专利名称：用于产生木糖醇或d-木酮糖的新微生物和方法
技术领域：
本发明涉及具有产生木糖醇或D-木酮糖能力地新微生物，以及通过利用具有产生木糖醇或D-木酮糖能力的微生物而制备木糖醇或D-木酮糖的方法。D-木酮糖可作为制备木糖醇的有用材料，而木糖醇在食品工业领域和类似的领域中可作为增甜剂。
未来对天然存在糖醇的木糖醇的需求会增加。由于木糖醇具有更低的卡路里并显示出与蔗糖可相比的甜度，所以木糖醇是一种有前途的低卡路里的增甜剂。此外，由于它具有抗牙龋的性质，所以利用它作为预防牙龋的增甜剂。此外，因为木糖醇不提高葡萄糖水平，所以在糖尿病的治疗中利用它进行液体治疗。因为这些理由，可预期未来对木糖醇的需求将增加。
当前的木糖醇工业生产主要依赖D-木糖的氢化，如美国专利4,008,285所公布的方法。用作为原材料的D-木糖由植物材料的水解获得，如树，稻草，玉米穗轴，燕麦外壳，以及其它富含木聚糖的材料。
然而，这样由植物材料的水解产生的D-木糖存在相当昂贵的弊端，这是由于高的生产成本而导致的。例如，植物材料水解处理的低产率导致产生的D-木糖醇的低纯度。因此，在水解处理后必须通过离子交换处理除去用于水解的酸和染色剂，产生的D-木糖必须进一步结晶以除去其它半纤维素化的糖类。为了获得适于食物的D-木糖，需要进一步的纯化。这样的离子交换处理和结晶处理使得生产成本增加。
因此，已开发了几个用于产生木糖醇的方法，它们利用易获得的原材料并产生少量消耗。例如，已开发了利用其它戊糖醇作为起始材料制备木糖醇的方法。这样易获得的戊糖醇之一是D-阿糖醇，D-阿糖醇可利用酵母来制备(Can.J.Mcrobiol.，31，1985，467-471；微生物遗传杂志，139，1993，1047-54)。至于利用D-阿糖醇作为原材料产生木糖醇的方法，见应用微生物学中所报导的方法(18，1969，1031-1035)，该方法包括利用汉逊德巴利酵母ATCC20121通过发酵由葡萄糖产生D-阿糖醇，然后利用弱氧化醋杆菌把D-阿糖醇转化成D-木酮糖，并在季氏假丝酵母大豆变种的作用下把D-木酮糖转化成木糖醇。
EP403 392A和EP421 882A公开了方法，其包括利用抗渗透的酵母通过发酵产生D-阿糖醇，然后利用醋杆菌属，葡糖杆菌属，或克雷伯氏菌属的细菌把D-阿糖醇转化成D-木酮糖，并在葡萄糖(木糖)异构酶的作用下把D-木酮糖形成木糖和D-木酮糖的混合物，通过氢化将所获得的木糖和D-木酮糖的混合物转化成木糖醇。其还公布了木糖醇的生产方法，该方法包括在木糖和D-木酮糖的混合物中预先浓缩木糖，并通过氢化把木糖转化成木糖醇。
然而，上述用于产生木糖醇的那些方法利用通过发酵产生的D-阿糖醇作为起始材料，通过多个步骤转化它。因此，该方法复杂，从经济角度出发与基于抽提的方法相比，该方法并不令人满意。
因此，要求一种具有从葡萄糖开始通过单一的发酵步骤(如用于其它糖类与食糖醇的生产中的)可产生木糖醇或D-木酮糖能力的微生物。然而，迄今为止还没有报导这种具有产生木糖醇或D-木酮糖能力的细菌。
在另一方面，已尝试利用基因操纵技术培养出木糖醇发酵性的细菌。国际出版物WO94/10325公开了通过利用重组微生物从葡萄糖通过发酵的木糖醇生产方法，这种重组微生物的获得是通过把阿拉伯糖醇脱氢酶基因(来源于克雷伯氏菌属的细菌)和木糖醇脱氢酶基因(来源于毕赤酵母属的细菌)导入到阿拉伯糖醇发酵微生物(念珠菌属，球拟酵母属，或接合酵母属的酵母)内。然而，已报导的上述重组微生物的400g/L葡萄糖产生15g/L木糖醇的产率，还达不到实践上有效的累积水平。此外，上述重组微生物被导入的基因来源于不同的物种，因此关于它的安全情况不能认为是足够的。
本发明是在上述该技术的水平上完成的，它的目的是提供一种通过发酵葡萄 糖产生木糖醇或D-木酮糖能力的微生物，及利用这种微生物产生木糖醇或D-木酮糖的方法。
为了达到上述目的，本发明者寻找具有发酵葡萄糖产生木糖醇或D-木酮糖能力的微生物。至于通过微生物(如酵母)发酵直接产生食糖醇的方法，除了上述阿拉伯糖醇的发酵外，还报导了通过利用产酸结合酵母(zygosaccharomycesacidifaciens)产生甘油的方法(Arch.Biochem.7，257-271(1945))，利用Trychosporonoides(Trychosporon-oides sp.生物技术通讯，15，240-246(1964))属和类似属的酵母产生赤藓糖醇的方法。所有这些具有产生食糖醇能力的酵母显示了趋渗能力，即，在高渗透压的培养基中能很好地生长。因此，当在嗜高渗酵母中没有发现任何具有产生木糖醇能力的微生物时，本发明者认为具有产生木糖醇能力的新微生物可能存在嗜高渗微生物中，并广泛地筛选嗜高渗微生物。结果，他们在嗜高渗微生物中找到了从葡萄糖产生木糖醇和D-木酮糖能力的微生物。根据基于16s rRNA基因的核苷酸序列基础上的分类学系统发育的观点，估计那些微生物是新的细菌。本发明是在上述发现的基础上完成的。
因此，本发明提供了一种属于醋酸杆菌科的微生物，其具有16s rRNA基因(该基因包含SEQ ID No1的核苷酸序列或者某核苷酸序列其在基于16s rRNA序列的分子分类学的观点上等同于SEQ ID No1核苷酸序列)并且具有由葡萄糖产生木糖醇或D-木酮糖的能力，并提供一种微生物，其具有16s rRNA基因(该基因包含SEQ ID No2核苷酸序列或者某核苷酸序列其在基于16s rRNA序列的分子分类学的观点上等同于SEQ ID No2核苷酸序列)并且具有由葡萄糖产生木糖醇或D-木酮糖的能力。
上述微生物的例子包括，例如，Asaia属或Zucharibacter属的那些微生物，更具体地说是Asaia ethanolifaciens或Zucharibacter floricola的菌株。Asaiaethanolifacieas是一新的物种(新种)暂时由发明者指定。Zucharibacter属和Zucharibacter floricola分别是一个新属(新属)和新种，暂时由发明者指定。
上述微生物的具体例子包括，例如，菌株P528(FERM BP-6751)，菌株S877(FERMBP-6752)，菌株S1009(FERM BP-6753)，菌株S1019(FERM BP-6754)，以及菌株S1023(FERM BP-6755)
菌株P528的16S rRNA基因包含SEQ ID No1核苷酸序列，菌株S877的16SrRNA基因包含SEQ ID No2核苷酸序列。菌株S1009，S1019，及S1023的16s rRNA基因的部分序列分别具有SEQ ID NOS3-5。这些核苷酸序列在基于16s rRNA核苷酸序列的分子分类学的观点上等同于SEQ ID No2的核苷酸序列。
本发明也提供了用于产生木糖醇或D-木酮糖的方法，其包括在合适的培养基中培养具有从葡萄糖产生木糖醇或D-木酮糖能力的微生物以便在培养基中积累木糖醇或D-木酮糖，并从培养基中收集木糖醇或D-木酮糖。
用于上述方法的微生物的例子包括，例如，一种醋杆菌科的微生物，其具有16s rRNA基因(该基因包含SEQ ID No1的核苷酸序列或者在基于16s rRNA序列的分子分类学的观点上等同于该核苷酸序列的某核苷酸序列)并且具有由葡萄糖产生木糖醇或D-木酮糖的能力，并包括一种Acetobacteracea科的微生物，其具有16s rRNA基因(该基因包含SEQ ID No2核苷酸序列或者在基于16s rRNA序列的分子分类学的观点上等同于该核苷酸序列的某核苷酸序列)并且具有由葡萄糖产生木糖醇或D-木酮糖的能力。
上述微生物的具体例子包括，例如，Asaia属或Zucharibacter属的那些微生物，更具体地说是Asaia ethanolifaciens或Zucharibacter floricola菌株。上述微生物的具体例子包括，例如，菌株P528，S877，S1009，S1019，及S1023。
本发明进一步提供了用于产生乙醇的方法，该方法包括在合适的培养基中培养微生物菌株P528(FERM BP-6751)以在培养基中积累乙醇，并从培养基中收集乙醇。
按照本发明，可由廉价的材料(如葡萄糖)有效地产生木糖醇或D-木酮糖。
此外，通过利用菌株P528可产生乙醇。
图1显示基于16S rRNA的核苷酸序列的本发明微生物和类似细菌的分子系统树。
图2显示产生木糖醇的微生物的16S rRNA的部分序列的排列。它显示了SEQ IDNo1和SEQ ID No2的核苷酸序列编号1-691的核苷酸序列与SEQ ID NOS3-5的这些核苷酸序列的比较情况。点(·)表示共同的核苷酸。
图3是图2的继续。
图4是描述添加NaCl对本发明微生物的生长影响的图表。
图5是描述在添加乙醇的培养基中培养菌株P528与S877时乙酸的产生情况的图表。
图6是描述在添加乙醇的培养基中培养菌株P528与S877时乙醇的消耗或产生情况的图表。
图7是阐述菌株P528的乙醇产生情况的图表。
下文详尽说明了本发明。<1>本发明的微生物
发明者如下文所论及的例子中描述的广泛地筛选了嗜高渗微生物，结果，发现具有由葡萄糖产生木糖醇或D-木酮糖能力的新微生物。指定那些微生物为菌株P528，S877，S1009，S1019，以及S1023。
上述菌株的微生物特征如下。[1]形态和培养特征
上述菌株在补充了11％(w/v)D-葡萄糖的YM培养基(1％葡萄糖，0.5％蛋白胨，0.3％酵母抽提物，0.3％麦芽汁，pH6.0)中，30℃下培养3天，然后在显微镜下观察。结果见表1。
表1[2]培养特征(1)琼脂平板培养
该菌株在补充了11％(w/v)D-葡萄糖的YM培养平板上，30℃下培养3天，观察的特征见表2。
表2(2)液体培养
该菌株在补充了11％(w/v)D-葡萄糖的YM液体培养基中，30℃下培养3天，观察的特征见表3。
表3[3]生理特征(1)各种生理特征的检验结果见表4。
表4(2)最佳生长条件
当菌株在补充了11％(W/V)D-葡萄糖的YM培养基中培养时的最佳生长温度和最佳pH见表5。
表5(3)生长条件
菌株在补充了11％(W/V)D-葡萄糖的YM培养基中培养时的允许生长的条件见表6。
表6(4)菌株在补充了蔗糖的YM培养基中培养时的最佳蔗糖浓度见表7。
表7(5)菌株在包含20％(w/v)D-葡萄糖，0.1％尿素，0.5％酵母抽提物的培养基中，30℃下培养5天。培养后在培养基中检测到的糖类见表8。
表8在上述菌株中，菌株S877，S1009，S1019及S1023这四种具有专性嗜高渗性，即，它们只能在添加了高浓度糖类的培养基中生长。
那五种微生物菌株的主要特征是能由葡萄糖产生木糖醇或D-木酮糖的能力。由于至今根本没有报导任何能由葡萄糖产生木糖醇或D-木酮糖的微生物，所以认为上述具有这些微生物特征的菌株是新的微生物。[4]分子分类学分析
为了确定菌株P528，S877，S1009，S1019及S1023的分类学位置，检测这些菌株的16s rRNA基因的核苷酸序列，并利用那些核苷酸序列与亲源最近的微生物的16s rRNA基因的核苷酸序列(图1)一起制定分子系统树。结果，显示了菌株P528属于醋杆菌(Acetobac teracea)科的可能性，并且是属于醋杆菌属或与醋杆菌属类似的一个新属的新物种。另一方面，显示了菌株S877属于醋杆菌科的可能性，并且是属于与醋杆菌属或葡糖杆菌属类似的新属的一种微生物。认为菌株S1009，S1019和S1023这三种是与菌株S877相同的物种。
已建立了基于分子系统树的用于研究有机体或基因进化的方法作为分子分类学(参见，例如，″Bunshi Shinka-gaku Nyumon(进化分子生物学概论)″，第7节，制定分子系统树的方法及其评估，T.Kimura，Baifukan编，日本，pp.164-184)
基于16s rRNA基因的核苷酸序列基础上的分子系统树可根据若干序列的序列对比所获得的数据，以及利用感兴趣的微生物的16s rRNA基因的核苷酸序列与已知的估计和感兴趣的微生物是相同的物种或类似的微生物的核苷酸序列一起计算进化距离，从而制定系统树来获得。用于分子系统树制备的已知微生物的16s rRNA基因的核苷酸序列可由，例如，搜索根据同源性的可用数据库来获得。本文所用的术语″进化距离″是指一定基因的每个基因座(序列长度)的突变总数。
多序列的序列对比及进化距离计算可由，例如，利用市售的包含在软件收集″系统发育程序″中的软件CLUSTAL W来完成(可从http//evolution.genetics.washington.edu/phylip/software.html获得，参见Thompson，D.J.，等，核酸研究，22，4673-4680(1994))。系统树也可由常规使用的软件进行制定(例如，树视图，Apple Machintosh的树画图软件Roderic D.，1995页，生物医学和生命科学研究所，格拉斯哥大学，英国)。具体地说，由CLUSTALW计算获得的结果可以PHLYP格式数据输出，并可由树视图进行处理。PHLYP(Felsenstein J.(1995)系统发育推理软件包，第3.5.7.版，华盛顿大学遗传系，Seatle WA，美国)也包括在上述系统发育程序中。[5]其它生化和生理特征(1)醌类型和DNA的GC含量
所有菌株P528，S877，S1009，S1019以及S1023的醌类型是泛醌-10，DNA的GC含量分别是56.5％，52.3％，52.3％，51.9％，以及52.9％。(2)酸产物
菌株对各种碳源的酸产物见表11。(3)添加NaCl对生长的影响
培养在包含各种浓度NaCl的培养基中的菌株生长情况见图4。菌株P528抗NaCl的能力至少为2％。(4)乙酸和乳酸的消耗
当在含有葡萄糖作为碳源的并补充了乙酸或乳酸的培养基中培养时，所有菌株显示乳酸分解能力，但是弱的或完全无任何乙酸分解能力。(5)添加乙酸或乙醇对生长的影响
所有菌株在添加了多达1％的乙酸或多达3％的乙醇的培养基中显示活性生长。所有菌株在添加了4％或更多的乙酸或5％或更多的乙醇的培养基中不能生长。(6)乙酸的产生及乙醇的消耗
当菌株在含有葡萄糖作为碳源的培养基中培养时，菌株显示弱的醋酸生产能力。菌株没有显示明显的乙醇消耗，菌株P528显示乙醇的产生。[6]本发明和其它乙酸细菌的微生物的表型比较
菌株P528，S877，S1009，S1019以及S1023和以前报导的已知的乙酸细菌，Asaia bogorensis，醋化醋杆菌，氧化葡萄糖杆菌，液化葡糖酸醋酸杆菌，和甲醇酸单孢菌(日本生物科学，生物技术，以及农业化学协会的会议，1999，演讲摘要，P.和p.66)的表型比较的结果见表9。Asaia bogorensis是属于一个在会议上由Yamada等报导的新属(新属)及一新物种(新种)的微生物。至于菌株P528，S877，S1009，S1019以及S1023，如实施例5和6中所描述的检测乙酸产物，乙醇产物，DNA核苷酸组合物，及主要的醌。其它特征的检测用Asai等的方法(Asai，T.等，应用微生物遗传学杂志，10(2)，p.95，1964)。
表9nd未确定，W弱
如表9所示，菌株P528类似于Asaia bogorensis，但不同于Asaia bogorensis因为该菌株显示从乙醇产生乙酸的能力(尽管弱)而且DNA的核苷酸组合物中的GC含量是56.5比Asaia bogorensis(59-61)的GC含量低得多。菌株S877，S1009，S1019，及S1023与其它乙酸细菌不同，因为它们由乙醇产生乙酸的能力弱，它们能在30％葡萄糖的存在下生长，并且它们没有显示从乙醇产生酸的能力。
基于上述结果，确定菌株P528为Asaia属的一个新物种，暂时地指定为Asaiaethanolifaciens新种。S877，S1009，S1019和S1023都被确定为一个新属的新物种，暂时地指定为Zucharibacter floricolagen新属，新种。<2>木糖醇和D-木酮糖的产生方法
在合适的培养基中通过培养具有由葡萄糖产生木糖醇或D-木酮糖能力的微生物，这样培养基上应该积累木糖醇或D-木酮糖或者两者，然后收集木糖醇和/或D-木酮糖，就可产生木糖醇或D-木酮糖。
若微生物不受特别限制只要其具有由葡萄糖产生木糖醇或D-木酮糖能力，那么其具体例子包括上述菌株P528，S877，S1009，S1019和S1023。那些同种的或与上述菌株属于相同属的并具有由葡萄糖产生木糖醇或D-木酮糖能力的微生物也可用于本发明。这样微生物的例子包括，例如，属于Acetobacteracea科的那些，它们具有16s rRNA基因(该基因包含SEQ ID No1的核苷酸序列或在基于16s rRNA序列的分子分类学的观点上等同于该核苷酸序列的某核苷酸序列，或者该基因包含SEQ ID No2核苷酸序列或在基于16s rRNA序列的分子分类学的观点上等同于该核苷酸序列的某核苷酸序列)并且具有由葡萄糖产生木糖醇或D-木酮糖的能力。具体地说，属于Asaia属或Zucharibacter属的那些菌株，更具体地说是Asaiaethanolifaciens或Zucharibacter floricola的菌株。
用本发明的方法所产生的靶产物可以是木糖醇或D-木酮糖之一，或者两者兼有。
根据本发明，可以利用任何通过紫外线暴露，N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍(NTG)处理，乙基甲磺酸盐(EMS)处理，亚硝酸处理，吖啶处理等方法从具有由葡萄糖产生木糖醇或D-木酮糖的能力的微生物菌株中所获得的任何突变体菌株，或者利用通过细胞融合或遗传工程技术(如遗传重组)所获得的遗传重组菌株和类似的菌株。
培养上述微生物的培养基可以是通常的培养基，其包含通常的碳源，氮源，无机离子，以及有机营养物(若要求)。尽管本发明的微生物在高渗透压条件下生长，当情况可以的话它们也可在正常的渗透条件下生长。例如，菌株P528在正常的渗透条件下生长。
糖类如葡萄糖，醇类如甘油，有机酸等适于用作碳源。鉴于在已知产生木糖醇的方法中观察到的优先选择，例如，在由戊糖醇(如D-木糖或D-阿糖醇)产生木糖醇的方法中优选己糖(如果糖和蔗糖)，二糖(如蔗糖和乳糖)，及多糖类(如淀粉)。这些材料在培养基中用作为主要的碳源，用量为10-60％，优选为20-50％。根据培养进程可一次或或部分添加这些碳源。
氨气，氨水，铵盐等可作为氮源。镁离子，磷酸离子，钾离子，铁离子，锰离子等可作为无机离子(若要求)。维生素，氨基酸以及含有它们的材料(如肝抽提物，酵母抽提物，麦芽汁，蛋白胨，肉膏，玉米浆，酪蛋白分解产物等)可用作为有机营养物(若要求)。
培养条件也不特别受限制。但需在5-8的pH值范围和25-40℃的温度范围之内所选择的一定pH值和温度下培养这些微生物。培养在需氧条件下完成，例如，搅拌或通气振荡。至于培养期，要求培养微生物直到主要碳源被消耗，即，通常是3-8天。
上述这样培养期间在培养基中所产生的木糖醇和/或D-木酮糖通过常规方法从中进行分离并收集。具体地说，例如，在通过离心、过滤等从培养基中除去固体物质后，可利用活性炭、离子交换树脂等使剩余溶液脱色和除去盐分，从溶液中可结晶出木糖醇和/或D-木酮糖。由于杂质的低含量，使得从培养基中分离和收集木糖醇和/或D-木酮糖的方法比从植物材料水解产物中分离更容易。
产生D-木酮糖可通过氢化转化成木糖醇，这可用已知的方法来完成。<3>乙醇的产生方法
乙醇可通过在含有葡萄糖的培养基中培养微生物菌株P528(FERM BP-6751)进行制备，这样在培养基上应该积累了乙醇，并从培养基中收集乙醇。除了菌株P528，具有16s rRNA基因(该基因包含SEQ ID No1的核苷酸序列或在基于16srRNA序列的分子分类学的观点上等同于该核苷酸序列的某核苷酸序列)并且具有由葡萄糖产生乙醇能力的微生物，或其突变体菌株可以类似地用于乙醇的产生。
培养基和培养条件类似于上述用于产生木糖醇和D-木酮糖的方法中描述的那样。培养基中所产生的乙醇可以按在常规乙醇发酵法中的方式进行浓缩和纯化。
参照下列实施例更具体地说明本发明。然而，本发明不限于这些实施例。
这些实施例中，在下列条件下用高效液相层析(HPLC)分析所产生的木糖醇和D-木酮糖。柱Shodex SC1211(Showa Denko的产品)流动相50％乙腈/50％ 50ppm Ca-EDTA的水溶液流速0.8mL/分钟温度60℃检测RI检测器
实施例1 分离产生木糖醇或D-木酮糖的微生物
首先，通过加富培养从自然界中收集嗜高渗微生物。将含有20％D-葡萄糖，1％酵母抽提物(Difco)，及0.1％尿素的培养基以每管4ml的量加入到试管中，在120℃下灭菌20分钟。将从各种位置收集的土壤样品接种到培养基中，在30℃下振荡培养4-7天。当观察到细菌生长时，将培养物铺板在含有同样物质的琼脂平板上，在30℃下温育1-3天。然后，挑选形成的集落。
然后，在30℃下将约3000株按上述所获得的嗜高渗细菌的菌株在含有20％(w/v)D-葡萄糖，0.1％尿素，及0.5％酵母抽提物的培养基中培养5天，由HPLC分析培养基以筛选具有产生木糖醇或D-木酮糖能力的菌株。结果，发现从Tama河岸，Kawasaki-shi，Kanagawa-ken所收集的土壤中分离出五种细菌菌株具有由葡萄糖产生木糖醇的能力。分别指定这些菌株为菌株P528，S877，S1009，S1019和S1023。按序分别安排这五种菌株的私人编号为AJ14757，AJ14758，AJ14759，AJ14760，及AJ14761，并自1998年6月18日保藏在国立生命科学和人体技术研究所的工业科学和技术机构中(邮政编码305-8566，1-3 Higashi l-Chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，日本)，其保藏号按顺序为FERM P-16848，FERMP-16849，FERM P-16850，FERM P-16851，FERM P-16852，并且根据布达佩斯条约在1999年6月14日由原来的保藏号转换成国际保藏号；并以FERM BP-6751，FERMBP-6752，FERM BP-6753，FERM BP-6754，及FERM BP-6755保藏号进行保藏。
实施例2 从葡萄糖制备木糖醇和D-木酮糖
将含有0.5％酵母抽提物(Difco)和0.1％尿素(pH6.0)的培养基以50ml的量加入到500ml的坂口烧瓶(Sakaguchi flask)内，并在120℃下加热灭菌20分钟。添加一定量单独灭菌的葡萄糖至培养基中，使得培养基含有20％(w/v)葡萄糖。将P528，S877，S1009，S1019以及S1023菌株分别接种到培养基中，在30℃下振荡培养5天。然后，在离心除去细菌细胞之后，由HPLC检测培养基中所形成的木糖醇和D-木酮糖。结果见表10。
表10
木糖醇和D-木酮糖的产生量实施例3 菌株P528，S877，S1009，S1019和S1023的分子分类学分析
从分子分类学观点，用常规方法通过分析16S rRNA的核苷酸序列对P528和S877菌株进行分析。
60℃下用蛋白酶处理每种菌株的细菌细胞悬液20分钟，然后在沸水中加热5分钟，并离心。获得上清液直接用作为PCR的模板。
利用与大肠杆菌的16S rRNA的8-27与1492-1510的位置(SEQ ID No6和7)相对应的通用引物，以常规方式完成30个PCR循环，并用PEG沉淀出法收集该产物。通过荧光循环测序法直接对PCR产物进行测序，并用DNA测序仪(Pharmacia)分析反应产物。所确定的核苷酸序列见SEQ ID No1(菌株P528)和SEQ ID No2(菌株S877)。在数据库中未发现任何与这些核苷酸序列对应的序列。具有与每种菌株的16s rRNA基因亲缘最密切的核苷酸序列的细菌组是属于葡糖杆菌属和醋杆菌属的细菌。
由GENETYX(软件开发，东京)处理所获得的核苷酸序列数据，并由CLUSTAL W对所获得的序列和来自数据库的类似序列(当前认为具有有效名称的13种乙酸细菌的16s rRNA基因序列)进行多重序列对比和进化距离计算。用树视图观看并处理所获得的PHYLIP格式的数据，以制备分子系统树。结果见图1。产生木糖醇的细菌的16S rRNA的序列对比见图2和3。以下列出了上述13种乙酸细菌。浅井氏葡糖杆菌蜡状葡糖杆菌弗氏葡糖杆菌氧化葡糖酸杆菌氧化亚种醋化醋杆菌巴氏醋杆菌Acetobacter methanolicusGluconobacter europaeusGluconobac ter xylinus subsp.xylinusGluconobac ter in termedicusGluconobac ter hansenii液化葡糖杆菌Gluconobacter diazotrophicusRhodophila globiformis
结果，具有与菌株P528亲缘密切的进化距离的已知菌株是Gluuconobacterintermedicus，液化葡糖杆菌，醋化醋杆菌，Acetobacter methanolicus及巴氏醋杆菌，它们的进化距离分别是0.0345，0.0359，0.0403，0.0419，和0.0499，16s rRNA基因的同源性分别是96.5％，96.3％，96.0％，95.9％和95.1％。此外，具有与菌株S877亲缘密切的进化距离的已知菌株是蜡状葡糖杆菌和氧化葡糖杆菌，其进化距离分别是0.0622和0.0629，16s rRNA基因的同源性分别是94.0％和93.9％。尽管菌株P528包括在醋杆菌属的种群(cluster)中，但它与已知物种的三种菌株亲缘较远，因而认为它是一个新的物种。已有报导说Acetobactermethanolicus属于另一个属(酸单胞菌属)。如果Acetobacter methanolicus被认为是属于另一个属，菌株P528可能属于一个新属，因为菌株被定位在醋杆菌属种群之外。
另一方面，菌株S877被定位在葡糖杆菌属种群之外，并且与任何属于葡糖杆菌属的已知物种亲缘关系较远。菌株S877与最密切的菌株(蜡状葡糖杆菌)的进化距离是0.066，该值明显大于葡糖杆菌属和醋杆菌属之间的距离(0.044)。因此，自然认为该菌株属于一个新属。
当确定了菌株S1009，S1019和S1023的16S rRNA的部分核苷酸序列(分别为SEQ ID NOS3-5)时，它们基本上显示出与菌株S877的16S rRNA序列相同的序列，因而发现它们是属于相同的物种。
通过上述的分子分类学分析和表9的表型，确定菌株P528是属于Asaia属的一个新的物种，并且暂时地指定为Asaia ethanolifaciens新种。菌株S877，S1009，S1019和S1023全都被鉴定为属于一个新属的新物种的微生物，并且暂时地指定为Zucharibacter floricolagen新种，新属。
实施例4 由葡萄糖产生木糖醇和D-木酮糖
将含有0.2％乙酸铵，0.3％磷酸二氢钾，0.05％镁硫酸盐七水合物，0.5％酵母抽提物(Difco)和4％碳酸钙的培养基以50ml的量加入到500ml的坂口烧瓶中，并在120℃下加热灭菌20分钟。添加一定量单独灭菌的葡萄糖至培养基中，使得培养基含有20％(w/v)葡萄糖。将菌株P528接种到培养基中，30℃下振荡培养4天。然后，在离心除去细菌细胞之后，由HPLC检测培养基中所形成的木糖醇和D-木酮糖。结果发现形成了6.4g/L木糖醇以及17.5g/L D-木酮糖。
实施例5 菌株P528，S877，S1009，S1019和S1023的生化和生理特征(1)醌和DNA的GC含量分析
通过常规方法由高效液相层析(HPLC)(参见Saikingaku Gijutsu Sosho(细菌学的技术文库)，第8卷“用于微生物鉴定下列新分类学的方法″，pp.61-73，pp.88-97，Saikon Shuppan，日本)分析上述菌株的DNA的醌和GC含量。结果见表11。
表11
醌类型和DNA的GC含量UQ泛醌(2)各种碳源的酸产物
将上述菌株分别培养在含有各种碳源之一(1％)的培养基中，并检测所形成酸的存在。28℃下将菌株在YPG培养基中预培养一天，并用0.5％酵母抽提物溶液洗涤细菌细胞，接种到YPC培养基中，并在28℃下振荡培养4-7天。然后，通过培养基中pH值指示剂的颜色变化(紫红到黄色)鉴定酸的产生。
YPG培养基的制备如下。将含有1％酵母抽提物(Difco)和1％蛋白胨的培养基在120℃下加热灭菌20分钟。往培养基中加入单独已灭菌的D-葡萄糖，直到使得培养基中含有7％的D-葡萄糖。
YPC培养基的制备如下。将含有0.5％酵母抽提物(Difco)，0.012％溴甲酚紫，和1％的各种碳源之一的培养基在120℃加热灭菌20分钟。
结果见表12。
表12
由各种碳源形成的酸+酸产物存在，±弱酸产物，-没有酸产生(3)添加NaCl对生长的影响
在YPM培养基中培养上述菌株并检查添加NaCl对它们生长的影响。28℃下，将上述菌株和作为对照的醋化醋杆菌NCIB 8621菌株在上述YPG培养基中预培养一天，并用未添加D-葡萄糖的YPG培养基洗涤细菌细胞，并悬浮在未添加D-葡萄糖的YPG培养基中。将获得的细菌悬液接种(1.6％v/v)到添加了各种浓度NaCl的YPM培养基中，并在28℃下振荡培养两天。然后，由来自东京Koden的分光光度计ANA-75A(光密度660毫微米)测量培养基的浊度以检测生长情况。
YPM培养基的制备如下。将含有1％酵母抽提物(Difco)，1％蛋白胨和1％甘露糖醇的培养基在120℃下加热灭菌20分钟。
结果见图4。菌株P528显示了在添加多达2％NaCl的培养基中能活跃的生长，即，显示出NaCl抗性。(4)乙酸和乳酸的消耗
将上述菌株培养在添加了乙酸或乳酸的YG培养基中，以检查对乙酸和乳酸的消耗。
28℃下，将上述菌株和作为对照的醋化醋杆菌NCIB 8621菌株在上述YPG培养基中振荡预培养一天。将获得的预培养基接种(1.6％v/v)到添加了1％乙酸或乳酸的YG培养基中，并在28℃下培养7天。通过培养基的时程取样来检查乙酸和乳酸的消耗。在下列条件下由HPLC测量乙酸和乳酸。柱ULTTRONPS-80(Shinwa Kagaku Kogyo的产品)流动相高氯酸溶液(pH2.1)流速0.9ml/分钟温度60℃检测紫外线检测器(210毫微米)
添加了乙酸或乳酸的YG培养基制备如下。将含有1％酵母抽提物(Difco)及1％乙酸或乳酸的培养基调整至pH6.0，并在120℃下加热灭菌20分钟。添加单独已灭菌的D-葡萄糖至培养基中，直到培养基中含有7％的D-葡萄糖。
结果见表13(数据以消耗量(％)来说明)。菌株P528，S877，S1009，S1019及S1023都显示出乳酸分解能力，但是弱的或完全无乙酸分解能力。
表13
乙酸和乳酸的消耗A.aceti醋化醋杆菌菌株NCIB8621(5)添加乙酸或乙醇对生长的影响
在添加了乙酸的YG培养基中检查添加乙酸对上述菌株生长的影响。在添加了乙醇的YPG培养基中检查添加乙醇对上述菌株生长的影响。
28℃下，分别将上述菌株在上述YPG培养基中预培养一天，并分别将培养基接种(1.6％v/v)到添加了各种浓度的乳酸的YPG培养基和添加了各种浓度的乙醇的YPG培养基中，并在28℃下振荡培养10天。然后，由来自东京Koden的分光光度计ANA-75A(光密度660毫微米)测量培养基的浊度以检测生长情况。
所有菌株P528，S877，S1009，S1019和S1023显示出在添加多达1％乙酸或3％乙醇的培养基中能活跃地生长。所有菌株均不能在添加了4％或更多的乙酸或者5％或更多的乙醇的培养基中生长。(6)乙酸的产生及乙醇的消耗
将上述菌株培养在添加了乙醇的YPG培养基中以检查乙酸的产生及乙醇的消耗。28℃下，将上述菌株和作为对照的醋化醋杆菌NCIB 8621菌株在上述YPG培养基中预培养2天。分别将培养基接种(1％，v/v)到添加了1％乙醇的YPM培养基中，并在28℃下培养。通过培养基的时程取样来检查乙酸和乳酸的浓度。乙酸和乙醇浓度的测量通过F-试剂盒(Roche诊断公司)来进行。
结果见图5和6。所有菌株P528，S877，S1009，S1019以及S1023，与对照细菌醋化醋杆菌菌株NCIB 8621相比显示了更弱的乙酸生产能力(该图只描述菌株P528和S877的数据)。此外，与对照细菌醋化醋杆菌菌株NCIB 8621相比，菌株S877，S1009，S1019和S1023没有显示出乙醇消耗。相反，菌株P528显示出增加的乙醇产量。实施例6 由菌株P528产生乙醇
利用类似于上述的方法，在YPG培养基中培养菌株P528，隔一段时间后，测量在培养基中的乙醇浓度。结果见图7。菌株P528显示出乙醇生产能力。
序列表(110>味之素株式会社<120>用于产生木糖醇或D-木酮糖的新微生物和方法<130>P-6562<141>1999-<150>JP 10-193472<151>1998-07-08<150>JP 10-310398<151>1998-10-30<150>JP 11-12244<151>1999-01-20<160>5<170>PatentIn 2.0版本<210>1<211>1438<212>DNA<213>未知<220><223>未知生物的描述菌株P528<400>1tgatcctggc tcagagcgaa cgctggcggc atgcttaaca catgcaagtc gcacggacct 60ttcggggtga gtggcggacg ggtgagtaac gcgtagggat ctatccacgg gtgggggata 120acactgggaa actggtgcta ataccgcatg atacctgagg gtcaaaggcg cgagtcgcct 180gtggaggagc ctgcgttcga ttagcttgtt ggtggggtaa aggcctacca aggcgatgat 240cgatagctgg tctgagagga tgatcagcca cactgggact gagacacggc ccagactcct 300acgggaggca gcagtgggga atattggaca atgggcgcaa gcctgatcca gcaatgccgc 360gtgtgtgaag aaggtcttcg gattgtaaag cactttcgac ggggacgatg atgacggtac 420ccgtagaaga agccccggct aacttcgtgc cagcagccgc ggtaatacga agggggctag 480cgttgctcgg aatgactggg cgtaaagggc gtgtaggcgg ttgttacagt cagatgtgaa 540attccagggc ttaaccttgg ggctgcattt gatacgtagc gactagagtg tgagagaggg 600ttgtggaatt cccagtgtag aggtgaaatt cgtagatatt gggaagaaca ccggtggcga 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1.一种属于醋杆菌科的微生物，其中所说的微生物具有16s rRNA基因，其中该基因包含SEQ ID No1的核苷酸序列或者在基于16s rRNA序列的分子分类学的观点上等同于该核苷酸序列的某核苷酸序列，并具有由葡萄糖产生木糖醇或D-木酮糖的能力。
2.权利要求1的微生物，其属于Asaia属。
3.权利要求2的微生物，其是Asaia ethanolifaciens的菌株。
4.一种具有16s rRNA基因并有从葡萄糖产生木糖醇或D-木酮糖能力的微生物，其中所说的16s rRNA基因包含SEQ ID No2核苷酸序列或者在基于16s rRNA序列的分子分类学的观点上等同于该核苷酸序列的某核苷酸序列。
5.权利要求4的微生物，其16s rRNA基因包含SEQ ID NOS3-5的核苷酸序列之任一。
6.权利要求4的微生物，其属于Zucharibacter属。
7.权利要求4的微生物，其是Zucharibacter floricola的菌株。
8.具有由葡萄糖产生木糖醇或D-木酮糖能力的微生物菌株P528(FERM BP-6751)。
9.具有由葡萄糖产生木糖醇或D-木酮糖能力的微生物菌株S877(FERM BP-6752)。
10.具有由葡萄糖产生木糖醇或D-木酮糖能力的微生物菌株S1009(FERM BP-6753)。
11.具有由葡萄糖产生木糖醇或D-木酮糖能力的微生物菌株S1019(FERM BP-6754)。
12.具有产生木糖醇或D-木酮糖葡萄糖能力的微生物菌株S1023(FERM BP-6755)。
13.一种用于产生木糖醇或D-木酮糖的方法，该方法包括在合适的培养基中培养具有由葡萄糖产生木糖醇或D-木酮糖能力的微生物，以在培养基中积累木糖醇或D-木酮糖，并从培养基中收集木糖醇或D-木酮糖。
14.权利要求13的方法，其中所说的微生物是权利要求1-12的微生物之任一种。
15.一种用于产生乙醇的方法，该方法包括在合适的培养基中培养微生物菌株P528(FERM BP-6751)以在培养基中积累乙醇，并从培养基中收集乙醇。
全文摘要
根据本发明,本发明提供了具有通过发酵产生木糖醇或D－木酮糖能力的微生物,及利用这些微生物产生木糖醇或D－木酮糖的方法。从土壤中收集嗜高渗微生物,并搜索所获得的微生物以找到具有由葡萄糖产生木糖醇或D－木酮糖能力的细菌。木糖醇或D－木酮糖的产生可通过在合适的培养基中培养分离的细菌以在培养基中积累木糖醇或D－木酮糖,并从培养基中收集木糖醇或D－木酮糖来完成。
文档编号C12P7/06GK1263944SQ9911167
公开日2000年8月23日 申请日期1999年7月8日 优先权日1998年7月8日
发明者三原康博, 竹内园子, 城嶋恭子, 外内尚人, 不动亮介, 横关健三 申请人:味之素株式会社