专利名称：蛋白质－胶体金属－氨基葡聚糖包覆的粒子及其制备方法和用途的制作方法
技术领域：
本发明一般涉及新颖的流式血细胞计数和细胞分离及试剂，更具体地说，本发明涉及新颖的由结合有蛋白质的胶体金属和氨基葡聚糖包覆底物而形成的粒子以及这种粒子的制备方法和用途。
流式血细胞计数技术为研究者提供了细胞的物理参数数据，该技术用于分离不同种类的细胞，例如将白细胞分成三个主要的组类，即淋巴细胞、单核细胞和巨核细胞。业已描述了其他技术用于鉴定其他白细胞种群，例如T-细胞、B-细胞、胞毒细胞和阻抑细胞、中性粒细胞、嗜酸性细胞和嗜碱性细胞。例如参见“流式血细胞计数和分类”，第371页，由Melded，Mullaney和Mendelsohn编辑(1979年)，JohnWiley&Sons，N.Y.，N.Y.；美国专利5,125,737；美国专利5,492,833；美国专利5,223,398；美国专利5,231,005。
现有技术的亚类计数方法是利用涂覆有抗体的聚苯乙烯胶乳颗粒靶向全血中特定的白细胞亚群，其结果是使靶细胞的体积、直流或低频电流(DC)或高频(RF)电导以及光散射方面发生变化(位移)。例如参见1992年6月11日公开的PCT申请WO92/09682；J.C.Hudson等人的“血细胞计数”，22150(1995年)；美国专利5,639,620以及1995年9月14日公开的国际专利申请WO95/24631。事实上，可利用市售的血液学仪器，例如配备有VCS技术的COULTERSTKSTM仪器检测到后三种变化。这些仪器能计算白细胞总数中位移细胞数所占的百分比。
以上由颗粒引发位移的所有方法都用到一种结合有抗体的聚苯乙烯颗粒，以便一次只对淋巴细胞亚群计数。使用无机材料颗粒产生位移的方法直到最近才有记载。例如参见美国专利5,466,609；国际专利申请WO9524631；美国专利5,552,086。特别是金/银胶体包覆的聚苯乙烯-氨基葡聚糖颗粒及其制备方法和特征已有记载。例如参见美国专利5,248,772和美国专利5,552,086。
目前对淋巴细胞进行分类的方法包括使用荧光标记物和测定前光散射、侧光散射和荧光强度或者利用颗粒上的抗体并测定中心角度的光散射、DC和RF。因此，利用颗粒上的抗体在任一次分析淋巴细胞的一个亚群时，只涉及到一种类型的涂覆有抗体的颗粒。还可参见P.K.Horan和L.L.Wheeless，Jr.，“科学”198149-157(1997)；以及1980年2月13日公开的英国专利1561042。另一方面，常规使用的具有荧光标记物的流式血细胞计数同时使用了多种荧光标记的抗体(2-6)，来分析白细胞的不同亚群。
目前，还没有一种方法能用颗粒上抗体来分析血液样品，从而可同时对淋巴细胞的多种亚群进行计数。因此，本领域需要有能够更有效地分析血液或其他多细胞流体物质的组合物和方法。
本发明一方面提供了一种稳定的胶体粒子，该粒子包括(a)一个具有能够与胺反应的官能团的胶体大小的核底物；(b)所述底物的外表面上有一层氨基葡聚糖涂层；(c)一层覆盖所述氨基葡聚糖涂层的胶体大小的金属固体，所述金属固体中的金属是由那些能够被上述核底物的氨基葡聚糖涂层从离子态还原成金属态的金属中选择的；(d)一种附着到所述金属固体上的键合剂，所述键合剂具有游离的氨基；以及(e)一种通过与所述游离氨基共价键合而附着到所述键合剂上的蛋白质。
另一方面，本发明提供了用于制备上述粒子的方法，包括利用氨基三硫醇键合剂将蛋白质结合到包覆粒子上的方法。
再一方面，本发明提供了利用上述粒子在一种生物溶液或悬浮液中，如全血中，同时定量测定两种或多种白细胞亚群的方法。
以下通过参考附图和优选实施例详细描述本发明，进一步阐述本发明的其他方面和优点。
图1是醛/硫酸酯聚苯乙烯胶乳颗粒(PS)悬浮液的电泳淌度-pH值曲线图，其中PS未包覆或已包覆有氨基葡聚糖(Amde×)、金胶体、氨基三硫醇键合剂以及抗-CD4(T4)抗体或抗-CD8(T8)抗体。
图2是醛/硫酸酯PS悬浮液的电泳淌度-pH值曲线图，其中PS未包覆或已包覆有1，3-二氨基丙烷(DAP)、4-〔N-马来酰亚胺甲基〕环己烷-1-羧酸硫代琥珀酰亚胺酯(硫代-SMCC)以及T4或T8抗体，所有试剂都只用1×磷酸缓冲盐(PBS)冲洗。
图3是醛式/硫酸酯PS悬浮液的电泳淌度-pH值曲线图，其中PS未包覆或已包覆有硫代-SMCC-DAP和T4或T8抗体，所有试剂都用牛血清白蛋白(“BSA”)缓冲液和1×PBS洗涤。
图4A是本发明粒子的放大了20,000倍的扫描电子显微图片，该粒子包括通过氨基三硫醇键合剂将T4抗体键合到金包埋的、氨基葡聚糖涂覆的PS粒子上(T4-氨基三硫醇-金-氨基葡聚糖-PS)。
图4B是图4A的粒子放大40,000倍的扫描电子显微图片。
图4C是图4A的粒子放大100,000倍的扫描电子显微图片。
图5A是与图4A类似粒子的放大18,500倍的扫描电子显微图片，只是金属胶体是银(T4-氨基葡聚糖-银-氨基葡聚糖-PS)。
图5B是图5A的粒子放大10,000倍的扫描电子显微图片。
图5C是图5A的粒子放大50,000倍的扫描电子显微图片。
图5D是图5A的粒子放大100,000倍的扫描电子显微图片。
图6A-6F是全血以及全血与T4-Amde×-Ag-Amde×-PS粒子的不同混合物的电子测试参数(DC)-侧角光散射(SALS)矩阵图(在633nm处激发得到的)，从而证实随着粒子滴定度的增加(分别为2、5、10、20和40μl)，靶T4+淋巴细胞的SALS逐渐发生位移。
图7A-7L是全血与T4-Amde×-Ag-Amde×-PS(7A-7F)的混合物或者与常规的T4-DAP-PS粒子(7G-7L)的混合物的参数对(分别为DC-LMALS；DC-UMALS；LMALS-PMT1；UMALS-SALS；DC-SALS；RF-SALS)的矩阵图(在633nm处激发得到的)，从而表明在每个矩阵中靶T4+淋巴细胞的位移位置。
图8A-8L与图7A-7L相同，是全血与T4-Amde×-Ag-Amde×-PS或者与T4-DAP-PS粒子的混合物的参数对的矩阵图(在780nm处激发得到的)，表明在每个矩阵中靶T4+淋巴细胞的位移位置。
图9A-9F描绘出全血与T4-DAP-PS粒子混合物的图中所示不同参数对的矩阵图(在633nm处激发得到的)，从而表明T4+淋巴细胞的位移位置。
图10A-10F描绘出全血与T4-氨基三硫醇-金-Amde×-PS粒子混合物的不同参数对的矩阵图(在633nm处激发得到的)，表明T4+淋巴细胞的位移位置。
图11A-11F描绘出全血与T4-Amde×-Ag-Amde×-PS粒子混合物的不同参数对的矩阵图(在633nm处激发得到的)，从而表明T4+淋巴细胞的位移位置。
图12A-12D是全血与T4-DAP-PS粒子的四个样品混合物的90°LS-UMALS矩阵图(在633nm处激发得到的)，从而表明T4+淋巴细胞的位移位置R1。
图13A-13E是全血与五个滴定度增加的T4-氨基三硫醇-金-Amde×-PS粒子悬浮液的混合物的90°LS-UMALS矩阵图(在633nm处激发得到的)，从而表明每个矩阵中T4+淋巴细胞的位移位置R1。
图14A-14F是三个全血样品与左边的T8-DAP-PS和T4-氨基三硫醇-金-Amde×-PS粒子悬浮液以及与右边的T4-DAP-PS和T8-氨基三硫醇-金-Amde×-PS粒子悬浮液的混合物的90°LS-UMALS矩阵图(在633nm处激发得到的)，从而表明左边(LHS)中T8+(R1)和T4+(R2)淋巴细胞的位移位置以及右边(RHS)中T4+(R1)和T8+(R2)淋巴细胞的位移位置。
图15A-15F是全血与T4-DAP-PS和T8-Amde×-Ag-Amde×-PS粒子悬浮液的混合物的不同参数对的矩阵图(在633nm处激发得到的)，从而表明T4+(R1)和T8+(R2)淋巴细胞的位移位置。
本发明通过提供新颖稳定的胶体粒子而满足了本领域的需求，该粒子中的蛋白质(优选的是抗体)结合到胶体金属和氨基葡聚糖包覆的底物上。这种粒子用于流式血细胞计数方法，可有效的分析和分离生物样品中不同类型的细胞，只要每一种不同类型的细胞至少有一种独特的非重叠的抗原决定簇。
I、定义在此处以及权利要求书中所用到的下列术语具有如下定义。
“直方图(histogram)”是一个变量的频率分布图，即在×轴上标出变量，在Y轴上以“数字(#)”标出频率所描绘出的二维线图。直方图也是计算机中以图形表示的抽象数字列表或电路的一些其他形式。
“矩阵(matri×)”是两个无关变量的频率分布图，即在×轴上标出一个变量，在Y轴上标出第二个变量并以等脉冲线的形式标出频率或点数所描绘出的三维等高线图。为了清楚起见，只标出一个等脉冲线，用于表示种群的外形。矩阵还可定义为计算机中以图形表示的抽象数字列表或电路的一些其他形式。在本文中描述矩阵时，先列出×变量，再列出Y变量。
“参数(parameter)”与单一变量同义并意指对流式血细胞计数中分析的粒子或细胞同时单独进行测定所得到的任何数值。利用某些数学函数将两个或多个参数组合定义为产生另一个参数。
“选通(gating)”是一种过滤的方法，用于在多个参数数据中作出一个参数的直方图，并同时询问一个或多个其他参数。对于每一项测定来说，它是单个血细胞经过流动池并由参数转换器产生细胞测定值的必经过程，与将用于选通的每个参数相对应的测定值同一个或两个参考值或阈值进行比较，并在阈值之下、阈值之上或两个阈值之间进行“试验”。如果该试验对于所有被考虑的选通参数产生真实的结果，那么该项测定就包括在直方图中。也可利用选通画出矩阵图。因此，通过选通，可简化多参数数据的分析和图示。
“DC”和“RF”是作为小孔阻抗细胞感应的库尔特原理的电子感应参数。“DC”是通过施加直流或低频电流而得到的脉冲峰信息，因此细胞膜不会被渗透并且没有电流通过细胞。DC脉冲的最高振幅是细胞体积的函数。“RF”是从通过施加高频电流得到的测定值中得到的脉冲峰信息，因此细胞膜是短路的并且有电流通过细胞。RF是细胞体积和内电导率的函数。
“LMALS”是下中角光散射，即光学检测装置接收到的光线是以与入射光柱成10°-20°的角度散射进入或穿过的。
“UMALS”是上中角光散射，即光学检测装置接收到的光线是以与入射光柱成20°-65°的角度散射进入或穿过的。
“SALS”或“90°LS”是侧角光散射，即光学检测装置接收到的光线位于同入射光柱成90°+/-20°近似角度的位置上。
词汇“粒子(particle)”还包括除此之外的微球、小颗粒和小球，并且这些词汇可互相交换使用。
“抗体”的定义包括任意天然来源的多克隆抗体和天然或重组的单克隆抗体即IgG、IgM、IgA、IgD和IgE类、杂化衍生物、人化或嵌合抗体以及抗体片断〔包括Fab、Fab’和F(ab’)2〕。
II、本发明的组合物本发明提供了一种新颖稳定的胶体粒子，该粒子包括(a)一个具有能够与胺反应的官能团的胶体大小的核底物；(b)所述底物的外表面上有一层氨基葡聚糖涂层；(c)一层覆盖所述氨基葡聚糖涂层的胶体大小的金属固体，所述金属固体中的金属是由那些能够被上述核底物的氨基葡聚糖涂层从离子态还原成金属态的金属中选择的；(d)一种附着到所述金属固体上的键合剂，所述键合剂具有游离的氨基；以及(e)一种通过与所述游离氨基共价键合而附着到所述键合剂上的蛋白质。
在一个优选的实施例中，本发明的粒子包括氨基葡聚糖涂覆的聚苯乙烯粒子，该粒子也被含有键合剂的胶体金属涂覆，并且该键合剂上附着有一种交联剂。蛋白质(优选的是抗体)通过交联剂与键合剂的氨基结合而附着到被包覆的粒子上。这种结合的显著优点是能够在含有白细胞的生物样品中同时分析至少两个不同的白细胞亚型，例如T淋巴细胞的两个亚型。
A、胶体金属-氨基葡聚糖包覆的底物上述被包覆的底物最好是聚苯乙烯颗粒核底物(a)，优选的是该聚苯乙烯颗粒的直径在约0.2-约0.5mm的范围内(即胶体大小)。这些含有醛和/或硫酸盐官能团的聚苯乙烯核底物可购买到，例如从Interfacial Dynamics Corporation，Portland Oregon购买。当然，本领域的技术人员也可以从其他供货商处选购其他类似的粒子。
这种核底物的外表面上涂覆有氨基葡聚糖。优选的是，氨基葡聚糖涂层(b)与核底物(a)共价结合，其结合是否通过氨基葡聚糖的游离氨基与聚苯乙烯底物77上可与胺反应的官能团之间的共价键，进而通过与某种交联试剂，如戊二醛等，而结合的。形成涂层(b)的氨基葡聚糖的一般特征是，双胺取代程度的范围与最大理论值(1/2.5)相比，在1/40-1/35(1×-氨基葡聚糖)。更优选的是，氨基葡聚糖涂层(b)中的双胺取代程度约为1/7-1/8(5×-氨基葡聚糖)。
这种被包覆的底物的另一类型是利用羧基官能化的聚苯乙烯粒子作为核底物，该底物涂覆通过EDAC偶合的氨基葡聚糖(如美国专利5,639,620中所述)。
被包覆的底物还含有一层胶体大小的金属固体(c)，覆盖在氨基葡聚糖涂层上。优选的是，该金属层均匀地分散在氨基葡聚糖层的分散表面上。用涂覆底物的胶体金属通常是指那些能够被氨基葡聚糖涂层从离子态还原成金属态的金属，或者是能够形成具有约+0.7伏或更高还原势的金属离子或金属离子复合物的金属。这些金属离子可包括Ag(I)、Au(III)、Pd(II)、Pt(II)、Rh(III)、Ir(III)、Ru(II)、Os(II)，优选的金属离子是胶体金(III)和胶体银(I)。
B、键合剂本发明还提供了一种键合剂，可使所选择的蛋白质，例如抗体，结合到上述胶体金属-氨基葡聚糖涂覆的底物上。该键合剂通常具有为了结合蛋白质而能够被激活的游离氨基。
i、氨基葡聚糖键合剂被引入覆盖在胶体金属-氨基葡聚糖涂覆的底物上的键合剂，较优选的是氨基葡聚糖键合剂，最好是与最大理论值(1/2.5)相比，氨基葡聚糖中的双胺取代程度在约1/40-约1/35之间(1×-氨基葡聚糖)。另外，氨基葡聚糖键合剂中的双胺取代程度可在约1/7-1/8之间(如5×-氨基葡聚糖)。优选的是，当胶体金属是银时使用5×-氨基葡聚糖键合剂。
氨基葡聚糖含有足够的氨基，使其交联到银胶体包覆的聚苯乙烯粒子的现存粒子表面上以及共价键合蛋白质(例如抗体)。交联的氨基葡聚糖涂层可防止银胶体在随后的化学反应中从聚苯乙烯粒子上脱落，这些化学反应是激活粒子、使其与单克隆抗体结合以及封闭可发生化学反应的官能团。
ii、氨基三硫醇键合剂另一优选的键合剂，特别是当胶体金属是金时使用的键合剂是氨基三硫醇键合剂。特别有用的氨基三硫醇键合剂是三(3-巯基丙基)-N-甘氨酰氨基甲烷、具有蜘蛛样结构式，分子式为C12H26N2OS3〔J.K.Whitesell and H.K.Chang，Science，26173-76(1993)〕。
这种化合物最初是在粗糙的金膜表面上形成一个层，从而为丙氨酸N-羧酸酐聚合提供了NH2的初始部位，而形成聚丙氨酸单环。该聚氨基丙酸单环均匀排列，垂直于表面，甚至在180℃下加热一周后仍然附着在金表面上，保持着其构象不变。
该键合剂的优选形式是刚刚脱去保护的形式，在如下实施例4中详细描述了其优选制备过程。实施例4证实氨基三硫醇键合剂在沉积到聚苯乙烯粒子上的金粒子与单克隆抗体之间起到配位体的作用。即通过其三个硫原子而与胶体金属上的金或银原子强烈配位并通过其氨基而激活及结合抗体，氨基三硫醇键合剂还起到一种新的双功能键合剂的作用。软碱、低电负性、强极性硫原子最好与软酸，如金或银原子配位。
然而，正如下述的例5B中所述的，氨基三硫醇键合剂与氨基葡聚糖竞争聚苯乙烯粒子上沉积的银胶体表面上的结合位置，并将多数银胶体从银-氨基葡聚糖-聚苯乙烯粒子表面上替代下来。这样，氨基三硫醇在聚苯乙烯粒子上的银胶体存在下，不能很好的起到交联剂作用。
C、交联剂上述的键合剂共价结合到胶体金属-氨基葡聚糖包覆的底物或氨基葡聚糖-金属-氨基葡聚糖包覆的底物上。为了激活粒子上的键合剂，可使用异双功能交联剂，例如硫代琥珀酰亚胺基4-〔N-马来酰亚胺甲基〕环己烷-1-羧酸盐(“sulfo-SMCC”)。Sulfo-SMCC与具有活性氨基的键合剂共价结合。诸如The Pierce Handbook和Chemistry Of Protein Conjugation And Cross-Linking，S.S.Wong，CRC Press，Inc.，Boca Raton，FL(1991)这些教科书中提到了其他各种适合的交联剂和方法。
D、蛋白质然后，所选择的被激活的蛋白质(最好是抗体)通过交联剂附着到胶体金属-氨基葡聚糖包覆的底物的键合剂上，从而形成了本发明的新颖稳定的胶体粒子。更具体地说，键合剂上的游离氨基通过异双功能交联剂与被激活的蛋白质上的巯基或氨基共价键合而使得蛋白质(e)共价结合到键合剂-胶体金属-氨基葡聚糖包覆的底物上。
尽管任何蛋白质都可以这种方式固定到底物上，但是优选的蛋白质是单克隆或多克隆抗体或者各种重组抗体中的任何一种。抗体需要专对一种细胞上的抗原决定簇，而该抗原决定簇对于该种细胞的类型来说是独一无二的，因此使该粒子可用于细胞的分离测定中。可利用常规方式制备多克隆抗体，即从接触了所选抗原的动物或人血清中得到。例如，通过用所选择的抗原用常规方法刺激所选择的动物或人的免疫系统，使免疫系统产生天然抗体，然后从动物或人血或其他生物液体中收集这些抗体来制备多克隆抗体。
利用常规的杂交瘤方法并通过硫酸铵(45％)沉淀、离心及利用蛋白A进行亲和色谱方法从腹水中纯化而得到单克隆抗体。制备单克隆抗体的方法记载在G.Kohler and C.Milstein，Nature，256495-497(1975)中并包括许多公知的改良方法，这些方法列在此作为参考。通过应用公知的重组技术开发这些抗原的单克隆或多克隆抗体，可制备出类似需要的高滴定度抗体〔参见，例如PCT专利申请PCT/GB85/00392；英国专利申请GB21886 38A；Amit等，Science，233747-753(1986)；Queen等，Proc.Nat’1.Acad.Sci.USA，8610029-10033(1989)；PCT专利申请PCT/WO9007861；Riechmann等，Nature，332323-327(1988)；Huse等，Science，2461275-1281(1988)a〕。
本领域的技术人员通过操作动物或人抗体的互补测定区采用公知技术即可制备出嵌合人化或完全的人抗体，用作本发明蛋白质。参见，例如E.Mark和Padlin，“Humanization of Monoclonal Antibodies”，第4章，The Handbook of E×perimental Pharmacology，Vol.113，The Pharmacology of Monoclonal Antibodies，Springer-Verlag(1994年6月)。
当然，具体的制备方法和抗体种类并不限于这些技术，可以预见，任何制备这些抗体的方法都在本发明的实施范围内。在一个优选的实施例中，蛋白质是特异于T淋巴细胞上的CD3、CD4或CD8受体的单克隆抗体。这些单克隆抗体的例子如下单克隆抗体(MAb)“T3”(可从Coulter Corporation，Miami，Florida购得)是IgG1亚类的抗-CD3抗体，用具有Sezary细胞白血病病人的未成熟胸腺细胞和外周血淋巴细胞免疫BALB/c小鼠，再使该小鼠的脾细胞与鼠的P3/NS1/1-AG4-1骨髓瘤细胞杂交，从而制备出这种抗体。
MAb“T4”(Coulter Corporation)是从用人外周血淋巴细胞免疫的BALB/cJ小鼠的脾细胞与鼠NS/1-AG4细胞的杂交中制备的抗-CD4抗体。Mab“T8”是抗-CD8抗体其制备方法如T4所述，但用人胸腺细胞(Coulter Corporation)免疫的。以下例子选用MAbs T4和T8，是由于它们具有高密度的抗原受体(每个靶细胞具有104-105个受体)并具有相互排斥的靶细胞。
E、本发明粒子的实施例本发明的稳定粒子的一个例子，是该粒子的组成为在胶体大小的聚苯乙烯微粒的外表面上具有一个1×-氨基葡聚糖涂层，并且一层胶体大小的金覆盖在氨基葡聚糖涂层上。具有游离氨基的氨基三硫醇键合剂共价键合到金上，而抗-CD4抗体通过异双功能交联剂附着到键合剂上。将该粒子称作T4-氨基三硫醇-金-1×-氨基葡聚糖-聚苯乙烯粒子。
另一例粒子的组成是在胶体大小的聚苯乙烯粒子的外表面上具有一个1×-氨基葡聚糖涂层，并且用一层胶体大小的银覆盖在氨基葡聚糖涂层上。具有游离氨基的5×-氨基葡聚糖键合剂围绕银-氨基葡聚糖-PS粒子交联，而抗-CD4抗体通过异双功能交联剂(例如sulfo-SMCC)与游离氨基共价键合而附着到所述的键合剂上。将该粒子称作T4-5×-氨基葡聚糖-银-1×-氨基葡聚糖-聚苯乙烯粒子。
根据本发明粒子的又一实施例是该粒子在胶体大小的聚苯乙烯粒子的外表面上具有一个1×-氨基葡聚糖涂层，并且用一层胶体大小的金覆盖在氨基葡聚糖涂层上。具有游离氨基的氨基三硫醇键合剂与金粒子交联，而抗-CD8抗体蛋白通过异双功能交联剂附着到键合剂的游离氨基上。将该粒子称作T8-氨基三硫醇-金-1×-氨基葡聚糖-聚苯乙烯粒子。
根据本发明的另一粒子的实施例是该粒子在胶体大小的聚苯乙烯粒子的外表面上具有一个1×-氨基葡聚糖涂层，并且用一层胶体大小的银覆盖在氨基葡聚糖涂层上。具有游离氨基的5×-氨基葡聚糖键合剂围绕银-氨基葡聚糖-PS粒子交联，而抗-CD8抗体通过异双功能交联剂(例如sulfo-SMCC)与游离氨基共价键合而附着到所述的键合剂上。将该粒子称作T8-5×-氨基葡聚糖-银-1×-氨基葡聚糖-聚苯乙烯粒子。
本发明的这些稳定粒子特别适于作为试剂用于同时分析一种生物液体，例如全血中至少两种不同的相互排斥的淋巴细胞亚型。
III、本发明的粒子的制备方法本发明还包括用于制备此处所述的新颖稳定的胶体粒子的方法。通常，如下制备本发明的粒子首先，使氨基葡聚糖包覆的聚苯乙烯粒子与金属盐反应，再将键合剂固定到其上，最后通过键合剂使蛋白质例如抗体附着到被包覆的粒子上。
更具体地说，用于制备这些粒子的方法包括第一步骤是将市售的醛官能化聚苯乙烯粒子与上述氨基葡聚糖反应。一些氨基葡聚糖吸附到胶体大小的聚苯乙烯核底物表面上并与其共价键合。另一些氨基葡聚糖通过与戊二醛交联共价键合到颗粒上。用还原剂处理所生成的反应混合物，从而得到稳定包覆的颗粒。该还原剂可以是任何常规的还原剂例如氢硼化钠。随后用水(最好是蒸馏水)洗涤所生成的交联的氨基葡聚糖包覆的聚苯乙烯粒子。氨基葡聚糖一般能够将金属离子或金属离子复合物还原成金属态，即将金(III)还原成金(0)或将银(I)还原成银(0)。
然后这些氨基葡聚糖包覆的聚苯乙烯粒子与金属盐水溶液反应，该溶液含有能够被氨基葡聚糖涂层还原的金属离子或金属离子复合物。如上所述，金属盐最好是金(III)或银(I)盐。简言之，当预定量的第二还原剂存在时，在升温下使被包覆粒子的含水悬浮液与过量的金属盐水溶液混合，该第二还原剂可将过量的金属离子还原成金属态(主要作为聚苯乙烯粒子表面上的胶体金属)。升温在约80-约100℃的范围内。而另一还原剂是柠檬酸钠，它用于快速形成胶体金属。
所得到的胶体金属-氨基葡聚糖包覆的粒子用洗涤方法纯化，例如用柠檬酸钠水溶液和蒸馏水洗涤。
与制备本发明的新颖粒子有关的另一步骤是将键合剂或具有游离氨基的可键合的试剂固定到胶体金属-氨基葡聚糖包覆的粒子上。该键合剂使得蛋白质可结合到金属胶体包覆的粒子表面上。优选的是，银包覆的粒子或颗粒，键合剂是氨基葡聚糖，最优选的是5×-氨基葡聚糖。金包覆的颗粒，优选的键合剂是上述的氨基三硫醇键合剂。
当键合剂是氨基葡聚糖时，可通过吸附并与双功能交联剂(例如戊二醛)交联而将该键合剂固定到被包覆的粒子上。然后用能够使胶体金属粒子与蛋白质键合的适宜的异双功能交联剂〔例如4-〔N-马来酰亚胺甲基〕环己烷-1-羧酸硫代琥珀酰亚胺基酯(sulfo-SMCC)或本领域所公知的上述其他化合物〕激活氨基葡聚糖键合剂上的游离氨基。
硫醇基与胶体金表面反应可固定氨基三硫醇键合剂。更具体地说，使用氨基三硫醇键合剂的方法包括将受保护的氨基三硫醇配位体溶解在无水甲醇中；然后将浓盐酸加入到该溶液中并回流此混合物。在一个实施例中优选的回流时间约是5小时。分离混合物中的组分，例如在BioGel p2胶上用筛析色谱法，收集在280nm处吸收的第一谱带部分(代表去保护的氨基三硫醇配位体)。然后将去保护的氨基三硫醇配位体与上述的金胶体-氨基葡聚糖包覆的聚苯乙烯颗粒混合。这样，在键合剂上的硫基与金胶体表面之间形成了较强的共价键。然后用sulfo-SMCC激活键合剂的游离氨基。
一旦交联剂固定到粒子上，就利用常规方法，例如用可提供巯基的氨键合剂激活蛋白质的方法，使所选择需要固定到胶体粒子上的蛋白质与被包覆粒子上的被激活的键合剂的氨基结合。适宜的氨键合/激活试剂是2-亚氨基硫醇烷。在Chemistry Of Protein ConjugationAnd Cross-Linking，S.S.Wong，CRC Press，Inc.，Boca Raton，FL，1991中描述了2-亚氨基硫醇烷激活抗体及马来酰亚胺(sulfo-SMCC)激活被包覆粒子上的氨基的常规方法。本领域的技术人员从可得到的教科书(参见Pierce Handbook)中可容易地选择到其他可与氨反应的巯基引发剂。
最后，利用常规方法可纯化被激活的胶体金属、键合剂包覆的粒子以及被激活的蛋白质。然后将被纯化粒子的水悬浮液与一定量被激活蛋白质水溶液混合，蛋白质的量足以饱和激活粒子上的反应基团。混合温度优选是室温，混合时间应足以使蛋白质与粒子之间发生结合并生成稳定的胶体粒子。本领域的技术人员根据要与蛋白质结合的粒子的量，可清楚地选择被激活蛋白质溶液的量和混合时间，并且这些参数是本方法的限制因素。
所生成的稳定胶体粒子在使用之前最好用合适的封闭剂例如L-半胱氨酸和碘乙酰胺来封闭其上未反应的官能团。为了用于生物测定方法中，本发明的典型粒子例如结合有抗体的金或银包覆的聚苯乙烯粒子可悬浮在适宜的缓冲剂例如牛血清白蛋白(BSA)缓冲剂中。
IV、使用方法——同时测定本发明的上述胶体粒子可以用于同时定量测定至少两种不同的细胞亚类的方法中。例如，使用本发明粒子的一个典型方法是在一种含有红细胞和白细胞的生物溶液/悬浮液中同时定量测定白细胞的两种或多种亚类。优选的是，细胞亚型的特征在于具有一些相互独立并不重叠的抗原位置。
因此，本发明的方法包括将一种生物溶液或悬浮液(例如全血)与上述至少两种不同的稳定胶体粒子混合的步骤。每个不同粒子含有结合到其上的不同蛋白质，例如抗体，并且每个蛋白质键合到白细胞亚类的不同抗原决定簇上。粒子与生物材料混合的时间足以使粒子与细胞的每个亚类键合。
随后，所述生物溶液/悬浮液中的红细胞被溶解并猝灭。在一种仪器中分析该混合物，该仪器可根据与每个不同胶体粒子结合的白细胞亚类进行分类鉴别，并定量计数白细胞的至少两个亚类。优选的是，这种仪器利用靶细胞的位移光散射方法VCS(即体积、电导率及光散射)技术可同时分析该混合物并区分细胞。在一个优选的实施例中，检测仪器配有至少两个激光器。一种特别适当用的仪器是美国专利5,125,737和5,492,833中记载的改进的库尔特VCS仪器，在此作为参考。
通过这种方法，可定量检测白细胞的亚类，例如CD4+T淋巴细胞(“T4细胞”)、CD8+T淋巴细胞(“T8细胞”)、B淋巴细胞、粒细胞、嗜碱性细胞和单核细胞。
正如以下例8中所表示的，本发明的方法还包括利用三种不同的胶体粒子同时分析全血中的T4和T8细胞组群。一种粒子是购买的聚苯乙烯颗粒、其他粒子是本发明的粒子即T4-氨基三硫醇盐-金-1×-氨基葡聚糖-聚苯乙烯粒子和T8-5×-氨基葡聚糖-银-1×-氨基葡聚糖-聚苯乙烯粒子。
以下提供的实施例用于说明本发明。具体地说，实施例1-4描述了本发明粒子的制备。例5提供了粒子的分析评估。实施例6和7提供了细胞组群的分离分析，例8提供了利用本发明的方法同时分析多种细胞的例子。这些例子只是用于说明解释而并不限定本发明的范围。而且，本领域的技术人员将意识到，虽然以下例子中示出了具体的试剂和条件，但只是在在本发明的精髓和范围内可作一些变动。
实施例1用1×-氨基葡聚糖或5×-氨基葡聚糖包覆聚苯乙烯醛/硫酸酯粒子A、聚苯乙烯微球聚苯乙烯醛/硫酸酯胶乳粒子原料是从Interfacial DynamicsCorporation(IDC)，Portland，Oregon得到的。利用透射电子显微镜(TEM)测定的平均直径为2.15μm，CV＝5.5％的IDC批号2-300-36的粒子来完成T4-5×-Amde×-PS和T4-Ag-5×-Amde×-PS粒子的最初研究。随后用IDC批号496的粒子制备T4、T8-PS粒子，据报道该IDC批号496的粒子TEM测定的平均直径为2.200μm，CV＝5.4％，在COULTERN4MDTM亚显微粒子分析仪上利用准弹性光散射(QELS)测定其平均直径为2.021μm，CV＝1.0％。所有随后金或银包覆的粒子都是用TEM测定的平均直径为2.130μm，CV＝2.7％、QELS测定的平均直径为2.007μm，CV＝1.1％的IDC批号540的粒子来制备的。
B、用氨基葡聚糖包覆这些胶体粒子的制备参照美国专利5,639,620方法。简言之，将36.6ml的4.1％w/v这些粒子的固体吸移到250ml聚丙烯离心管中。用氨基葡聚糖包覆这些粒子的方法如下所述。在上述悬浮液中加入3.0g 1×-或5×-氨基葡聚糖，并且溶解在50ml热蒸馏水中，然后用250ml 0.2μm的过滤器过滤。用美国专利5,466,609方法制备1×或5×-氨基葡聚糖。然后将蒸馏水加入到混合物中至总体积为150ml，并加入18.3μl 45％w/w的氢氧化钾溶液，使混合物中氢氧化钾的浓度为1mM。将管和内容物滚动混合16-24小时。
C、交联用3mg/ml或1.8ml的25％戊二醛与粒子悬浮液反应1小时完成氨基葡聚糖的交联。在混合过程结束时可在粒子混合物中观察到浅黄色。将10mg/ml或1.531g的氢硼化钠固体加入到反应管中，然后再滚动混合3小时。管中再加入1.834ml 45％w/w的氢氧化钾溶液，以减少氢气排出。由于在与戊二醛反应中所产生的Schiffs’碱的作用，黄色反应混合物与氢硼化钠混合约15分钟之后变成无色的白粒子悬浮液。3个多小时的混合期间内共释放气体2-3次。
然后用Beckman J6-B离心机在3400g下离心约15分钟来分离粒子，弃去上清液并将残留物用150ml的蒸馏水洗涤4次。。每次通过剧烈涡流和声处理2-5分钟可使残留物再悬浮以便重新分散粒子。
将所生成的氨基葡聚糖包覆的粒子称作1×-Amde×-PS和5×-Amde×-PS。
例2 用胶体金属包覆1×-Amde×-PS和5×-Amde×-PS微球A、用银包覆粒子用美国专利5,552,086中所述方法，用银胶体包覆实施例1中的粒子。简言之，将3.12ml的0.589M硝酸银溶液加入到1L三颈圆底烧瓶内的540ml的蒸馏水中。用高架的玻璃柱套管搅拌器搅拌溶液，在顶部和底部用加热罩(Glas-Col)加热到约90℃。将30ml实施例1中的1％w/v固态1×-Amde×-PS加入到无色的热硝酸银溶液中并加热搅拌所得到的混合物约1-2分钟。然后将48ml、1.36M的柠檬酸钠溶液加入到热的、已搅拌的反应混合物中。
根据悬浮液的颜色可在不同时刻观察在粒子上形成胶体银的反应进程约2分钟时是淡黄色的；约4分钟时是深棕色的；约7分钟时是黑色的；约10分钟时是深灰色的；约15分钟时是深灰色的。15分钟之后，通过将烧瓶中的内容物倒入1L的烧杯内而使反应停止并使粒子悬浮液冷却到室温。约40分钟之后深灰色的粒子沉降下来，此时倾去上清液，将约50ml的残留物重新悬浮在0.01M柠檬酸钠溶液中，使得总体积为100ml。粒子在500g下约离心5分钟进行分离和洗涤，最后分散在0.01M柠檬酸钠溶液中，使得总体积为30ml。
B、工艺过程放大的制备5倍的工艺过程放大的制备与上述A部分所述的类似，然而需要15.6ml、0.589M硝酸银溶液溶于2600ml蒸馏水中、150ml1％w/v的固态1×-或5×-氨基葡聚糖聚苯乙烯粒子和240ml的1.36M柠檬酸钠溶液。对于5L 3-颈口圆底烧瓶内的反应物来说，仍需要约15分钟的反应时间和约90℃的反应温度以及高架搅拌和顶部与底部加热罩。反应期结束时将5L烧瓶及内容物从加热罩中拿出并冷却约10分钟，这时所有粒子以黑色固体的形式沉降到烧瓶的底部。尽可能倾去所有上清液，剩余的深灰色粒子悬浮物加入0.01M柠檬酸钠溶液重新悬浮，至总体积为125ml。
用0.01M柠檬酸钠溶液在500g下约离心5分钟而将粒子分离并洗涤两次，最后用0.01M柠檬酸钠溶液使粒子重新分散到150ml的总体积中。
C、银-1×-Amde×-PS和银-5×-Amde×-PS粒子的分析对0.01M柠檬酸钠溶液中稀释10倍的A部分的粒子在1000放大倍数下进行的显微检查表明多数是单个初级粒子和小聚集体(2-3个初级粒子)，几乎无大聚集体。在流式血细胞计数仪(用488nm氩离子激光激发波长的COULTERProfile IITM测定银-Amde×-PS粒子；用633nm氦/氖激光激发波长的COULTER EliteTM测定金-和银-Amde×-PS粒子)测出了相关群体的单体(单个的初级粒子)、双体(两个初级粒子粘在一起)、高级多重体(三个或多个初级粒子粘在一起)以及金属包覆的1×-Amde×-PS和金属包覆的5×-Amde×-PS粒子胶体悬浮物中未包覆或稍微包覆的PS粒子。
如果初级粒子是单分散的并且金或银涂层是均匀的，那么这些大小和形状不同的初级和聚集的粒子群的光散射能力会局限在较小范围内。用二次过滤的1mM氢氧化钾溶液对粒子浓度进行连续稀释，使悬浮液中粒子的最后体积约为1.2×10-5。将流式血细胞计数仪与COULTERDNA-CHECKTM粒子的光线取向一致，对于FS和SS给出了HPCV2.0％，并以直方图形式得出F11和F12参数，用标准的Brite粒子校准该计数仪。
如下选择运行参数50μl的样品吸入体积；10μl/min的样品流速使得总的样品运行时间达10,000次测定；直方图参数Y轴作为FS，×轴作为SS；FS的放大器增益处于线性增益与平均通道(Y轴)区域的关系曲线中间；SS的PMT电压处于线性电压与平均通道(×轴)区域的关系曲线中间；直方图1(全区域)和2(在位映象1处选通)为64×64型FS-SS，并且位映象1包括框1中的单个粒子、框2中的双体和框3中的所有高级聚集体，但忽略放大器噪声；直方图1和2的适宜的比例尺比率；位映象1和直方图2的计数为10,000；直方图2在位映象1处选通并建立了分析框，在直方图1中的相同位置处单个粒子为1、双体为2以及多重体为3。从直方图2的扩充打印输出中可读出每个粒子态的百分率。直方图1上的分析框不能反映粒子的真实百分比，因为这些分析框包括了电子噪音和直方图1中位映象1之外的任何小粒子。
流式血细胞计数(正向-侧向散射)直方图给出了65％的单体、32％的多重体和3％的未包覆的聚苯乙烯粒子。
对B部分的工艺过程放大的制备中稀释10倍的悬浮液进行的显微检查显示了大多数黑色单体、许多双体和一些大聚集体。所有两微米标称直径的聚苯乙烯粒子都被直径为50-200nm的黑色银粒子均匀密集地包覆着。流式血细胞计数显示出74％的单体、22％的多重体和4％的未包覆的聚苯乙烯粒子，488nm激光激发波长下，银-聚苯乙烯的平均位移在侧散射轴为40.1(3.3)，聚苯乙烯粒子在15.5(1.6)。
D、用金包覆粒子按美国专利5,552,086完成实施例1的胶体金包覆的1×-Amde×-PS和5×-Amde×-PS粒子的制备。简言之，将0.740g的四氯金酸氢盐(III)HAuCl4.3H2O溶解到1L3-颈口圆底烧瓶内的270ml蒸馏水中，用顶部和底部加热罩加热到约80℃，并进行高架搅拌。将30ml、1％w/v的实施例1的固态1×-或5×-氨基葡聚糖-聚苯乙烯粒子加入到该热的、已搅拌均匀溶液中混合约5分钟，然后加入1.5ml、1.36M的柠檬酸钠溶液。
在5秒钟内反应混合物的颜色从浅黄色变为无色，约25秒钟时变为棕色。反应1分钟之后，停止加热和搅拌并将烧瓶中的内容物倒入1L的烧杯中，在其中对粒子悬浮物进行声处理并冷却到室温。然后，在500g下约离心5分钟分离棕色粒子，弃去上清液，残留物用0.01M的柠檬酸钠溶液洗涤两次，加0.01M的柠檬酸案溶液至重新悬浮的总体积为30ml。
E、工艺过程放大的制备进行与B部分类似的5倍工艺过程放大的制备；将3.58g四氯金酸氢盐(III)溶于2800ml蒸馏水中，与150ml、1％w/v的固态1×-或5×-氨基葡聚糖-聚苯乙烯粒子在5L 3-颈口的圆底烧瓶内在约80℃下混合56分钟，并且使用高架搅拌和顶部与底部加热罩。随后，向混合物中加入7.5ml、1.36M的柠檬酸钠溶液。10秒钟后反应混合物的颜色从浅黄色变为无色，然后在30秒钟时变为紫色，在55秒钟时变为棕色。反应在约80℃下再进行约9分钟。在反应期终止时停止加热和搅拌并将5L烧瓶及内容物从加热罩中拿出，冷却到室温。约1小时之后，倾析浅紫色上清液并在500g下通过离心5分钟来分离约150ml的深棕色悬浮液。弃去上清液，并且残留物用0.01M的柠檬酸钠溶液洗涤两次，用0.01M的柠檬酸钠溶液重新悬浮至总体积为150ml。
可选择每毫升1％w/v粒子中所用的金盐的量，从而使所形成的金属金的体积等于B部分中所形成的金属银的体积〔假设每个金属离子被100％还原成金属态(0)〕。在B部分的较大规模的银包覆过程中，所形成的银金属的体积是15.6m/L(1000ml/L)×0.589M AgNO3×107.87g Ag/mol÷10.49g/cm3Ag。这样，在大规模的金包覆过程中每150ml、1％w/v的粒子所需要的金盐HAuCl4.3H2O的量是0.0945cm3Au×19.32g/cm3×393.88gHAuCl4.3H2O/196.97gAu＝3.65g。在反应混合物中聚苯乙烯粒子(0.05％w/v的固体)上包覆的银或金的体积部分为3×10-6，但是在聚苯乙烯粒子的最终悬浮液中被浓缩到6×10-5。用蒸馏水对一份粒子悬浮物彻底洗涤5-6次，冷冻干燥后测得，增加的金属使初始的1％w/v固态粒子悬浮液变为约2.2％w/v固态金-Amde×-PS粒子和约1.7％w/v固态银-Amde×-PS粒子。
F、金-1×-Amde×-PS和金-5×-Amde×PS粒子的分析对D部分的粒子稀释10倍进行的显微检查显示出单体和小聚集体，几乎无大聚集体。如上所述对银包覆的粒子所作的流式血细胞计数(正向-侧向散射)直方图显示出相当于16.0(2.5)的聚苯乙烯粒子的633nm激光激发波长下金-聚苯乙烯粒子在侧散射轴的的平均位移为42.0(4.7)。金-Amde×-聚苯乙烯单体的百分比是43％，聚集体是53％，未包覆的聚苯乙烯粒子是4％。
在E部分的工艺过程放大的制备中所完成的流式血细胞计数显示出单体的百分比为53％；多重体为26％，而稍微包覆的聚苯乙烯粒子为16％。
实施例3胶体银-氨基葡聚糖-聚苯乙烯粒子的交联和结合A、5×-氨基葡聚糖交联的银-Amde×-PS粒子的制备如例2A所述，用1％w/v的固态聚苯乙烯粒子制备悬浮在0.01M的柠檬酸钠溶液中25ml的银-氨基葡聚糖-聚苯乙烯粒子，在500g下离心5分钟进行分离，弃去上清液，残留物以初始体积重新悬浮于2％w/v的5×-氨基葡聚糖溶液中。使混合物滚动混合过夜16-24小时，随后在500g下约离心5分钟以便分离残留物并弃去上清液。最终的残留物用1mM的氢氧化钾溶液重新悬浮至总体积为25ml。
此后，将0.10ml、25％w/v的戊二醛加入到粒子悬浮液中，从而使得每毫升粒子悬浮液中含有1mg的戊二醛，将该悬浮液滚动混合约50分钟。然后，在反应混合物中加入等摩尔量的0.601mg/ml或16.9μl的乙二胺，并再次滚动混合约30分钟以便封闭醛基。制备3ml、1mM氢氧化钾溶液中含有30mg氢硼化钠的溶液，取该溶液2ml移到粒子悬浮液中并再滚动混合30分钟。
反应平息约1-2分钟之后释放出气体。在反应期终止时在500g下离心5分钟分离粒子，弃去上清液并且残留物用1×PBS洗涤4次。如下制备1×PBS将53.8gK2HPO4溶解在1.6L的蒸馏水中，加入12.8g的KH2PO4，然后搅拌至溶解。其次，将340g的NaCl溶于该溶液中。所有盐溶解之后，加入蒸馏水至体积为2L，用0.2μm的过滤器过滤。所得到的溶液为20×PBS。用19份的蒸馏水稀释1份的20×PBS制备1×PBS。1×PBS溶液的pH值为7.1-7.3，典型的为7.2，电导率为13,500-15,500，而NaCl的浓度为0.15M。最终的残留物重新悬浮到25ml的1×PBS总体积中。
B、将T4/T8抗体结合到交联的5×-氨基葡聚糖-涂覆银-氨基葡聚糖-聚苯乙烯粒子上将4.5μl的每毫升1％w/v的固态粒子中含有10mg/ml的sulfo-SMCC或72.0μl的sulfo-SMCC溶液加入到50ml聚苯乙烯离心管内的16ml交联的5×-氨基葡聚糖-银-聚苯乙烯粒子中。使该管及内容物滚动混合约1小时，此后，在500g下离心约5分钟来分离粒子，弃去上清液，残留物用1×PBS洗涤4次(如上所述)。用1×PBS将最终的残留物重新悬浮到16ml的总体积中。
用65μl的2mg/ml 2-亚氨硫醇烷(IT)溶液分别激活10mgT4(0.225ml)和10mg T8(0.266ml)在0.667ml1×PBS中的浓缩液，IT与抗体的摩尔比是15∶1。将15ml聚苯乙烯离心管中的反应混合物滚动混合1小时，然后加到50ml的G-50 Sephade×(葡聚糖凝胶)柱的顶部，并用1×PBS进行平衡。用1×PBS洗脱柱子，收集含有IT-T4或IT-T8抗体的第一A280吸收带部分，得到2.6ml的2.351mg/mlIT-T4抗体和3.0ml的2.709mg/mlIT-T8抗体。
用0.7mgIT-T4和0.8mgIT-T8，每毫升含有1％w/v固态粒子进行结合，两份4ml sulfo-SMCC激活的粒子悬浮液样品中加入1.191mlIT-T4/1.181ml IT-T8溶液，并使混合物滚动混合约2小时。在结合期终止时将1ml每一结合反应混合物吸移并通过0.2μm低蛋白键合的过滤盘进行过滤。测定上清液的A280，浓度为0.504mg/ml IT-T4/0.534mg/ml IT-T8。通过区分可知，IT-T4的表面浓度是0.107(0.084)mg/ml或每平方米粒子表面积具有5.1(4.0)mg的T4抗体，而IT-T8的表面浓度是0.391(0.386)mg/ml或每平方米粒子表面积具有18.7(18.5)mg的T8抗体(假设直径为2μm光滑球形粒子表面积为2.7082m2/g)。
将结合有T4和T8的粒子各分成两份4.2ml的样品，一份样品不用封闭，另一份用L-半胱氨酸和碘乙酰胺封闭。欲封闭样品用0.503ml，5mg/ml L-半胱氨酸的1×PBS溶液进行封闭(约15分钟)，然后用0.563ml 20mg/ml碘乙酰胺的1×PBS溶液和0.105ml 1M的硼酸盐缓冲液(pH9.8)进行封闭(30分钟)。在封闭反应终止时在500g下约离心5分钟来分离这四个样品，弃去上清液并且残留物用BSA缓冲液(即1％BSA/0.1％叠氮化钠的1×PBS溶液)洗涤两次，然后重新悬浮在BSA缓冲液中，滚动混合约1小时，在约5℃的冰箱中贮存16-24小时。缓冲液洗涤两次，将每个样品的总体积调到3.2ml以便得到1％w/v(基于未包覆的胶乳粒子)的固态悬浮液。
实施例4胶体金-氨基葡聚糖-聚苯乙烯粒子的交联与结合A、氨基三硫醇键合剂的制备用Whitesell&Chang〔Science 261，73(1993)〕中所述方法制备交联剂C12H26N2OS3并以饱和的配位体多支链三乙酸N-叔丁氧基羰基酯来贮存。
在使用之前，将10mg受保护的配位体溶解在5ml的无水甲醇中，从而得到无色溶液。然后将2.5ml浓盐酸(36.5-38.0％)加入到受保护的多支链溶液中。在50ml圆底烧瓶中回流混合物约5小时，得到具有游离巯基气味的黄色溶液。
将这个多支链配位体的酸催化的水解混合物(最终体积为3.0ml)加入1.1cm×30cm的Bio-Gel P-2柱的顶部并用蒸馏水洗脱。收集在280nm处吸收的第一谱带部分用Ellman’s试剂，即5，5’-二硫代-双-(2-硝基苯甲酸)(Pierce Chemical Co.)检验游离巯基并以磷酸缓冲液作为空白对照液。
该试剂与游离巯基反应，从而形成在412nm处吸收的深色发色团〔J.C.Ellman，Clin.Chem.Acta，28234-241(1962)〕。与Ellman’s试剂反应约15分钟。
为了定量测定巯基，绘制L-半胱氨酸的标准曲线以便测定该复合物的线性响应范围。12份总体积为56ml的脱保护配位体给出读数为0.549的A412或0.458mM的巯基浓度(代表44％的产率)。
B、氨基三硫醇交联的金-Amde×-PS粒子的制备如上所述制备4.950ml 0.33M氨基三硫醇键合剂的乙醇溶液并加入到50ml聚苯乙烯管内的15ml 1％w/v固态金-1×-氨基葡聚糖-聚苯乙烯粒子的蒸馏水悬浮液中。将该管及内容物滚动混合16-24小时，随后在200g下约离心10分钟来分离粒子，弃去上清液并且残留物用1×PBS洗涤四次。用1×PBS将最终的残留物悬浮到15ml的总体积中。
C、将T4/T8抗体结合到交联的氨基三硫醇盐-涂覆金-氨基葡聚糖-聚苯乙烯粒子上将每毫升1％w/v固态粒子中含有1.50μl10mg/ml sulfo-SMCC的1×PBS溶液或者22.5μl，15ml粒子悬浮液试样加入到50ml聚苯乙烯离心管内的粒子中，并滚动混合约1小时。反应终止时在200g下约离心10分钟来分离粒子，弃去上清液，残留物用1×PBS洗涤四次。用1×PBS将最终残留物重新悬浮到15ml的总体积中，并将每个试样分成两个7.5ml。
用IT激活10mg每一抗体即T4和T8并用与实施例3中所述相同的方式纯化IT-T4和IT-T8衍生物。用类似的方式以各自试样中0.7mgIT-T4/ml1％粒子和0.8mgIT-T8/ml1％粒子分别进行结合。每个试样取1ml，分析上清液中的IT-Ab，其结果是6.7mgT4抗体/m2和9.5mgT8抗体/m2(假设直径为2μm的光滑球形粒子具有2.7082m2/g的特定表面积)。然后等分样品，一份不封闭，另一份用L-半胱氨酸和碘乙酰胺封闭。在200g下约离心15分钟来分离粒子，弃去上清液，残留物用1％BSA/0.1％叠氮化钠的1×PBS溶液洗涤两次并重新悬浮到BSA缓冲液中，随后滚动混合约1小时后在约5℃的冰箱中贮存16-24小时。
T4-和T8-结合的粒子再用BSA缓冲液洗涤两次并重新悬浮到3.4ml的总体积中，从而得到1％w/v(基于未包覆胶乳粒子)的固态悬浮液。
D、多角度多普勒电泳光散射分析(DELSA)通过用多角度多普勒电泳光散射(DELSA)测定法〔Laser DopplerSpectroscopyApplications To Cell And Particle Electrophoresis.E.E.Uzgiris，Adv.Colloid Interface Sci.，1475-171(1981)〕得到这些粒子及其所有母粒子(即PS醛/硫酸酯原料、1×-Amde×-PS(实施例1)和金-1×-Amde×-PS(例2D)粒子)的淌度(是每个粒子悬浮液的函数)，证实了固定到实施例4B的金-1×-氨基葡聚糖-聚苯乙烯(“1×-Amde×-PS”)粒子表面上存在氨基三硫醇盐键合剂。
氨基三硫醇-金-1×-Amde×PS粒子(实施例4B)及其T4和T8抗体结合的粒子(实施例4C)悬浮液的DELSA测定可在COULTERDELSATM440上进行。这些测定用于获得原料粒子上被包覆粒子每层的密度和pH稳定性。
淌度与水悬浮液中粒子的表面电荷有直接关系——正或负电荷越多，淌度越高。图1表示出所有阶段被包覆的粒子的淌度与pH的关系。在电泳测定之前，将原料PS和1×-Amde×-PS粒子悬浮在蒸馏水中；金-1×-Amde×-PS粒子悬浮在0.01M的柠檬酸钠中；氨基三硫醇盐-金-1×-Amde×-PS粒子悬浮在1×PBS中；T4-和T8-氨基三硫醇盐-金-1×-Amde×-PS粒子悬浮在1％BSA/0.1％叠氮化钠的1×PBS溶液中。为了测定起见，所有粒子都用0.01M硝酸钾水溶液从4％或1％w/v固体稀释到4×10-4％w/v固体。用0.1M氢氧化钾水溶液或0.1M硝酸水溶液调节被稀释粒子悬浮液的pH值。
将1.00mm高的长方形样品通道定位在通道顶部附近的稳定层上(0.16mm)可进行DELSA测定。在定位样品槽时可利用电泳标准品COULTER EMPSL7来进行最后的调节。EMPSL7标准品淌度的van Gils图(即(H-h)2/H2与淌度的关系曲线，其中h是从通道顶部算起的高度(0-1.00mm)，并且H＝0.50mm)通过通道大部分深度并且以通道的中心轴为对称的直线。在h大于0.95mm或(H-h)2/H2大于0.8时，通道底部附近出现-些偏差。这样就显示出标准粒子在DELSA样品槽中的抛物线形电渗流的完整轮廓。可如下选择DELSA的其他参数频率范围500Hz；频率位移250Hz；电流0.7mA(如果不考虑其他因素)；开机时间2秒钟；关机时间0.5秒钟。
粒子悬浮液的电导率在1.3-1.6mS/cm的范围内。如图1所示，氨基葡聚糖(1×-Amde×)包覆的聚苯乙烯醛/硫酸酯胶乳粒子在pH为7-10的测定范围内显示出近乎恒定的约1cm2/V-s的淌度，反映存在出带正电荷的质子化氨基，而这些氨基已经取代了一些中性醛基，以抵消胶乳粒子表面上预先存在的带负电荷的硫酸酯基团。
原料聚苯乙烯醛/硫酸酯胶乳粒子开始是带负电荷的，如图1所示，在7-10的pH范围内具有非常高的负淌度(6至7cm2/V-s)。金胶体覆盖到1×-Amde×-PS粒子上之后，在4-6的pH范围内粒子淌度急剧下降，从+2至4cm2/V-s，表明甚至在粒子用硝酸钠水溶液稀释之后金-1×-Amde×-PS粒子上还存在被吸附的柠檬酸盐。尽管被吸附的柠檬酸的影响，柠檬酸酸离解常数分段pKa值在20℃下为3.14、4.77和6.39，在相同的pH范围内淌度有较大的下降。
氨基三硫醇盐-金-1×-Amde×-PS粒子的电泳淌度图显示出，pH在4-10范围内，这些粒子的淌度在-0.6至-3.5cm2/V-s，并且还存在约+0.3×10-4cm2/V-s的假象。该假象还存在于1×-Amde×-PS和金-1×-Amde×-PS粒子的淌度图形的相同位置上〔特别是在细胞内的小于1mA的低电流(施加了电场)下〕。需要1-2.5mA的较高电流来得到后者粒子悬浮液的电泳图，所以对于最小的散射角度(8.6°)多普勒频率位移大于+/-10Hz。假象的鉴别是利用其在粒子淌度的van Gils图上的固定位置，还可以在强度能谱与多普勒频率位移关系图上，在所有四个散射角度测定的接近0Hz处的固定位置进行。
氨基三硫醇盐-涂覆金-1×-Amde×-PS粒子的淌度稍高于pH大于5.8时母金-1×-Amde×-PS粒子的淌度，但是低于pH小于5.8时母粒子的淌度。这反映出氨基三硫醇键合剂通过作为负三价三硫醇盐基，取代金属粒子表面上的负三价带电的柠檬酸盐，可以获得的较少的负电荷。末端氨基由于在pH 4-10时质子化作用仍保留正电荷。而且，在5.8-4.2的低pH范围内淌度从-3.3cm2/V-s至-0.6cm2/V-s急剧上升表明硫醇盐基的部分质子化。巯基的典型pKa值z 7-9的范围内。正如淌度测定所显示出的，固定到金或银原子表面上的硫醇盐基的单个硫原子形成了非常强的键，不象胶体金或银上柠檬酸的三个羧基氧原子那样易于质子化。
加入碱使pH为10，然后加入酸使pH为4，这样几次循环使得氨基三硫醇-金-1×-Amde×-PS粒子的电泳图的性质可逆。
结合有T4-和T8-抗体的氨基三硫醇-金-1×-Amde×-PS粒子显示出两种包覆了抗体的粒子比母粒子具有更窄、更正的淌度(+1.2至-2.3cm2/V-s)。而且，在4-10的pH范围内，母粒子的负电荷被平衡但却不受抗体支配，从而结合有抗体的粒子的零点电荷(“p.z.c.”)介于4.5和5.0的pH之间，而不是在对于T4抗体pH为5.4-5.8而对于T8抗体pH为6.7-7.3的单克隆抗体的pI范围内(常规的凝胶电泳对各自抗体所分离出的主谱带中所测定到的)。结合有T4-和T8-的粒子在用0.01M硝酸钠溶液稀释之前可贮存在1％牛血清白蛋白(“BSA”)和0.1％叠氮化钠的1×PBS缓冲液中，通过BSA吸附到粒子表面上也可以产生与BSA约为4.9的pI值相重叠的零点电荷范围。
银-1×-Amde×-PS(例2A)粒子在pH从5-10时显示出稍微减小的负淌度(-0.57至-1.6cm2/V-s)，这与母1×-Amde×-PS粒子非常类似，也是只有稍小的负淌度。通过利用移动界面方法对用柠檬酸钠水溶液洗过的Carey Lea银胶体(平均直径约为10nm的银粒子)进行分析可得到与之相比的淌度数据，据报告电势为-80+/--5mV或淌度为-3.7cm2/V-s〔参见G.Frens等人的Kolloid Z.Z.Polym.，233922(1969)〕。另外，用几个银胶体，例如含有硼氢化钠的银胶体〔Ag(NaBH4)，pH为8.1〕、用乙二胺四乙酸制备的银胶体〔Ag(EDTA)，pH为10.1〕、Carey Lea银胶体〔Ag(Carey Lea)pH为7.0〕以及在硫酸银水溶液中制备的银胶体〔用60Co辐射的Ag(AgSO4水溶液)〕所作的微电泳试验在pH约为5.7时给出了在-4.2和-5.0cm2/V-s之间的淌度，而利用红色的柠檬酸金胶体(平均直径约为20nm的金粒子)，在pH约为5.5时可给出-4.5cm2/V-s的电动淌度〔Heard等人的J.Colloid Interface Sci.，93545(1983)〕.
虽然金-1×-Amde×-PS粒子在6-9的pH范围内显示出与柠檬酸金胶体在pH约为5.5时类似的淌度(约-4.0cm2/V-s)，但是银-1×-Amde×-PS粒子的淌度(-0.6至-1.6cm2/V-s)并不类似柠檬酸银胶体的淌度(-4.2至-5.0cm2/V-s)，这说明银-1×-Amde×-PS粒子中银-柠檬酸的键合较弱，造成在电动测定，用0.01M硝酸钾溶液稀释粒子悬浮液，可将大量最初吸附到银-1×-Amde×-PS粒子上的柠檬酸释放出来。
例5 分析交联的、胶体金属覆盖的蛋白质-氨基葡聚糖包覆的粒子实施例3和4的金或银包覆的聚苯乙烯粒子的检测是根据在固体底物上干燥粒子的SEM显微照片和前散射(FS)与侧散射(SS)的流式血细胞计数直方图，对于结合有抗体的粒子，还根据角光散射和DC或RF电导率矩阵，检测对全血中的靶向白细胞亚群专一性。还针对与实施例4A的氨基三硫醇键合剂反应的银包覆的粒子进行了检查。
A、交联的金属-Amde×-PS粒子和结合有蛋白质的粒子的流式血细胞计数分析对实施例3A的粒子所进行的流式血细胞计数分析显示出41％的单体、51％的多重体和5％的未包覆的聚苯乙烯粒子。
对实施例3B的结合有蛋白质的粒子所进行的流式血细胞计数分析，对于未封闭的T4-Amde×-银-Amde×-PS粒子显示出64％的单体、33％的多重体和1.4％的未包覆的聚苯乙烯粒子；对于封闭的T4-Amde×-银-Amde×-PS粒子显示出57％的单体、41％的多重体和0.4％的未包覆的聚苯乙烯粒子；对于未封闭的T8-Amde×-银-Amde×-PS粒子显示出60％的单体、38％的多重体和0.4％的未包覆的聚苯乙烯粒子；对于封闭的T8-Amde×-银-Amde×-PS粒子显示出56％的单体、42％的多重体和0.3％的未包覆的聚苯乙烯粒子。
然而，对银包覆的粒子(以与实施例4B中所述的类似方式用氨基三硫醇盐键合剂交联)所进行的流式血细胞计数分析，所得到的在前-侧散射直方图中的侧散射位移不如已经与配位体反应的银-PS粒子的位移那么大，并且趋向于转回到直方图中未包覆聚苯乙烯粒子的位置上。
对实施例4B的交联的金-Amde×-PS粒子所进行的流式血细胞计数分析显示出64％的单体、23％的多重体和8％稍微包覆的聚苯乙烯粒子。
对实施例4C的结合有蛋白质的粒子所进行的流式血细胞计数分析，对于封闭的T4氨基三硫醇金-Amde×-PS粒子显示出82％的单体、8％的多重体和10％稍微包覆的聚苯乙烯粒子；对于未封闭的T4-氨基三硫醇-金-Amde×-PS粒子显示出75％的单体、12％的多重体和13％稍微包覆的聚苯乙烯粒子；对于封闭的T8-氨基三硫醇-金-Amde×-PS粒子显示出83％的单体、5％的多重体和11％稍微包覆的聚苯乙烯粒子；对于未封闭的T8-氨基三硫醇-金-Amde×-PS粒子显示出73％的单体、12％的多重体和15％稍微包覆的聚苯乙烯粒子。
B、SEM分析图4A-4C示出了通过在金属短截线上蒸发悬浮液小滴而干燥的T4-氨基三硫醇-金-Amde×-PS粒子的扫描电子显微(SEM)照片。这些照片显示出聚苯乙烯粒子上的一层金胶体作为沉积在聚苯乙烯粒子表面上的原始金粒子被氨基三硫醇键合剂的键合，用sulfo-SMCC激活，与抗体结合，被封闭、并用BSA缓冲液洗涤后并无有所改变。
以与上述实施例4中金包覆的粒子类似的方式，银-Amde×-PS粒子用氨基三硫醇键合剂涂覆并与抗体结合。然而，氨基三硫醇键合剂与氨基葡聚糖强烈竞争聚苯乙烯粒子上所沉积的银胶体表面上的键合位置，并将大量银胶体从银-氨基葡聚糖-聚苯乙烯粒子的表面上取代下来。可从粒子洗涤的含有小银粒子的上清液的乳色上看出该现象。从图5A-5D所示出的SEM照片上可看到一些粒子上有大光秃点和小银粒子上的大聚集体。显然，氨基三硫醇盐键合剂还强烈键合银粒子，将银粒子从PS粒子上的氨基葡聚糖涂层中的包埋位置上逐出。
而且，样品在与配位体反应之后所拍摄的SEM显微照片显示出小银粒子的大聚集体和具有许多光秃点的聚苯乙烯粒子，其中相同的粒子在与配位体反应之前用银粒子均匀地包覆着。这样，氨基三硫醇作为交联剂与聚苯乙烯粒子上的银胶体不能很好的结合。
实施例6 T4和T8抗体与二氨基丙烷包覆的聚苯乙烯醛/硫酸酯胶乳粒子的结合本实施例描述的被包覆的粒子用作对比试验中的对照品和一对颗粒中的一个，以便验证本发明的方法和组合物的效果。
A、粒子的制备除了工艺过程放大的制备之外，1，3-二氨基丙烷(DAP)与聚苯乙烯胶乳粒子的偶合是利用以前所述的方法(参见1995年9月14日公开的国际专利申请WO9524631)来完成的。
向2L聚丙烯瓶内的1000ml 4％w/v固态聚苯乙烯醛/硫酸酯粒子(Interfacial Dynamics Corp.，直径约2μm)中以每毫升粒子悬浮液中含有16.8mg的量加入液态DAP(0.888g/ml比重)或加入19.1mlDAP。通过涡流、进行30秒钟的声处理并滚动混合24-72小时充分混合所得到的悬浮液。为了还原粒子表面上Schiff’s碱基和未反应的醛，以每毫升与DAP滚动混合的4％w/v固态粒子中含有10mg的量或将10.4g的固态硼氢化钠直接加入到粒子反应混合物中。在pH约为11.5的条件下由于过量DAP的存在而没有过度地起泡沫。反应混合物进行约3小时的滚动混合并不定时地进行短暂的30秒钟的声处理(sonicated)，同时有氢气从反应容器中释放出来。然后在约2600g下约离心25分钟分离粒子。弃去上清液并且粒子残留物重新悬浮到约1L的蒸馏水中。
通过涡流和短暂的声处理可重新分散粒子。利用离心使洗涤过程重复4次并且最终的粒子悬浮液用1×PBS溶液调到总体积为1000ml。
用sulfo-SMCC激活DAP偶合的粒子。通常，每毫升4％w/v固态DAP包覆的聚苯乙烯粒子悬浮液使用14.2μl新鲜制备的10mg/mlsulfo-SMCC的1×PBS溶液。在典型的制备中，将14.2ml Sulfo-SMCC溶液加入到1000ml4％w/v固态粒子中。然后混合物在2L的塑料瓶中滚动混合约1小时，利用离心进行分离并用1×PBS溶液洗涤多次。
从上述一系列步骤中得到的官能化、DAP包覆的粒子具有侧顺丁烯二酰亚胺基并适合同多种生物分子结合。如果需要结合到粒子上的物质具有足够的活性巯基，那么无需激活该物质，因此以下步骤就可省略。
用2-亚氨基硫醇烷(IT)盐酸盐激活抗体。在典型的操作中，制备浓度为42.77mg/ml含有0.1％叠氮化钠的T4单克隆抗体的1×PBS溶液。在偶合期间对于1000mgT4(或T8)抗体及15mg/ml抗体浓度来说，反应总体积应该是66.67ml。利用15∶1＝IT∶T4的激活比例，需要93.75μmol(12.9mg)IT(6.45ml2mg/ml的IT)的1×PBS溶液。因此，将36.84ml的1×PBS溶液加入到23.38mlT4浓缩液中，再加入6.45ml 2mg/ml的IT溶液。在250ml离心管中使最终得到的溶液滚动混合1小时。然后将反应管中的内容物施加到2000ml G-50Sephade×柱上，用1×PBS溶液平衡并洗涤。
用1×PBS洗脱所得到的抗体，借助于紫外监控器件收集多个15ml的馏分。收集在280nm处吸收的谱带中部的馏份并用A280值测定IT-T4抗体浓度。通常IT-T4或IT-T8的浓度为5-6mg/ml。
然后使IT-T4或IT-T8与sulfo-SMCC制备的粒子结合。在试验室规模进行时，总体积为1000ml，粒子浓度为6.67％w/v的固态，IT-T4的浓度为0.7mg/ml或IT-T8的浓度为0.8mg/ml。在一样品中，当被纯化的IT-T4溶液浓度为6.236mg/ml时，随后将112mlIT-T4抗体的1×PBS溶液及288ml的1×PBS溶液加入到1000ml已经通过去掉400ml上清液而被预浓缩的4％w/v固态sulf-SMCC激活的粒子中。
在另一样品中，被纯化的IT-T8抗体溶液浓度是5.846mg/ml，因此将137ml IT-T8抗体的1×PBS溶液及263ml的1×PBS溶液加入到1000ml已经通过去掉400ml上清液而被预浓缩的4％w/v固态sulf-SMCC激活的粒子中。再将25ml的IT-抗体溶液增量加入到粒子中，在两次加入之间进行涡流和超声。然后在2L瓶中将所得到的混合物滚动混合约2小时。
在封闭之前，吸移1ml的结合混合物样品并通过0.2μm的低蛋白键合的滤器进行过滤，在280nm处测定上清液的吸收度，从而得到抗体的表面浓度，即T4为0.44mg/ml，T8为0.53mg/ml而表面密度为4.2mgT4抗体/m2和5.1mgT8抗体/m2。
Sulfo-SMCC激活的粒子上的未反应的顺丁烯二酰亚胺基在抗体结合之后用L-半胱氨酸封闭。通常的做法是，将120ml 5mg/ml L-半光氨酸的1×PBS溶液加入到以上步骤的结合混合物中并使所得到的悬浮液滚动混合约15分钟。通过加入134ml 20mg/ml碘乙酰胺的1×PBS溶液并随后加入25ml pH为9.8的1M硼酸钠缓冲液封闭未反应的巯基。使所得到的悬浮液滚动混合约30分钟，离心分离所封闭的结合混合物并且粒子用1％牛血清白蛋白(Pente×组份V，不含蛋白酶)和0.1％叠氮化钠的1×PBS溶液(BSA缓冲液)洗涤两次。洗涤之后，粒子重新悬浮到BSA缓冲液中并使总体积为1000ml(4％w/v的固体)，然后滚动混合约1小时并在约4℃下贮存24-72小时，再进行离心分离并用BSA缓冲液洗涤三次。
B、粒子的分析粒子单独在1mM的KOH溶液中进行流式血细胞计数分析，其结果是对于T4粒子有87.2％的单体、11.6％的双体和0.6％的多重体，对于T8粒子有94.3％的单体、5.1％的双体和0.1％的多重体。
C、DELSA分析本发明还研究了如上所述的结合有T4-和T8-抗体的二氨基丙烷(DAP)包覆的聚苯乙烯醛/硫酸酯粒子的电动性质。还对DAP-PS(用1×PBS洗涤)、sulfo-SMCC-DAP-PS(w/封闭并用1×PBS洗涤)、T4-DAP-PS(用1×PBS洗涤)和T8-DAP-PS(用1×PBS洗涤)进行淌度(作为pH的函数)的DELSA的测定。图2中比较了原料粒子、DAP-PS粒子、sulfo-SMCC-DAP-PS粒子及T4-和T8-DAP-PS粒子的淌度与pH的关系曲线图，以便根据每个粒子衍生物上预防的电荷证实存在特定的被包覆的粒子。图2中的结果是用1×PBS洗过的粒子的结果，而图3中的结果是用BSA缓冲液和1×PBS洗过的粒子的结果。
原料粒子悬浮在蒸馏水中，而其他衍生粒子为了进行电动测定，在用0.01M硝酸钾溶液稀释之前用1×PBS洗涤和悬浮。
DAP-PS粒子显示出正电性氨基的极好覆盖度，从而可补偿原料粒子的较高的负电性，并且当pH为10-5.5时淌度在-2.2和+4.9×10-4cm2/V-s之间，而且在约6.95的pH处具有一个零电位。当为了结合抗体用sulfo-SMCC激活氨基时DAP-PS粒子的正电荷稍稍减少，在pH为10-4时淌度为-3.6至+2.9×10-4cm2/V-s，而且在约5.8的pH处具有一个零电位。假设T4-和T8-抗体结合的DAP-PS粒子的电动性质介于DAP-PS和sulfo-SMCC-DAP-PS粒子之间，其零电位在5.9和6.2之间。
图3是先用BSA缓冲液洗涤、再用1×PBS洗涤的粒子淌度与pH的相关性曲线，当pH为5.3-5.6时其零电位接近BSA的pI值(4.9)。
实施例7淋巴细胞亚群的个体分析用全血单个试验每种粒子，以便分别区分全血的白细胞中的CD4或CD8的阳性性细胞，即测定不同直方图中位移靶群的位置。对于全血中的T4和T8细胞群中的一种和两种分析，所用的粒子包括结合有T4和T8抗体的金或银包覆的PS粒子以及二氨基丙烷(DAP)包覆的PS醛/硫酸酯粒子。后一种粒子由于形成的聚集体非常少，因此为了准确起见最好作为颗粒对照体是。实施例7和例8中的所有测定都是用DAP-PS作为比较和对照品进行的。
A、利用(T4或T8)-Amde×-银-Amde×PS粒子分别分析CD4和CD8+细胞的百分比是利用本发明的结合有T4或T8的银包覆的聚苯乙烯粒子(实施例3B)或结合有T4或T8无金属涂层的聚苯乙烯粒子，在改进的库尔特VCS仪上进行的。用STKS2B血液学分析仪，采用库尔特VCS技术(该技术可测定血细胞的体积、电导率和光散射性质)测定全血样品中的CD4和CD8细胞群。用COULTERLATRONTM的初级品和LATRON的对照品对分析仪进行日校准。
使滴定度在2和40μl之间的1％w/v固态T4-Amde×-银-Amde×-PS粒子与200μl全血混合约2分钟。混合物在改进的VCSTM仪上进行分析。
图6A-6F示出了全血和不同混合物的DC-SALS(PMT1)矩阵。注意，当使用较大滴定度的粒子时，SALS强度较高时，靶向T4阳性性淋巴细胞的位移也较大。无论是利用T4-DAP-PS还是T4-Amde×-银-Amde×-PS粒子，20μl的标准滴定度足以将位移的淋巴细胞从未位移的淋巴细胞中解析出来。
很容易计算靶细胞群的粒子-细胞比并与理论值相比较。每200μl全血的2.4-6.8×105个淋巴细胞中平均有45％CD4+淋巴细胞，是1.1-1.3×105个CD4+细胞。2μm直径的4％w/v固态粒子，有6.83×109个粒子/ml，所以每200μ全血中20μl标准滴定度的1％w/v固态粒子含有3.4×107个粒子。那么粒子-细胞比的范围是110-310。
这样，图6A-6B显示出加入的粒子越多得到的位移越大。它还显示出最少需要20μl的滴定度才能将位移的靶细胞从未位移的靶细胞中较好地分离出来。
为了进行比较，可估计淋巴细胞周围的粒子单涂覆层的理论上的限制。对于直径为8-12μm淋巴细胞来说，假设为球形的表面积是4πr2或201-452μm2。这样，以方点阵形式在单个淋巴细胞周围的2μm直径粒子的最大数目为50-113。在排列最紧密点阵中每个粒子的面积为3d2/2，而不是d2，从而粒子-细胞的最大比例为58-130。后一范围几乎以化学计量的方式被试验证实T4-DAP-PS粒子滴定度表明，当10μl 1％w/v的固态粒子或粒子-细胞比范围在55-155时，几乎每个试验中都是足够的，而5μl的量总是不够的。
对于T8-PS粒子与细胞的比例可得到类似的结果。CID8+淋巴细胞的平均值为20％，对于10μl滴定度1％的2μm直径的粒子来说，粒子-细胞比的范围是124-349，因此需要比理论上计算的值多2倍的粒子。
对于同全血混合的银包覆的PS粒子，所需要的粒子滴定度要增大，以补偿较大数目的以非线性别几何结构排列的多于两个粒子的粒子聚集体。而且，其他因素例如所固定的抗体-细胞表面抗原亲和常数、每个靶细胞的特定抗原受体数目以及细胞上的抗原受体对所固定抗体的可接受度都会影响所需要的粒子-细胞比例。
T4和T8抗体与T淋巴细胞表面上的抗原配体的亲和力是非常高的，即T4为1010-1012M-1，T8为108-109M-1，从而键合没有限制因素〔Oonishi等人的，J Immunol.Methods，115159(1988)；还参见Siiman等人的1996年3月27日申请的美国专利申请08/624,014〕。另外，对于CD4和CD8抗原每个细胞的受体值为104-105，该值足以体现出从细胞表面与潜在固定的抗体配体的完美接触〔R.F.Vogt，Jr.等人的Cytometry，12525(1991)；A.N.Barclay等人的The LeukocyteFacts Book，Academic Press，San Diego，CA，(1993)〕。
图7A-7L和图8A-8L是在矩阵图中以不同参数对和以激发波长633nm和780nm表示的由于T4-Amde×-银-Amde×-PS或T4-DAP-PS粒子的存在，淋巴细胞群所发生的位移的比较结果。T4-Amde×-银-Amde×-PS位移淋巴细胞和T4-DAP-PS位移淋巴细胞有最好分离度的矩阵是SALS(PMT1)与LMALS或UMALS的曲线关系图。用多抗体标志的对照分析，使用的最佳矩阵图是SAL(PMT1)与LMALS或UMALS的曲线关系图。
B、利用本发明的结合有蛋白质的粒子在改进的库尔特VCS仪，用本发明的结合有T4或T8的金和银包覆的聚苯乙烯粒子，或没有金属涂层的(T4或T8)-DAP-PS粒子进行全血的白细胞群中CD4或CD8阳性性细胞百分比的分别测定。
为了测定CD4/CD8的百分比，在Coulter型6705473单速混合器上的5ml玻璃管中使40μl或60μl1％w/v固态粒子悬浮液与400μ1EDTA抗凝全血混合约2分钟。用手动设备时，将150μl全血-粒子混合物置分析仪中，在混合完成之后该仪器立刻会对红细胞进行自动酸溶解和猝灭。对混合物中的粒子标记的白细胞和粒子未标记的白细胞进行不同光散射(SALS、UMALS、LMALS)参数分析和DC与RF电导率的分析。图9A-9F、10A-10F及11A-11F示出了T4粒子的代表性矩阵。
在90°LS与RF、UMALS、DC或LMALS的矩阵图以及UMALS与DC的矩阵图中T4(T8)-DAP-PS粒子表现出对靶细胞群的最好分离。而T4(T8)结合的金或银包覆的聚苯乙烯粒子只在90°LS与RF、UMALS、DC或LMALS矩阵图中表现出较好的分离。
利用T4(T8)-DAP-PS粒子、40μl 1％w/v固体和400μl来自4个正常供体(每个供体分成三份)的全血从90 °LS-UMALS矩阵图上检查CD4和CD的定量百分比。在库尔特STKS血液学分析仪上用相同的粒子和血液供体进行平行测定。向每个供体中加入适当的荧光抗体标记物鼠IgG1-藻红素/鼠IgG1荧光素异硫氰酸盐(“MsIgG1-PE/MsIgG1-FITC”)；或双荧光标记物T3-FITC/T4-PE和T3-FITC/T8-PE(都得自于Coulter Corporation)，利用流式血细胞计数仪得到淋巴细胞的CD4/CD8阳性性细胞百分比的对比结果。表I为用T4(T8)-DAP-PS得到的四个供体的全血中CD4/CD8阳性性细胞百分比的总结果。
表I全血中CD4、CD8阳性性细胞百分比供体 4684853522 53960 54152白细胞中％ ％CD4％CD8％CD4％CD8％CD4 ％CD8％CD4 ％CD8试样110.963.88 14.105.16 13.59 8.15 13.99 8.64试样29.94 3.37 14.335.25 13.16 8.33 14.36 8.82试样38.82 3.18 14.185.66 12.66 8.32 14.40 8.68平均值 9.91 3.48 14.205.36 13.14 8.27 14.25 8.71白细胞中％L 18.9 27.6 30.1 27.8％in L， 52.4218.4051.4619.4143.64 27.4651.26 31.34mod.VCSSTKS％ 54.3 17.3 50.9 19.2 39.8 25.3 49.5 33.1Flow％ 56.1 17.6 49.3 20.5 38.6 28.1 50.1 32.6％diff，mod. 6.56 4.54 4.38 5.32 13.0 2.28 2.31 3.86VCS-flow图1 2A-12D示出了每个血液供体的T4-DAP-PS粒子-全血混合物的代表性90°LS与UMALS的矩阵图。供体5 3960似乎表示在位移和未位移白细胞群之间矩阵的左下角接界选通处存在更多的细胞。有时在这个区域也可鉴定出具有非常少粒子的CD4阳性单核细胞。对于该供体，稍稍将选通移动到更高的90°LS和更高的UMALS处可给出白细胞中12.25％的CD4细胞平均值或淋巴细胞中40.71％的CD4细胞平均值，而用流式血细胞计数对照体只给出2.29％的区分。
另外，为了得到粒子悬浮液的最佳量，使10-80μl滴定度的1％w/v固态T4(T8)-氨基三硫醇-金-Amde×-PS粒子与400μl三个供体的全血混合并在90°LS-UMALS矩阵中分析白细胞群中CD4(CD8)细胞的百分比。表II列出的结果说明粒子滴定度与三个供体的全血中CD4/CD8阳性细胞百分比的关系。图13A-13E示出了代表性供体49070的T4-氨基三硫醇-金-Amde×-PS粒子的滴定度矩阵图。
表II粒子滴定度与白血细胞中CD4、CD8阳性细胞百分比的关系供体 49070 50184 53608粒子滴定度，μl ％CD4 ％CD8 ％CD4 ％CD8 ％CD4 ％CD810，T4(T8)-金-PS粒子 8.404.783.422.256.025.2420 9.654.294.342.426.495.284011.064.615.182.187.875.096011.365.225.132.328.115.218011.904.985.271.958.225.6260，T4(T8)-PS粒子 11.555.465.542.588.516.78白细胞中％L24.512.519.1％in L，T4(T8)-金-PS粒子 46.421.341.0186 4.2527.3％in L，T4(T8)-PS粒子 47.122.344.320.644.535.5flow％ 45.925.955.224.643.235.0STKS％ 42.322.556.225.041.330.4当每400μl全血中有40μ1滴定度的1％w/v固态粒子时CD4或CD8的百分比通常可达到一个常数值。该值约是以前建立的相同大小的1％w/v固态T4(T8)-DAP-PS粒子最小滴定度的两倍，对于该粒子可选择每200μl全血中含有20μl的量作为标准滴定度。这样，此后选择每400μl全血中含有60μl1％w/vT4(T8)-氨基三硫醇-金-Amde×-PS粒子作为标准滴定度。对于每个供体，在库尔特STKS血液学分析仪上得到白细胞群中淋巴细胞的百分比；此后，将利用各自的抗体-氨基三硫醇-金-Amde×-PS和抗体-DAP-PS粒子得到的白细胞中CD4百分比/CD8百分比转换成淋巴细胞的百分比，以便与用荧光标记物得到的流式血细胞计数数据和用PS粒子得到的STKS数据相比。
供体50184和53608具有较低的淋巴细胞在白细胞中百分比，其不在20-55％的正常范围内。这些供体还显示出在改进的VCS上测定的CD4/CD8百分比相对于同全血混合的T4/T8粒子在STKS血液学分析仪上得到的对比结果或用合适的荧光标记物通过流式血细胞计数仪得到的对比结果的最大偏差。
本申请中最有用的矩阵是(i)SALS与LMALS或UMALS，(ii)UMALS与DC，(iii)SALS与DC，以及(iv)SALS与RF。这样，本发明的结合有抗体的聚苯乙烯粒子通过以下方式可从结合有抗体的银或金聚苯乙烯粒子上解离下来在450和800nm之间合理地选择激发激光波长，以便激发沉积在聚苯乙烯粒子表面上的银(λe×c＝400-520nm)或金(λe×c＞520nm)或这两种金属的混合胶体(λe×c＝520-880nm)的细胞质基因组共振，并选择SALS与UMALS、DC、或RF的矩阵图以及UMALS与DC的矩阵图。
波长的相关性提供了使用固定或未固定银或金胶体的结合有抗体的二或三色粒子的方法，并且提供了不同抗体靶向互相排他的白细胞亚型，以便同时分析白细胞的二或三个亚型群体。
包埋在2微米直径的球形聚苯乙烯粒子(围绕在被抗体包覆的粒子特定靶向的白细胞周围)表面上的直径为50-200nm的金粒子的总的光散射应该是以下三种主要散射分布的叠加(1)细胞散射，(2)聚苯乙烯粒子散射，以及(3)金粒子散射。由于2μm的聚苯乙烯粒子通常比白细胞小，因此它们与细胞表面的结合根据粒子-细胞比和细胞周围粒子的几何排列对粒子-细胞结合物的形状与大小的作用而干扰了原始细胞的光散射。金粒子比聚苯乙烯粒子或白细胞小得多，因此它们对粒子-细胞结合物的形状和大小的影响可忽略。然而，由于金粒子在近红外区域中具有特殊的与波长相关的消光光谱，因此它们又显示出聚苯乙烯粒子-细胞结合物中不存在的额外的散射和吸收。
而且，细胞表面上金-聚苯乙烯粒子的聚集(粒子彼此最近地邻接)干扰了分开的金-聚苯乙烯粒子的消光性质。另外，金粒子的消光吸收部分实际上在一些角度的散射范围内产生与聚苯乙烯粒子-细胞结合物有关的散射强度损失。
与淋巴细胞亚型结合的抗体-氨基三硫醇-金-Amde×-PS粒子的额外侧散射位移相对于结合到细胞上的PS粒子的位移来说是较小的；然而，在SALS-UMALS矩阵图上靶淋巴细胞位置的改变由于用抗体-氨基三硫醇-金-Amde×-PS粒子包覆的细胞的UMALS实际上减少了，而使得抗体-氨基三硫醇-金-Amde×-PS与PS位移的淋巴细胞群之间明显地分开。结合到淋巴细胞上的抗体-Amde×-银-Amde×-PS粒子与抗体-氨基三硫醇-金-Amde×-PS粒子本身具有相同的作用，即相对于用PS粒子标记的淋巴细胞的散射来说其前散射和UMALS是减小的。然而，用抗体-Amde×-银-Amde×-PS粒子标记的靶淋巴细胞的侧散射比用抗体-氨基三硫醇-金-Amde×-PS粒子标记的淋巴细胞的侧散射增强了两倍。
实施例8淋巴细胞亚群的同时分析在改进的库尔特VCS仪上用本发明的结合有T4或T8的聚苯乙烯及结合有T8或T4的金或银包覆的聚苯乙烯粒子同时测定CD4或CD8+阳性细胞在全血的白细胞群中的百分比。
由于实施例7中所述的原因，所用的粒子包括结合有T4和T8抗体的金包覆的PS粒子或银包覆的PS粒子以及二氨基丙烷(DAP)包覆的PS醛/硫酸酯粒子。
简言之，使结合物与全血混合，然后在红细胞酸溶解和猝灭之后分析白细胞。具体做法是，首先使40μl1％w/v固态T4(T8)结合的聚苯乙烯粒子及40-60μl的T8(T4)结合的金或银包覆的聚苯乙烯粒子与400μl全血混合约2分钟。然后如实施例7所述处理并分析混合物。
图14A-14F示出了典型的矩阵图。90°LS-UMALS矩阵显示出能够将用T4(T8)结合的聚苯乙烯粒子标记的细胞与用T8(T4)结合的金或银包覆的聚苯乙烯粒子标记的细胞最好地分离开。在UMALS-DC矩阵中只可解离用T4(T8)结合的聚苯乙烯粒子标记的细胞，而在90°LS与RF、DC的矩阵中用T4(T8)结合的金或银包覆的聚苯乙烯粒子标记的细胞有时可被解离。
对60μlT4(T8)-PS/60μlT8(T4)-金-PS粒子与400μl来自三个供体的全血(分成三份)的混合物的90 °LS-UMALS矩阵进行分析，得到白细胞中的CD4百分比/CD8百分比。表3示出了三个供体的全血中CD4/CD8阳性细胞的百分比。
表III全血中CD4、CD8阳性细胞的百分比供体 4907050184 53608％CD4 ％CD8％CD4 ％CD8 ％CD4 ％CD8T4-PS/T8-金-PS粒子试样1 12.405.10 5.672.40 8.844.95试样2 12.505.43 6.11 2.5 9.675.16试样3 (14.16) 5.02 5.612.61 9.715.30平均值12.455.18 5.802.52 9.415.144分钟 13.485.24 5.752.76 9.484.90平均％in L 50.821.1 46.420.2 49.326.9T8-Ps/T4-金-PS粒子试样1 10.057.01 6.653.18 (19.66) 7.30试样2 11.136.72 6.812.86 14.43 7.16试样3 (8.80) 7.26 6.552.63 14.57 6.98平均值10.597.00 6.672.89 14.50 7.154分钟 10.296.38 6.522.96 13.80 7.19平均％in L 43.228.6 53.423.1 75.9 37.4％in L 47.122.3 44.320.6 44.5 35.5T4(T8)-PS粒子Flow％ 45.925.9 55.224.6 43.2 35.0STKS％ 42.322.5 56.225.0 41.3 30.4对于一些运行过程，通过将矩阵左下角的选通调到更高的90°LS和更高的UMALS可提高在改进的VCS仪上得到的CD4/CD8百分比与流式血细胞计数的结果之间的一致性。例如，在对供体49070进行调节之后，用T4-Amde×-PS/T8-氨基三硫醇-金-Amde×-PS粒子在L＝45.6处得到CD4的百分比，而利用T8-Amde×-PS/T4-氨基三硫醇-金-Amde×-PS粒子可在L＝25.6处得到CD8的百分比。
对于供体53608，用T4-Amde×-PS/T8-氨基三硫醇-金-Amde×-PS粒子可在L＝35.5处得到CD4的百分比，利用T8-Amde×-PS/T4-氨基三硫醇-金-Amde×-PS粒子可在L＝49.7处得到CD4的百分比，而利用T8-Amde×-PS/T4-氨基三硫醇-金-Amde×-PS粒子可在L＝30.6处得到CD8的百分比。
利用与400μl全血混合的40μlT4(T8)-Amde×-PS和60μlT8(T4)-Amde×-银-Amde×-PS粒子并用633nm的He/Ne激光激发可得到一个供体的类似结果(汇总于表IV)，但是由于存在大量T4(T8)-Amde×-银-Amde×-PS粒子的聚集体扩大了不同矩阵中非靶细胞的区域，因此与流式计数对照数据相比的定量结果不是那么好。表IV示出了利用四种不同粒子得到的全血中CD4/CD8阳性细胞的百分比。
表IV全血中CD4、CD8阳性细胞的百分比矩阵 ％CD4 in L ％CD8 in LT4-PS或T8-PS粒子 90°LS-UMALS 46.123.2UMALS-DC 37.421.8T4-银-PS或T8-银-PS粒子90°LS-DC20.117.2T4-PS/T8-银-PS粒子UMALS-DC 36.990°LS-UMALS 17.8T8-PS/T4-银-PS粒子90°LS-UMALS 53.3UMALS-DC 23.190％S-DC 36.9UMALS-DC 23.1流式计数对照物 45.625.4用几种选通方法来计算白细胞群中靶细胞的百分比，图15A-15F示出的其中一个选通策略是利用T4-Amde×-PS/T8-氨基三硫醇-金-Amde×-PS粒子得到的。正如在库尔特STKS血液学分析仪上所测定的，该供体白细胞中淋巴细胞的百分比为18.8。
本说明书中提到的所有出版物标志着与本申请有关的技术领域中技术人员的技术水平，这些出版物在此一起作为参考文献。
虽然对本发明用特别优选的实施作为参考进行了描述，但是应该意识到对其所作的变型并不脱落本发明的精髓，而且这些变型都在后面所附的权利要求书的范围内。
权利要求
1.一种稳定的胶体粒子，包括(a)一个具有与胺反应的官能团的胶体大小的核底物；(b)一层位于所述底物外表面上的氨基葡聚糖涂层；(c)一层覆盖所述氨基葡聚糖涂层的胶体大小的金属固体，所述金属固体中的金属是从能够被所述核的氨基葡聚糖涂层从离子态还原成金属态的金属中选择的；(d)一种附着到所述金属固体上的键合剂，所述键合剂具有游离的氨基；以及(e)一种通过与所述游离氨基共价键合而附着到所述键合剂上的蛋白质。
2.根据权利要求1所述的粒子，其特征在于所述核底物(a)是聚苯乙烯。
3.根据权利要求2所述的粒子，其特征在于所述核底物(a)的直径在约0.2至约5.0微米的范围内。
4.根据权利要求1所述的粒子，其特征在于所述氨基葡聚糖涂层(b)通过所述氨基葡聚糖的游离氨基与所述底物的所述与胺反应的官能团之间的共价键而共价键合到所述核底物(a)上。
5.根据权利要求4所述的粒子，其特征在于所述氨基葡聚糖涂层(b)中的氨基葡聚糖选自若干被二胺取代的氨基葡聚糖，且这些氨基葡聚糖的二胺取代程度与1/2.5的最大理论值相比在约1/40-约1/35的范围内。
6.根据权利要求5所述的粒子，其特征在于所述氨基葡聚糖涂层(b)中的所述二胺取代约为1/7-1/8。
7.根据权利要求1所述的粒子，其特征在于所述金属固体(c)选自具有+0.7伏或更高还原势的金属离子或金属离子复合物。
8.根据权利要求7所述的粒子，其特征在于所述金属固体是金。
9.根据权利要求7所述的粒子，其特征在于所述金属固体是银。
10.根据权利要求1所述的粒子，其特征在于所述金属固体(c)和所述氨基葡聚糖涂层(b)分散在所述聚苯乙烯核底物的所述表面上。
11.根据权利要求1所述的粒子，其特征在于所述键合剂(d)是一种氨基葡聚糖键合剂。
12.根据权利要求11所述的粒子，其特征在于所述氨基葡聚糖键合剂(d)中的氨基葡聚糖选自若干被二胺取代的氨基葡聚糖，且这些氨基葡聚糖的二胺取代程度与1/2.5的最大理论值相比在约1/40-约1/35的范围内。
13.根据权利要求12所述的粒子，其特征在于所述氨基葡聚糖键合剂中的所述二胺取代约为1/7-1/8。
14.根据权利要求11所述的粒子，其特征在于所述氨基葡聚糖键合剂是5×-氨基葡聚糖。
15.根据权利要求11所述的粒子，其特征在于所述氨基葡聚糖(d)通过氨基与戊二醛交联而共价键合到所述胶体金属-氨基葡聚糖包覆的底物上。
16.根据权利要求1所述的粒子，其特征在于所述键合剂(d)是氨基三硫醇盐键合剂。
17.根据权利要求16所述的粒子，其特征在于所述键合剂是三(3-巯基丙烷基)-N-甘氨酰氨基甲烷。
18.根据权利要求16所述的粒子，其特征在于所述氨基三硫醇键合剂(d)是通过共价的金属-硫键而共价键合到所述胶体金属-氨基葡聚糖包覆的底物上的。
19.根据权利要求18所述的粒子，其特征在于所述胶体金属是金。
20.根据权利要求1所述的粒子，其特征在于所述蛋白质(e)是一种抗体。
21.根据权利要求20所述的粒子，其特征在于所述抗体选自抗-CD4抗体和抗-CD8抗体。
22.根据权利要求1所述的粒子，其特征在于所述蛋白质(e)共价键合到所述键合剂-胶体金属-氨基葡聚糖包覆的底物上，其方法是将被sulfo-SMCC中的马来酰亚胺激活的键合剂上的游离氨基与被2-亚胺硫醇烷上的巯剂激活的蛋白质共价键合。
23.根据权利要求1所述的粒子，其特征在于包括(a)一个胶体大小的聚苯乙烯微粒；(b)一层覆盖在所述聚苯乙烯微粒的外表面上的1×-氨基葡聚糖涂层；(c)一层覆盖在所述氨基葡聚糖涂层上的胶体大小的金；(d)一种具有游离氨基的氨基三硫醇盐键合剂；以及(e)一个通过共价键合到所述游离氨基上而附着到所述键合剂上的抗-CD4抗体。
24.根据权利要求1所述的粒子，其特征在于包括(a)一个胶体大小的聚苯乙烯微粒；(b)一层覆盖在所述聚苯乙烯微粒的外表面上的1×-氨基葡聚糖涂层；(c)一层覆盖在所述氨基葡聚糖涂层上的胶体大小的银；(d)一种具有游离氨基的5×-氨基葡聚糖键合剂；以及(e)一个通过共价键合到所述游离氨基上而附着到所述键合剂上的抗-CD4抗体。
25.根据权利要求1所述的粒子，其特征在于包括(a)一个胶体大小的聚苯乙烯微粒；(b)一层覆盖在所述聚苯乙烯微粒的外表面上的1X-氨基葡聚糖涂层；(c)一层覆盖在所述氨基葡聚糖涂层上的胶体大小的金；(d)一种具有游离氨基的氨基三硫醇盐键合剂；以及(e)一个通过共价键合到所述游离氨基上而附着到所述键合剂上的抗-CD8抗体。
26.根据权利要求1所述的粒子，其特征在于包括(a)一个胶体大小的聚苯乙烯粒子；(b)一层位于所述聚苯乙烯粒子的外表面上的1X-氨基葡聚糖涂层；(c)一层覆盖在所述氨基葡聚糖涂层上的胶体大小的银；(d)一种具有游离氨基的5×-氨基葡聚糖键合剂；以及(e)一个通过共价键合到所述游离氨基上而附着到所述键合剂上的抗-CD8抗体。
27.一种在含有红细胞和白细胞的生物溶液/悬浮液中同时定量测定白细胞的两种或多种亚群的方法，该方法包括以下步骤(a)将所述生物溶液/悬浮液与至少两种不同的权利要求1所述的稳定胶体粒子与混合，其中每种不同粒子含有一种蛋白质，该蛋白质与所述白细胞的一个亚群上的不同抗原决定簇键合，所述混合进行的时间足以使所述粒子键合到每个所述细胞亚群上；(b)溶解所述生物溶液/悬浮液中的所述红细胞并猝灭所述混合物(a)中的所述细胞；(c)在一种仪器上分析步骤(b)的所述混合物，该仪器可鉴别与每种所述不同胶体粒子键合的白细胞亚群，从而同时定量计数所述白细胞的至少两个相互排他的亚群。
28.根据权利要求27所述的方法，其特征在于所述生物液体是全血。
29.根据权利要求27所述的方法，其特征在于所述亚群选自T淋巴细胞、B淋巴细胞、粒细胞和单核细胞。
30.根据权利要求27所述的方法，其特征在于所述淋巴细胞是CD4+淋巴细胞和CD8+淋巴细胞。
31.根据权利要求27所述的方法，其特征在于每个所述蛋白质是抗体。
32.根据权利要求27所述的方法，其特征在于所述仪器通过光散射、电导率和体积来鉴别细胞。
全文摘要
本发明提供了一种稳定的胶体粒子,包括一个胶体大小的有与胺反应的官能团的核底物、底物外表面上的氨基葡聚糖涂层和覆盖该涂层的胶体大小的金属固体。附着到金属固体上的键合剂有游离氨基,蛋白质与该游离氨基共价键合而附着到键合剂上。这种新颖粒子用于流式血细胞计数,特别同时分析白细胞的若干亚群。本发明还提供了该粒子的制备和应用方法。基于所结合的蛋白质的键合亲和力,可同时分析白细胞的至少两个不同的相互排他的亚型。
文档编号G01N33/548GK1276871SQ98809901
公开日2000年12月13日 申请日期1998年10月1日 优先权日1997年10月9日
发明者奥拉维·西尔曼, 克里斯特里·戈登, 卡洛斯·M·罗德里戈渥斯, 亚历山大·伯斯特因, 约翰·A·马普勒斯, 詹姆斯·凯勒·怀特塞尔 申请人:库尔特国际公司