专利名称：双链引物聚合酶链反应的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种由含双链引物的DNA体外扩增技术。
在现有的DNA体外扩增技术中，聚合酶链反应(polymeras chain reaction,PCR)是最主要也是最有效的技术。该技术系将含有耐热DNA聚合酶、特异性引物、dNTP底物、模板DNA、镁离子等的反应体系反复进行高温模板变性、低温引物与模板结合、中温引物延伸的热循环，而使靶DNA片段在体外得到扩增。在常规的PCR中，很容易出现引物二聚体的扩增和其它非特异性的DNA扩增，从而降低特异性靶DNA扩增的效率，导致扩增的假阳性和假阴性，影响扩增结果的判定。这一缺点在以粗制的变性DNA标本作模板进行PCR时尤为突出。因而出现了几种改良的PCR方法来克服上述问题。其中最成功的有下述三种1、热启动PCR，即所用试剂及扩增条件与常规PCR相同，只是不象常规PCR那样在室温或室温以下将耐热DNA聚合酶与其他成分预先混合好，而是在进入扩增的前夕，反应体系处于较高的温度下(如80℃)时最后加入，加入酶之后随即进入热循环；2、固体石蜡膜法PCR，即预先将耐热DNA聚合酶与其他反应成分隔开，而在进入扩增前随着温度升高到一定程度(如超过60℃)时，石蜡膜融化，DNA聚合酶与其他反应成分才开始混合，然后进入热循环；3、抗体-酶法PCR，即用耐热DNA聚合酶的单克隆抗体预先与酶结合，将其暂时灭活，在反应体系进入高温后，抗体失活，酶被释放出来发挥作用，并进入热循环。上述三种方法都利用在较高温度时让酶促反应才开始进行，从而降低非特异扩增、提高特异扩增的效率。但它们也有缺点，例如第一种方法增加了操作的难度和污染的机会，且不适合大批量的反应；第二种方法在反应结束后石蜡凝固，给取样带来困难；第三种方法需要价格昂贵的单克隆抗体。而且这三种方法本质上都属于热启动PCR，即让反应在较高温度时才开始进行，而一旦反应开始后，就与常规PCR无异。
本发明目的在于提供一种操作简单，不仅能够在反应开始之前发挥作用，而且能够在整个反应过程中发挥作用，从而提高特异性扩增、降低非特异性扩增效率的DNA体外扩增技术。
本发明双链引物聚合酶链反应(doubl-strand primered polymerase chain reaction,DSP-PCR)首先根据待扩增的靶DNA序列合成一对特异性的单链引物，记作正引物，这一对正引物界定待扩增的靶DNA片段；再根据上述两条引物序列分别合成与其互补的两条引物，随后将后者的3’-末端进行加双脱氧核苷酸或磷酸化修饰，使其失去延伸能力，记作反引物；最后将正、反引物按小于1的比例混合并使正引物完全与修饰后的反引物退火成双链引物。将双链引物、耐热DNA聚合酶、dNTP底物、模板DNA、镁离子、PCR缓冲液、超纯水等混匀成反应体系，在热循环仪上进行高温、低温、中温的反复热循环。在反应体系混匀时，由于正引物全部以双链引物的形式存在，即使温度较低也不会形成引物二聚体及引物与DNA的非特异性结合，而仍保持单链状态的剩余部分反引物即便能够非特异性地与DNA结合，因其没有延伸能力，也不能形成扩增产物，只有当经过热变性步骤后，正引物才释放出来，发挥引物的作用，引导靶DNA片段的扩增。因而能够起到热启动的效果。在反应过程中，反应体系由高温降到低温时，一部分解链为单链的正引物与特异的靶DNA结合引导靶DNA片段的特异扩增，同时，多余的单链正引物能与单链反引物复性为双链引物，迅速降低能够引起非特异扩增的正引物的浓度，抑制非特异扩增的产生。当温度再度升高时双链引物又解链释放出正引物，从而引导又一轮扩增。这样经过25-35个热循环后，就能获得上百万拷贝的特异的正引物界定的靶DNA片段。
下面以扩增脆性X智力低下1号基因(fragile X mental retardation 1,FMR1)的5’非翻译区为例来进行详细说明。链则在重复序列区新链延伸受阻，不能合成完整互补新链。75℃时ORS从(GCC)n模板链上脱离下来，使该模板此时可以指导合成完整互补新链。这样经过25-35个热循环后，就能获得上百万拷贝的特异的含重复序列的靶DNA片段。
权利要求
1.一种将含有双链引物、耐热DNA聚合酶、dNTP底物、模板DNA、镁离子、PCR缓冲液、超纯水等的反应体系进行高温、低温、中温反复热循环而达到目的DNA片段大量扩增的DNA体外扩增技术，其中的双链引物为依据靶DNA序列合成的能够延伸的一对正引物(包括一条正向引物和一条反向引物)和3’-末端经过修饰的不能延伸的与该对正引物分别互补的反引物退火而成。该双链引物在PCR反应前的低温条件下保持双链状态，不形成二聚体和非特异性退火；在PCR过程中的高温时解链，释放出正引物，使其在低温时与靶DNA的相应区段退火，引导特异的DNA片段的合成；同时还可与反引物退火迅速降低正引物的浓度，降低反应过程中的非特异扩增。经过多次的热循环，产生大量的靶DNA片段。
2.根据权利要求1所述的双链引物DNA体外扩增技术，其特征在于使用的引物为双链引物。
3.根据权利要求2所述的双链引物，其特征为系依据靶DNA序列合成的能够延伸的一对正引物(包括一条正向引物和一条反向引物)和3’-末端经过修饰的不能延伸的与该对正引物分别互补的反引物退火而成。
4.根据权利要求3所述的3’-末端经过修饰的不能延伸的与该对正引物分别互补的反引物，其3’末端进行磷酸化或加双脱氧核苷酸修饰，或使用能够与正引物特异结合但又不能在耐热DNA聚合酶的作用下延伸的其他物质，如肽核酸(PNA)。
5.根据权利要求1所述的双链引物DNA体外扩增技术，依据该技术装配的DNA体外扩增试剂盒。
全文摘要
本发明是一种由含双链引物的DNA体外扩增技术。首先根据待扩增的靶DNA序列合成一对特异性的单链引物，再分别合成与其互补的两条引物，并对后者的3’－末端进行修饰，使其失去延伸能力，然后让它们分别退火成双链引物。将该双链引物、耐热DNA聚合酶、dNTP底物、模板DNA、镁离子、PCR缓冲液、超纯水等混匀成反应体系，在热循环仪上进行高温、低温、中温的反复热循环，从而获得上百万拷贝的特异的靶DNA片段。本发明中用双链引物取代常规PCR中使用的单链引物，不仅能够达到热启动的效果，而且在整个反应过程中都能起到降低非特异扩增的作用。
文档编号C12P19/00GK1238387SQ99114950
公开日1999年12月15日 申请日期1999年6月22日 优先权日1999年6月22日
发明者夏庆杰 申请人:夏庆杰