专利名称：微结构聚合酶链式反应扩增器的制作方法
技术领域：
本发明属于信息技术和生物医学相结合的交叉领域，采用信息技术中的微电子机械加工技术和半导体致冷原理制造的微型基因扩增器，而适宜于生物医学等多种领域中应用的一种快速、无污染的DNA基因扩增装置。
聚合酶链式反应(Polymeraze Chain Reaction-PCR)扩增技术提出十多年来，发展迅速，现已成为分子生物学及医学等研究领域极为重要的工具，它能快速、体外扩增出任何所希望的DNA片段，甚至单拷贝基因。而广泛应用于分子生物学、医学、遗传学各个领域，用于基因克隆、测序、突变体和重组体构建、基因表达调控、基因多态性分析、遗传病和传染病诊断、肿瘤机制的探查、法医鉴定等多方面研究。
目前国内外使用的聚合酶链式反应(PCR)扩增器都属于大型装置，而不是微结构型一次性使用装置。存在污染耗样量大、速度慢等问题，特别是国产装置，存在着严重的污染问题，而被严格控制生产使用。
而微结构型PCR扩增器国内尚没有研制，国外正在研制，尚没有商品进入市场。国外正在研制的微结构聚合酶链式反应(PCR)扩增器未见解决在加热循环过程中的主动降温、散热问题。如果解决主动散热降温，可以进一步加快热循环速度，提高效率。如果在扩增器上制作精密测温传感器，有效地监测控制扩增过程的温度，研究温度变化对扩增过程的影响，将对扩增器的性能有更大改进，这都是非常重要的，本项发明将解决上述问题。
本发明的目的是克服通常扩增器设备体积大，耗时长，30-40次循环需数小时，而且耗样量大，容易产生污染等问题；采用微电子机械加工技术在约0.5mm厚的硅片上制造出容积约μl级的微井型扩增腔，放置待扩增样品液，微腔一边制作出多晶硅加热电阻，另一边加玻璃盖板，并制作上液体进出口而成。工作时多晶硅加热电阻用来循环加热，自然降温。因为聚合酶链式反应(PCR)是一种在体外模拟自然界DNA复制过程的核酸扩增技术，其工作过程是多次热循环过程。通常DNA分子在95℃温度下变性解链，其后温度降至55℃下，进行退火、结合，然后再度升温到75℃，结合的DNA分子延伸成形，完成一次复制过程，如此往复，单个DNA基因，经过35次循环复制扩增，可达到340亿个之多。实现完整的基因扩增过程。
本发明的技术方案如
图1所示，提出一种新型微结构聚合酶链式反应(PCR)扩增器，它采用了珀尔贴半导体致冷器件致冷，把半导体致冷器件作为扩增器的组成部分，并提出两种典型的结构和设置高精度铂电阻来加热、测温和控温。
图2和图3是本发明的两种典型的结构示意图。
图2中1是Si微型腔体，2是样品入口，3、5是致冷器导流片，4、8 P.N型半导体致冷片，6是热耦层，7是散热片，9是样品输出口，10绝缘膜，11是加热铂电阻，12是测温精密铂电阻。其结构属于单边加热升温，单边致冷降温结构；图3中1是Si微结构腔体，2、9是样品进出口，3、5、10、12是致冷器导流片，4、8、11、15是N.P型半导体致冷片，6、13是热耦层，7、14是散热片，16是绝缘层，17是测温精密铂电阻，制造时它要同导流片之间电绝缘。
两种扩增器的结构如下a．扩增器的衬底为Si微型腔体，衬底上沿分别开有样品入口和样品出口，在出口上方装有一层致冷器导流片，导流片上方分别装有P型半导体致冷片和N型半导体致冷片，在致冷片上方还装有致器导流片，该导流片上装有热耦层，热耦层上有一散热片；在衬底底部下加一层绝缘膜，绝缘膜下装有加热铂电阻和测温精密铂电阻；b．扩增器的衬底为Si微结构腔体，衬底上沿分别开有样品入口和样口出口，在出口上方装有一层致冷器导流片，导流片上方分别装有P型半导体致冷片和N型半导体致冷片，在致冷片上方还装有致冷器导流片，该导流片上装有热耦层，热耦层上有一散热片；在Si微结构腔体的底部下加一层绝缘膜，在绝缘膜上装有一测温精密铂电阻；绝缘膜下装有致冷器导流片，导流片下分别为N型半导体致冷片和P型半导体致冷片，致冷片下装有致冷器导流片，导流片下为热耦层。
本发明的技术要点还在于在扩增器微腔体的两边装配的半导体器件为珀尔贴半导体致冷件。珀尔贴半导体致冷器件的结构为在N型半导体制冷片和P型半导体制冷片上装有金属导流片，致冷片的下方分别装有导流片，这两个导流片与直流电源连接。
本发明具有如下优点一是这种采用半导体致冷原理进行主动降温的微型PCR扩增器在国内外是首次提出，可以大大提高效率，加快扩增速度；本发明中采用了铂电阻加热和测温不仅仅工艺中是便捷可行的，而且阻值可调，铂材料温度系数线性好，便于精确测温，从而能精确控制扩增时温度，对提高扩增效率、研究和掌握扩增过程的规律十分关键，是通常扩增器不能实现的；本发明装置可以一次性使用，在密封微腔中扩增没有污染问题，对有传染性疾病基因的扩增时用特别必要；本项发明也是集成化、微型化、多功能化的新型高技术DNA芯片之一，性能优越，是未来发展的方向和目标。
图2为新型单边加热单边致冷型聚合酶链式反应(PCR)扩增器示意图。
1-Si微型腔体、2-样品入口、3-致冷器导流片、4-P型半导体致冷片、5-致冷器导流片、6-热耦片、7-散热片、8-N型半导体致冷片、9-样品输出口、10-绝缘膜、11-加热铂电阻、12-测温精密铂电阻。
图3为新型加热和致冷一体化结构聚合酶链式反应(PCR)扩增器示意图。
1-Si微结构腔体、2-样品入口、3-致冷器导流片、4-N型半导体致冷片、5-致冷器导流片、6-热耦层、7-散热片、8-P型半导体致冷片、9-样品出口、10-致冷器导流片、11-P型半导体致冷片、12-致冷器导流片、13-热耦层、14-散热片、15-N型半导体致冷片、16-绝缘层、17-测温精密铂电阻图4为珀尔贴半导体致冷器件原理图。
1-N型半导体制冷片、2-P型半导体制冷片、3-金属导流片、4-导流片、5-导流片、6-电源。
实施例本发明首次提出在微结构聚合酶链式反应(PCR)扩增器的装置中直接引入珀尔贴半导体致冷效应器件致冷，从而加快了扩增循环周期，提高了效率。
还提出一种采用微电子机械系统(MEMS)技术加工制造的PCR扩增器，它的扩增区是微型腔体结构，容积可以按要求设计，通常在μl级扩增区的两边分别设计制造成加热区和致冷区，两区中都有测温传感器，采用了高精度铂电阻测温，构成一种新型微型的PCR扩增装置，样品注入后，可以自动实现扩增，无需其他操作。
并提出另外一种珀尔贴效应型的微结构型PCR扩增装置，这种装置是PCR扩增器微腔体扩增区的两边设计制造了两个珀尔贴半导体致冷器件，组成循环加热和致冷一体化结构，只要改变珀尔贴半导体器件的工作电流极性，实现致冷和加热的转换，可以实现基因快速、无污染扩增。
所设计的微腔体PCR扩增器两边采用珀尔贴器件后，组成循环加热和致冷一体化结构。当改变珀尔贴半导体致冷器件的工作电流的极性时，致冷和致热将发生转换，速率更快，效率更高。
本发明在于采用多项高技术实现微型聚合酶链式反应扩增器的加热、致冷降温和精密测温系统的集成化、微型化和多功能化；在技术上还采用微型电子平面工艺和微电子机械三维工艺技术在双面抛光的硅片上制造出带有铂电阻加热和精密铂电阻测温的三维结构微腔体及相匹配的小型半导体致冷单元，然后将它们键合或组装在一起，成为完整的新型的微结构PCR扩增器。组装结构中的致冷单元也可重复使用图4中N、P型半导体制冷片1、2用金属导流片3连接，当正向直流电由1-N型半导体制冷片通过导流片到2-P型半导体制冷片中的空穴，背向导流片接头运动，即导流片3接头片N型和P型上分别产生电子、空穴，电子、空穴产生的能量得自晶格的热能，于是在导流片3上产生吸热现象，而在N、P型的另一端导流片4.5上产生放热现象，从而产生温差。当放热的高温侧的热量能有效的放散时，吸热的低温则能不断地吸热，使之能起到冷却的作用。6是电源。
依据珀尔贴效应制作的温差电致冷组件具有重量轻、体积小和相对高的致冷量等优点，特别适用于有限空间的致冷。由于致冷组件是一种固态热泵，因而它无需维护，无噪音，能在任何位置工作，抗冲击和抗振动能力强。另外，改变组件工作电流极性时，它又可以致热，改变电流强度可调整致冷功率。
权利要求
1．一种由半导体致冷片、致冷器导流片、热耦层、散热片、绝缘膜、电阻构成的微结构聚合酶链式反应扩增器，其特征在于扩增器有以下两种a．扩增器的衬底为Si微型腔体，衬底上沿分别开有样品入口和样品出口，在出口上方装有一层致冷器导流片，导流片上方分别装有P型半导体致冷片和N型半导体致冷片，在致冷片上方还装有致冷器导流片，该导流片上装有热耦层，热耦层上有一散热片；在衬底底部下加一层绝缘膜，绝缘膜下装有加热铂电阻和测温精密铂电阻；b．扩增器的衬底为Si微结构腔体，衬底上沿分别开有样品入口和样口出口，在出口上方装有一层致冷器导流片，导流片上方分别装有P型半导体致冷片和N型半导体致冷片，在致冷片上方还装有致冷器导流片，该导流片上装有热耦层，热耦层上有一散热片；在Si微结构腔体的底部下加一层绝缘膜，在绝缘膜装有一测温精密铂电阻；绝缘膜下装有致冷器导流片，导流片下分别为N型半导体致冷片和P型半导体致冷片，致冷片下装有致冷器导流片，导流片下为热耦层。
2．根据权利要求1所述的微结构聚合酶链式反应扩增器，其特征在于在扩增器微腔体的两边装配的半导体器件为珀尔贴半导体致冷件。
3．根据权利要求2所述的微结构聚合酶链式反应扩增器，其特征在于珀尔贴半导体致冷器件的结构为在N型半导体制冷片和P型半导体制冷片上装有金属导流片，致冷片的下方分别装有导流片，这两个导流片与直流电源连接。
全文摘要
新型微结构型聚合酶链式反应(PCR)扩增器属于生物、医学领域中应用的新型装置,不仅适用于生物学、医学研究,也适用于医学临床中无污染的DNA基因扩增用。这种装置不仅采用微电子机械系统(MEMS)技术加工制造,具有微型化和一次性无污染使用,而且装置结构中采用了珀尔贴半导体致冷效应组件,在DNA基因扩增热循环过程中,实现可控地主动快速致冷降温,加快了扩增过程,提高了效率。
文档编号C12M1/38GK1301810SQ99127328
公开日2001年7月4日 申请日期1999年12月29日 优先权日1999年12月29日
发明者崔大付 申请人:中国科学院电子学研究所