专利名称：：杆状病毒载体表达系统中蛋白质的表达的制作方法
技术领域：
：本发明涉及在杆状病毒载体表达系统中增强蛋白质或多肽表达的方法。当重组DNA技术发展起来后，人们期望利用遗传修饰的细菌大规模地生产蛋白质。但是，大多数具有商业价值的蛋白质在它们变成生物活性蛋白质之前需要进行翻译后的修饰。所以，现在更经常用于生产重组蛋白质的是动物细胞。在动物细胞中，昆虫细胞在重组蛋白质的生产中变得越发重要。现在已经开发了利用昆虫细胞的一个便利和多用途的杆状病毒载体系统。但是，昆虫细胞的生理学资料相当少，通常接受的是杆状病毒重组技术生产的疫苗。一个例子是将I型人免疫缺陷病毒的杆状病毒表达的gp160包膜蛋白作为临床实验中可能的AIDS疫苗。直到现在，昆虫细胞中大规模生产杆状病毒表达的蛋白质还局限于最多达约10升的生物反应器。为了扩大规模，悬浮培养的可能性最大。在大规模的生产中(参见，Tramper等人，生物技术最新进展，1992，263-284；Power和Nielson，细胞技术20209-219，1996)，特别应该关注影响细胞生长和病毒生产的因素。这些因素的变化大大地影响了重组蛋白质生产的最后水平。杆状病毒的特征是通常包含在包含体(也称为多角体)的杆状病毒颗粒。杆状病毒科可以分成两个亚科真杆状病毒，有两个包含体病毒属核多角体病毒(NPV)和颗粒体症病毒(GV)，和包括非包含体病毒的亚科裸杆状病毒。人们已经更详细地研究了苜蓿银纹夜蛾(Ac)NPV的细胞和分子生物学。许多蛋白质已经在编码该蛋白质的重组杆状病毒感染的昆虫细胞中表达。编码意味着将编码异源蛋白质的核酸序列提供给病毒，经常还将调节核酸序列如启动子提供给这种病毒。更常见的是，多角体启动子用于表达外源基因，但p10启动子同样适用，也可使用。可被重组杆状病毒感染的细胞系有几个。SF-21细胞系是起源于秋粘虫(草地夜蛾)的卵巢组织的。得自美国典型培养物保藏中心(CRL1711)的克隆分离物SF-9或多或少是体外生产重组病毒的标准细胞系，并且据说在生产重组病毒中是优秀的。其它细胞系如从粉纹夜蛾获得的Hi-Five细胞系和Tn-368和Tn-368A细胞系。最广泛利用的昆虫细胞生长培养基包括TNM-FH，BML-TC/10和IPL-41。这些培养基通常或多或少补充了确定的一些成分，如哺乳动物血清，特别是胎牛血清。血清替代品也用于昆虫细胞培养，无血清培养基如Ex-Cell400TM和Sf900是可以买到的。通常昆虫细胞在固体支持物上以及悬浮液中生长，但是，据报道，当生长在固体支持物上时病毒的产量较高。当在指数生长期感染细胞时，感染是最有效的，但在细胞周期的不同时期感染的细胞之间，每个细胞产生的多角体和病毒的量没有明显的差异。细胞密度对病毒生产具有很大的影响。昆虫细胞表现出接触抑制的形式，在更高的细胞密度时病毒生产减弱。每个细胞的感染病毒数，即最初的感染复数(m.o.i.)通常在感染结束时影响感染细胞部分和每个细胞的多角体的数目。通常认为病毒生产的最佳感染复数在20-30左右。在表达β-半乳糖苷酶的重组杆状病毒的研究中(Licari和Bailey，生物技术和生物工程，37:238-246，1991)，Sf-9细胞的感染复数是0-100之间。β-半乳糖苷酶产量增加，并且细胞密度随着感染复数增加而下降。通常认为感染复数的增加或下降只对每个感染细胞的重组蛋白质的最大可得产量有有限影响。但是，选择低的感染复数能减少感染所需要的病毒原液和使杆状病毒的干扰缺损颗粒的产生的危险最小。如果以高感染复数(＞5)感染昆虫细胞的批量培养物，接着发生的感染过程将基本同步，即，所有细胞将同时经过感染循环。当批量培养物中细胞的感染复数是1-5，培养物不再同步。培养物最初将包括非感染细胞和各个感染循环的不同点的细胞，直到所有细胞感染，并且需要的蛋白质的生产结束。通常在这样的培养物中，生产水平更低。培养物行为是不同生产时期的各个细胞的行为的组合，解释了亚最佳生产水平。在连续培养中，连续地加入非感染细胞，培养物将明显地非同步感染。通过数学模型的设计，据认为可以推测低感染复数感染细胞时或在连续培养系统中繁殖病毒时观察到的复杂行为。人们认为同样的现象的纯粹的实践分析如果不是不可能的，也是非常困难的。目前，已知有三个模型，Licari&Bailey，deGooijer和Power&Nie1sen模型。尽管它们的复杂性和开发它们付出的努力，所有这些均是第一代模型，是以表达在多角体启动子控制下表达模型重组蛋白质(β半乳糖苷酶)的杆状病毒的行为为出发点。在很大程度上，当看作黑盒子系统时，他们概括了我们目前对杆状病毒和昆虫细胞之间的相互作用的定量理解，没有考虑DNA和RNA的积累和感染循环，。结合和最初的感染过程在定量上仍然认识很少，有待于在这一领域进一步的研究。杆状病毒表达系统提供了生产重组蛋白质的有力工具。可以利用几个细胞培养的构型进行大规模的生产。但是，这些系统需要最佳化，以便利用他们潜在的全部优点。对于商业应用，大规模和低耗价生产是关键。在大规模细胞培养中报道的多角体生产系统应该急速改善，以满足价格竞争产品的商业需要。本发明提供了利用能增加或改良需要的蛋白质的产量的杆状表达系统的大规模重组蛋白质生产的方法。本发明提供了生产和提高昆虫细胞培养物中重组蛋白质的方法，其中包括选择编码所述蛋白质的重组杆状病毒，在培养容器的生长培养基中生长昆虫细胞，和以感染复数＜0.01感染细胞。在优选的实施方案中，本发明提供了增加在昆虫细胞培养物中产生的重组蛋白质的产量的方法，包括选择编码所述蛋白质的重组杆状病毒，在培养容器的生长培养基中生长昆虫细胞，以感染复数＜0.01，利用至少一个杆状病毒接种物感染细胞。增加产量已经成为几个研究组的主题。例如，Chen等人(药物代谢和沉积24p399-405,1997)研究了优化共感染途径的感染复数，从而在昆虫细胞培养物中生产两个不同杆状病毒表达蛋白质的可能性。与本文叙述的结果相反，他们发现他们的两个蛋白质的最好MOI约为0.015到0.03。将感染复数减少到＜0.01，减少了Chen等人的共感染系统的产量。没有受共感染系统研究的妨碍，Radford等人(Cytotechnology24,73-81,1997)，清楚地表示，MOI＞1应该总能用于使最后产量最大化，再次否认了本发明的发现。他们报道，利用低MOI在每个细胞中生产更高产量的蛋白质和病毒是不可能的，而且建议取而代之调节感染的时间(TOI)。其它人，如Nguyen等人(生物技术杂志，31，205-217，1993)没有发现改变MOI的溶液，而是利用补料分批培养或改变病毒生长的温度增加产量(Wu等人，细胞技术学，9，141-147，1992；King等人，生物技术，Bioeng,38,1091-1099,1991)，并且避免在感染复数＜0.01时使该病毒生长。这些较早的结果明显与本文中提供的不同(参见例如图1)，在本文中，感染复数MOI＜0.01(如0.003,0.001,或甚至0.0001)的培养物比感染复数MOI0.01或0.1的那些产量更高。本发明的优选的实施方案中提供了生产和提高未长成单层培养物的昆虫细胞培养物中重组蛋白质的产量。在杆状病毒表达载体系统中小量生产蛋白质的常规实验室方法利用了培养瓶中昆虫细胞的单层培养物。这些培养物通常感染复数高，以保证同步感染。在单层变成铺满之前感染所有的细胞是关键的，因为接触抑制将导致细胞中的代谢变化，这可能影响最后的产物的产量。因为在单层培养中准确地确定细胞的密度是困难的，所以进行MOI实验是不可能的。利用低的MOI(＜0.01)感染培养物甚至更加没用。在感染时期过高和过低估计细胞密度将导致蛋白质产量明显地低于最佳。通常，人们利用高MOI，保证总细胞群体的同步感染。这暗示了，感染单层培养物获得最佳产量需要大的病毒原种。利用单层培养大规模蛋白质生产仅意味着利用更多的组织培养瓶。利用单层培养大量生产蛋白质是非常耗费劳动力的。另外，调节和/或检测重要的培养参数如溶解氧浓度和pH是不可能的。本发明提供了适于所有昆虫细胞培养的方法，本发明提出了低MOI对于优化非单层培养物的昆虫细胞培养物中的产量是有益的。培养不是单层培养物的昆虫细胞可以利用不同类型的培养容器。每个发酵罐设计的目的是达到足够的通气和高细胞密度，同时尽可能地保持低的剪切力(Tramper等人，在生物技术的最新优点(Vardar-Sukan和Sukan编辑)1992)。在该文献叙述的大多数情况中，利用了装备了喷气装置的搅拌箱式生物反应器。在这一类型的容器中，均一性是利用推动器完成的。这一类型的发酵罐可以不同方法操作。首先，是分批的方法。这是最直接和简单的方法。培养细胞，加入病毒，在感染结束时收集产物。更复杂的方法是补料分批培养。在培养容器中加入营养物的浓缩混合物，达到较高的细胞密度和较高的体积产物产量(Nguyen等人，1993，生物技术杂志，31卷，p205-217)。这更加复杂是因为不总是清楚限制性营养素是什么。加入底物消除一个营养物的限制但可能直接导致了另一个营养物的限制，所以对更高的产物产量不是必需的。在气升式生物反应器中可以利用各种混合方法(Wu等人，1992细胞技术9卷，p141-147)。这一类型的容器包括两个圆筒。最小直径的圆筒(通气管)放置于较大直径的圆筒(降液管)内部。中心圆筒的空气或另一种气体喷气，产生了向上的流动。在发酵罐的顶部，气体离开液体，液体从中心圆筒的外面下来。在这一方法中，只利用喷气完成了通气和均质，因为在通气管和降液管中密度是不同的。该方法可以减少剪切强度，但是达到适当的混合需要连续的通气速率。另一个提高发酵罐中活细胞密度的方法是包括旋转过滤器或另一种细胞滞留装置。这称为灌注。这允许从发酵罐中除去废培养基，加入新鲜的培养基，而同时细胞滞留在发酵罐中。这一方法需要许多特别的设备和更困难的发酵罐操作(Caron等人，1994生物技术和生物工程43卷，881-891)。另外，也有报道如多孔床和凝胶基质中固定的方法。这一类型的方法依赖于细胞固定在基质上或内部，使除去废培养基和加入新鲜培养基而不稀释细胞培养物成为可能。如果细胞密度，接触抑制和其它单层培养的相关问题是可控制的，本发明的方法不仅可以用于上面的各种培养系统，而且可以用于单层培养。例如，本发明的优选实施方案提供了生产和提高昆虫细胞培养物中重组蛋白质的产量的方法，其中包括选择编码所述蛋白质的重组杆状病毒，在足够体积的至少含有2升生长培养基的培养容器中生长昆虫细胞，和利用至少一种杆状病毒接种物以MOI＜0.01所述杆状病毒PFU/细胞感染昆虫细胞。本发明提供的方法中利用的感染复数相当低，例如低于1-5，导致培养物的感染是非同步的。通过利用本发明提供的感染复数以杆状病毒感染昆虫细胞，在细胞的复制速度和病毒的复制速度之间达到了最佳的平衡，因此使得需要的蛋白质的表达最佳。本发明提供的方法可以容易地通过调节感染复数而适应更高或更低的细胞密度，并且，其中在复制的各个时期可以感染细胞的病毒颗粒的相对比率仍然是根据本发明提供的复数和密度的。本发明的一个优选的实施方案包括在足够体积的能含有至少10升，更优选地至少20升，更优选地至少50或250升生长培养基的培养容器中生长细胞，因此能扩大杆状病毒培养物表达异源蛋白质。例如可以利用体积比生长培养基的体积所需的更大的培养容器，例如可以利用100升培养容器培养20-70升细胞培养物。本发明的优选的实施方案包括在细胞密度1×105到5×106细胞/毫升，更优选地5×105到1.5×106细胞/毫升时感染细胞，因此使病毒接种物的真正体积保持在容易控制的极限内。本发明的方法的另一个实施方案包括以感染复数≤0.005，如0.003，0.001，0.0005或0.00025感染细胞，因此接种物尽可能地少。本发明的方法的优选的实施方案包括选择在p10启动子控制下表达需要的蛋白质的重组杆状病毒。p10启动子在细胞溶解中起作用，缺乏p10蛋白质导致感染细胞保持完整，阻止了多角体从感染的细胞中释放，从而减少了再感染率但不是感染性。病毒感染的整个过程是可以肉眼检测的，因为多角体基因，由此的多角体仍然存在。病毒感染可以如在细胞核中积累的致密蛋白质颗粒观察到。本发明的方法的另一个实施方案包括在分批培养系统中生长昆虫细胞，由此使干扰缺损杆状病毒颗粒的积累最小，这可以帮助仍然未感染的细胞的感染和复制。本发明提供的方法的另一个实施方案包括悬浮培养昆虫细胞，优选地在培养容器如可以(适中)搅拌的发酵罐中生长昆虫细胞。利用(搅拌)悬浮培养，特别是当结合利用重组杆状病毒，其中需要的蛋白质在p10启动子的控制下时，以肉眼观察病毒生长(如在利用多角体启动子的情况中其它检测方法如观察CPE也可以)时，能更好地控制培养。适中地搅拌悬浮液保证了均一培养，其中未建立底物梯度，并且其中细胞没有承受太高的剪切力。另外，搅拌导致病毒有效地从感染细胞转移到非感染细胞，使病毒感染细胞的效率更高。因为最初只有0.1-0.3％的细胞感染，留下的99.7％-99.9％的细胞能生长和增倍。本发明提供了表达和生产各种起源的重组蛋白质的方法。本发明提供的一个例子是生产瘟病毒起源的蛋白质到收获时生长培养基中所述蛋白质的浓度至少100，120或150微克/毫升，更优选地至少200或甚至300微克/毫升。需要的蛋白质也可以用于畜牧业或医药用途中制备抗原物质，例如掺入疫苗或用于诊断测试。本发明的方法生产的需要的蛋白质可以例如用于制备疫苗。本发明提供的一个实施例是瘟病毒E2蛋白质或其片段，其例如可以用于制备抗瘟病毒感染的疫苗，如猪中典型的猪瘟。在优选的实施方案中，本发明提供了包括重组瘟病毒E2或Erns蛋白质或其片段的疫苗，特征是它不是免疫亲和纯化的，并且优选地在单剂量接种一次后，保护不受PD95水平的瘟病毒感染。这与CSFV接种相关性很大。当适用时，通常CSFV的接种是在CSFV的发作已经发生的区域的大规模行动的过程中进行的。这需要在相当短的时期中快速接种大量动物。在这样的大规模行动中，快速达到适当的保护水平(即保护大量的猪不受野生型病毒感染)是特别重要的。为了完成保护，在第一次接种后等待几个星期再第二次接种大大地妨碍了并且延迟了疾病的控制。在各种生产重组表达E2蛋白质的方法中，甚至当比较杆状病毒中表达的E2(片段)时，是存在差异的。在早期报道的E2蛋白质生产培养物中，E2蛋白质(片段)的产量在20-90微克/毫升之间变化(Hulst等人，病毒学杂志，5435-5442，1993；Hulst和Moormann，细胞技术，20271-279，1996)，另外需要利用单克隆抗体免疫亲和纯化，以获得单射接种所必需的和相关的抗原物质E2。另一个方法(利用了EP0389034中叙述的E2的片段)利用了不经过进一步免疫亲和纯化从昆虫细胞的上清液中收集的E2，导致需注射两次才能获得满意(保护性)免疫应答的基于E2的疫苗。虽然目前已经注册了含有E2抗原的疫苗(PorcillisPesti)，这一疫苗需要接种两次，从而严重妨碍了这一疫苗在抗常见的猪瘟感染的接种中的用途，因为它需要至少两次接种，间隔4星期，才能提供需要的免疫应答。(本发明解决的)这些问题涉及在起始物质如制备疫苗的细胞培养上清液中相关抗原物质的低浓度，在本文中是E2蛋白质(片段)。在理论上，人们可以进一步通过本领域已知的纯化和浓缩方法积累抗原物质，但是，这不会产生有商业价值的疫苗，却导致了每剂的成本高。另一个例子是瘟病毒Erns蛋白质，它也用于疫苗和诊断测试，或其它(治疗)物质中。例如，Ruggli等人(病毒基因10115-126，1995)在单层昆虫细胞培养物中生长了表达E2的杆状病毒，最大产量不超过5-10微克/106个细胞。另外，Moser等人(畜牧业微生物学，5141-53)利用MOI为5在单层昆虫细胞培养物中生长了Ruglli等人的E2，但不能生产足够的未浓缩形式的抗原用于ELISA。在他们的实践中，该蛋白质的另一个螯合镍亲和层析的纯化方法是简化操作和提高ELISA质量的必要条件。这样制备的E2蛋白质都没有用于疫苗制剂。当研究的目的是接种时，发现利用免疫纯化的E2蛋白质接种需要两次，才能达到一定量保护。例如，在Hulst等人(病毒学杂志，675435-5442，1993)，W095/35380，和VanRijn等人(病毒学遗传杂志，772737-2745，1996)中，E2是在单层中生产的，并且免疫亲和纯化获得保护性疫苗。本发明提供的一个实施例是含有重组CSFVE2蛋白质(片段)的疫苗，现在它已经可以令人满意地大量生产，但不再需要免疫亲和纯化即可掺入在动物接受一个剂量的单次接种后两个到三个星期内赋予抗典型的猪瘟病毒感染的保护性(保护剂量水平的95％(PD95))疫苗。本发明提供的方法提供了含有在一个剂量单次接种后赋予抗昆虫感染的保护性的重组瘟病毒E2或Erns蛋白质或其片段的疫苗，而该蛋白质(片段)不经过免疫亲和纯化。本发明也提供了另外含有佐剂的包含本发明提供的蛋白质的疫苗。适当的佐剂是本领域技术人员已知的，例如弗氏佐剂，或氢氧化铝，或乳剂，如油包水或双倍的油包水或水包油乳剂。需要的蛋白质也可以用于制备其它物质例如畜牧业或医药用途。本发明提供的另一个例子是激素类物质如促卵泡激素(FSH，α-单位，和/或，β单位，和其复合物和片段)，其可以例如用在培养物中的表达α-单位的一个杆状病毒和/或另一个表达β单位的杆状病毒感染昆虫细胞培养物生产。本发明的方法也可以用于大规模和低耗价生产作为生物杀虫剂的(重组)杆状病毒。优选的实施方案是在生物杀虫剂的生产中利用用于外源基因表达的p10启动子的重组病毒，因为缺乏多角体基因的杆状病毒通常感染昆虫比较差。在本发明的方法中表达其它重组蛋白质的其它重组杆状病毒的培养，和掺入杀虫，医药，治疗和/或抗原物质或产品的这样的病毒蛋白质的生产和/或用途是本领域技术人员熟悉的。本发明进一步在实验部分加以解释，但不是限制本发明。实验部分黄病毒科的瘟病毒属通常包括典型性猪瘟病毒(CSFV)，边界病病毒(BDV)，和牛病毒性腹泻病毒(BVDV)。已经测序了几个BVDV和CSFV毒株的基因组(Renard等人，1987，欧洲专利申请0208672；Collett等人，1988，病毒学165，191-199；Deng和Brock，1992，病毒学1991，865-679；Meyers等人，1989，病毒学171，555-567；Moormann等人，1990，病毒学177，184-188)。对于BDV，仅能获得不完整基因组核苷酸序列。瘟病毒基因组是含有一个大的开放读框的约12.5kb的正链RNA分子。开放读框翻译成约4,000个氨基酸的假设聚蛋白，其经过病毒和细胞编码的蛋白酶加工。开放读框侧接两个可能参与基因组复制的高度保守的小的非翻译区。5’非编码区也在翻译的起始时起作用。细胞和病毒蛋白酶翻译同时和翻译后加工的聚蛋白含有所有病毒结构和非结构蛋白质(参见，C.M.Rice在病毒学领域，第三版，1996黄病毒科病毒和它们的复制30章931-959)。病毒结构蛋白质包膜蛋白Erns，E1和E2定位于聚蛋白的N末端部分。非结构蛋白质丝氨酸蛋白酶NS3和RNA复制酶复合物NS5A和NS5B定位于聚蛋白的C末端部分。用瘟病毒感染的动物产生了抗Erns，E2和NS3的抗体。但是，只有抗E2的抗体是强病毒中和性的。而抗Erns和NS3的那些抗体只有低病毒中和能力或完全没有该能力。这一发现促使我们开始评估E2作为CSF亚单位标记疫苗的适用性。在这里，Erns和/或NS3可以伴随E2标记疫苗用于开发诊断测试。目前，BDV和BVDV已经从各种物种中分离，而CSFV似乎限于猪。瘟病毒在结构上和抗原性上是紧密相关的。包膜糖蛋白E2是最具免疫原性和最可变的瘟病毒蛋白质。我们克隆了许多不同的瘟病毒毒株的E2基因，包括那些来自鹿和长颈鹿的。这些E2基因可被瞬时表达，用单克隆抗体鉴定，测序和比较，P.A.vanRijn等人，1997，病毒学，237337-348。根据这些数据，我们可以在瘟病毒属中勾勒出6个主群。4个病毒群对应于确定的基因型，而其它两个病毒群在瘟病毒属中是新的基因型。一个病毒群包括从猪分离的CSFV毒株，第二个病毒群包括BDV毒株Moredun,L83和X818，已经从羊中分离，另外含有来自猪的毒株F。第三个组含有来自羊的毒株BD78，来自猪的毒株5250和来自牛的毒株178003。在E2的基础上，这些病毒非常相似于与严重的急性牛病毒性腹泻的发作有关的BVDV毒株，所以称为2型BVDV。第4个组包括主要起源于牛的BVDV毒株。这一BVDV组可以分为两个亚型或亚组BVDV-1a和1bBVDV-1a含有来自美国的病毒，如NADL和Oregon，和其它，如来自欧洲的150022和1138。亚组BVDV-lb含有毒株Osloss和几个荷兰分离物。第5和第6“病毒群”可被提议为两个新基因型，分别含有毒株Deer和Giraffe。用于兽医业的标记疫苗的开发已经导致产生了控制和消灭具有经济重要性的病毒性家畜疾病的新概念。标记疫苗的利用允许在血清学上区别接种和野外病毒感染的动物，从而控制消除病毒。例如，在欧盟的大多数成员国中，抗假狂犬病(AD)的接种只允许用gE阴性的疫苗。利用AD野外病毒感染的动物确实产生了抗gE的抗体。将检测这些抗体的ELISA测试用于检测感染动物随后可以从畜群中除去，和用于检测接种行动过程中畜群中野外病毒感染的情况。最终的目的是达到畜群中无野外病毒的状态。然后，接种可以停止，并且应该进行一个保护这一状态的血清学监督程序。所以，用标记疫苗接种将降低消除感染的行动成本，因为它依赖于挑出感染的畜群，而不只是感染的个别动物，显然，如果结果是在足够大规模中和在足够长的时期中进行，甚至可以是比挑出感染畜群更快的达到猪群体无野外病毒状态的方法。在现在和将来，当地方性疾病象AD已经消除时，仍然可以利用标记疫苗，例如控制已经从群体中消除，并且不再常规接种的疾病的发作。在动物群体的血清是未经感染的情况中，容易传染的疾病可能爆发性传播，引起巨大的经济损失。许多例子已经表明杆状病毒系统支持异源蛋白质的高水平表达。高水平表达是高度有利的，因为当应用大量的抗原时，死的亚单位疫苗通常只能引发保护性免疫应答。在我们的第一途径中，构建的两个重组杆状病毒，一个表达了具有TMR的E2(BacE2[+])，另一个表达了没有TMR的E2(BacE2[-])(Hulst等人，1993，病毒学杂志675435-5442)。请注意在这一公开物，和其它可比较的公开物中，E2仍然命名为它的老名字E1。没有TMR的E2分泌到细胞培养基中，而具有TMR的E2没有。另外，两个E2同样与代表E2上四个抗原区的单克隆抗体反应。这表明细胞结合的和分泌的E2的抗原特性是相同的，并且因为分泌的E2比细胞结合的E2产生的水平更高(高10倍)，决定在猪的接种实验中测试分泌的免疫亲和纯化E2。在双倍的水油佐剂中制备含有20微克E2/毫升和100微克E2/毫升的两个疫苗配方。在四个2个SPF猪的小组中，两个组IM接种了20微克E2，两个组接种了100微克的E2。在28天后，接种20微克E2的一组和接种100微克E2的一组再接种同样剂量的E2。在42天时，用病毒CSFV毒株Brescia鼻内攻击所有的动物。不考虑应用的疫苗剂量，所有的接种的猪在第28天已产生中和抗体，虽然水平不同。到第42天，攻击的时候，不管是否加强的接种，所有动物中抗体效价都上升到高水平。所以，甚至只用剂量20微克的免疫亲和纯化的E2接种一次的动物也已经完全有抗CSF的保护性并不令人吃惊(Hulst等人，1993病毒学杂志，675435-5442)。因为用瘟病毒感染的动物总是产生抗第二种病毒包膜糖蛋白Erns的抗体(Kwang等人，1992，畜牧业微生物学，32281-292)，，它是最适用于结合E2进行诊断测试开发的病毒蛋白质。但是，也有一个报道提出Erns可能是保护猪不受CSF的感染的重要抗原(Konig等人，1995，病毒学杂志，696479-6486)。在这些研究中，利用活病毒疫苗载体表达Erns。动物同时通过三个不同的途径(皮内，静脉内和腹膜内)用每个注射位点5×107pFU的疫苗Erns重组病毒接种，在接种后5个星期用致死量的CSFV毒株AlfortIN攻击中生存，没有显示任何CSF信号。为了评估Erns作为死亚单位疫苗的适用性，在猪中测试了杆状病毒表达的Brescia毒株Erns(符合Hulst等人，1994，病毒学，200558-565)。分别用5.0和20微克Erns一次IM接种6个SPF猪的组(Moormann等人，1996，第14次国际猪畜牧业协会大会进程，25-29，Bologna，意大利)。将4个非接种SPF猪的第三个组作为对照。在接种后3个星期，用105TCID50的毒株BehringIM攻击所有的动物。在攻击后5天，用最低剂量的Erns接种所有的动物，产生了严重的CSF信号。在攻击后14天内，2个动物死了，3个垂死时杀死了，1个似乎恢复了。这5个动物，包括恢复的一个是IFT阳性的。在攻击后，用最高剂量的Erns接种的所有动物显示了或多或少的严重的CSF信号，和高热几天，但在14天内，6个中的4个动物恢复了，1个动物死了，另一个在垂死时杀死了。在4个生存的动物中，只有一个显示了IFT阳性。相反，所有对照动物在攻击后5天内显示了严重的CSF信号，在攻击后14天死亡，并且是IFT阳性(Moormann等人，1996，第14次国际猪畜牧业协会大会进程，25-29，Bologna，意大利)。我们的结论是杆状病毒表达的Erns可以保护猪不受异源CSFV攻击，尽管效率比杆状病毒表达的E2低许多。促卵泡激素(FSH)属于糖蛋白激素家族，它是在垂体中产生的(促黄体素，LH；促甲状腺素，TSH)或在胎盘中产生的(人绒膜促性腺激素，hCG；怀孕母马血清促性腺激素，PMSG)。在一个物种中，这些激素的每一个都含有常见的α亚单位，它非共价地结合于激素特异性β亚单位。单独给药或结合LH给药的纯化FSH广泛地用于在许多物种包括牛中诱导超排卵应答。在牛中的问题是从垂体难于将牛FSH大量纯化。由于这一原因，牛(oFSH)，猪(pFSH)或马(eFSH，PMSG)来源的FSH通常用于牛的超排卵处理。但是，由于可能存在可以引起牛海绵体脑病(BSW)的朊状蛋白质，可能是人的克罗伊茨费尔特一雅各布综合症疾病(CJD)的变异体，脑组织起源的物质的应用不是没有危险的。另外，应用胎盘起源的物质的缺点是生物半衰期非常长，需要注射特异的抗体中和。最后，所有目前使用的FSH制剂都含有一些被认为至少部分导致在超排卵结果中观察到大的变化的LH活性。由于这些原因，似乎牛的超排卵处理可以得益于应用非哺乳动物细胞如昆虫细胞(杆状病毒表达系统)生产的重组牛FSH(rbFSH)。材料和方法1．SF21细胞的生产细胞培养物(PCS)的制备的实施例将含有1.5毫升SF21工作细胞种子(WCS)(总共细胞数为4-10×106个细胞/毫升)的冷冻小瓶在20-30℃的温度融化。在融化后，将小瓶中的物质转移到含有8.5毫1升的无血清培养基SF900Ⅱ的15毫升Falcon试管中，悬浮。在悬浮后，在100-200×g离心Falcon试管中的物质10分钟沉淀细胞。丢弃培养基，在4-6毫升的SF900Ⅱ中悬浮沉淀。将悬浮的细胞转移到100毫升的含有l0毫升SF900Ⅱ的摇瓶中。将摇瓶置于40-80rpm的有轨道的振摇平台上，在26-30℃培养细胞3-7天。在培养过程中取样进行细胞生长和细胞存活率的检测。当细胞密度是1.0-6.5×106个细胞/毫升时，将细胞转移到两个各含有100毫升SF900Ⅱ的500毫升摇瓶中。这相当于细胞稀释10倍。再次，将摇瓶放置于40-80rpm的有轨振摇平台上，在26-30℃下培养细胞3-7天。通过过程中对照不断检测细胞生长和细胞存活率。这时，当细胞密度是1.0-6.5×106个细胞/毫升时，将细胞第二次转移到6-11个各含有100毫升SF900Ⅱ的500毫升摇瓶中。丢弃过量的细胞物质。同样在这种情况下，细胞稀释了10倍。就瓶放置于40-80rpm摇动的有轨摇瓶平台上，在26-30℃培养细胞3-7天。通过过程中对照不断地检测细胞的生长和细胞存活率。当细胞密度是1.0-6.5×106个细胞/毫升时，将含有细胞的500或1000毫升悬浮液转移到各约含有4.5升或9升SF900Ⅱ的5升或10升的发酵罐中。这也相当于稀释细胞10倍。在26-30℃下培养细胞3-7天。不断地搅拌(50-100rpm)悬浮液。通过过程中对照不断检测细胞生长和细胞存活率。当细胞的密度达到1.0-6.5×106个细胞/毫升时，将5升发酵罐中的物质转移到约含有40升SF900Ⅱ的50升的发酵罐中。在26-30℃下培养细胞直到密度达到±5-15×105个细胞/毫升。不断搅拌悬浮液(50-100rpm)。取样作为过程中对照。2．生产E2抗原的实施例在上面提到的细胞悬浮液中，加入1-2毫升含有±107个TCID50/毫升的工作种子病毒(WVS)(BacE2[-])。在28℃温育悬浮液3-8天直到70-100％的细胞显示了致细胞病变效应。在温育过程中，取样作为过程中对照。然后，通过微过滤除去细胞澄清悬浮液。收集得到的过滤物(即，抗原溶液)，储藏在≤-20℃下直到失活步骤开始(3.3)。取样作为过程中对照。为了确定抗的含量，例如在酶联免疫测试中测试样品，确定抗原量，或在蛋白质测试中确定每体积水蛋白质的真正重量，或结合这些方法测试。3．病毒失活的实施例加入2-溴乙基-溴化铵(BEA)直到浓度为10毫摩尔/升将病毒失活。调节pH到8.2-8.7，和34-37℃的温度，BEA即转变成2-溴乙基一溴化亚胺(BEI)，这是失活病毒的活性成分。取样作过程中对照检测病毒的杀死率。失活需要24-72小时。在失活后，每10000升中存在的感染颗粒可能＜1。在病毒失活后，加入硫代硫酸钠直到浓度为5-25毫摩尔/升并且调节pH到5.7-6.3中和BEI。取样作过程中对照。将失活的和中和的抗原溶液转移到1和/或5升的袋中，储藏在≤-20℃下。4．配方的实施例在22-28℃下融化冷冻的抗原溶液并且用SF900Ⅱ或PBS稀释抗原溶液到50微克/毫升。加入作为抗微生物试剂的乙基汞硫代水杨酸钠到100微克/毫升。取样作过程中对照。将这一溶液(即，第一水相)储藏在2-8℃下不超过3天。同时，以9∶1的比例混合Marcol52和Montanide80制各了油相。也将该溶液贮存在2-8℃，不超过3天。用0.22微米的无菌过滤器无菌过滤油相。取样作过程中对照。最后，以98∶2的比例混合磷酸缓冲盐(PBS)或SF900Ⅱ培养基和Montanox80制备第二个水相，加入乙基汞硫代水杨酸钠直到最后浓度为100微克/毫升。将这一溶液储藏在2-8℃直到使用(不超过3天)。在使用之前，将第一水相无菌过滤。取样作过程中对照。以1∶1.1混合第一水相和油相制备第一乳化剂。将这一乳化剂储藏在2-8℃下不超过3天。取样作过程中对照。以2.1∶1的比例混合第一乳化剂和第二水相制备双倍的油包水乳化剂。将双倍乳化剂在2-8℃下储藏在隔离储藏室中，直到填充在小瓶中。取样作过程中对照。5．填充和加盖的实施例在清洁室A级区域中将双倍乳化溶液无菌地填充。填充体积是在50，100或250毫升的小瓶中分别51，102或255毫升。通过检测填充容器的重量不断检测填充的体积。在填充后，马上终止填充小瓶，并加盖。最后，将小瓶在2-8下储藏在隔离室中，然后开始质量控制。50升发酵罐规模的E2亚单位疫苗的流程实施例制备SF21生产细胞培养物(PCS)E2抗原的生产填充和加盖6．E2稳定性实验的实施例目的为了研究在其它均为正常条件下，延长培养后，在感染的细胞培养物(MOI*0.0001)中E2蛋白南质的稳定性。由于在细胞培养物中杆状病毒的感染过程的溶菌特性，在感染循环的后期，蛋白酶可能释放到培养基中。是否这导致了E2蛋白质的降解，和因此导致体积E2蛋白质水平下降是本实验的主题。材料和方法提到培养基或SF900Ⅱ，即指含有0.2％PluronicF68的SF900Ⅱ培养基。融化含有SF21细胞的小瓶，在100毫升摇瓶中，在10毫升SF900Ⅱ中培养，摇瓶放置于有轨摇床平台上的温育器中。当细胞培养物达到需要的细胞密度时，在500毫升的摇瓶中稀释细胞10倍到100毫升。当细胞培养物达到需要的细胞密度时，再次稀释10倍到100毫升。丢弃过量的细胞物质。当细胞培养物达到需要的细胞密度时，将它稀释10倍后加入三个500毫升的摇瓶，每瓶100毫升。过量的物质丢弃。将摇瓶放置于IKS有轨摇床平台，在28℃的温育器中，以70rpm搅拌。在细胞密度为每毫升0.612×105个细胞时，在摇瓶2号和3号中加入63微升稀释100倍的病毒悬浮液。摇瓶1号保持未感染空白状态。培养物感染的MOI是(0.063×0.01×0.8×107)/(100×0.612×105)=0.00008利用的稀释100倍的病毒悬浮液是如下制备的。经过QC融化MSV小瓶253，并且在补充了10％FBS(批号，97QC0139)TC100培养基中稀释100倍，并以0.5毫升每部分储藏在-70℃。定期地，从感染的摇瓶培养物和未感染的摇瓶中取样确定细胞培养物的状况。如下进行取样。在1000rpm，IECCentraGP8R中离心15毫升Falcon试管中的1.1毫升细胞物质6分钟。然后，通过GelmanAcrodisc针筒过滤器在0.45微米过滤上清液，以去掉可能仍然存在的细胞。在-70℃储藏Nalgene低温小瓶中的0.4毫升样品，以备后面分析。结果和结论正如在图1的数据和图2的图中可以看到的，在摇瓶2和3号中的细胞生长曲线或多或少有些相似。在191hpi后，未再计数细胞数，因为最终所有的细胞死了和感染了。摇瓶2的139hpi的样品不在图中。这一样品的细胞数比之前和之后的样品高得多。这表明可能在取样前后发生了一些沉淀，导致混合了锥虫蓝溶液的不准确的样品。这一推测被存活率和感染百分数都在预期的结果中的事实所证实。这意味着感染培养物本身没有发生任何不寻常的事。这一不精确的取样几乎对样品中的E2浓度没有影响，因为E2存在于培养基中而不是细胞内。在139hpi左右，摇瓶2号中的E2浓度很快上升到最大值大于190微克/毫升，然后慢慢在215hpi下降到170微克/毫升。然后，E2含量下降更快，到306.5hpi时的最后水平小于100微克/毫升。摇瓶3号中的情况或多或少有些相似。也在139hpi左右E2蛋白质的含量达到最大，但稍微比摇瓶2号中高。在浓度更快速下降到215hpi时的141微克/毫升之前，E2浓度慢慢从139hpi时的233微克/毫升下降到191hpi时的212微克/毫升。摇瓶2号和摇瓶3号显示出良好的相关性。在t=44.25hpi时，同样对摇瓶1号空白进行计数。活细胞密度是2.435×106个细胞/毫升，死细胞的密度是0.190×106个细胞/毫升，总的细胞密度是2.625×106个细胞/毫升，存活率为92.8％。活细胞密度明显高于摇瓶2号和摇瓶3号，表明感染已经减慢了细胞生长。随后这一空白培养物继续继代培养。下面的表表示了在摇瓶2号的选择样品中进行的免疫印迹测试的结果。<tablesid="table1"num="001"><table>样品(hpi)V3降解的V3V8降解的V8044115139164.5191288306.5--++++++-----+++---+++++------+-</table></tables>‘-’表示不能检测到，’+’表示能检测到在这一表中可以看到，在0和44hpi的样品中，表位V3和V8仍然不能检测到。这与E2-ELISA的结果对应良好。在115hpi以后的样品中，检测到了完整的E2，因为在E2带检测到了V3和V8。从191hpi以后，在凝胶上可见一较小的蛋白质的第二个带。在两个不同的印迹中V3和V8的免疫印迹表明降解产物含有V3表位，仅没有V8表位。在印迹的任何其它地方都没有检测到V8，仅在完整的E2带中检测到了。这一测试清楚地表明E2蛋白质的降解是由于存在蛋白酶而发生的。事实上，这可能是大体积的E2抗原溶液的微过滤过程中观察到的E2蛋白质含量的下降的原因。在这以后的过程中，在病毒失活开始之前除去细胞。所以，最可能的情况是，蛋白酶的存在引起了E2蛋白质的降解。7．MOI实验的实施例目的目的是为了研究MOI(感染复数，每个细胞的病毒数)，最大细胞密度和E2的体积含量之间的关系。在一方面，在培养基耗尽之前整个细胞群体的感染必需完成，但另一方面，整个群体低细胞感染密度导致亚最佳蛋白质产量。物质和材料提到培养基，即指SF900Ⅱ培养基。在1000毫升的瓶中的444毫升SF900Ⅱ中稀释76毫升细胞悬浮液并且轻轻混合。在即将稀释培养物之前活细胞密度是3.41×106个细胞/毫升，死细胞密度是0.190×106，存活率是94.8％。稀释后细胞的密度是±5×105个细胞/毫升。另外，加入的庆大霉素的最后浓度是10微克/毫升。将细胞悬浮液在250毫升的摇瓶中分成9个50毫升，过量的细胞丢弃。将第一个50毫升转移到摇瓶1，最后的50毫升转移到摇瓶5。1号和6号使用时MOI=0(空白)，2号和7号使用时MOI=0.000001，3号和8号使用时MOI=0.00001，4号和9号使用时MOI=0.0001，5号使用时MOI=0.001。如下制备病毒原液。稀释的范围是一个小瓶含有100倍稀释的病毒悬浮液(小瓶含有0.8×105个噬斑形成单位(pfu)每毫升)。这一稀释100倍的病毒原液制备如下。将总的种子病毒融化，在补充了10％的FBS的TC100培养基中稀释100倍，以每份0.5毫升储藏在-70℃。用3.6毫升SF900Ⅱ培养基将0.4毫升稀释100倍的病毒溶液稀释，得到稀释倍数是10-1。将1毫升该溶液加入9毫升培养基，稀释倍数是10-2，将1毫升该溶液加入9毫升培养基，稀释倍数时10-3，将1毫升该溶液稀释10倍，稀释倍数是10-4。将3.1毫升培养基加入含有细胞培养物的摇瓶1号和6号(空白)。将10-2，10-3，10-4稀释的3.1毫升病毒稀释液分别加入摇瓶4和9，3和8，2和7。这些摇瓶中已经含有细胞培养物。在3.1毫升稀释10-2的病毒稀释液中，存在3.1×10-2×0.8×105=2.5×103个噬斑形成单位。在含有50毫升细胞悬浮液的摇瓶中，存在0.5×106×50=2.5×107个细胞。所以，在50毫升细胞悬浮液中加入3.1毫升稀释10-2的病毒稀释液得到的MOI是2.5×103/2.5×107=0.0001。对其它病毒稀释液进行可比的计算，对加入50毫升细胞培养物的10-3和10-4稀释倍数的病毒稀释液得到的MOI数分别是0.00001和0.000001。最后在摇瓶5号加入2.85毫升10-1稀释倍数的稀释液，得到的MOI是0.00092而不是0.001。在加入病毒后马上从每个摇瓶中取3.1毫升样品。样品中的细胞放入15毫升的Falcon试管在IECCentraGP8R离心机中离心(10分钟1000rpm)。为了防止病毒从高MOI感染的细胞悬浮液转移到低MOI感染的细胞悬浮液，取样品是从低MOI到高MOI。在离心后，0.45微米过滤样品(除去可能仍然存在于上清液中的细胞)，分在3个Nalgene冷冻小瓶中，储藏在-70℃下，以备以后测试。在病毒加入后马上确定摇瓶1和摇瓶5的细胞密度。这些是第一个和最后接种细胞的摇瓶。为细胞密度几乎相同，所以假定所有摇瓶中的细胞密度等于两个细胞计数的平均值。起初的活细胞密度是0.423×106个细胞/毫升，而0.012×106个细胞是死的，存活率为97.3％。将所有摇瓶放置于Labotech300有轨摇床平台上，在28℃的室中以75rpm搅拌。在23，95，125，144，173和194hpi(感染后的小时)时，在所有瓶中取样。确定细胞密度的样品的体积是3.3毫升，其中的0.2毫升用于确定细胞密度。留下的3.1毫升如上t=0的样品同样操作。没有计数的培养物的样品的体积是3.1毫升。确定194hpi时的细胞密度，终止实验。将留下的细胞悬浮液(约30毫升)以每份1毫升储藏在3个Nalgene冷冻小瓶中，每份约6毫升的储藏在4个15毫升的Falcon管中。结果和结论结果显示在MOI和最佳细胞密度之间，更重要的是，在MOI和E2蛋白质产量之间存在良好的相关性。这可以在以MOI0.001感染培养物中E2蛋白质的最大体积产量设定为100％的图中看到。图中显示E2蛋白质的体积产量随着MOI的下降而提高。当MOI达到0.0001时，在可获得的细胞密度达到最大之前细胞被感染了。利用MOI0.00001或更小产生的结果是在培养物的感染完成之前培养基耗尽了，导致蛋白质的产量亚最佳。所以，可以得出结论，假如在感染过程和E2生产完成之前培养基没有耗尽，利用的MOI越低，E2蛋白质产量越高。表达bFSHα/或bFSHβ的重组杆状病毒构建了转移载体pDW-α-9.1和pDW-β-3.1。利用pDW-α-9.1或pDW-β-3.1和从细胞外病毒颗粒中分离的野生型(wt)AcNPV/MO21DNA共转染SF21细胞(PCT申请WO96/25696)。分离表达β半乳糖苷酶的多角体阳性噬斑，通过ELISA分析培养基中bFSHα或bFSHβ的表达。将一个噬斑纯化的bFSHα病毒(AcNPVα3.4)和一个噬斑纯化的bFSHβ病毒(AcNPVβ1.4)用于制备TCID50分别为107和108的病毒原液。根据如上所述的方法生产FSH，结果生产水平在17到33微克/毫升之间。PD95实验测定在一次接种后能够保护95％(PD95)的接种的猪抵抗100LD50的强毒CSFV毒株Brescia的攻击需要的E2的剂量(微克)。动物将26个无特异致病原(SPF)的，6-7星期大的猪任意分成三个每组8个猪的组(A-C)和一个2个猪的组(D)。动物关在ID-DLO的大容量设备的猪圈B18，B19，B20和B21中。让动物驯化3天。每天在含有完全食物小丸(HopeFarms)的水槽中喂动物一次，并且可以任意从胶管中喝水。接种和攻击如上制备三个双倍油包水佐剂疫苗，每个具有的不同E2抗原的浓度是，32.0，8.0和2.0微克/剂。在左耳后2厘米肌肉内接种猪一次，每个猪接受一剂(A2微克E2，B8微克E2，C32微克E2，D0微克E2)。对照组D只接种DOE佐剂，岗哨猪完全没有接种。接种后三个星期时，除了岗哨猪，每个动物接受100个50％致死剂量(=100VaLD50)的CSFV毒株Brescia456610的鼻内攻击。即将攻击之前，将岗哨猪从组中分隔出来，24小时后返回。接种物的病毒含量是从返回猪圈后取的样品的效价确定的。临床观察动物护理人员每天检测这些猪，记录不正常的发现，如果需要，报告高级畜牧医生。在喂食时间和清洗猪圈之前和期间，每个组每天至少观察15分钟。要注意组或个别动物减少进食的现象。在接种后的9天和攻击后的20天时，记录体温(直肠)。在攻击后分析血液在攻击后0，2，4，7，10和14天时收集EDTA血样，检测白细胞和凝血细胞数的变化。在血液中白细胞数下降(白细胞减少)和凝血细胞数下降(凝血细胞减少)是CSF的典型信号之一。在普通的猪中白细胞和凝血细胞的正常细胞数的范围是11-23×109个/升，和320-720×109个/升。对于SPF猪，同样的值偏低，为6-12×109个/升和300-700×109个/升。在各个猪中，上面提到的两个范围是有变化的。血液细胞分析是利用MedonicCA570计数器进行的。白细胞减少和凝血细胞减少定义为细胞/血小板数比上面提到的最小数低得很多优选地时间一天以上，。病毒传播/分泌和病毒检测岗哨猪的体温，白细胞和凝血细胞数和血清转变是用于检测病毒从接种动物转移到岗哨动物中的参数。在mortem组织后，从下面的器官扁桃体，脾，肾和回肠收集组织样品，并且通过直接免疫荧光技术测试了病毒抗原的存在。固定来自这些组织样品的低温恒温切片(4微米厚，每个器官两个)，并且用多克隆猪抗瘟病毒FITC缀合的血清保温。在洗涤后，在荧光显微镜下看切片。将结果表示为阳性(=有荧光)或阴性(=没有荧光)。血清学应答在接种后0，2和3星期和死亡时，收集所有猪的血清。将样品储藏在-20℃，在病毒中和测试(VNT)和Ceditest，检测CSF特异抗体的ELISA中进行测试。在微滴板系统中确定了血清中CSFV的中和抗体的效价。将血清的二倍系列稀释液与等体积的含有30-300TCID50的CSFV(毒株Brescia)悬浮液混合。在37℃的CO2温育器中温育一个小时后，在每个孔中加入约25.000PK15细胞。在4天后，如上处理微滴平板，并在显微镜下观察。将CSFV中和效价表示为中和所有病毒的最高稀释度的倒数。统计学评估95％的保护剂量是根据CSFV中和Ab效价≥50代表完全保护者一假设确定的。结果这一部分的动物编号参见表1或2。在接种后的临床观察接种对猪没有任何不利的影响，进食和体温都仍然正常。在接种后3天，观察到在组A和C中，有中度的腹泻，厌食和压抑。在整个时期中，组A的一个猪(448号)一般性地呕吐，并且生长落后。组B的438号猪呕吐一次。434号猪(组C，岗哨猪)的体温稍微升高，该动物遭受了右后腿上的金属薄片。在接种和攻击之间的时期进食使猪的体重每天每组增加了3到6公斤。在攻击后的临床观察在攻击后3天(59号)和6天(60号)，未接种的对照猪产生了CSF症状在攻击后10天，可以观察到发烧，身体缩成一团，哆索，没有食欲和压抑直到死亡。另外，动物发生青紫，后部轻瘫，腹泻和严重呕吐。濒死时杀死这两个动物。所有接种2微克E2(组A)的猪在攻击后2-3天产生了疾病症状，主要包括发烧，缩成一团，压抑和厌食。发烧持续了2-10天，最高体温(Tmax)在40.7-42.2C之间变化。猪443-446，在后面的第7天，不再发烧，进食增加到攻击之前的量。但猪448号在第9天死亡，猪447发生急性CSF(抽搐，后部轻瘫)，在同一天濒死时杀死。两个岗哨猪仍然正常，直到攻击后7-9天，在此之后，它们发生了急性CSF，当第20天濒死时杀死。在组B和组C的动物中，因为E2抗原的有效负载增加了，疾病的临床症状和持续时间更加适度。在组B中，发烧(435-439)持续到第27天，最大体温在40.2和41.7℃之间。猪编号436能抵抗攻击，临床症状非常微弱。在18天之后，一个猪(440号)死于急性CSF，濒死时杀死。组B中留下的5个猪恢复了。两个岗哨猪仍然正常，直到攻击后11-12天时，之后，发生了急性CSF，在20天时杀死。在组C中，在第4-6天，6个猪中有2个(430,431号)观察到中度的发烧，最高体温在40.5-41.2℃之间变化。没有观察到临床症状除了在攻击后第6天有轻微的压抑。在攻击前，猪430号有呕吐。两个岗哨猪仍然正常直到实验结束。在攻击后的血液分析在组A中，只有一个猪(450号)，岗哨猪发生了明显的白细胞减少和凝血细胞减少。猪445号和446号在攻击后7和10天发生了凝血细胞减少，猪449在攻击后10和14天发生了凝血细胞减少。组B的一个猪(440号)发生了白细胞减少和凝血细胞减少，其它仍然正常。两个岗哨猪在14天时表现出发生凝血细胞减少的信号。在组C中，包括岗哨猪中没有检测到白细胞减少和凝血细胞减少。两个对照动物(59和60号)在第7天后发生凝血细胞减少。在攻击后检测病毒传播和病毒抗原在从稳定状态中恢复后，接种物的回滴得到的病毒的效价是2.55TCID50/毫升。在组A和组B的对照和岗哨猪的所有选择的组织样品中检测到CSFV病毒抗原(表1)。在组A和组B中，6个接种动物中有一个是阳性。在包括岗哨猪的组C中，没有一个是阳性。血清学应答CSFV的血清转变定义为在VNT中效价≥25。为了确定在VNT中利用的Brescia病毒的量，回滴的结果是41TCID50/毫升。在实验中没有对照(D)和岗哨动物发生血清转变(表2)。在3个星期后，组A的6个动物中有2个发生了血清转变。但在攻击后，6个动物中的4个进行加强注射。组B和组C在接种后的21天发生了血清转变。在攻击后所有动物都加强免疫。后面的发现表明在动物中成功地复制了攻击病毒。结论每个动物的PD95剂量确定为给予32微克2毫升DOE佐剂中的E2一次。在这一剂量下，在高毒性的CSFV毒株的攻击后，疾病的临床症状仍然最小，没有发生病毒传播到接触的动物。概括地说，分别用32(A)，8(B)，2(C)和0微克(D)2毫升佐剂(DOE)中的Ed经过肌肉内途径接种4组每组6个猪(A-D)。在每个组(A-C)中保留2个非接种猪用于检测引起感染(岗哨猪)的病毒分泌。在3个星期后，用100LD50的高毒性CSFV毒株Brescia，经过鼻内途径攻击这些动物。为了测定该E2亚单位疫苗的效率，测量临床的，病毒学的和血清学的参数。如预期的，在组C中的动物能比其它组的动物更好地抵抗攻击。在接种最高剂量的E2(32微克)的动物的组织样品中没有检测到病毒抗原，在该组中没有疾病。假设给出完全保护(没有传播病毒)的NPLA效价≥50(在接种后21天)，计算PD95的剂量。结果时PD95的剂量是32微克/动物。为了进一步测定在接种后2和3星期时抵抗100LD50毒性的CSFV攻击的保护水平，用32微克E2，经过肌肉内途径接种2组每组6个猪(A-B)。在每个组(A-B)中保留两个非接种猪用于检测引起接触感染的接种猪的病毒分泌。在2星期(A)和3星期(B)后，用100LD50的高毒性CSFV毒株Brescia，经过鼻内途径攻击接种和对照动物。为了在接种后2和3星期测定E2亚单位疫苗的效率，测量了临床，病毒学，以及血清学参数。正如预期的，组B抵抗攻击的临床症状比组A少。只在组A中发生了病毒传播到岗哨猪，在两个组的所有动物的白细胞部分，检测到了病毒。只有组B的一个动物在接种后14天发生血清转变(414号)。同一组中，一个动物在21天后没有血清转变，但得到了保护，发烧只有2天，在攻击后11天时血清转变。只有对照和一个岗哨猪(组A)发生了白细胞减少和凝血细胞减少。在组A和B的动物的任何一个组织样品中都没有检测到病毒抗原。结论是，在单剂量接种后的2和3星期时，所有动物都能够抵抗攻击。为了进一步测定在接种后3和6个月时，抵抗100LD50毒性的CSFV的攻击的保护水平，用32微克E2，经过肌肉内途径接种2组每组6个猪(A-B)。在每个组(A-B)中保留了2个非接种猪，用于检测接种猪引起接触感染的分泌病毒。在3个月(A)和6个月(B)后，用100LD50的高毒性CSFV毒株Brescia，经过鼻内途径攻击已经接种的动物和对照动物。为了在这一时期后，测定E2亚单位疫苗的效率，测量了临床的，病毒学的和血清学的参数。所有组A和B的动物抵抗攻击，其临床症状很少。只有对照发生了白细胞减少和凝血细胞减少。没有发生病毒转移到岗哨猪。在两个组中选择的任何一个白细胞部分都没有检测到病毒。只有组B的一个动物在接种后28天发生了血清转变(1983号)。在组A，B和岗哨动物的任何一个组织样品中都没有检测到病毒抗原。结论是，在单剂量接种后3和6个月时，所有动物都能够抵抗攻击，并且没有发生病毒转移。利用BVDV毒株4800，150022和178003产生实验性E2亚单位疫苗。在杆状病毒表达系统中表达这些毒株的E2基因(Hulst等人，1993，病毒学杂志，675435-5442)(P.A.vanRijn等人，1996，I)，病毒遗传学，772737-2745)。利用草地夜蛾细胞系SF21繁殖重组杆状病毒和生产E2蛋白质。在28℃，和无血清SF900培养基(GIBCOBRL)中生长SF21细胞。用重组杆状病毒，以感染复数每细胞5TCID50(50％培养物感染剂量)感染SF21细胞的铺满单层。在4-5天后，培养物显示80-90％的细胞致病效果。在1500×g下离心细胞10分钟，收集含有杆状病毒和E2的上清液，储藏在-20℃。为了失活病毒，根据标准方法，进行2-溴乙基-溴化亚胺(BEI)处理。简要地说，混合600微升的BEI和600微升的1MNaOH。在20℃下30分钟后，加入150毫升上清液，在20℃搅拌24小时。然后加入20毫升25％的硫代硫酸盐。上清液滴定SF21细胞的效价确定杆状病毒是否失活。实验性BVDV疫苗包括在双倍水油乳化剂中含有E2的上清液。油中含有90％的Marco152(Esso)和10％的Montanide80(Seppic)。水部分(PBS+)含有98％的磷酸缓冲盐水，2％的Montanox80(Seppic)和100ppm的乙基汞硫代水杨酸钠。上清液，油和PBS+利用的比例是10∶11∶10。首先，乳化上清液和油，然后加入PBS+，乳化。同样制备用野生型杆状病毒感染的SF21细胞的上清液的对照疫苗。在制备后的疫苗是无菌的。我们的由于表达的蛋白质的可比较性，在3个疫苗中的抗原量是相似的初步假设是不准确的。在抗原量上的不同可能是昆虫细胞中表达上的差异引起的。每剂量疫苗15002含有55微克E2且对2次接种(0和21天)的胎儿是有保护性的(Brusche等人，1997，出版中的疫苗)。疫苗4800和疫苗178003每剂量分别含有12微克和17微克的E2，对胎儿没有保护性。这一结果暗示在E2蛋白质的量和胎儿保护性之间有相关性。但是，E2糖蛋白的不同的免疫原性和攻击毒株不能穿过胎盘也可能是不同的攻击结果的原因。没有疫苗能够保护抵抗异源BVDV的攻击。这一研究的结果在进一步开发BVDV亚单位疫苗中是有前途的，因为我们已经看到用包膜糖蛋白E2接种可以实现保护胎儿。另外，它是一个标记疫苗，使得能区别接种动物和野外病毒毒株感染的动物。这在将来消除BVDV行动中是有优势的。讨论开发生产方法的目的是达到最佳生产插入杆状病毒的基因编码的异源蛋白质。杆状病毒表达载体系统(BEVS)对不同的重组蛋白质的生产是非常合适的，因为准确的蛋白质折叠和准确的翻译后加工产生了用于动物和人的生物活性蛋白质。杆状病毒含有2个非必需基因，它们是从非常有效的启动子p10和多角体启动子转录的。p10基因的缺失变异(vanOers等人，病毒遗传学杂志，74563-574；1993)表明该启动子在细胞培养中的病毒复制中不是必须的，但p10在细胞溶解中起作用，缺乏p10蛋白引起感染的细胞仍然完整，阻止了多角体从感染细胞中释放，从而减少了再感染率但不是感染力本身。基因产物(p10(或原纤蛋白)和多角体蛋白)是在感染期后期表达的。用需要的蛋白质基因替代这些基因在理论上可以使昆虫细胞培养物的总蛋白质产物的产量高达50％(在多角体蛋白启动子的情况中)，导致的表达水平在每升培养物中有1克以上的多角体蛋白(Maiorella等人，(1988)昆虫细胞培养物大规模生产重组蛋白质。生物/技术，6，1406-1410)。对于最佳的蛋白质生产，感染复数(MOI，每升病毒密度和每升细胞密度的比例)是关键的参数。低感染复数感染的明显的原因是病毒接种物尽可能小。如果感染时，50升的发酵罐中，细胞密度是2百万细胞/毫升，MOI是0.1，那么需要1×1010个病毒。这将需要1升左右的接种物。另外，制造这样的接种物需要特别的生产步骤。上面的培养的两个主要的缺点是培养基的利用效率低，和氧限制。由于氧在水状液体中的可溶性相当低，氧作为单层培养的细胞的底物是受限制的。决定静态培养物中的最大细胞密度的因子是可得表面。一旦表面覆盖了单层细胞，细胞的生长将停止。这样产生的细胞密度约1×106个细胞/毫升培养基。在悬浮培养物中，不存在氧限制，其它底物的可得性是细胞密度的限制因子。这一限制在细胞密度比氧限制更高时发生，所有细胞密度比静态培养物中更高。利用氧电极检测溶解的氧的浓度可以防止氧限制。一旦溶解氧的浓度降低到一定值时，氧就自动加入到悬浮液，可以通过喷气或通过发酵罐的上面的空间加入。适度地搅拌悬浮液保证了均一地培养，没有堆积起底物梯度，细胞也没有经受太高的剪切力。另外，搅拌使病毒有效的从感染细胞转移到非感染细胞，使病毒感染细胞的效率更高。由于，最初只有约0.1-0.3％的细胞感染，剩下的99.7-99.9％的细胞是允许生长和增倍的。在感染细胞中生产的病毒颗粒是在感染后12-20小时时释放的(Dee,K.U.和Shuler,M.L.1997，生物技术过程，13，14-24)。每个细胞释放的病毒颗粒数是100-200，这些细胞可以在新的循环中感染未感染的细胞。在产生足够的病毒颗粒之前，感染培养物中存在的所有细胞需要几个循环。目的是在培养基耗尽和所有代谢过程停止之前，完成最后的感染过程中的蛋白质生产。在细胞密度亚最佳时达到完全感染也是不需要的，因为然后培养基将不能有效地利用，导致异源蛋白质的体积产量较低。病毒感染的整个过程是可以肉眼检查的，因为多角体基因仍然存在。病毒感染可以观察到为密集的蛋白质颗粒积累在细胞核中。为了防止剪切破坏细胞，在培养基中加入了最后浓度为0.2％的PluronicF-68。另外，如果需要可以加入抗泡沫剂A防止过量的泡沫，泡沫也可以导致细胞死亡。50升的培养物中加入的抗泡沫剂A的总量平均是20毫升。感染细胞的最佳病毒密度是可以计算的。这一密度取决于细胞的生长速度，感染后新病毒颗粒释放的时间，每个感染细胞产生的新病毒颗粒的数目。说明本发明提供的方法的是瘟病毒E2蛋白质的生产。虽然已知这一蛋白质是潜在的抗原，但用E2(片段)生产疫苗或用于诊断测试并不总是成功的。尽管(当利用特殊的免疫原E2片段时)，PD50低至2微克，怎样以有市场吸引力的方法增加足够量的疫苗剂量中的足够的抗原量以便能够在大群体动物的每个动物的单次接种中达到保护性接种仍然是一个问题。这与CSFV接种关系密切。当应用CSFV接种时，通常是在已经发生CSFV爆发的区域的大行动的过程中进行的。这需要在相当短的时期快速接种大量的动物。在这样的大行动中，迫切需要快速达到适当的保护水平(保护抵抗野生型病毒感染的猪的数目)。为了达到保护，在第一次接种后等待几个星期进行第二次接种大大妨碍和延迟了疾病的控制。甚至当比较杆状病毒中表达的E2(片段)时，生产重组表达的E2蛋白质的各种方法之间也是存在差异的。在E2蛋白质生产培养的早期报道中，E2蛋白质(片段)的产量在20-90微克/毫升之间变化(Hulst等人，病毒学杂志，5435-5442，1993；Hulst和Mormann，细胞技术学20271-279，1996)，另外需要用单克隆抗体免疫亲和纯化以便获得单次接种必须的和相关的E2抗原量。另一个方法(利用EP0389034中叙述的E2片段)利用了从没有进一步没有亲和纯化的昆虫细胞上清液中收获的E2，获得了在满意的(保护)免疫应答之前注射两次的基于E2的疫苗。在起始物质例如制备疫苗的细胞培养物中的E2蛋白质(片段)的情况中，在众多问题中，这些问题涉及低浓度的相关抗原物质。在理论上，通过本领域已知的纯化和浓缩方法是可以进一步积累抗原量的，但是这不会导致具有商业吸引力的疫苗生产，而是引起每个剂量的价格高。利用本发明提供的方法进行生产，通常可以在50升的发酵罐中产生200-300微克/毫升CSFVE2蛋白质片段，在理论上每次培养足够接种100，000个动物了。在细胞密度为0.5到1.5×106个细胞/毫升时，利用1-10毫升约含有107TCID50/毫升的病毒接种物就能够感染细胞了。优选地，在50-80％的细胞显示CPE时收获培养物。这时大约在感染后100-150小时。早期的E2蛋白质生产培养物中，细胞是用MOI＞1(同步)感染的，产生的蛋白质产量比本发明提供的方法低3倍。在本发明提供的方法中，用在5升发酵罐中生长的5升细胞悬浮液或在10升发酵罐中生长的10所有10升细胞悬浮液接种50升的发酵罐。最初的细胞密度约为3×105个细胞/毫升。生长细胞并在悬浮液中加入病毒之前计算细胞密度。下面的步骤是从微过滤除去细胞和多角体开始的。将一个中空的纤维微过滤装置与发酵罐连接，将物质泵过孔大小为0.22微米的过滤装置。将滞留的流体再循环到发酵罐，透过的流体收集在100升的容器中。当完成过滤时，在100升的容器中失活仍然含有感染的杆状病毒但无细胞的抗原溶液失活。通常，在悬浮液中加入最后浓度为8-12毫摩尔/升的2-溴乙基-溴化胺(BEA)。加入2M的NaOH将pH提高到5.8到8.2-8.7。这一pH转变将BEA转化成BEI(2-溴乙基-溴化亚胺)。这是DNA失活剂。小心检测pH，调节到6-10，保持温度为34-39。在失活6小时后，将抗原溶液转移到第二个失活容器。这保证了所有容器中的物质与BEI接触，从而失活。在第一个容器中的液滴可能含有病毒而不含有BEI，但第二个容器不会。104-107pfu/毫升的杆状病毒的浓度下降到小于10-7pfu/毫升(每10升中不超过1个病毒颗粒)的值。这是用于基于能够感染寄主动物的病毒的病毒疫苗(如FMD)的同样标准。猪不是杆状病毒寄主。将失活的抗原物质储藏在不高于-20℃下直到它用于配制水一油一水乳剂。在接种后2星期到至少6星期中，含有32微克E2(剂量体积2毫升)的单个剂量是于得到抵抗典型猪热病的保护(＞PD95)。以如下方法设计生产过程，直接大规模生产，可以利用250升或更大的发酵罐。也可以直接大规模静态培养生产；只需要利用更多的组织培养瓶。但是，在50升发酵罐中通常获得的总蛋白质产量需要约7000个T175组织培养瓶。在发酵罐中可以检测细胞生长和感染并可以调节得更好，因为存在氧和pH电极。在组织培养瓶中，瓶与瓶之间可能存在差异，但不能定量。如静态培养生产检测失活并调节得准确的多。如果用本发明提供的方法生长细胞，在BEVS(在我们研究所)表达的其它蛋白质的体积生产水平也相当大地提高了。例如，利用10升的发酵罐，牛FSH的产量增加的3-4倍。在细胞密度为1.1×106个/毫升和每两个重组杆状病毒的MOI为0.003时，细胞共感染。在摇瓶中的悬浮培养物中，BVDV的不同的E2蛋白质和Erns蛋白质或BVDV和/或CSFV的产量增加了3倍。这一方法也可以用于其它重组蛋白质。表1．利用免疫荧光技术检测不同组织的冷冻切片的病毒抗原-=没有检测到荧光+=检测到荧光-=没有数据*=在实验20dpc结束时动物被杀死表2病毒中和测试的结果-=没有数据权利要求1．提高在昆虫细胞培养物中生产的重组蛋白质的产量的方法，包括选择编码所述蛋白质的重组杆状病毒，在培养容器的生长培养基中生长昆虫细胞，和用至少一个杆状病毒的接种物以感染复数小于0.01感染细胞。2．根据权利要求1的方法，包括在体积足够含有2升，更优选地10升，更优选地50升生长培养基，更优选地250升生长培养基的培养容器中生长细胞。3．根据权利要求1或2的方法，包括在细胞密度为1×105到5×106个细胞/毫升，更优选地5×105到1.5×106个细胞/毫升时感染细胞。4．根据权利要求1，2或3的方法，包括以≤0.005的感染复数感染细胞。5．根据权利要求4的方法，感染复数≤0.003。6．根据权利要求1-5任何一项所述的方法，包括选择在p10启动子控制下表达需要的蛋白质的重组杆状病毒。7．根据权利要求1-6任何一项所述的方法，包括优选地在培养容器如能够适当搅拌的发酵罐中悬浮生长昆虫细胞。8．根据权利要求1-7任何一项生产重组瘟病毒E2或Erns蛋白或其片段的方法。9．增加在昆虫细胞培养物中生产的重组瘟病毒E2或Erns蛋白或其片段的方法，特征是收获时生长培养基中的所述蛋白质(片段)的最后浓度至少100微克/毫升。10．根据权利要求9所述的方法，其中浓度大于120微克/毫升，或至少150微克/毫升，更优选地至少200微克/毫升。11．根据权利要求1-10任何一项所述的方法在生产抗原物质中的用途。12．根据权利要求11所述的用途，其中抗原物质是瘟病毒蛋白质(片段)，更优选地是典型性猪瘟病毒蛋白质(片段)。13．含有利用权利要求1-10任何一项方法获得的抗原物质的疫苗。14．含有重组瘟病毒E2或Erns蛋白或其片段的疫苗，特征是它不是免疫亲和纯化的，并且优选地在单剂量接种一次后赋予PD95水平的抵抗瘟病毒感染的保护性。15．根据权利要求14所述的疫苗，其中瘟病毒感染是典型性猪瘟感染。16．根据权利要求13-15的任何一项所述的疫苗，另外还含有佐剂，所述的佐剂优选地含有双倍油包水乳剂。17．生产在生长培养基中收获时浓度至少为15微克/毫升的重组促卵泡激素，α单位和/或β单位和其复合物和片段的方法。18．根据权利要求17所述的方法，其中浓度至少为20微克/毫升，更优选地至少25微克/毫升。19．根据权利要求17或18所述的方法，包括用在培养物中表达α单位的一个杆状病毒和表达β单位的另一个杆状病毒感染昆虫细胞培养物。20．根据权利要求1-7或17-19任何一项所述的方法在生产激素类物质中的用途。21．根据权利要求20所述的用途，用于生产激素类物质掺入药物组合物治疗生殖疾病。全文摘要本发明涉及增强杆状载体病毒表达系统中的蛋白质表达的方法。本发明提供了在昆虫细胞培养物中生产重组蛋白质的方法,包括选择表达所述蛋白质的重组杆状病毒,在足够体积的至少含2升生长培养基的培养容器中生长昆虫细胞,并且用至少一种杆状病毒的接种物以感染复数<0.01感染细胞密度为1×10文档编号C12P21/02GK1295620SQ98813684公开日2001年5月16日申请日期1998年12月17日优先权日1997年12月18日发明者迪特马尔·克雷茨多恩,迪尔克·弗朗西斯库斯·马里纳斯·范德维尔,亚伯拉罕·约翰尼斯·德斯米特,罗伯特茨·雅各布斯·玛丽亚·莫尔曼,埃里克·谢斯·阿曼申请人:动物育种及动物保健基金研究所,拜耳股份公司