物抗病性的蛋白的信号转导基序的结构域。这种嵌合蛋白发挥受体的功能，由此赋予植物抗病性。
上述诱发剂的具体例子有葡聚糖、多聚半乳糖醛酸、N-乙酰壳糖类(chitosaccharide)、诱发素、来自黄枝孢的Avr基因产物、或来自黑麦喙孢的niple基因产物。上述诱发剂受体的具体例子包括上述列举的诱发剂的受体。关于葡聚糖诱发剂受体的诱发剂结合位点，可以给出的蛋白质为至少含有SEQ ID NO27中所示的氨基酸序列的蛋白质；或含有SEQ ID NO27中所示的氨基酸序列、缺失、置换、增加或插入至少一个氨基酸、且能够与相关的葡聚糖诱发剂相结合的蛋白质。关于该含有信号转导基序的结构域，可给出的结构域为含有至少一个选自富含亮氨酸的重复序列、亮氨酸拉链、核苷酸结合位点以及丝氨酸/选自苏氨酸激酶域的基序的结构域。这种结构域的具体例子包括来自番茄Pto基因、Prf基因、Cf-2基因或Cf-9基因的表达产物的信号转导域；来自水稻Xa21基因的表达产物的信号转导域；来自拟南芥RPS2基因或RPM1基因的表达产物的信号转导域(例如SEQ ID NO29代表的结构域)；来自亚麻L6基因的表达产物的信号转导域；以及来自烟草的N基因的表达产物的信号转导域。
本发明还涉及编码嵌合蛋白的DNA，该嵌合蛋白含有SEQ ID NO5、7或9中所示的氨基酸序列；或含有SEQ ID NO5、7、或9中所示的氨基酸序列，缺失、置换、增加或插入至少一个氨基酸，且赋予植物抗病性。这种DNA的具体例子包括含有SEQ ID NO6、8或10中所示的核苷酸序列的DNA。
本发明还涉及含有上述DNA的重组载体。
本发明还涉及用上述重组载体转化的转化植物或该植物的后代。
本发明还涉及具有抗病性的植物或该植物的后代，其中该植物具有上述DNA并表达该DNA。
本发明还涉及产生抗病性植物的方法，包括将上述重组载体转移入植物中。
本发明还涉及产生具有抗病性的植物或该植物的后代的方法，包括将上述DNA整合入植物的染色体中，并表达该DNA。
下面是本发明的详细描述。
将其编码的结构域含有至少一个诱发剂受体的诱发剂结合位点的DNA与其编码的结构域含有至少一个赋予植物抗病性的蛋白的信号转导基序的DNA相连接，可获得本发明DNA。本发明DNA有时被称作“编码嵌合受体的DNA”或“嵌合DNA”。
可具体列举的诱发剂受体包括结合于植物降解产物诱发剂(如多聚半乳糖醛酸)的受体，或结合于真菌细胞壁降解产物诱发剂(如葡聚糖、N-乙酰壳寡糖)的受体，以及结合在蛋白类诱发剂(如真菌产生的诱发素)的受体和结合于诸如来源于黄枝孢的Avr基因产物或来源于黑麦喙孢的niple基因产物的受体。
以下描述的方法，可用作克隆编码这些诱发剂报告物的cDNA(以下称作“ERDNA”)的方法。
简要地说，先将上述诱发剂用同位素标记，然后，从植物质膜部分中，通过测定标记诱发剂与该部分的结合活性，纯化与该诱发剂特异结合的诱发剂受体。以纯化的诱发剂受体获得的部分氨基酸序列信息为基础，设计PCR引物。运用这些引物并以来自植物细胞的DNA为模版进行PCR，从而获得一个探针。用该探针从cDNA文库中克隆目的cDNA。
另一方面，如上所述，本发明中编码信号转导基序的DNA已为人们所知。因此，该DNA能够用PCR等克隆。
随后，连接ERDNA与编码信号转导基序的DNA。连接这些DNA的方法为用适当的限制性酶消化这些DNA，然后用连接酶连接。或者，可这样连接用适当的寡核苷酸将ERDNA连接至编码信号转导基序的DNA上。或者，将上述DNA插入适合的质粒中而连接。连接时，并不特别限制ERDNA和编码信号转导基序的DNA的相对位置，即ERDNA可以位于编码信号转导基序的DNA的上游或下游。
最后，用传统方法(例如双脱氧法、Maxam-Gilbert法)确定所获的嵌合DNA的核苷酸序列。通常，用全自动DNA测序仪分析核苷酸序列。


图1显示本发明嵌合DNA的结构图，本发明嵌合DNA例如由编码葡聚糖诱发剂受体(ER)的DNA和来自拟南芥的RPS2基因组成。在图1中，CER为由相应于大约三分之一(1/3)RPS2(SEQ ID NO29)的RPS2基因5’端区和全长ERDNA(SEQ ID NO2)组成的嵌合DNA。图1中的IER和ISER具有截短的ERDNA。在这些嵌合DNA中，ERDNA位于RPS2基因的上游(例如，相比之下，在CER中它们的位置交换)。
葡聚糖诱发剂受体的诱发剂结合位点相应于SEQ ID NO1中所示氨基酸序列从239位至442位的部分序列，并具有SEQ ID NO27中所示的氨基酸序列。只要该诱发剂结合位点是至少含有SEQ ID NO27中所示氨基酸序列的蛋白质，或是含有SEQ ID NO27中所示氨基酸序列、缺失、置换、增加或插入至少一个氨基酸、并能与相关的葡聚糖受体结合的蛋白质，则该诱发剂受体的长度并无特殊限制；该诱发剂受体可以是截短形式(参见图1中的“2-11”，“2-16”和“1-5”)。作为编码由SEQ ID NO27代表的诱发剂结合位点氨基酸序列的DNA，可给出SEQ ID NO28中所示的核苷酸序列。
上述嵌合DNA的核苷酸序列和由该DNA编码的嵌合蛋白的氨基酸序列，对于CER，分别示于SEQ ID NO5和6中；对于IER，分别示于SEQ ID NO7和8中；对于ISER，分别示于SEQ ID NO9和10中。只要这些嵌合蛋白具有如诱发剂受体的结合功能并赋予植物抗病活性，则所述氨基酸序列(SEQ ID NO5、7和8)可以有诸如缺失、置换、增加或插入至少一个氨基酸的突变。除那些编码包含在本发明嵌合蛋白中的氨基酸序列的核苷酸序列之外，编码相同多肽而仅因简并密码子而有差异的DNA(定义为“简并异构体“)也包括在本发明DNA中。例如，相应于Asn的密码子AAC被改变成简并密码子(如AAT)的DNA在此被称作简并异构体。
用定点诱变可完成上述突变体的导入(例如，参见D.F.Mark等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 815662-5666，1984；1985年2月28日公开的PCT WO 85/00817；R.P.Wharton等，Nature 316601-605，1985年8月15日)，本申请提交之前，该方法是广为人知的技术。一旦确定上述核苷酸序列，本发明DNA就可由化学合成法、PCR法或以具有该核苷酸序列的DNA片段为探针的杂交法而获得。
编码本发明所使用的嵌合受体的DNA序列，在紧邻其3’末端最好有至少一个终止密码子(如TAG)。如果需要，在该DNA序列5‘端的上游也可选择性地含有起始蛋氨酸的ATG密码子，该密码子的读框与所述DNA序列的读框一致。另外，在该DNA序列的5’端上游或3’端下游可有适合长度的其它DNA作为非翻译区。
通常，编码本发明所用嵌合受体的DNA序列以插入质粒中或噬菌体DNA中成为它们组成部分而存在；或在插入质粒、噬菌体或基因组DNA中作为它们的组成部分的同时，存在于微生物(特别是细菌)、噬菌体颗粒或植物中。上述细菌的具体例子包括大肠杆菌(E.coli)和农杆菌(Agrobacterium)。为了使编码嵌合受体的DNA序列在植物中稳定表达，可将启动子、编码翻译起始密码子(ATG)的DNA和终止子，以适当的组合加到该DNA序列上。
可将编码本发明嵌合受体的DNA(以下有时称为“嵌合DNA”)加入适合的载体中，来构建本发明的重组载体。
对于待加入本发明嵌合DNA的载体并无特殊限制，只要其能在宿主中复制。例如，可采用质粒DNA、噬菌体DNA和诸如此类的DNA。
双元载体，是质粒DNA的一种，可用诸如碱提取法(Birnboim，H.C和Doly，J.(1979)Nucleic Acid Res.71513)从大肠杆菌或农杆菌中制备。可具体列举的双元载体包括pBI121和pBI101。或者，可使用诸如pUC118(Takara Shuzo)、pUC119(Takara Shuzo)、pBluescriptSK+(Stratagene)或pGEM-T(Promega)的市售质粒。
可具体列举的噬菌体DNA包括M13mp18、M13mp19和M13tv18。
为了连接嵌合DNA和载体，可使用的方法是将本发明的纯化嵌合DNA用适当的限制性酶消化，然后插入到适当载体DNA的相关限制位点或多克隆位点中用于连接。
待表达的嵌合DNA应加进载体中，使得可以显露该DNA的功能。为了这个目的，除启动子和上述基因外，还可将信号肽基因、终止子、药物抗性基因等加进本发明重组载体中。作为可用于本发明的信号肽基因，可举出来自番茄(Lycopersicon seculentum)的β-1，3葡聚糖或类似物的信号肽基因。作为可用于本发明的增强子，可举出烟草花叶病毒Ω的序列或类似序列。作为可用于本发明的药物抗性基因，可举出卡那霉素抗性基因、潮霉素抗性基因或类似基因。
可具体列举的上述启动子包括编码核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶小亚基基因的启动子(R.Fluhr等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1986)832358)、胭脂碱合酶(NOS)基因的启动子(W.H.R.Langridge等，PlantCell Rep.(1985)4355)、产生花椰菜花叶病毒19S-RNA的启动子(H.Guilley等，Cell(1982)30763)和产生花椰菜花叶病毒35S-RNA的启动子(J.T.Odell等，Nature(1985)313810)。可具体列举的上述终止子包括胭脂碱合酶基因的终止子[A.Depicker等，J.Mol.Appl.Gen.(1982)1561]和章鱼碱合酶基因的终止子[J.Gielen等，EMBO J.(1984)3835]。
确切地讲，如图2所示，花椰菜花叶病毒35S启动子(p35S)连接在该嵌合DNA的上游，胭脂碱合酶基因终止子(NosT)连接在该嵌合DNA的下游(该构建体被称作“ER盒”)。另外，构建了将卡那霉素抗性基因(NPT II)连接在胭脂碱合酶基因启动子和终止子之间的盒(“NPT II盒”)、将潮霉素抗性基因连接在p35S和NosT之间的盒(“Hm盒”)。然后，将NPT II盒连接在ER盒的上游，然后将Hm盒连接在ER盒的下游，从而获得本发明的重组载体(图2)。
从各种对于诱发剂及其受体的研究已提示在例如葡聚糖诱发剂及其受体的情况下，葡聚糖诱发剂受体在植物对广范围真菌(在它们的细胞壁组份中含有葡聚糖)的抗性中起重要作用。另外，已克隆了编码葡聚糖诱发剂受体的基因，分析其一级序列，结果表明该诱发剂受体缺乏参与信号转导的结构域。另一方面，将迄今报道的植物来源的抗性基因按其结构粗略分为下列4类[M.S.Dixon等，(1996)Cell 84451]。
第一类这一类的基因具有富含亮氨酸的重复序列和核苷酸结合位点。它们中的一些还含有亮氨酸拉链。这些基因被认为可能位于细胞质中。可具体列举的属于这一类的抗性基因包括来自烟草的抗性基因N、来自拟南芥的抗性基因RPS2和RPM1、来自亚麻的抗性基因L6和来自番茄的抗性基因Prf。
第二类该类的基因具有富含亮氨酸的重复序列和膜结合位点。这些基因被认为可能位于细胞表面。来自番茄的抗性基因Cf-2和Cf-9等属于该类。
第三类该类的基因具有丝氨酸/苏氨酸激酶结构域。来自番茄的抗性基因Pto等属于该类。
第四类这一类的基因具有富含亮氨酸的重复序列、膜结构域和丝氨酸/苏氨酸样激酶结构域。人们认为，富含亮氨酸的重复序列可能识别诱发剂，从而激活位于细胞中的丝氨酸/苏氨酸激酶。来自水稻的抗性基因Xa-21等属于该类。
因此，植物来源的抗性基因含有一个或多个预期参与信号转导的基序或结构域，即富含亮氨酸的重复序列、亮氨酸拉链、核苷酸结合位点和丝氨酸/苏氨酸激酶结构域。
所以，在本发明中，通过连接一个含有至少一个诱发剂受体的诱发剂结合位点的结构域和一个植物来源抗病性基因(如RPS2基因、RPM1基因、N基因、L6基因、Pto基因、Xa21基因、Cf-2基因、Cf-9基因、Prf基因)编码的参与信号转导的结构域，制备编码嵌合蛋白的DNA，然后使其表达。
例如，用已知方法，将由其编码的结构域含有至少一个葡聚糖诱发剂受体的诱发剂结合位点的DNA和其编码的结构域含有来自拟南芥抗性基因(RPS2)的亮氨拉链和核苷酸结合位点的DNA所组成的嵌合DNA或该嵌合DNA的片段，转移入高等植物中并在其中表达。
结果，与那些葡聚糖诱发剂受体单独被导入并表达的情况相比，有可能赋予植物对真菌还要更强的抗性。
曾经提出这样的理论那些感染植物的真菌通常具有抑制基因，并因此获得了抑制植物对真菌的内在抗性的能力。然而，即使在这些情况下，也有可能通过将本发明中编码嵌合受体的DNA或该DNA的片段转入该植物中并在其中表达，而使该嵌合受体发挥功能，或通过修饰该DNA或调节该DNA的表达量，从而产生对真菌有更强抗性的植物。
另外，将本发明DNA或其片段与增强对真菌抗性的基因或特征物(例如显示抗真菌的葡聚糖酶)相组合转入高等植物中，与那些单独导入葡聚糖酶或类似物的植物的抗性相比，有可能赋予植物对真菌还要更强的抗性。
可列举的编码葡聚糖酶的DNA序列，包括含有编码以下蛋白的核苷酸序列的DNA包含SEQ ID NO11或13中所示氨基酸序列的蛋白，或包含SEQ ID NO11或13中所示氨基酸序列、缺失、置换、增加或插入至少一个氨基酸并具有葡聚糖酶活性的蛋白。上述DNA旨在包括所有的简并异构体。可具体列举的这种异构体包括含有示于SEQ ID NO12或14中的核苷酸序列的DNA。
可采用将基因转移入植物细胞或植物中的传统方法。例如，可采用在J.Draper等，Blacwell科学出版社(1988)的“植物遗传转化和基因表达，实验室指南”一书中描述的方法。基因转化方法的例子包括用病毒或农杆菌的生物学方法和诸如电穿孔法、聚乙二醇法、微注射法、基因枪和葡聚糖法的物理化学方法。
当待转化植物是双子叶植物时，通常优选采用农杆菌的生物学方法。当待转化植物是单子叶植物，或对农杆菌感染不敏感的双子叶植物时，优选物理/化学法(如电穿孔法)。作为目的DNA将要转移入的植物材料，按照所述转移方法，适合的材料可选自叶片、茎、根、花瓣、块茎、原生质体、愈伤组织、花粉、种子胚、苗原基(shootprimordia)等。
将目的DNA转入培养的植物细胞中时，通常用原生质体作为材料，用诸如电穿孔法、聚乙二醇法或类似的物理/化学方法将该DNA转入其中。另一方面，将目的DNA转入植物组织中时，用叶片、茎、根、花瓣、块茎、原生质体、愈伤组织、花粉、种子胚、苗原基或类似物作为植物材料。优选叶片和茎。以采用病毒或农杆菌的生物学方法，或诸如基因枪法、微注射法或类似的物理∥化学方法，将该DNA转入这种植物组织中。优选使用农杆菌的生物学方法。
为了从那些其中已转移入编码嵌合受体DNA序列的植物组织或植物细胞中再生植株，将那些转化的植物组织或细胞培养在含有适合植物生长调节物的诸如MS的培养基上。将所得到的正在生根的幼苗转至土壤使之长成植株。
通过用上述方法转移并表达编码嵌合受体的DNA序列，赋予植物对致病性真菌的抗性，或增强植物对致病性真菌的抗性。这种植物的例子包括那些对在其细胞壁中含有葡聚糖的致病性真菌的感染敏感的植物。确切地讲，这些植物包括，但不限于茄科植物、豆科植物、菊科植物、石竹科植物和禾本科植物。更具体的例子包括但不限于烟草、大豆、马铃薯、水稻、菊花和康乃馨。
作为致病性真菌，那些在细胞壁中含有葡聚糖的真菌最适合作为靶。这种致病性真菌的具体例子包括但不限于疫霉属(Phytophthora)、丝核菌属(Rhizoctonia)、Pyricularia、柄锈菌属(Puccinia)、镰孢属(Fusarium)、单胞锈菌属(Uromyces)、葡萄孢属(Botrytis)和链格孢属(Alternaria)。更具体地讲，该致病性真菌包括，但不限于烟草疫霉(Phytophthora nicotianae)、立枯丝核菌(Rhizoctoniasolani)、Pyricularia oryzae、堀柄锈菌(Puccinia horiana)、尖镰孢(Fusarium oxysporum)、粉红镰孢(Fusarium roseum)、三隔镰孢(Fusarium tricinctum)、石竹单孢锈菌(Uromyces dianthi)、灰葡萄孢(Botrytis cinerea)和石竹链格孢(Alternaria dianthi)。
按照本发明，编码转移入植物中的嵌合受体的DNA序列能够通过种子遗传至后代。因此，转移的DNA序列也存在于那些从本发明植物的花粉或子房形成的种子中，且本遗传特性能够传至后代。所以，本发明的这种其中已转移了编码嵌合受体的DNA序列的植物能够通过种子繁殖，而不会丢失其对致病性真菌的抗性。本发明的植物还可以通过采用植物组织培养的大量繁殖法或诸如扦插、压条、嫁接、分株等传统技术法进行繁殖，而不会丢失其对致病性真菌的抗性。
转化植物是否对真菌有抗性，可以在加进葡聚糖诱发剂时是否存在抗性反应而得以确认，或以真菌接种实验进行检查。加入诱发剂的抗性反应实验进行过程为将葡聚糖诱发剂溶液加在叶片表面，或用注射器从叶片的背侧将葡聚糖诱发剂溶液渗透进叶片，一段时间之后，观察叶片表面出现的褐变反应，或检查由UV光所激发出的荧光物质(植物抗毒素)的累积。在真菌接种实验中，可由以下接种方法检查抗性，将其粗略地分为两组，即接种于地上部分和接种于地下部分。I.下列方法可用于将病原体接种于地上部分。
(1)喷洒接种将致病性真菌或其孢子的悬浮液喷洒到植物上，然后在饱和湿度的适当温度下，将植物在接种箱中孵育一个小时，观察得病程度。
(2)撒粉接种用笔刷(writing brush)将从病灶处收集的孢子直接撒到植物上，或用小的撒粉器接种到植物上。在调至适于感染温度的接种箱中将已接种植物孵育整整一天一夜。接下来采取的步骤与喷洒接种相同。
(3)创伤接种将孢子悬浮液或培养的一片菌丝体簇接种到树枝被切的一端或那些用钻器塞穿过树皮的部分。
(4)针接种用在致病性真菌的悬浮液中蘸过的一根针或一束针擦伤植物用于接种。
(5)细胞粘附接种当使用不在培养基上形成孢子的致病性真菌时，培养的菌丝团或菌核(sclerotia)粘附在植物表面而接种。
(6)损伤的植物接种不用致病性真菌直接接种，而将真菌损伤的植物置于待测试植物上，或将真菌损伤的叶悬在待测试植物上面，使得通过从受损伤的植物生长的菌丝体或从叶掉落的孢子进行接种。II.下列方法可用于地下部分的病原体接种。
(1)浸透土壤接种用孢子悬浮液或分裂的菌丝体浸透土壤而接种。
(2)混合土壤接种将在诸如小麦麦麸、谷粒、水稻杆、大麦麦杆中培养的丝状真菌与土壤混合而接种。
(3)掩埋病株接种在土壤中掩埋病株的残体而制备被致病性真菌污染的土壤。当植物残体腐烂后，充分混合土壤。然后，将种子播种在其中或将苗移植该处。
(4)污染的土壤接种如果一种特定土壤病害总在某区发生，从该区取走土壤，充分混合并装进盆中或桶中。然后，将种子播种在其中或将苗移植该处。
(5)浸根接种从致病性细菌或丝状真菌制备孢子悬液。将健康幼苗的根在这种悬液中浸3-5分钟然后移植到盆中。
抗性试验可按照上述接种方法进行。更详细地讲，可直接将真菌菌丝体接种到植物中，并观察病灶的扩大，分析对疫霉属的抗性。或者，抗性也可这样检测接种疫霉属游动孢子并观察病灶的变化。对疫霉属之外的土壤真菌的抗性检测，可将培养的真菌细胞与土壤混合，在该土壤上播种或在其上让植物生长，然后观察猝倒现象。但是，对真菌抗性的测试方法并不局限于这些方法。
附图简介图1图示本发明嵌合DNA的构建体。
图2显示质粒pBI(Hm)-ER的构建略图。
图3显示质粒pBI(Hm)-LER的构建略图。
图4显示含有编码蛋白RPS2 N末端区(相应于该蛋白1/3)的DNA的质粒略图。
图5显示质粒pBI(Hm)-CER的构建略图。
图6显示质粒pBI(Hm)-IER的构建略图。
图7显示质粒pBI(Hm)-ISER的构建略图。
实施本发明的最佳模式下面，将参考以下实施例更详细地描述本发明。但是，本发明的技术范围并不局限于这些实施例。
在以下实施例中，葡聚糖受体缩写为“ER”。图2-7中使用的缩写表示限制性酶切位点BBamHI；XbXbaI；SISalI；RIEcoRI；RVEcoRV；XhXhoI；SphSphI；SpSpeI；ScISacI；SmSmaI；NspNspI；NNotI；NsiNsiI；NcNcoI；H3HindIII(Sm)SmaI识别序列由于在SmaI位点插入DNA而缺失。
DScI，dBSacI位点和BamHI位点分别缺失。Lβ-1，3葡聚糖酶的前导序列。pNOSNOS启动子；p35S花椰菜花叶病毒35S启动子；Nos-TNOS终止子。NPTII卡那霉素抗性基因；Hm潮霉素抗性基因。RB，LBTi质粒右边界的DNA序列，Ti质粒左边界的DNA序列。
载体质粒的构建各个载体用下述方法构建。除非另有说明，否则诸如限制性酶、接头等在质粒制备中使用的试剂为Takara Shuzo生产的产品。为了在大肠杆菌中扩增和筛选，使用DH5α(BRL)。(1)pBI(Hm)-ER的构建(参见图2)用限制性酶BamHI和SalI消化位于质粒pER23-1[N.Umemoto等(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 279141]的多接头中的BamHI位点和SalI位点，获得含有介于这两个限制性位点之间的全长ER基因的片段。从琼脂糖凝胶分离该片段。另一方面，用BamHI和SacI消化植物表达型双元质粒pBI121(Clontech)；以下所示的合成接头DNA(SEQ ID NO15和16)用全自动DNA合成仪(Applied Biosystems)合成。
使这些接头DNA退火，连接到已消化的pBI121上，从而产生pBI接头。然后，将上述片段克隆到该pBI接头的BamHI位点和SalI位点之间，由此获得pBI-ER。
5’-CTAGAGGATCCGGTACCCCCGGGGTCGACGAGCT-3’(SEQ ID NO15)5’-CGTCGACCCCGGGGGTACCGGATCCT-3’(SEQ ID NO16)随后，用BamHI和SacI消化pBI-ER，获得含有全长ER基因的片段。从琼脂糖凝胶上分离该片段，与通过用BamHI和SacI消化植物表达型双元质粒pIG121-Hm [Nakamura等，(1991)，PlantBiotechnolgy II(Modern Chemistry Suppl.第20卷)，第123-132页；日本Nagoya大学的Kenzo Nakamura教授发表]而得到的质粒片段相连接，从而获得目的载体pBI(Hm)-ER。
对所得载体的DNA序列分析表明，已获得SEQ ID NO2中所示的核苷酸序列。SEQ ID NO2的核苷酸序列所编码的氨基酸序列示于SEQ ID NO1中。
1994年6月15日，将载有转移入质粒pER23-1的大肠杆菌DH5α EKB633，保藏在工业科学技术机构-国立生命科学和人体技术研究所(日本，1-3，Higashi 1-chome，Tsukeba City，Ibaraki教授)，保藏号为FERM BP-4699。(2)pBI(Hm)-LER的构建(参见图3)用HindIII酶切pER23-1中的两个HindIII位点。HindIII定，使得到的质粒自身连接从而去除位于ER中的HindIII位点之后的ER部分。接着，用NotI酶切余下的两个NotI位点，并由Klenow片段补平。对于获得的质粒，引入BamHI接头，由此产生一个BamHI位点。用BamHI和HindIII消化该质粒，获得含有位于所述HindIII位点之前的ER部分的片段。将该片段与一质粒片段相连接，该质粒片段含有通过用BamHI和HindIII消化pER23-1而得到的位于所述HindIII位点之后的ER部分。
用XbaI和BamHI进一步消化所得到的质粒。然后，使来源于大豆β-1，3葡聚糖酶非翻译5’端并用全自动DNA合成仪合成的合成接头DNA(SEQ ID NO17和18)退火，并连接到所述经消化的质粒上，由此制备pLER。5’-CTAGACTTCTTTCCTCAACCTTCTTTCTTCTTATATATTCGAAC-3’(SEQ ID NO17)5’-GATCGTTCGAATATATAAGAAGAAAGAAGGTTGAGGAAAGAAGT-3’(SEQ ID NO18)之后，用SalI消化pLER，并用Klenow片段补平。然后，将SacI接头引入以产生一个SacI位点。所得到的质粒进一步用XbaI和SacI消化，获得含有具引导序列(L)的ER基因的片段。从琼脂糖凝胶分离该片段，并将其与用XbaI和SacI消化植物表达型双元载体质粒pIG121而得到的质粒片段相连接，从而获得目的载体pBI(Hm)-LER。
对所产生载体的DNA测序结果表明，已获得示于SEQ ID NO4中的核苷酸序列。由SEQ ID NO4的核苷酸序列所编码的氨基酸序列示于SEQ ID NO3中。(3)编码源于拟南芥的RPS2的N-末端区(相应于该蛋白1/3)的cDNA克隆的获得拟南芥cDNA的获得方法如下感染大肠杆菌C600hfl之后，以每平板200.000个噬菌斑在十个15厘米的LB平板上涂布cDNA文库(Clontech)，并从所述平板上回收该噬菌体。获得了5组噬菌体文库，从2个平板回收的噬菌体作为1个库。按照Ishida法(“基因表达试验手册”，Ishida和Ando(编辑)，Kodansha Scientific Co.)，从每个库回收噬菌体DNA。
采用下列PCR引物对之一，并用约1微克噬菌体DNA(库#1-#5)为模版，以PCR法扩增编码pRPS2 N-末端区的目的cDNA(使用Takara Shuzo的EX-Taq试剂盒)，然后克隆至质粒pBluescript SKII(+)中。
(i)有义链引物5’-TGGCATGCGATGGATTTCATCTCATCTCTT-3’(SEQID NO19)反义链引物5’-GGGAATTCACTCCGCGAGCCGGCGAAT-3’(SEQ ID NO20)(ii)有义链引物5’-ACAAGTAAAAGAAAGAGCGAGAAATCATCGAAATG-3’(SEQ ID NO20)反义链引物5’-AGCCATGGCTCCTCCTAAAGTGAT-3’(SEQ ID NO21)用以上引物对(i)或引物对(ii)进行PCR。
将扩增的DNA磷酸化，插入pBluescript SKII(+)的SamI位点，从而获得示于图4的质粒DNA(pRPS2-6、pRPS2-14和pRPS2-16)。经DNA测序确认，除其引物部分外，这些DNA与所报道的序列[M.Mindrinos等(1994)Cell 781089]相一致。(4)pBI(Hm)-CER的构建(参见图5)用限制性酶XbaI消化pRPS2-14，并自身连接，由此去处该XbaI片段。将BamHI接头插入所产生质粒的EcoRV位点。此外，将SacI接头插入XhoI位点。所产生的质粒用BamHI和SalI酶消化，并克隆进用BamHI和SalI从pER23-1切下的全长ER。从该质粒，纯化含有部分RPS2和全长ER的嵌合DNA。对RPS2和ER之间的接点进行DNA测序，确认RPS2的读框与ER的读框一致。
另一方面，将pSpeI接头插入pRPS2-6的RcoRV位点。接着，用XbaI和SacI消化该质粒，然后克隆进上述纯化的DNA片段。该质粒含有嵌合基因，该嵌合基因由相应于约1/3 RPS2的RPS2 5’末端区和全长ER组成，用SpeI与SacI消化该质粒以切出该嵌合基因，然后将该嵌合基因克隆进质粒pIG121-Hm中。由此获得目的载体pBI(Hm)-CER。
对所获得载体进行DNA测序的结果是，得到示于SEQ ID NO6中的核苷酸序列。由SEQ ID NO6中的核苷酸序列所编码的氨基酸序列示于SEQ ID NO5中。(5)pBI(Hm)-IER的构建(参见图6)用BamHI和NspI，从pER23-1纯化编码N-端537个氨基酸的ER cDNA片段。另一方面，用EcoRV和SphI从质粒pRPS2-16纯化RPS2 cDNA片段。将这两个DNA片段克隆到质粒pBluescript SKII(+)的BamHI位点和SamI位点之间。这个质粒被命名为pERRPS-8。对RPS2和ER之间的接点进行DNA测序，确认RPS2的读框与ER的读框相一致。用SpeI和SacI消化pERRPS-8，获得含有融合基因的片段，该融合基因由编码诱发剂结合区的结构域和编码部分长度RPS2的结构域组成。从琼脂糖凝胶中分离该片段，与用XbaI和SacI消化植物表达型双元载体pIG121-Hm而获得的质粒片段相连接，由此获得目的载体pBI(Hm)-IER。
对所获得载体进行DNA测序的结果是，得到示于SEQ ID NO8中的核苷酸序列。由SEQ ID NO8中的核苷酸序列所编码的氨基酸序列示于SEQ ID NO7中。(6)pBI(Hm)-ISER的构建(参见图7)用NsiI和NotI消化质粒pERRPS-8。然后，将以下所示的NotI-NsiI连接物插入该质粒。经DNA测序确认位于该连接物中的ATG读框与ER的读框相一致。用EcoRV和SalI消化所产生的质粒，然后纯化所得到的该RPS2/ER嵌合DNA。
5’-GGCCGCGATATCATGAATGCA-3’(SEQ ID NO23)5’-TTCATGATATCGC-3’(SEQ ID NO24)制备下面所示的来源于β-1，3葡聚糖酶非翻译5’端的合成DNA，并插入pBluescript SKII(+)的NotI位点和EcoRI位点中，由此制备质粒pL。
5’-GGCCGCCTTCTTTCCTCAACCTTCTTTCTTCTTATATATTCGAAC-3’(SEQID NO25)5’-AATTGTTCGAATATATAAGAAGAAAGAAGGTTGAGGAAAGAAGGC-3’(SEQID NO26)用EcoRV和SalI消化质粒pL，将上述纯化的RPS2/ER嵌合DNA插入所述限制性位点之间。所得到的质粒被称作pSERRPS-8。用SpeI和SacI消化pSERRPS-8，获得含有融合基因的片段，该融合基因由编码诱发剂结合位点的结构域和编码部分长度RPS2的结构域组成。从琼脂糖凝胶中分离该片段，与用XbaI和SacI消化植物表达型双元载体pIG121-Hm而获得的质粒片段相连接，由此获得目的载体pBI(Hm)-ISER。
对所获得载体进行DNA测序的结果是，得到示于SEQ ID NO10中的核苷酸序列。由SEQ ID NO10中的核苷酸序列所编码的氨基酸序列示于SEQ ID NO9中。
嵌合受体基因转化拟南芥(1)农杆菌感染液的制备用电穿孔法，将含有嵌合受体基因的转化载体[pBI(Hm)-CER或pBI(Hm)-ISER]或含有作为对照的ER基因的转化载体[pBI(Hm)-ER]转移入根癌农杆菌EHA101中，在3毫升YEB培养基中接种该根癌农杆菌EHA101，并于28℃培养16小时。然后，离心收集细胞，悬浮于10毫升感染培养基中，制备转化用的农杆菌感染液。以下是YEB培养基和感染培养基的组成YEB培养基5g/L牛肉提取物；1g/L酵母提取物；5g/L蛋白胨；5g/L蔗糖；2mM硫酸镁。
感染培养基MS培养基[Murashige和Skoog(1962)Physiol.Plant.15473]中所用浓度的0.5倍浓度的无机盐和维生素；15g/L蔗糖；10g/L葡萄糖；10mM MES(pH 5.4)。(2)产生拟南芥转化子的方法将Landsberg生态型和Columbia生态型的拟南芥种子无菌播种在MSHF培养基上，培养3周。根长至2-3厘米时切为约5毫米，转移至愈伤组织诱导培养基上培养2天。将根切碎浸入农杆菌感染液。以滤纸吸去根碎片上的多余液体后，将根碎片转移至拟南芥协同培养基上，在暗处培养2天。然后，将根碎片转移至拟南芥重分化培养基上培养2天。之后，将根碎片转至拟南芥重分化培养基上筛选并培养1周。然后，每隔一周将根碎片转移至新鲜的拟南芥重分化培养基上培养直至得到再生的幼苗。
当苗长至约1厘米时，将幼苗移植至拟南芥根诱导培养基上继续培养。根延长至1-2厘米时，用PCR法检测幼苗中是否存在转基因，以获得转化子。除非另有说明，否则于22℃、光照16小时/非光照8小时下进行培养。培养过程中使用的每种培养基的组成如下。
MSHF培养基MS培养基[Murashige和Skoog(1962)Physiol.Plant.15473]中使用的无机盐和维生素；20g/L蔗糖；2g/L吉兰糖胶；5mM MES(pH 6.2)。
愈伤组织诱导培养基MS培养基中使用的无机盐和维生素；20g/L蔗糖；0.5mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)；0.1mg/L激动素；2g/L吉兰糖胶；5mM MES(pH 6.2)。
拟南芥协同培养培养基MS培养基中使用的无机盐和维生素；20g/L蔗糖；0.5mg/L 2，4-D；0.1mg/L激动素；0.2mM乙酰丁香酮；2g/L吉兰糖胶；5mM MES(pH 6.2)。
拟南芥重分化培养基MS培养基中使用的无机盐和维生素；20g/L蔗糖；1mg/L 2-异戊稀胺；0.15mg/L吲哚乙酸；250mg/L头孢噻肟；2g/L吉兰糖胶；5mM MES(pH 6.2)。
拟南芥重分化筛选培养基MS培养基中使用的无机盐和维生素；20g/L蔗糖；1mg/L 2-异戊稀胺；0.15mg/L吲哚乙酸；2g/L吉兰糖胶；50mg/L卡那霉素；250mg/L头孢噻肟；5mM MES(pH 6.2)。
拟南芥根诱导培养基MS培养基中使用的无机盐和维生素；20g/L蔗糖；2mg/L萘乙酸；2g/L吉兰糖胶；250mg/L头孢噻肟；5mMMES(pH 6.2)。
将嵌合受体基因转移入烟草植株(1)制备农杆菌感染液用电穿孔法，将含有嵌合受体基因的转化载体[pBI(Hm)-IER]或含有作为对照的ER基因的转化载体[pBI(Hm)-IER]转移入根癌农杆菌EHA101中，在3毫升YEB培养基中接种该根癌农杆菌EHA101，并于28℃培养16小时。然后，离心收集细胞，悬浮于10毫升感染培养基中，制备转化用的农杆菌感染液。以下是YEB培养基和感染培养基的组成YEB培养基5g/L牛肉提取物；1g/L酵母提取物；5g/L蛋白胨；5g/L蔗糖；2mM硫酸镁。
感染培养基MS培养基[Murashige和Skoog(1962)Pbysiol.Plant.15473]中所用浓度的0.5倍浓度的无机盐和维生素；15g/L蔗糖；10g/L葡萄糖；10mM MES(pH 5.4)。(2)产生烟草转化子的方法将烟草(Nicotiana tabacum L.)栽培品种Samsun的叶片消毒后切成约1平方厘米的碎片，漂浮于农杆菌感染液上10分钟，然后用滤纸去掉多余液体。之后，将叶片转移至烟草协同培养基上，于暗处培养2天。将叶片转移至烟草重分化培养基上培养1周之后，再转移至烟草重分化培养基上筛选并培养2周。然后，每隔2周将它们转移至新鲜的烟草重分化培养基上，直至获得再生幼苗。
当苗长至约1厘米时，将幼苗移植至烟草根诱导培养基上继续培养。根延长至1-2厘米时用PCR法检测在幼苗中是否存在转基因，以获得转化子。除非另有说明，否则于25℃、光照16小时/非光照8小时下进行培养，培养过程中使用的每种培养基的组成如下。
烟草协同培养培养基MS[Murashige和Skoog(1962)Physiol.Plant.15473]培养基中使用的无机盐和维生素；30g/L蔗糖；0.1mg/L萘乙酸；1mg/L苄基腺嘌呤；0.2mM乙酰丁香酮；8g/L琼脂；5mMMES(pH5.8)。
拟南芥重分化培养基MS培养基中使用的无机盐和维生素；30g/L蔗糖；0.1mg/L萘乙酸；1mg/L苄基腺嘌呤；250mg/L头孢噻肟；8g/L琼脂；5mM MES(pH 5.8)。
拟南芥重分化筛选培养基MS培养基中使用的无机盐和维生素；30g/L蔗糖；0.1mg/L萘乙酸；1mg/L苄基腺嘌呤；100mg/L卡那霉素；250mg/L头孢噻肟；8g/L琼脂；5mM MES(pH 5.8)。
烟草根诱导培养基MS培养基中使用的无机盐和维生素；30g/L蔗糖；250mg/L头孢噻肟；8g/L琼脂；5mM MES(pH 5.8)。
转化拟南芥的过敏反应试验(1)转化拟南芥(Landsberg生态型)的过敏反应试验用拟南芥转化子(CER)、拟南芥转化子(ER；SEQ ID NO2)和非转化拟南芥，拟南芥转化子(CER)已经被确认所产生的嵌合受体基因之一(即含有示于SEQ ID NO6中的核苷酸序列的基因)在其中高度表达，也确认拟南芥转化子(ER；SEQ ID NO2)中的ER蛋白高度表达。
用去掉针头的注射器，将溶解于10mM氯化镁溶液中的来源于真菌细胞壁的葡聚糖诱发剂(100μg/ml)和单独的10mM氯化镁溶液从叶片背面分别渗透进在温室中生长的拟南芥植物叶片中。植物于25℃、光照16小时/暗8小时下培养7天，观察叶片表面发生的变化。该试验中采用的来源于真菌细胞壁的葡聚糖诱发剂按照Umemoto等的方法[N.Umemoto等，(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 941029]获得。
葡聚糖诱发剂渗透到非转化拟南芥中之后，在其叶片表面上未观察到变化。这表明拟南芥不能够识别该葡聚糖诱发剂。另一方面，在表达葡聚糖诱发剂受体的拟南芥植物(ER)中，受检测的6个克隆中有2个显示出弱褐变反应(抗性反应)。在表达嵌合受体的拟南芥植物(CER)中，受检测的12个克隆中有8个显示出有效的褐变反应(抗性反应)，有1个克隆显示出弱褐变反应(表1)。
表1、转化拟南芥(Landsberg生态型)的过敏反应试验来源于真菌细胞壁10mM氯化镁的葡聚糖诱发剂对照1 - -对照2 - -对照3 - -对照4 - -对照5 - -对照6 - -对照7 - -对照8 - -对照9 - -对照10- -对照11- -对照12- -ER1 - -ER2 - -ER3 + -ER4 - -ER5 - -ER6 + -CER1 ++ -CER2 ++ -CER3 ++ -CER4 ++ -CER5 - -CER6 +++-CER7 +++-CER8 ++ -CER9 - -CER10 - -CER11 ++ -CER12 - --无变化；+轻微褐变反应；++中度褐变反应；+++强褐变反应。
这些结果证实，对宿主植物不能识别的葡聚糖诱发剂的识别不仅发生在大豆来源的ER蛋白单独表达时，还发生在由ER蛋白和拟南芥来源的RPS2蛋白的N-端结构域(预期其含有信号转导域)组成的嵌合受体在拟南芥中表达时。另外，还证实表达嵌合受体对于识别葡聚糖诱发剂更有利。这表明嵌合受体表达时，相对于ER蛋白单独表达的情况，葡聚糖诱发剂结合受体之后信号转导进行得更加有效。
本发明提供DNA和植物，所述DNA和植物通过识别诸如其细胞壁中含有葡聚糖结构的真菌等的植物致病性微生物的接触和/或侵入，能够比单独表达ER蛋白更强烈地诱导与抗病性紧密相关的抗性反应。通过产生这种强烈诱导由葡聚糖诱发剂引起的抗性反应，有可能培育出对诸如真菌的植物致病性微生物显示强抗性的植物。(2)转化拟南芥Columbia生态型的过敏反应试验用拟南芥转化子(ISER)和非转化拟南芥(对照)的叶片检测大豆诱发剂对过敏反应的诱导，该拟南芥转化子已经被确认所产生的嵌合受体基因之一(即含有示于SEQ ID NO10中的核苷酸序列的基因)在其中高度表达。
用去掉针头的注射器，将溶解于10mM氯化镁溶液中的来源于真菌细胞壁的葡聚糖诱发剂(100μg/ml)和单独的10mM氯化镁溶液，从叶片背面分别渗透进在温室中生长的拟南芥植物叶片中。植物于22℃、光照16小时/暗8小时下培养7天，观察叶片表面发生的变化。该试验中采用的来源于真菌细胞壁的葡聚糖诱发剂按照Umemoto等的方法[N.Umemoto等，(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 941029]获得。
葡聚糖诱发剂渗透到非转化拟南芥中之后，在其叶片表面上未观察到变化。这表明拟南芥不能够识别该葡聚糖诱发剂。另一方面，在表达嵌合受体的拟南芥植物(ISER)中，受检测的5个克隆中有3个显示出有效的褐变反应(抗性反应)(表2)。
表2、转化拟南芥(Columbia生态型)的过敏反应试验来源于真菌细胞壁10mM氯化镁的葡聚糖诱发剂对照1 - -对照2 - -对照3 - -ISER1 +++ -ISER2 - -ISER3 ++-ISER4 +++ -ISER5 - --无变化；+轻微褐变反应；++中度褐变反应；+++强褐变反应。
这些结果证实，对宿主植物不能识别的葡聚糖诱发剂的识别，通过表达由已缺失相应于ER蛋白约1/3的N-末端区的ER和拟南芥来源的RPS2蛋白的N-端结构域(预期该结构域含有信号转导域)组成的嵌合受体而发生。本发明提供能够识别诸如其细胞壁中含有葡聚糖结构的真菌等的植物致病性微生物的接触和/或侵入的植物。通过产生这种强烈诱导由葡聚糖诱发剂引起的抗性反应的植物，有可能培育出对诸如真菌的植物致病性微生物显示强抗性的植物。
转化烟草的过敏反应试验用烟草转化子(IER)、烟草转化子(LER；SEQ ID NO4)和非转化烟草(对照)的叶片检测大豆诱发剂对过敏反应的诱导，其中所述烟草转化子已经被确认所产生的嵌合受体基因之一(即含有示于SEQ IDNO8中的核苷酸序列的基因)在其中高度表达，也确认烟草转化子(LER；SEQ ID NO4)中的ER蛋白高度表达。
于叶柄部切下生长在温室中的烟草植物的叶片，置于透光的塑料盒中。叶片上表面放置直径为5毫米、长度为5毫米的硅氧烷管碎片，使之保留液体。将来源于真菌细胞壁的葡聚糖诱发剂(100μg/ml)溶解于10mM氯化镁溶液，一种化学合成的葡聚糖诱发剂(100μg/ml)溶解于相同溶液，用单独的10mM氯化镁溶液作为对照，将这三种溶液分别保留于硅氧烷管碎片中，使每种溶液与叶片表面接触。于过高湿度下培养叶片以防干燥，于光照16小时/暗8小时、25℃下培养7天。所述化学合成的葡聚糖诱发剂(β-D-葡己糖苷(glucohexaoside))[N.Hong和T.Ogawa(1990)Tetrahedron Lett.313179]由Ogawa教授发表(东京大学，物理化学研究所)。培养之后，移去硅氧烷管碎片。然后，在UV灯(Funakoshi)上观察烟草植物抗毒素的积累。
将该葡聚糖诱发剂加进非转化烟草时，未观察到变化。这表明非转化烟草不能识别该葡聚糖诱发剂。在表达ER的烟草植物中，所检测的5个克隆中有1个只显示出十分少量的荧光物质(植物抗毒素)积累。在表达IER的烟草中，所检测的5个克隆中有3个显示出可观量的荧光物质(植物抗毒素)积累，1个克隆显示出十分少量的荧光物质(植物抗毒素)积累(表3)。
表3、转化烟草的过敏反应试验

-无变化；+荧光物质轻微积累；++荧光物质中度积累；+++荧光物质大量积累。
这些结果表明不仅在大豆来源的ER蛋白单独表达时，而且在由ER蛋白和拟南芥来源的RPS2蛋白的N-端结构域组成的嵌合受体在非大豆和拟南芥(烟草)的宿主植物中表达时，均发生对该宿主植物本身不能识别的葡聚糖诱发剂的识别。也表明嵌合受体的表达对于葡聚糖诱发剂的识别更有利。因此表明，即使在非拟南芥的植物中，当编码含有RPS2的N-端结构域的嵌合受体在其中表达时，较之只有编码ER蛋白的基因单独表达的情况，信号转导可以更有效地进行。本发明提供编码嵌合受体的DNA，所述嵌合受体能够识别诸如其细胞壁中具有葡聚糖结构的真菌的植物致病性微生物()的接触和/或侵入，本发明也提供具有这种嵌合受体的植物。结果是，比起那些ER蛋白在其中单独表达的情况，可更强烈地诱导与抗病性紧密相关的抗性反应，如诱导植物抗毒素。通过产生这种强烈诱导由葡聚糖诱发剂引起的抗性反应的植物，有可能培育出对诸如真菌的植物致病性微生物显示强抗性的植物。工业应用性根据本发明，提供编码嵌合蛋白(嵌合受体)的DNA，该嵌合蛋白(嵌合受体)包含一个含有至少一个诱发剂受体的诱发剂结合位点的结构域和一个包含植物来源的抗性基因的信号转导基序的结构域；转移入上述DNA的抗病性植物；以及产生这种植物的方法。
本发明的嵌合受体可用于阐明抗真菌的机理。
另外，含有编码嵌合受体和其片段的核苷酸序列的本发明DNA可用作建立培育抗真菌植物的技术的材料。即如果将本发明的DNA或其片段转移入各种植物并在其中表达，可增强植物对真菌的抗性。
序列表SEQ ID NO1序列长度667序列类型氨基酸拓扑学线性分子类型蛋白质序列描述Val Asn Ile Gln Thr Asn Thr Ser Tyr Ile Phe Pro Gln Thr Gln Ser1 5 10 15Thr Val Leu Pro Asp Pro Ser Lys Phe Phe Ser Ser Asn Leu Leu Ser20 25 30Ser Pro Leu Pro Thr Asn Ser Phe Phe Gln Asn Phe Val Leu Lys Asn35 40 45Gly Asp Gln Gln Glu Tyr Ile His Pro Tyr Leu Ile Lys Ser Ser Asn50 55 60Ser Ser Leu Ser Leu Ser Tyr Pro Ser Arg Gln Ala Ser Ser Ala Val65 70 75 80Ile Phe Gln Val Phe Asn Pro Asp Leu Thr Ile Ser Ala Pro Gln Gly85 90 95Pro Lys Gln Gly Pro Pro Gly Lys His Leu Ile Ser Ser Tyr Ser Asp100 105 110Leu Ser Val Thr Leu Asp Phe Pro Ser Ser Asn Leu Ser Phe Phe Leu115 120 125Val Arg Gly Ser Pro Tyr Leu Thr Val Ser Val Thr Gln Pro Thr Pro130 135 140Leu Ser Ile Thr Thr Ile His Ser Ile Leu Ser Phe Ser Ser Asn Asp145 150 155 160Ser Asn Thr Lys Tyr Thr Phe Gln Phe Asn Asn Gly Gln Thr Trp Leu165 170 175Leu Tyr Ala Thr Ser Pro Ile Lys Leu Asn His Thr Leu Ser Glu Ile180 185 190Thr Ser Asn Ala Phe Ser Gly Ile Ile Arg Ile Ala Leu Leu Pro Asp195 200 205Ser Asp Ser Lys His Glu Ala Val Leu Asp Lys Tyr Ser Ser Cys Tyr210 215 220Pro Val Ser Gly Lys Ala Val Phe Arg Glu Pro Phe Cys Val Glu Tyr225 230 235 240Asn Trp Glu Lys Lys Asp Ser Gly Asp Leu Leu Leu Leu Ala His Pro245 250 255Leu His Val Gln Leu Leu Arg Asn Gly Asp Asn Asp Val Lys Ile Leu260 265 270Glu Asp Leu Lys Tyr Lys Ser Ile Asp Gly Asp Leu Val Gly Val Val275 280 285Gly Asp Ser Trp Val Leu Lys Thr Asp Pro Leu Phe Val Thr Trp His290 295 300Ser Ile Lys Gly Ile Lys Glu Glu Ser His Asp Glu Ile Val Ser Ala305 310 315 320Leu Ser Lys Asp Val Glu Ser Leu Asp Ser Ser Ser Ile Thr Thr Thr325 330 335Glu Ser Tyr Phe Tyr Gly Lys Leu Ile Ala Arg Ala Ala Arg Leu Val340 345 350Leu Ile Ala Glu Glu Leu Asn Tyr Pro Asp Val Ile Pro Lys Val Arg355 360 365Asn Phe Leu Lys Glu Thr Ile Glu Pro Trp Leu Glu Gly Thr Phe Ser370 375 380Gly Asn Gly Phe Leu His Asp Glu Lys Trp Gly Gly Ile Ile Thr Gln385 390 395 400Lys Gly Ser Thr Asp Ala Gly Gly Asp Phe Gly Phe Gly Ile Tyr Asn405 410 415Asp His His Tyr His Leu Gly Tyr Phe Ile Tyr Gly Ile Ala Val Leu420 425 430Thr Lys Leu Asp Pro Ala Trp Gly Arg Lys Tyr Lys Pro Gln Ala Tyr435 440 445Ser Ile Val Gln Asp Phe Leu Asn Leu Asp Thr Lys Leu Asn Ser Asn450 455 460Tyr Thr Arg Leu Arg Cys Phe Asp Pro Tyr Val Leu His Ser Trp Ala465 470 475 480Gly Gly Leu Thr Glu Phe Thr Asp Gly Arg Asn Gln Glu Ser Thr Ser485 490 495Glu Ala Val Ser Ala Tyr Tyr Ser Ala Ala Leu Met Gly Leu Ala Tyr500 505 510Gly Asp Ala Pro Leu Val Ala Leu Gly Ser Thr Leu Thr Ala Leu Glu515 520 525Ile Glu Gly Thr Lys Met Trp Trp His Val Lys Glu Gly Gly Thr Leu
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权利要求
1.编码嵌合蛋白的DNA，所述嵌合蛋白包括一个含有至少一个诱发剂受体的诱发剂结合位点的结构域和一个含有至少一个赋予植物抗病性的蛋白的信号转导基序的结构域。
2.权利要求1的DNA，其中所述诱发剂是葡聚糖、多聚半乳糖醛酸、N-乙酰壳寡糖、诱发素、来源于黄枝孢的Avr基因产物或来源于黑麦喙孢的nipl基因产物。
3.权利要求1的DNA，其中所述诱发剂结合位点包含以下重组蛋白(a)或重组蛋白(b)(a)包含SEQ ID NO27中所示的氨基酸序列的蛋白(b)包含SEQ ID NO27中所示的氨基酸序列、缺失、置换、增加或插入至少一个氨基酸的蛋白，所述蛋白能够与葡聚糖诱发剂相结合。
4.权利要求1至3中任一项的DNA，其中含有信号转导基序的结构域包含至少一个选自以下的基序富含亮氨酸的重复序列、亮氨酸拉链、核苷酸结合位点和丝氨酸/苏氨酸激酶域。
5.权利要求1至4中任一项的DNA，其中含有信号转导基序的结构域是来源于番茄的Pto、Prf、Cf-2或Cf-9基因的表达产物的信号转导域；来源于水稻的Xa21基因的表达产物的信号转导域；来源于拟南芥的RPS2基因或RPM1基因的表达产物的信号转导域；来源于亚麻的L6基因的表达产物的信号转导域；或来源于烟草的N基因的表达产物的信号转导域。
6.权利要求5的DNA，其中RPS2基因包含示于第SEQ ID NO29中的核苷酸序列。
7.编码以下蛋白(c)或蛋白(d)的DNA(c)含有示于SEQ ID NO5、7或9中的氨基酸序列的嵌合蛋白；(d)含有示于SEQ ID NO5、7或9中的氨基酸序列、缺失、置换、增加或插入至少一个氨基酸的嵌合蛋白，所述蛋白赋予植物抗病性。
8.编码赋予植物抗病性的嵌合蛋白的DNA，所述DNA含有示于SEQ ID NO6、8或10中的核苷酸序列。
9.含有权利要求1至8中任一项的DNA的重组载体。
10.用权利要求9的重组载体转化的转化植物或所述植物的后代。
11.产生抗病性植物的方法，包括将权利要求9的重组载体转移入植物中。
12.具有植物抗病性的植物或所述植物的后代，所述植物已转移入权利要求1至8中任一项的DNA并表达所述DNA。
13.产生具有植物抗病性的植物或所述植物的后代的方法，包括将权利要求1至8中任一项的DNA整合进植物染色体中并表达所述DNA。
全文摘要
编码嵌合蛋白的DNA,所述嵌合蛋白每种均包括一个含有至少一个诱发剂受体的诱发剂结合位点的结构域和一个含有至少一个可赋予植物抗病性的蛋白的信号转导基序的结构域;包含这些DNA的重组载体;通过用所述重组载体制备的转化植物或其后代;以及构建抗病性植物的方法,其特征在于将所述重组载体转移入宿主植物中。
文档编号C12N15/29GK1266457SQ98808119
公开日2000年9月13日 申请日期1998年6月18日 优先权日1997年6月18日
发明者柿谷诚, 梅基直行, 塚原正义, 石田功 申请人:麒麟麦酒株式会社