杂交种子生产的制作方法

专利名称：杂交种子生产的制作方法
技术领域：
本发明涉及制备杂交种子的方法。
具体地讲，本发明涉及作物不育性的分子控制。植物的所述雄性和雌性不育性可用于由天然自花授粉的作物制备杂交种子。
本发明还提供了恢复亲本植株育性的方法，以便能够自花授粉，从而能够保持亲本系。
本发明还涉及用于整合到植物亲本中的表达框，并涉及将所述表达框用于雄性/雌性不育性恢复系统。
由杂交种子长成的杂交植物具有让两种不同的遗传背景杂交的杂交优势。杂交种子的生产取决于控制自花授粉并确保父本植株和母本植株异花授粉的能力。
有多种方法可用于控制花粉育性。例如，就玉米而言，它具有分离的雄花和雌花，控制花粉育性是在花粉释放之前机械去除雄花或穗状雄花而实现的，由此阻止自花授粉。
不过，大部分主要作物在同一朵花内具有功能性雄性和雌性生殖器官，在这种情况下，去除生产花粉的器官需要花费大量的劳动力和资金。特别是在小麦、玉米和稻上，可用化合物(杀配子剂)杀死或抑制花粉产生，能产生暂时性的雄性不育性，但使用这种化合物是昂贵的。化合物的可靠性及其作用时间也成问题。
人们对开发基于产生雄性不育性的遗传机制的花粉控制系统有极大的兴趣。存在两种大的类型a)由于一个或几个核基因引起的花粉生产缺陷所导致的核雄性不育性，和b)细胞质雄性不育性(CMS)，其中，花粉的生产由于存在于线粒体上的基因的缺陷而受到抑制。
现有的核系统是基于将雄性不育性状导入一种亲本植物，然后通过与另一种植物异花授粉导入育性恢复基因，以便产生可育的杂交植物。披露于WO96/01799中的Paladin系统是不同的，它基于基因在杂交种子生产中的分离，当这些基因在一个植株中同时表达时，具有细胞毒性作用，导致雄性不育性。
稻和小麦是自花授粉植物，并具有小的两性花，因此，不能采用用于在玉米上生产杂交种子的去雄方法。首先，去除花药是困难的并且要花费大量时间。另外，小麦花粉比较重，并且仅能存活很短时间，很少能保存活力超过30分钟。因此，用于杂交玉米生产的种植技术，即将父本种植在与母本(雄性不育)机械隔离的小区中，并利用风力传粉，不能很好适用于小麦或稻。这些作物的父本和母本必须相间种植，以确保异花授粉。由于杂交种子需要包括95％以上的杂种，必须清除由父本自花授粉所产生的种子或者使得父本不能够自花授粉，从而不能产生非杂交种子。很显然，亲本植株的相间种植意味着上述第一种选择是困难的，除非父本植物容易受某种化学处理的影响，而母本对这种化学处理有承受能力，例如，除草剂处理。
我们的国际专利申请号PCT/GB90/00110披露了一系列基因序列，该基因序列能表达一种能在母本植株中破坏有活力的花粉生物合成的蛋白。不过，在这种情况下，仅有一种亲本植物，即母本是不育的，以便减少母本植物的自花授粉，并且该母本植物与可育的父本植物杂交，以便产生可育的杂交种子。不过，在该文献中没有披露生产杂交种子的方法，其中，两种亲本植物都不能自花授粉。
本发明涉及两种方法，通过该方法可以生产杂交种子，该方法试图克服目前与杂交种子生产，特别是与杂交小麦和稻种子生产相关的问题。
根据本发明的第一方面，提供了一种制备杂交种子的方法，包括相间种植雄性可育并且纯合隐性的雌性不育父本植物和纯合隐性雄性不育而雌性可育的母本植物，进行异花授粉，并获得由此所产生的种子。
根据本发明的第二方面，提供了将上述方法用于生产杂交种子的用途。
根据本发明的第三方面，提供了通过上述方法生产的可育的植物。
根据本发明的第四方面，提供了上述植物的后代，所述植物和所述后代的种子。
根据本发明的第五方面，提供了一种表达框，包括
(a)第一基因启动子序列，它是雄花特异性启动子序列；(b)编码一种能够破坏雄性育性的产物的破坏基因，该基因有效连接于所述第一基因启动子序列上；(c)第二基因启动子序列，它是可任选有效连接于一个或几个翻译增强子或内含子序列上的雌花特异性启动子序列；(d)编码一种能够恢复雌性育性的产物的恢复基因，它有效连接于所述第二基因启动子序列上；(e)对一种外源化学诱导物的存在或缺乏有反应的第三基因启动子序列，它选择性、有效连接于一个或几个翻译增强子或内含子序列上；和(f)编码一种能够恢复雄性育性的产物的恢复基因，它有效连接于所述第三基因启动子序列上；因此，所述外源化学诱导物的存在能够控制雄性可育性。
根据本发明的第六方面，提供了一种表达框，包括(a)第一基因启动子序列，它是雌花特异性启动子序列；(b)编码一种能够破坏雌性育性的产物的破坏基因；(c)第二基因启动子序列，它是可任选有效连接于一个或几个翻译增强子或内含子序列上的雄花特异性启动子序列；(d)编码一种能够恢复雄性育性的产物的恢复基因，它有效连接于所述第二基因启动子序列上；(e)对一种外源化学诱导物的存在或缺乏有反应的第三基因启动子序列，它可任选有效连接于一个或几个翻译增强子或内含子序列上；和(f)编码一种能够恢复雌性育性的产物的恢复基因，它有效连接于所述第三基因启动子序列上；因此，所述外源化学诱导物的存在能够控制雌性可育性。
根据本发明的第七方面，提供了另一种生产杂交种子的方法，包括将本发明上述第五方面的第一表达系统整合到第一种植物中，以便产生半纯合的母本植物，并将根据本发明第六方面的第二表达系统整合到第二种植物中，以便产生半纯合的父本植物；将一种外源化学诱导物施加在所述转化体上，以便使所述植物自花授粉；由所得的种子长成植株；筛选雄性和雌性纯合的植株；让所述筛选的雄性和雌性植株杂交；和获得所产生的杂交种子。
根据本发明的第八方面，提供了一种用上述任一种表达框转化的植物组织和由所述转化的植物组织产生的材料。
根据本发明的第九方面，提供了包括上述组织或材料的可育的全植株。
根据本发明的第十方面，提供了按照本发明第七方面生产的筛选植株的后代，所述后代包括整合的上述表达框，优选稳定地整合到其基因组中，以及所述植物和所述后代的种子。
根据本发明的第十一方面，提供了一种植物，其基因组包括根据本发明第五方面的第一表达框。
根据本发明的第十二方面，提供了一种植物，其基因组包括根据本发明第六方面的第二表达框。
根据本发明的第十三方面，提供了通过让上述两种植物杂交所产生的杂交种子，并获得由此产生的杂交种子。
根据本发明的第十四方面，提供了将本发明第二种方法用于生产杂交种子的用途。
根据本发明的第十五方面，提供了一种转化植物的方法，包括将上述表达框整合到所述植物的基因组中，其中，所述有效连接于第三基因启动子序列上的恢复基因能在目标组织中诱导表达，但可以在一种或几种其他组织中以组成型形式表达，因此，所述破坏基因只能在所述目标组织中起作用。所述第三启动子序列可以在特定的阶段，例如在愈伤组织中以组成型形式表达。
本发明的第一种方法优选是这样的，其中，所述每一种亲本植物的基因组DNA上业已整合了一种基因结构，该结构包括对一种外源化学诱导物的存在或缺乏有反应的启动子序列，可任选有效连接于一个或几个反应增强子或内含子序列上，有效连接于能完全恢复每一种亲本植物的育性的基因上，所述基因是通过在所述植物上使用一种外源化学诱导物而表达的，因此使得每一种亲本能够自花授粉。
所述母本植物的一种隐性基因优选是纯合的，该基因能破坏有活力的花粉的生物合成，或者能显著降低花粉的生活力。
所述父本植物的一种隐性基因优选是纯合的，该基因能破坏诸如胚珠、花柱、柱头的雌花结构，以便阻止受精，或者抑制花粉的粘接、水合或萌发，或者抑制花粉管生长或导向。
所述诱导型启动子序列优选是Alc A启动子序列或GST-27启动子序列。
所述亲本植物优选是小麦、大麦、稻、玉米、甜菜、番茄、向日葵、canola、棉花、大豆和诸如莴苣的其他蔬菜。
由本发明第一种方法所生产的F1杂交种子优选能产生完全可育的植物。
由本发明第一种方法所生产的F2杂交种子优选能产生不育性发生分离的植物，大约25％是雌性不育的。
所述亲本的不育性优选是通过天然或遗传学操作的突变导致的。
上文所述的、并且用于本发明第二种方法中的所述第一表达框优选包括一个编码一种能破坏花粉产生的产物的破坏基因。
上述第一表达框优选包括一个编码一种能在所述植物的毡绒层细胞中表达的产物的破坏基因。
在所述第一表达框中的第三基因启动子序列优选是AlcA启动子序列或GST-27启动子序列。
上文所述的并且用于本发明第二种方法中的所述第二表达框优选包括一个编码一种能恢复花粉生产的产物的恢复基因。
上述第二表达框优选包括一个能够克服所述毡绒层细胞破坏的恢复基因。
在所述第二表达框中的第三基因启动子序列优选是AlcA启动子序列或GST-27启动子序列。
本发明第二种方法中的父本植物优选包括一个恢复雄性育性的纯合的显性基因。
本发明第二种方法中的母本植物优选包括一个恢复雌性育性的纯合的显性基因。
所生产的F1杂交种子优选能产生这样的植物，其花药能产生大约50％的有活力的花粉，其中，所述第一表达框的第一基因启动子序列是配子体启动子序列。
所生产的F1杂交种子优选能产生这样的植物，所有植物是完全可育的，其中，所述第一表达框的第一基因启动子序列是孢子体启动子序列。
F2杂交种子优选能产生不育性发生分离的植物，其中相当数量是雌性不育的。
优选通过在植物上使用一种外源化学诱导物，繁殖并保持通过本发明第二种方法所生产的父本和母本纯合植物，以便使得所述植物自花授粉。就此而言，可以生产所选择的父本和母本纯合植物的自花授粉的其他世代，并且当需要杂交种子时，让所述植物杂交以便获得杂交种子。
用于本发明第二种方法中的植物优选小麦、大麦、稻、玉米、甜菜、番茄、向日葵、canola、棉花、大豆和其他蔬菜。
用于本发明转化植物的方法中的恢复基因优选在再生转化植物的愈伤组织中以组成型形式表达。
所述恢复基因优选在雄花或雌花结构中以诱导型形式表达。
用于所述转化方法的表达框中的第三基因启动子序列优选为GST-27或Alc A启动子序列。
本发明的一种优选实施方案是一种制备杂交种子的方法，包括相间种植雄性可育并且纯合隐性雌性不育的父本植物和纯合隐性雄性不育而雌性可育的母本植物，进行异花授粉，并获得由此产生的种子，其中，在每一种亲本植物的基因DNA上业已整合了一种基因结构，该结构包括一个对一种外源化学诱导物的存在或缺乏有反应的启动子序列，它有效连接于一个能完全恢复每一种亲本植物的育性的基因上，该基因是通过在所述植物上使用一种外源化学诱导物而得到表达的，以便在需要繁殖每一种亲本植物的种子储备时让每一种亲本自花授粉。
本发明的另一种优选实施方案是一种表达系统，包括
(a)第一基因启动子序列，它是雄花特异性启动子序列；(b)编码一种能够破坏雄性育性的产物的破坏基因，该基因有效连接于所述第一基因启动子序列上；(c)第二基因启动子序列，它是可任选有效连接于一个或几个翻译增强子或内含子序列上的雌花特异性启动子序列；(d)编码一种能够恢复雌性育性的产物的恢复基因，它有效连接于所述第二基因启动子序列上；(e)对一种外源化学诱导物的存在或缺乏有反应的第三基因启动子序列，它可任选有效连接于一个或几个翻译增强子或内含子序列上；(f)编码一种能够恢复雄性育性的产物的恢复基因，它有效连接于所述第三基因启动子序列上；其中，所述外源化学诱导物的存在可控制雄性育性，其中，所述能够破坏雄性不育性的基因是一种编码一种能在所述植物的毡绒层细胞中表达的产物的破坏基因。
本发明的另一种优选实施方案是一种表达系统，包括(a)第一基因启动子序列，它是雌花特异性启动子序列；(b)编码一种能够破坏雌性育性的产物的破坏基因；(c)第二基因启动子序列，它是可任选有效连接于一个或几个翻译增强子或内含子序列上的雄花特异性启动子序列；(d)编码一种能够恢复雄性育性的产物的恢复基因，它有效连接于所述第二基因启动子序列上；(e)对一种外源化学诱导物的存在或缺乏有反应的第三种基因启动子序列，它可任选有效连接于一个或几个翻译增强子或内含子序列上；和(f)编码一种能够恢复雌性育性的产物的恢复基因，它有效连接于所述第三基因启动子序列上；其中，所述外源化学诱导物的存在可控制雌性可育性，并且其中，所述能够恢复雄性育性的基因是编码一种能在毡绒层细胞中恢复花粉生产的产物的基因。
所述优选的雄花特异性启动子序列是玉米MSF14和C5(源于果胶甲基酯酶)启动子序列。
术语“植物材料”包括发育中的颖果、萌发中的颖果或谷粒、或幼苗、小植株或植株、或其组织或细胞，如发育中的颖果的细胞或萌发的幼苗或发育中的谷粒或植物的组织(例如，根、叶和茎的组织)。
术语“框”与诸如“结构”、“杂合体”和“缀合体”的术语同义，包括一个直接或间接连接在基因启动子序列上的感兴趣的基因。间接连接的一个例子是，在所述启动子和感兴趣的基因之间提供一个诸如内含子或增强子序列的合适的间隔基团。所述结构还包括适用于转化感兴趣的细胞的质粒和噬菌体。
术语“破坏基因”是一种以显性方式起作用的基因，并且当其在植物发育的合适阶段表达时，可导致植物不能产生有正常功能的雌花结构或有正常功能的雄花结构，使得该植物雌性或雄性不育。所述基因可以通过破坏诸如毡绒层和内皮的组织而发挥其作用。所述基因可以在花粉形成期间在雄花中以特异方式表达，导致花药及相关组织、花粉母细胞、花粉及相关组织的细胞死亡。它还可以在柱头或花柱的传递通道中表达，从而干扰花粉粘接、水合、花粉萌发和花粉管生长和导向的过程。所述破坏基因可源于多种天然存在的资源，例如，人类细胞、细菌细胞、酵母细胞、植物细胞、真菌细胞，或者可以是完全合成的基因，它可以包括一些DNA序列，其中的一些可以是天然存在的，另一些是正常情况下自然界中不存在的或二者的混合物。所述基因优选对线粒体代谢有影响，正如所了解到的，良好的能量供应对于可育花粉的产生是绝对必要的。不过，所述破坏基因可以有效针对其他基本生化功能，如DNA和RNA代谢、蛋白质合成，以及其他代谢途径。优选的显性破坏基因是芽孢杆菌RNA酶。
术语“恢复基因”是以显性方式起作用的基因，当该基因表达时可逆转所述破坏基因的作用。优选的显性恢复基因是芽孢杆菌RNA酶抑制剂。
术语“雌花”意在包括雌性生殖器官的所有部分，包括，但不限于子房、卵细胞、雌蕊、花柱、柱头、传递通道、胎盘。
术语“雄花”意在包括雄花的所有部分，包括，但不限于毡绒层、花药、雄蕊、花粉。
本发明生产杂交种子的方法在很多方面不同于现有方法，并且具有多种优于现有方法的优点。雄性和雌性不育性的使用以前尚没有披露过。这一特征避免了另一种亲本的自花授粉，不需要父本和母本的分离的种植区就能生产杂交种子。这样相间种植的父本和母本植物能使得作物异花授粉的机会最大，所述作物如小麦和稻，它们主要是自花授粉作物。在小麦和稻的例子中，其中，不进行小区种植，该方法能够生产杂交种子，而不必使用除草剂，以便在母本受精之后去除父本植物。只需要一种化学诱导的恢复系统来保持纯化的母本品系，而不是用于杂交种子生产方法。这意味着，所述化合物仅使用在有限的土地面积上，并且仅仅是偶尔使用。可将多种破坏-恢复系统，或操纵子-抑制子系统用于本发明中。
含有能控制雄性和雌性育性的本发明表达框的植物还可分别用于与不含所述表达框的其他亲本系一起生产F1杂种，如果在其所述系中使用其他合适方法控制雄性或雌性育性的话(如机械去除花药或胚珠，或使用化学杀配子剂)。如果让所述F1杂种的后代与所述其他杂交亲本回交合适次数的世代，同时用分子、生化或后代测验技术筛选所述表达框的存在的话，可将所述用于控制雄性或雌性育性的系统转移或渐渗到新的亲本背景中。另外，与其他亲本系的F1杂种可以自花授粉，视需要，通过使用一种外源化学诱导物恢复雄性或雌性育性，以便通过普通植物育种方法筛选含有所述表达框的新的杂交亲本。使用所述渐渗和植物育种方法，使得本发明的杂交种子生产方法能用于多种新的和现有的F1杂交亲本组合。
可通过施加外源化合物诱导的启动子在本领域中是公知的。合适的诱导型启动子是通过施加一种诸如除草剂安全剂的化合物而激活的启动子。诱导型启动子的例子包括披露于我们的国际专利申请号WO93/21334中的Alc A/R开关系统，披露于国际专利申请号WO90/08826和WO93/031294中的GST开关系统，或披露于国际专利申请号WO96/37609中的蜕皮激素开关。所述启动子系统在本文中被称为“开关启动子”。与所述开关启动子组合使用的所述开关化合物是农业上可以接受的化合物，使得所述启动子特别适用于本发明的方法。
在本发明中使用Alc A启动子(它是Alc A/R开关系统的一个部分)的一个优点是所使用的化学诱导物是乙醇。该化合物的优点是，它作为灌根剂、含水喷雾剂或气体使用。它能在1％的浓度下起作用，并且对操作者和环境无害。
本发明可用于育种者或种植者想要生产F1杂交种子的任何单子叶或双子叶植物，并用于有合适的转化技术可供利用的植物，特别是小麦和稻作物。本发明具有降低与F1杂交种子生产相关的管理成本、容易控制杂交种子的纯度和保持亲本系的优点。
在具体应用中，本发明涉及生产父本和母本植物，利用分子工程技术使得所述亲本植物不育。通过化学处理可以逆转所述植物的不育性，导致育性的恢复。
花药是有花植物的雄性生殖过程的部位。它由若干类型的组织和细胞组成，并且决定含有精细胞的花粉粒的产生。毡绒层是特化的组织，它在花粉形成中起着关键作用。它在花粉发育的初期包围花粉囊，在发育的晚期降解，并且在成熟花药的组构形式中不存在。毡绒层能产生多种化合物，这些化合物有助于花粉或者结合到花粉外壁中，并且业已证实很多天然雄性不育突变具有受损的毡绒层分化或功能。因此，毡绒层组织对于有功能的花粉粒的形成是重要的。
业已鉴定并克隆了在毡绒层组织中特异表达的多个基因。其中包括Osg6B，Osg4B(Tsuchiya等1994，Yokoi，S等1997)，pE1，pT72(WO9213957)，pCA55玉米(WO92/13956)，TA29，TA13(Seurinck等1990)，RST2玉米(WO9713401)，MS14，18，19和源于欧洲油菜(Brassica napus)的A6，A9(Hird等1993)。
业已证实，从稻中分离的毡绒层特异启动子在用于在烟草中启动β1，3-葡聚糖酶表达时能产生雄性不育植物(Tsuchiya等1995)。所述毡绒层特异启动子TA29业已被用于生产雄性不育烟草(Mariani等1990)，而pCA55，pE1和pT72在用于驱动芽孢杆菌RNA酶表达时，能产生雄性不育小麦(De Block等1997)。
业已从包括玉米(Hanson等1989，Hamilton等1989)和番茄(Twell等1990，1991)在内的多种物种中获得了花粉特异性克隆。
除此之外，业已从源于欧洲油菜的Bp4A和C(Albani等1990)，源于矮牵牛、稻(Xu等1993，Zou等1994)的chs的多种类型中分离了其他特异克隆。
可以通过诸如简并PCR的方法获得上述克隆及其他克隆的小麦同系物，使用披露于所述文献中的序列，然后筛选小麦和其他基因组文库，并利用报导基因的表达分析组织特异性。所述方法在文献中有大量报导。
在高等植物中，雌性生殖器官以雌蕊为代表，它包括子房、花柱和柱头。业已证实所述雌器官含有高达10,000个不存在于其他器官中的不同mRNA(Kamalay和Goldberg1980)。其中包括决定控制雌蕊发育的调控基因以及编码与雌蕊中分化的细胞类型相关的蛋白的“下游”基因。决定自交不亲和性的基因及其同系物是具有雌蕊优势表达形式的一类基因(Nasrallah等1993)。其他克隆的基因包括在传递组织中表达的β葡聚糖酶(Ori等1990)，果胶裂合酶(Budlier等1990)和壳多糖酶(Lotan等1989)，和在花柱中表达的蛋白酶抑制剂(Atkinson等1993)。其他基因是与致病性相关的或参与糖苷键裂解的基因的同系物。所述酶可以通过降解有关组织中的蛋白促进花粉管的生长，所述花粉管是通过所述组织生长的。
业已在拟南芥属中鉴定了多种雌性不育突变。例如，sin1(短珠被)(Robinson-Beers等1992)和bel1(bell)(Robinson-Beers等1992)能影响胚珠发育。无珠被突变能在四分体阶段抑制大孢子发生(Elliot，R.C.等1996，Klucher，K.M.1996)。在玉米上业已观察到致死胚珠2突变，但尚未克隆(Nelson等1952)。业已从多种物种上克隆了以雌蕊特异型为基础的内切壳多糖酶(Sicker等1997，Czelzkalas等1993，Harikrishan等1996，Wemmer等1994)，并且业已证实伸展蛋白样基因能在花烟草(Nicotiana alata)的花柱中表达(Chen C-G等1992)。
以下是胚珠特异型克隆ZmOV23，13(Greco R.等，未发表)，OsOsMAB3A(Kang H.G.等1995)，ZmZmM2(Theissen G.等1995)和柱头特异型stig1(Goldman，M.H.等1994)，STG08，STG4B12(EP-412006-A)。Goldman等使用源于STIG1基因的启动子启动芽孢杆菌RNA酶在柱头分泌区的表达。这会导致在雌蕊上出现没有分泌区的花，因此是雌性不育的。花粉粒能够萌发，但不能穿透其表面。
业已从兰花上分离到7种胚珠特异型cDNA(Nadeau等1996)。同样，可以用标准分子生物学技术获得上述基因的小麦同系物及任何其他同系物。
本发明方法的另一方面是鉴定影响雄性和雌性不育性的基因。所述基因可用于多种系统中控制育性。
业已回顾了用转座因子标记玉米基因的方法(Doring，1989)。可以使用的上述方法之一是让具有活性转座因子和所述靶基因的一个显性等位基因的玉米品系与不具有转座因子的普通玉米品系杂交。可以让所述杂交的后代自交并筛选最理想的突变，即能导致不育性的突变。所述不育植株代表了潜在情况，其中，一种转座因子业已转座到对育性很关键的基因的基因座上。然后可以用多种方法回收所述基因。US5,478,369披露了通过该方法分离被称为MS45的基因。
业已用En/Spm-I/dSpm转座子标记系统在拟南芥(Arabidopsisthaliana)上鉴定到雄性育性基因，以便获得雄性不育性2(MS2)突变型和MS2基因(Aarts等1993)。业已证实MS2基因参与雄配子发生，细胞壁合成在小孢子母细胞减数分裂之后不能继续，并且小孢子最终分解。业已在欧洲油菜、玉米(Zea mays)上鉴定到MS2的同系物，以及存在于小麦线粒体DNA中的一个开放读框。因此，对拟南芥属育性重要的基因的分离可导致在其他种上同系物的克隆。该方法显然可用于分离对育性重要的其他基因。
现在已经有牧草物种之间在遗传水平上存在广泛的保守性共线性区的证据。Ahn和Tanksley(1993)证实了稻和玉米之间的关系，而Kurata等(1994)证实了小麦基因组可以与稻比较，而Moore等(1995)证实了所有三种图谱都可以比较。由此开辟了利用比较基因组作图作为基因分析方法的途径。
基因克隆的微同线性方法是基于在进化上相关的物种之间分子标记和基因次序相似性的出现。该方法特别适用于农业上重要的大基因组禾本科物种，如小麦、玉米和小麦，这些作物具有小的基因组的稻所没有的优点。Kilian等(1997)报导了用稻作为基因组间作图载体，基于作图的大麦RpgI和rpg4的基因的克隆进展。
由于上述方法局限于遗传学上业已作图的靶基因，在水稻上利用玉米Ac/Ds系统开发了另一种基因分离方法，该方法是一种有效的转座子标记系统，Izawa等(1997)。
业已提出了多种可用于使育性所必需的基因失活或在有关组织中产生细胞毒性化合物以便阻止配子体正常发育的方法。
我们的国际专利申请号PCT/GB96/01675披露了一种在利用选自zANT，微管蛋白，T-URS，ATP酶亚基，cdc25，ROA，MOT的破坏基因在目标植物组织中抑制基因表达的方法。
存在若干其他已知的失活系统。例如，芽孢杆菌RNA酶(Mariani等1990)，白喉毒素A-链，果胶裂合酶。早先披露的表达细胞毒性化合物的两个例子是亲和素表达和IamH/IamS。
业已证实β-1，3-葡聚糖酶在毡绒层细胞中的表达能产生雄性不育植物(Worrall等1992)。业已提出反义是一种能够下调对花粉发育重要的基因表达的机制，并且业已证实(Van der Meer1992)，类黄酮生物合成的反义抑制确实能导致雄性不育性。在玉米上业已证实黄酮醇表达的减弱可导致雄性不育(WO9318171先锋Hi-Bred国际公司)。业已披露了其他机制(Spena等1992)。
Baulcombe(1997)披露了一种通过使用可复制的病毒RNA载体(AmpliconsTM)在转基因植物中使基因沉默的方法，该方法还可用作内源基因失效表达的手段。该方法的优点是，它能产生一种显性突变，即在杂合状态下就可以观察到，并能剔除靶基因的所有拷贝，还可剔除同种型。在作为六倍体的小麦上这是一个突出的优点，然后通过利用诱导型启动子驱动所述剔除基因的功能性拷贝的表达恢复育性。
Kempin等(1997)报导了利用同源重组定向破坏一种功能性基因。不过，该方法通常产生一种隐性突变，即只能在纯合体中观察到。为了在杂合状态下能够检测到，它必须是能够直接致死的，或者例如，导致一种途径的抑制，以便导致致死性的细胞毒性化合物的积累。为了检测一种不育性突变，必须通过自花授粉产生一种隐性纯合体，其中，四个后代中的一个应当是不育的。使得所述剔除基因能够表达的开关结构必须导入一种通过所述纯合体凝胶获得的杂合体中。这是一种用于制备在下面的例1所述方法所必须的隐性突变体的潜在的有用方法。
核酶是能够催化内切溶核裂解反应的RNA分子。它能以反式形式催化反应，并能针对不同的序列，因此，可以作为反义的潜在替代方法调节基因表达(Hasselhof和Gerlach)。Wener等(1994)业已证实，通过在植物中表达核酶基因能产生反式显性突变。
已有若干用于改变植物自交不亲和系统的方法，该系统通过改变S-基因表达导入雄性不育性，其中，用一种结构转化植物，该结构采用一种配子体S-基因编码一种核糖核酸酶，用这种方法将自交不亲和的植物转变成自交亲和的植物，或者将自交亲和的植物转变成自交不亲和的植物，从而避免自花授粉。
破坏基因/恢复基因的组合的例子包括芽孢杆菌RNA酶和芽孢杆菌RNA酶抑制剂，以及TPP和TPS。业已披露了首先利用芽孢杆菌RNA酶/芽孢杆菌RNA酶抑制剂系统产生不育性，然后恢复育性(Mariani等1992)。当利用源于金鱼草属的毡绒层特异型启动子Tap1(Nacken等1991)在烟草毡绒层细胞中表达海藻糖磷酸磷酸酶(TPP)时，可导致雄性不育性。这被认为是改变了表达这种物质的组织中糖类代谢和光合能力所造成的。与野生型烟草回交可导致正常种子的形成。对其后代进行的分析表明，不育性与所述转基因发生分离。TreC，海藻糖-6-磷酸水解酶是第二种基因，其表达扰乱了海藻糖-6-磷酸的水平，并且业已证实，当它利用组成型质体蓝素启动子表达时，其结果是花芽在开花之前脱落。因此，如果表达局限于毡绒层的话，雄性不育性可导致与TPP在毡绒层中表达时相同的结果。另外，业已证实，在使用GA之后花芽保留在植株上，并且会产生一些花粉，在某些场合下导致结实。
业已证实，海藻糖磷酸合酶(TPS)和TPP的同时、等摩尔表达对植物生理学没有影响，即TPS抵消了TPP对表达这种物质的组织中的糖类代谢和光合能力的影响。业已证实，通过用一种在毡绒层中表达TPS的结构再次转化不育的烟草品系可以恢复其育性。很显然，TPS表达可以受一种诱导型启动子的控制，使得在必要时可以恢复育性，或者将优化的GA使用作为恢复育性的另一种方法。源于在环绕胚珠或位于胚珠内的组织中特异表达的基因的启动子，如MADS框基因FBP7可用于启动TPP或TreC的表达，以便获得雌性不育性。很可能，某些密码子使用的优化可能是在诸如小麦或玉米的单子叶作物中获得相同效果所必须的(Merlo和Folkerts)，(种子和Haas)。
业已披露了可将多种操纵子/阻抑蛋白系统用作控制基因在植物中表达的手段。Wilde等证实，使用大肠杆菌lac系统可以抑制受玉米cab启动子控制的GUS表达(由35S CaMV启动子启动的lacI表达)。将操纵子序列插入CAB启动子的各种位点上，并测定抑制的程度。根据所述操纵子序列的位置，观察到多种抑制作用。当所述操纵子序列是通过取代TATA框和转录起始位点之间的部分整合的时，获得大约90％的抑制作用。通过添加IPTG可以解除这种抑制作用。这种现象在烟草原生质体和稳定的转化体中都得到证实。
Lehming等报导，通过修饰lac阻抑蛋白的识别螺旋上的氨基酸，可以显著改变其结合亲和力，从而实现对表达更严格的控制。业已披露了其他诸如此类的系统，其中包括由Gatz等(1991，1992)研制的四环素诱导型启动子系统，其中，在高水平表达四环素阻抑蛋白的植物中，修饰过的35S CaMV启动子受到抑制，但当加入四环素时得到恢复。
蛋白活性的类固醇诱导可以提供一种化学诱导型表达系统，该系统不存在化学毒性问题。哺乳动物的配体结合域和昆虫类固醇受体，如糖皮质素受体(GR)，雌激素受体等可被用于在哺乳动物细胞中调节蛋白活性(Picard等1993)。配体结合域与一种蛋白融合，保持该蛋白处于失活状态，直到引入配体。Lloyd等(1994)披露了一种玉米转录调节物与GR的融合体。Simon等(1996)披露了一种GR与拟南芥属开花时序基因产物的融合物，由它控制转录的诱导，而Aoyama等(1995)披露了一种Gal4或VP16与植物反式激活蛋白Athb-1的融合物，通过GR配体结合域受类固醇的控制。众所周知，转录激活物结合DNA并同时激活转录的能力局限于所述转录因子的特定区域。业已证实(Ptashne1988，Mitchell和TIJAN1989)，转录激活物因子是由独立起作用的组件构成的。Ptashne和Gann(1980)以及其他人业已证实，可以将一个控制一种因子的转录激活的部分与另一个因子的DNA部分结合，并得到在酵母细胞中有活性的杂合蛋白。可将采用了上述部分的系统用于解除抑制作用，并由此诱导基因以受控制的方式表达。另外，还披露了通过受体介导的反式激活用保幼激素或它的拮抗物之一作为化学受体控制基因在植物中表达的方法。
用于诱导表达所述恢复基因的开关系统优选为AlcA/R开关系统。我们业已证实了GUS在番茄花药和花粉中的诱导型表达，并且业已将类似结构导入小麦，证实雄性和雌性组织利用AlcA/R开关系统表达GUS。我们业已利用安全剂诱导型GST开关系统证实了在玉米雄花、长须、胚和胚乳中诱导型GUS表达(Jepson等1994)。其他开关系统无疑也可用于本发明中。
在植物转化期间细胞毒性或破坏基因的表达(这种表达是在雄花和雌花特异启动子的作用下以极低的水平在除目标组织之外的组织中“渗漏”表达的结果)，可导致细胞死亡而不能回收到转化体。在本发明中用于启动所述恢复基因表达的诱导型启动子可以在一定程度上在随后的季节避免以上可能性。
对GST-27启动子来说，业已在愈伤组织中观察到组成型表达。对由乙醇诱导的AlcA启动子来说，业已在7ng/100ml空气的浓度下观察到能诱导GUS表达。可将乙醇浓度加入组织培养基中，以确保组织基因的表达。
破坏基因/恢复基因组合的例子包括芽孢杆菌RNA酶和芽孢杆菌RNA酶抑制剂，以及TPP和TPS。
在本发明中优选使用翻译增强序列，特别是TMVΩ序列(Gallie等)以便用组成型组织特异性和诱导型启动子提高表达水平，以便恢复基因的表达，例如，芽孢杆菌RNA抑制剂远远超过抑制所述破坏基因，例如所产生的芽孢杆菌RNA酶的量。Gallie等证实，利用被称为Ω的烟草花叶病毒U1菌株的5’前导序列的68个核苷酸的连续衍生物可大大加强原核和真核mRNA的翻译。业已证实若干其他病毒前导序列也能增强表达，如苜蓿花叶病毒(A1MV)和金鹊花花叶病毒(BMV)。在烟草叶肉原生质体中观察到大约增强20倍。还可将诸如烟草蚀刻病毒的其他增强子序列用于本发明。
另外，有大量报导披露利用内含子序列增强表达水平。上述研究包括玉米adh1内含子1序列，业已证实，该序列在插入被导入玉米原生质体的嵌合结构上的5’翻译序列之后可提高表达水平12-20倍(Mascarenhas等1990)，还包括同样源于玉米的Sh1内含子。将该内含子加入由CaMV35S启动子启动CAT表达的结构中，可导致表达增强11-90倍(Vasil等1989)。
还可以用以下方法平衡或调节所述恢复基因和破坏基因的表达水平。可将能进行高水平表达的启动子用于启动恢复基因的表达，而将能进行较低水平表达的启动子用于启动破坏基因的表达。这样可以确保破坏基因的产物被恢复基因产物淹没，从而使所有细胞毒性或破坏分子失活，以便完全恢复育性。调节表达水平的另一种方法可以通过诱变实现，通过诱变改变环绕AUG起始密码子的序列，以便所述破坏基因的表达不是最佳(Kozak1989)，并因此得以下调。
可以通过任何现有方法将本发明的表达系统导入植物或植物细胞，如植物细胞和原生质体的农杆菌属转化，电穿孔，显微注射，微粒轰击，细菌轰击，特别是“纤维”或“颈须”方法，所用方法取决于待转化的具体植物物种。然后可以在合适条件下将转化细胞再生成全植株，其中，所述新的核材料稳定地整合到其基因组上。用这种方法可以获得转化的单子叶和双子叶植物。有关所述已知方法的详细内容可以参考有关文献。
Christou和Heie(1997)披露了利用轰击方法转化稻，和由根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的稻转化的进展。
用于转化小麦的其他公开方法包括Becker等(1994)的方法，该方法披露了利用小盾片组织进行微粒轰击，还包括Vasil等(1993)的方法，该方法披露了在直接轰击未成熟胚之后快速产生转基因小麦。图22披露了通过轰击进行小麦转化的等时线。
在筛选携带所述不育性结构的转化方法中需要使用一种选择标记。所述标记可以是一种抗生素选择标记或除草剂抗性基因。对于杂交种子生产方法来说除草剂抗性基因或其他标记的使用不是必须的(但可视为更方便)。可以用化合物处理用于本发明第二种方法中的半纯合植物，以便诱导所述恢复基因的表达，从而能够进行自花授粉。所述自花授粉的后代会发生分离，并可以长成植株，用化合物处理并自花授粉。来自纯合品系的后代的不育性不会发生分离。可以重复进行以上过程，以便生产纯合的不育种子。
可将本发明表达框的单个组分提供到一个或多个载体上。可以用所述载体转化或共转化植物细胞，以便使所述因子之间发生合适的相互作用。
下面将仅通过举例方式对本发明进行说明，其中，将结合附图进行说明，其中

图1表示用纯合的隐性雄性不育母本生产杂交种子的第一种方法中的表达框的示意图。
图2a和2b表示本发明的第一种方法用纯合隐性雄性不育母本和雌性不育父本生产F1杂种，及其在F2代中的分离。
图3表示用第二种杂种生产方法中的表达框的示意图。
图4表示用于利用雄花特异性启动子和雌性组织特异性启动子生产雄性不育雌性可育亲本植物中的表达框的示意图。
图5表示用于利用雄花特异性启动子和雌花特异性启动子生产雌性不育父本植物的表达框的示意图。
图6a、6b和6c表示按照本发明第二种方法，利用雄性不育母本植物和雌性不育父本植物生产F1杂交植物的方法，这两种植物都受孢子体启动子的控制，以及F1杂交种子的产生和F2代的分离。
图7a、7b和7c表示按照本发明第二种方法，利用雄性不育母本植物和雌性不育父本植物生产F1杂交植物的方法，雄性不育性是受配子体启动子的控制，而雌性不育性是受一种孢子体启动子的控制，以及F1杂交种子的产生和F2代的分离。
图8表示二元植物转化载体pMOG1006。
图9表示二元植物转化载体pMOG1006-FSE。
图10表示克隆载体pFSE4。
图11表示通过Northern分析证实的GST在各种玉米组织中的表达。
图12表示在烟草叶片中由GST启动子诱导的GUS报导基因的诱导型表达。
图13表示在玉米叶片中由GST启动子诱导的GUS报导基因的诱导型表达。
图14表示在玉米雄花中由GST启动子诱导的GUS报导基因的诱导型表达。
图15表示GUS报导基因在玉米胚乳中的诱导型表达。
图16表示pPUG和RMS-3克隆方法。
图17表示pGSTTAK载体。
图18表示RMS-3载体。
图19表示一种用于双子叶植物中的诱导型GUS表达载体pSRN.AGS的图谱。
图20表示一种用于双子叶植物中的诱导型GUS表达载体pSRN.AGS的克隆方法。
图21表示一种用于单子叶植物中的诱导型GUS表达载体pUIRN.AGS的图谱。
图22表示通过轰击进行的小麦转化等时线。
图23表示pSRN图谱。
图24表示pAGS图谱。
图25表示一种稻转化载体pMOG1006-SRN.AGS的图谱。
图26表示pGUN的图谱。
图27表示pdvh405的图谱。
图28表示Tap1AlcR-AlcAGluGUSIntnos。
图29表示Stig1AlcR-AlcAGluGUSIntnos。
图30表示玉米转化载体Zm/RMS14。
图31表示一种稻转化载体pMOG1006-C5-GUS。
图32表示克隆载体pFSE。
图33表示一种稻转化载体pMOG1006-MFS14-GUS。
图34表示框A，MFS14-芽孢杆菌RNA酶/芽孢杆菌RNA酶抑制剂-nos。
图35表示框B，C5-芽孢杆菌RNA酶/芽孢杆菌RNA酶抑制剂-nos。
图36表示框C，CaMV35S-AlcR-nos。
图37表示框D，AlcA.Glu11-芽孢杆菌RNA酶抑制剂-nos。
图38表示框E，MFS14.Glu11-芽孢杆菌RNA酶抑制剂-nos。
图39表示框F，Stig1-芽孢杆菌RNA酶/芽孢杆菌RNA酶抑制剂-nos。
图40表示框G，Stig1.Glu11-芽孢杆菌RNA酶抑制剂-nos。
图41表示RMS30。
图42表示RMS32。
图43表示在未诱导过的和乙醇诱导过的野生型和转基因Alc-GUS烟草愈伤组织中的表达。
图44表示在未诱导过的和乙醇蒸汽诱导过的野生型和转基因Alc-GUS烟草花药中的表达。
图45与上文所述相同，不过是通过用水和乙醇灌根诱导。
图46表示GUS在源于9-10毫米烟草花芽的未诱导的和诱导过的雌蕊中的表达。
图47表示GUS在源于17-22毫米烟草花芽的未诱导的和诱导过的雌蕊中的表达。
图48表示GUS在源于33-35毫米烟草花芽的未诱导的和诱导过的雌蕊中的表达。
图49表示GUS在未诱导的和诱导过的油菜花中的表达。
图50表示未诱导的油菜花。
图51表示GUS在灌根诱导2天之后在油菜雌蕊中的表达。
图52-55表示GUS在乙醇诱导的油菜花的柱头和花柱中的表达。
图56表示野生型和水诱导的Alc-GUS油菜雌蕊。
图57表示在用2％乙醇灌根2天之后Alc-GUS油菜雌蕊。
图58表示水处理和50％乙醇处理的Alc-GUS雌蕊。
图59表示诱导之后的油菜花。
图60a表示在番茄花药中由Alc A启动子启动的GUS表达，而60b表示在番茄花粉中由Alc A启动子启动的GUS表达。
图61表示在玉米中编码ZmC5启动子序列的DNA序列。
在下面划线的A是推测的转录起点，而加粗并在下面划线的ATG是翻译起点。例1在该实施例中，由于天然或工程突变的结果，父本植物是雄性可育的，并且是纯合的雌性不育的。母本植物是纯合隐性雄性不育的，并且雌性可育。所述雄性不育性可以进行遗传学操作或者通过杂交导入或者由于天然突变产生。例如，它可以是由于在诸如MS45的基因上的突变产生，业已证实该基因以隐性方式起作用，只能在纯合时导致不育性。
所述亲本系还含有编码一种诱导型启动子的DNA序列，所述启动子有效连接于所述不育性基因的功能性拷贝上，从而恢复其育性，以便分别保持所述母本和父本系(参见图1)。
以上两种亲本植物杂交，产生F1杂种，该杂种在所述隐性雄性不育性和雌性不育性等位基因上是杂合的，因此是完全可育的。不过，如果农民收获并种植F1种子，F2代会发生不育性的分离，导致杂种优势和产量损失，因为有大约25％的母本植物是不育的(参见图2a、2b和2c)。
尽管在玉米上雌性隐性突变是已知的，但有关基因尚未克隆。例2生产杂交种子的第二种方法是基于完全通过遗传操作产生的不育性形成的(参见图3)。母本母本是雄性不育系，即通过一种雄性孢子体启动子表达失活的基因，从而阻止有活力的功能性花粉的产生。另外，在其雌性组织中表达一种恢复基因。通过连接于一个恢复基因上的诱导型启动子可以恢复自交可育性。用这样一种表达框(参见图4)进行转化可产生半纯合的植物MSRFRCS......。
RCS＝可通过化学方法恢复的雄性和雌性育性MS＝显性雄性不育性RM＝显性雄性可育恢复基因FS＝显性雌性不育性RF＝显性雌性育性恢复基因为了获得用于杂种生产的纯合植物，必须用一种外源化学诱导物诱导所述半纯合植物，例如对Alc A/R基因开关来说，所述诱导物是乙醇，并进行自花授粉。
由于不育性基因具有显性效应，3/4的植物产生100％的不育花粉，仅有无效品系是雄性可育的。通过种植自花授粉所得到的种子，重复所述诱导和自花授粉过程，可以区分纯合植物和杂合植物。其后代的不育性会发生分离，并可以按照上文所披露的方法根据基因型方便地进行统计。还可将除草剂抗性或其他选择标记基因用于统计。对于纯合植物来说，所有后代都是雄性不育的(并且是抗除草剂的)，对于杂合植物来说，其后代会连续发生不育性分离。
因此，可以用这种方法筛选纯合雄性不育、纯合雌性可育品系。父本父本植物是完全雄性可育的，但雌性不育，即具有纯合的雌性不育，雄性可育。在这种情况下，雌性不育性是通过在雌花器官中表达一种抑制基因而产生的，如上文所述，所述抑制基因对雌花器官发育有破坏作用。另外，花粉管可以受到破坏，或者植物以其他方式阻止形成种子。还在雄花组织中表达一种恢复基因。
所述父本植物是用与母本植物相同方法获得的，所不同的是，使用图5所示结构。在这里，半纯合的植物具有以下基因型FSRMRCS……而纯合植物具有以下基因型FSFSRMRMRCSRCS例3
在该实施例中，有关表达框包括一种配子体(例如，花粉特异型启动子(参见图5)。父本植物如上文例2中所述。花粉特异型启动子的例子包括于1998年1月26日保存在国立工业和海洋微生物保藏有限公司的Zm13(Hanson等)和C5，其保藏号为NCIMB40915。C5启动子序列如图61所示。同样，必须获得纯合的雄性不育品系，并对半纯合的植物进行化学处理和进行自花授粉。
在这里，所述纯合品系，即MSMSRFRFRCSRCS能产生100％的不育花粉，这些花粉可以用DAPI染色鉴定。这些花粉可以与来自杂合植物的花粉加以区分，杂合植物能产生50％不育的和50％可育的花粉，这些花粉也是通过DAPI染色鉴定的。
因此，可以筛选MSMSRFRFRCSRCS品系。
因此，可以看出的是，雄性或雌性纯合亲本都不能自花授粉。
例2和3中的母本植物都携带一种表达框，该表达框包括一种启动恢复基因表达的雌性特异型启动子，而父本植物携带一种表达框，该表达框包括一种启动一种恢复基因表达的雄性特异型启动子。在所述亲本植物中，由于所述启动子的特异性，所述表达框对育性没有影响。
不过，当让以上两种亲本系杂交时，其结果是，根据是使用了配子体(例如花粉特异型)还是孢子体(例如毡绒层特异型)启动子而在所述母本中产生雄性不育性。在使用孢子体启动子时，可以获得育性的完全恢复，并且F1种子是完全可育的，即产生大约100％的可育花粉(参见图6a、6b)。不过，如果农民保持并种植F1种子，其不育性会以上述方式分离(参见图6c)。如果用配子体启动子获得雄性不育性，不能实现育性的完全恢复，因为花粉是单倍体，并且只有大约5％的花粉能遗传产生花粉可育性功能性等位基因(参见图7a，7b)。F2代按上述方式分离(图7c)。
在必要时，通过所述系统的第三个部分实现纯合不育品系的保持。因此，每一个亲本系包括一种可任选连接于增强子序列或一个或几个内含子序列上的诱导型启动子，在使用所述诱导化合物时启动所述恢复基因在所有组织中的表达，从而在母本上产生花粉，并在父本上形成正常的胚珠和组织发育。然后可以进行自花授粉，产生亲本种子。
在所有实施例中，只有在生产亲本系的种子时才有必要在大田中使用化合物，化合物的使用只需偶尔进行，并且是在较小的土地面积上进行。
在上述实施方案中，可以使用毡绒层特异型(图6a，6b或6c)或花粉特异型启动子(图7a，7b)启动所述失活基因的表达。优选使用毡绒层特异型启动子，因此，育性可以完全恢复。由于花粉是单倍体，在使用花粉特异型启动子时，不可能完全恢复育性。不过，使用花粉特异型启动子是有利的。例如，花粉特异型启动子可能具有更高的组织专一性。只有在恢复育性以便进行自花授粉时才有必要对所述植物进行化学处理。例4制备通用克隆载体所有分子生物学技术是按照Maniatis等所述进行(分子克隆实验室手册，第2版(1989)冷泉港实验室出版社第1和2卷(D.N.Glover著1985))，或按照有关生产商的推荐进行。制备pMOG1006-FsepMOG1006(图8)是一种具有潮霉素抗性基因作为选择标记的二元载体，并且被用于农杆菌属介导的稻的转化。所述修饰过的载体是通过用EcoRI消化pMOG1006并插入具有以下序列的退火的互补寡核苷酸对而制备的LinklA AATTGATCGGCCGGCCCTAG
LinklBAATTCTAGGGCCGGCCGATC以上序列可导入一个单一的FseI位点。通过与用γ32P标记的LinklA寡核苷酸杂交选择含有正确的寡核苷酸序列的克隆，并在通过测序鉴定之后选择含有处于所需取向的所述序列的克隆(图9)。
pVB6pVB6是上述二元载体的类似物，即它含有单一的FseI位点，但携带npt11选择标记，并且被用于农杆菌属介导的烟草转化。制备pFse4(图10)构建该载体，以便组装含有多种表达框的载体。这一目的是通过在多克隆位点区使用罕见的8碱基识别限制酶位点而实现的。用FseI消化pFSE(图32)DNA，并除去现有的多克隆区。插入具有以下序列的互补寡核苷酸DAA-1A5’CCGTTTAAACATTTAAATGGCGCGCCAAGCTTGCGGCCGCCGGGAATTCGGCCGG-3’DAA-1S5’CCGAATTCCCGGCGGCCGCAAGCTTGGCGCGCCATTTAAATGTTTAAACGGCCGG-3’该序列导入单一的EcoRI、NotI、HindIII、AscI、SwaI和PmeI位点，其旁侧为FseI位点。在pSK+上组装表达框，并将接头插入每一个具有下文所述单一位点的表达框旁侧。然后根据需要将完整的表达框插入pFSE4。然后可按上文所述方法将多个表达框以FseI片段形式从pMOG1006-FseI和VB6载体上除去。例5源于烟草的STIG1启动子的PCR克隆利用Stratagene’s PfuTurbo DNA聚合酶和寡核苷酸ST1-L2(5’-ATTCGACCTCGCCCCCGAGCTGTATATG-3’)和ST1-R2(5’-GCTGAGAATGAGAAGGTTGATAAAAGCC-3’)由100ng烟草基因组DNA通过PCR扩增1.6kb片段。热循环条件如下
95℃3分钟，然后进行35个轮次的95℃1分钟，50℃1分钟，72℃4分钟，随后在72℃下最终保温5分钟。利用QIAGEN’s QIA快速凝胶提取试剂盒对1.6kb的扩增产物进行凝胶纯化，并连接到Invitrogen’s pCR-ZERO Blunt载体上。测定插入片段的DNA序列，并具有与公开的STIG1序列100％的相同性(Goldman等1994)。然后将存在于SacI-NotI片段上的所述插入片段转入pBluescriptSK+，作进一步的操作(pSK-STIG1)。例6制备植物转化载体，测试由化学诱导型启动子进行的表达GST-GUS以前业已报导了玉米GST27 cDNA的鉴定，并且实验业已证实GST27在长须、叶片、胚或胚乳中的表达不是组成型的。在使用安全剂之后，在上述所有组织中检测到表达(参见图11-15)。可以按照US5,589,614所披露的方法制备利用GST27启动子启动GUS表达的植物转化结构(图16)。所述结构是用于烟草转化的pGSTTAK(图17)和用于玉米转化的RMS-3(图18)。所述载体可用于产生稳定的烟草和玉米转化体。如上述专利文件所述，制备的安全剂可以作为叶片涂抹剂(烟草)或作为灌根剂(玉米)使用，并观察GUS的表达。在图12中示出了在烟草叶片中诱导GUS表达的结果；表达的明确诱导发生高达100X。类似地，对玉米来说，在安全剂处理之后在叶片中诱导了GUS表达。还在雄花和胚乳组织以及胚胎中观察到表达的诱导。
另外，用RMS-3转化小麦，并研究GUS表达的诱导。可将用潮霉素作为选择标记的改性载体导入稻。GST-芽孢杆菌RNA酶抑制剂玉米转化载体Zm/RMS14(如上文所述)具有与所述安全剂诱导GST27启动子融合的芽孢杆菌RNA酶抑制剂基因。通过PCR证实WU25含有该基因融合体。通过用R-29148对温室生长的植物进行灌根证实了不育性的逆转。相对未处理过的植物而言，处理过的植物表现出增大了的雄花体积。所述安全剂对非转基因可育植物的雄花的大小或育性没有影响。与雄花大小增加相关的是，在取自温室中的灌根样品的花药样品中观察到小孢子发育。在对大田生长的植物进行叶面喷施之后观察到类似效果，但在所有实验中在未处理过的植物上都没有观察到该效果。小孢子发育的恢复似乎与芽孢杆菌RNA酶抑制剂对芽孢杆菌RNA酶的抑制相关，通过所述抑制作用克服了毡绒层细胞的剥离。在用安全剂长时间处理的植物上，小孢子发生得以进行，产生充满了未成熟的有丝分裂后期花粉的花药。相反，来自不育植物的花药是瘪的。
pSRNAGS按照在图20中所述方法构建二元植物转化载体pSRNAGS(图19)。该载体包括启动GUS表达的嵌合35S-AlcA启动子，和启动AlcR基因表达的35S CaMV启动子。
pUIRN.VGS制备用于转化玉米和小麦的以pUC为基础的载体，其中，用连接于遍在蛋白内含子上的遍在蛋白启动子启动AlcR基因的表达(图21)。在图22中示出了用于获得转基因小麦的等时线。pMOG1006-SRNAGS(稻)用EcoRI和HindIII消化质粒pSRN(图23)，以便释放出2.6kb的片段(AlcR-nos)，将该片段作为EcoRI-HindI片段克隆到pMOG1006中。然后将560bp的CaMV35S启动子片段克隆到EcoRI位点上，以便产生35S-AlcR-nos，通过序列分析筛选处于所需取向的克隆(pSRN)。用HindIII消化质粒pAGS(图24)，并将一个2.5kb的片段(AlcA-GUS-nos)克隆到pMOG1006-SRN的EcoRI和HindIII位点上，以便产生最终结构，该结构被称为PMOG1006-SRN-AGS(图25)。通过限制和序列分析确定所述HindIII片段的方向。
为了优化AlcR在毡绒层、雌蕊、花粉和其他生殖组织中的表达水平，制备以下载体，利用组织特异型启动子启动AlcR表达。AlcA-Glu11-GUSint-nos按常规方法，用QUIckChange试剂盒将位于pGUN(图26)上的GUS基因末端的SacI位点改变成PstI位点，然后将含有GUS基因(+内含子)的NcoI-SacI消化物用于取代框D上的芽孢杆菌RNA酶抑制剂基因(参见下文)，以便产生含有AlcA启动子-葡聚糖酶增强子-GUS-nos的载体。将该载体作为PmeI片段切除，并克隆到pFSE4上。Tapl-AlcR-nos-AlcA-Glu11-GUSint-nos将AlcA-Glu11-GUSint-nos(Glu11是葡聚糖酶5’非翻译区)作为PmeI片段克隆到PmeI裂解过的pFSE4上。
将最初从金鱼草属中分离的现在由pvdh405(图27)克隆的毡绒层特异Tap1启动子作为EcoRI片段克隆到pSK-AlcR-nos(通过将来自pSRN的EcoRI-HindIII克隆到pSK+上产生)，并将所得到的Tap1-AlcR-nos作为NotI片段克隆到pFSE4-AlcA-Glu11-GUSint-nos上。将所得到的FseI插入片段插入pVB6上，产生最终的烟草转化载体(图28)。Stig1-AlcR-nos-AlcA-Glu11-GUSint-nos该结构是按上述方法制备的，所不同的是将由烟草克隆的雌蕊传递通道特异Stig1启动子(参见下文)作为EcoRI-EcoI片段克隆到pSK-AlcR-nos上，进行上文所述的其他操作(图29)。例7构建载体，以便评价雄性启动子的组织专一性pMS14-GUS将源于MS14(Wright等1993)的5.8kb启动子片段融合到GUS报导基因上。仅仅在花芽发育的早期阶段在花药中检测到GUS的表达，但在叶片中未检测到其表达。pMS14-芽孢杆菌RNA酶将相同的启动子片段融合在芽孢杆菌RNA酶上，以便产生玉米转化载体ZM/RMS14(图30)。该融合体还含有一个框外芽孢杆菌RNA酶抑制剂基因和一个功能性细菌启动子，以便在克隆步骤中提供对芽孢杆菌RNA酶的保护。获得转基因玉米植物，并且进行若干进一步分析。通过分析由源于与完全可育的植物的花粉杂交产生的后代对植物WU25的某些细节进行研究。通过PCR证实所有后代都遗传了所述转基因，并通过叶片涂抹检测pat基因是完全不育的，而缺乏所述转基因的后代是完全可育的。不育的雄花一般小于可育姊妹株的雄花，并携带缺乏花粉的花药，并且不能从雄花上分离。在其他所有方面不育植株与其可育的非转基因姊妹株没有差别。pC5-GUS业已分离了源于玉米的果胶甲基酯酶基因组克隆(如图61所示，被称为C5)，并将所述启动子用于和GUS组成的转录融合体中，以便研究组织特异性。通过农杆菌属介导的转化将所述载体导入烟草，并在卡那霉素上选择转化体。收获来自开裂花药的花粉粒，并染色分析GUS活性。有两个植株表现出大约50％的兰色染色花粉。在非转基因对照中未出现染色。用包括各种发育阶段的花药在内的多种组织制备提取物，并通过荧光测定分析GUS表达。在除了发育中的和开裂花药以外的组织中仅观察到极低水平的表达。小孢子染色表明，表达的时间与Northern数据十分吻合，Northern分析表明ZmC5启动子在其天然环境中在转基因烟草和玉米中在花粉发育的后期起作用。pMOG1006-C5-GUS(稻)用EcoRI和BamHI裂解C5-GUS(Bin)，以便产生2.1kbBamHI-EcoRI片段(GUS-nos)，将该片段克隆到EcoRI-BamHI裂解的pMOG1006上，然后将1.9kb的BamHI片段(C5启动子)克隆到该pMOG1006-GUS-nos上，以便产生最终载体pMOG1006-C5-GUS，通过测序证实该启动子的取向(图31)。pMOG1006-MFS14-GUS(稻)利用BamHI从RMS30(图41)上分离2.3kb的MFS14启动子，并克隆到pFSE上(图32)。然后将来自pGUN的GUS内含子框作为PstI片段克隆到pFSE-MFS14载体上。然后将完整的MFS14-GUSint-nos片段作为FseI片段克隆到pMOG1006-Fse(图33)上。例8制备产生不育性并恢复可育性的载体制备框A-MFS14-芽孢杆菌RNA酶nos-一种显性孢子体雄性不育框以EcoRI-HindIII片段形式从RMS14中分离nos终止子，并克隆到用相同的两种酶裂解过的pSK+上。用HindIII消化所得到的质粒，并将具有以下序列的退火的互补寡核苷酸对Link2A AGCTTCTGGAATTCGTCT
Link2B AGCTAGACGAATTCCAGA即编码与所述裂解载体连接的ΔHindIII-EcoRI-HindIII。将推测的转化克隆划线到尼龙膜上，并按常规方法用由γ32P标记的Link2A寡核苷酸探测。通过测序分析多个阳性克隆，并选择其取向为其中的HindIII位点相对两个EcoRI位点来说处于其内部的克隆作进一步操作。将从RMS14上分离的并携带MFS14启动子和芽孢杆菌RNA酶和芽孢杆菌RNA酶抑制剂编码序列的HindIII连接到用HindIII裂解过，并用河虾碱性磷酸酶处理过以防其再连接的上述载体上。通过序列分析鉴定含有处于所需取向的HindIII片段的转化体(图34)。以EcoRI片段形式将携带MFS14-芽孢杆菌RNA酶/芽孢杆菌RNA酶抑制剂-nos的完整片段插入pVB6和pMOG1006-Fse上，通过pFse4导入稻和烟草。制备框B-C5-芽孢杆菌RNA酶-一种显性配子体雄性不育框通过将一种寡核苷酸接头MKLINK4(5’TCGATTCGGCGGCCGCCGAA-3’)插入消化过的SalI位点，用NotI识别位点取代pBluescriptSK+(Stratagene)的单一的SalI位点。将携带芽孢杆菌RNA酶编码区及其随后的细菌启动子启动的芽孢杆菌RNA酶抑制剂编码区的0.9kb的BamHI-HindIII片段插入修饰过的pBluescript的相应片段上。将位于HindIII-NotI片段上的nos终止子插入所得到的载体的相应片段上。然后用Stratagene的Quiak Change系统，按照生产商的说明使用寡核苷酸DAM-3A(5’-GGTCGACTCTAGAGGAACCCCGGGTACCAAC-3’)和DAM-3B(5’-GCTTTACCCGGGGTTCCTCTAGAGTCGACC-3’)除去不希望的BamHI位点。用BamHI完全消化得到的质粒(被命名为pSK-BBN)，用河虾碱性磷酸酶去磷酸化(37℃，1小时)。将C5 5’旁侧区的1.9kb的BamHI片段连接到它上面，然后用BamHI和PstI消化分别检查所述插入片段的存在和方向。所得到的质粒被命名为pSK-C5-BBN(图35)。然后将整个框以EcoRI-NotI片段形式除去，连接到二元植物转化载体pVB6上。然后通过冻融法将该结构导入根癌农杆菌中。用标准方法将所述DNA导入烟草。制备框C-35S-AlcR-nos
从被称为pUC3的载体上分离EcoRI-HindIII片段，该片段含有AlcR编码序列和nos终止子。将该片段克隆到EcoRI-HindIII裂解过的pSK+上。将具有ΔHindIII-NotI-PmeI-ΔHindIII的限制位点的具有以下序列的退火的互补寡核苷酸对插入所述HindIII位点，从而在该表达框的3’末端增加PmeI和NotI位点，并去掉HindIII位点Link5AAGC TAT TAG CGG CCG CTA TGT TTA AAC GCG TLink5BAGC TAC GCG TTT AAA CAT AGC GGC CGC TAA T将源于pUC3的携带35S CaMV启动子的EcoRI片段克隆到EcoRI位点上，并通过限制和序列分析定向(图36)。可以NotI片段形式将整个框切除，作进一步操作，它含有PmeI位点，可将AlcA-Glu11-芽孢杆菌RNA酶抑制剂-nos框插入该位点。制备框D-AlcA-Glu11-芽孢杆菌RNA酶抑制剂-nos用XhoI和NcoI消化载体pMJB1，并除去TMVΩ增强子。按常规方法将编码葡聚糖115’UTR并且其旁侧为XhoI和NcoI位点的两种寡核苷酸退火，并连接到所述裂解过的载体上Glu1 TCG AGA CAA TTT CAG CTC AAG TGT TTC TTA CTC TCT CAT TTCCAT TTT AGCGlu11 CAT GGC TAA AAT GGT TTT GAG AGA GTA AGA AAC ACT TGA GCTGAA ATT GTC用HindIII和XhoI消化所述测序载体，以便除去35SCaMV启动子，并将AlcA启动子连接到HindIII-XhoI片段上。通过PCR由RMS9获得具有NcoI和BamHI末端的编码芽孢杆菌RNA酶抑制剂的片段。然后将该片段插入上述用NcoI-BamHI裂解过的载体，得到具有AlcA-Glu11-芽孢杆菌RNA酶抑制剂-nos的完整的框。为了便于对该框进行操作，通过使用编码ΔHindIII-PmeI-HindIII和ΔEcoRI-PmeI-ΔEcoRI的寡核苷酸在所述框的每一个末端添加一个PmeI位点(图37)。这使得该框能插入上述35S-AlcR-nos框上，使得AlcA/R开关的两个部分能作为NotI片段形式转移到pFSE4上。制备框EMFS14-Glu11-芽孢杆菌RNA酶抑制剂-nos-一种雄性育性恢复框将携带MFS14启动子3’末端320bp的BamHI-SacI片段克隆到BamHI-SacI裂解过的pSK+上。用购自Qiagen的试剂盒按照标准方法除去HindIII位点。用于除去所述位点的寡核苷酸具有以下序列MKM1A CGG TAT CGA TAA GCT AGA TAT CGA ATT CCT GMKM1S CAG GAA TTC GAT ATC TAG CTT ATC GAT ACC G通过限制分析和测序证实所述位点的缺失。然后通过插入编码ΔSacI-HindIII-SacI位点的退火寡核苷酸，将新的HindIII位点导入SacI位点附近。
SHSLINK1 CCT AAA GCT TAT ACA GCTSHSLINK1 GTA TAA GCT TTA TGA GCT通过限制分析证实所述新位点的存在，并通过测序证实所述接头的正确取向。理想的取向使得所述HindIII位点相对BamHI位点而言位于SacI位点外面。然后用相同方法使用编码ΔBamHI-XhoI-ΔBamHI的寡核苷酸除去BamHI位点，并导入一个新的XhoI位点。它具有以下序列Link6 GAT CGT ATC TCG AGA TAC按常规方法证实BamHI位点的缺乏和XhoI位点的导入。
用BamHI和SacI消化RMS14，并分析编码MFS14启动子的其余部分的5.5kb的片段。然后将该片段插入上述用BamHI-SacI裂解过的载体上，并通过测序证实该启动子的完整性。然后以HindIII-XhoI框的形式将整个MFS14启动子切除，并插入框D，并在将接头添加到其末端之前取代AlcA启动子，对该框来说，使用在每一个末端导入SwaI位点的接头(图38)。制备框F Stig1-芽孢杆菌RNA酶-nos-一种雌性孢子体不育框将一个BamHI位点导入靠近载体pSK-STIG1上的STIG1启动子的翻译起始位点处。这一目的是使用Stratagene的Quick Change试剂盒用以下寡核苷酸实现的ST1-BA(5’-GATAAAAGCCATAATTGGATCCTGGTGGTTTCTGC-3’)和ST1-BS(5’-GCAGAAACCACCAGGATCCAATTATGGCTTTTATC-3’).
然后以BamHI片段形式将1.6kb的STIG1启动子切除，并克隆到BamHI消化过的pSK-BBN上。通过在载体和启动子序列之间的PCR扩增测定所述启动子的存在和正确方向。以NotI-EcoRI形式将STIG1-BBN框转移到载体pFse4上，所得到的质粒被称为pFSE4-STIG1-BBN(图39)上。然后将完整的框作为FseI片段转入VB6上。制备框G Stig1-Glu11-芽孢杆菌RNA酶抑制剂-nos-一种雌性育性恢复框对结构pAlcA-Glu11-芽孢杆菌RNA酶抑制剂-nos-pp进行修饰，用EcoRI位点取代HindIII位点。这一目的是用Stratagene的Quick Change试剂盒和以下寡核苷酸实现的DAM-6A(5’-CGGAACTATCCCGAATTCTGCACCGTTTAAACGC-3’)和DAM-6S(5’-GCGTTTAAACGGTGCAGAATTCGGGATAGTTCCG-3’).
将XhoI位点导入载体pSK-STIG1上靠近STIG1启动子的翻译起始位点。这一目的是用Stratagene的Quick Change试剂盒和以下寡核苷酸实现的ST1-XA(5’-GATAAAAGCCATAATTGGCTCGAGGTGGTTTCTGCTGAG-3’)ST1-XS(5’-CTCAGCAGAAACCACCTCGAGCCAATTATGGCTTTTATC-3’).
然后以XhoI-EcoRI片段形式将1.6kb的STIG1启动子切除，并克隆到通过用XhoI和EcoRI消化pAlcA-gluII-芽孢杆菌RNA酶抑制剂-nos-pp产生的较大的片段，用STIG1启动子取代AlcA启动子(图40)。以PmeI片段形式将所述完整的框切除，并克隆到pVB6和pMOGl006-Fse上。制备可以开关的TPS载体-AlcA-TPS-nosTap1-AlocR-nos业已披露了Tap1-AlcR-nos框。用TPS取代pAGS上的GUS基因，并将新的框作为HindIII框克隆到pFSE4上。将上文所披露的Tap1-AlcR-nos作为NotI片段克隆到pFSE4-AlcA-TPS-nos载体上。切除完整的Fse1片段，并克隆到pVB6上。现在将该载体用于重新转化烟草，通过用具有Tap1-TPP-nos表达框的结构转化使其不育。例9制备植物转化载体可以在pFSE4上对上述框进行任意组合，然后将所得到Fse1片段转入pMOG1006-Fse或pVB6上，以便转化到烟草或稻中。
业已进行了以下组合，作为植物转化载体A+C+D＝孢子体雄性不育植物，其育性可以通过对恢复基因进行化学诱导恢复E＝孢子体雄性可育恢复植物，当它授粉到上述植物上时，在其后代中恢复育性F+C+D＝孢子体雌性不育植物，其育性可以通过对恢复基因进行化学诱导恢复G＝孢子体雌性可育恢复植物，当它由上述植物授粉时产生雌性可育后代B+D＝配子体雄性不育植物，其育性可以通过对恢复基因进行化学诱导恢复本文所披露的F1杂交植物的亲本的产生是通过以下方式实现的父本，即雌性不育框F Stig1-芽孢杆菌 雌性不育性RNA酶框E MFS14-Glu11-芽孢 雄性恢复基因杆菌RNA酶抑制剂框C 35S-AlcA-nos 开关部分框DAlcA-Glu11-芽 孢 “”杆菌RNA酶抑制剂母本，即雄性不育框AMFS14-芽孢杆菌 雄性不育性RNA酶框GStig1-Glull-芽孢 雌性恢复基因杆菌RNA酶抑制剂框C35S-AlcA-nos 开关部分框DAlcA-Glu11-芽孢 “”杆菌RNA酶抑制剂例10构建载体，测定新的猪基因RMS30和RMS32(烟草)将来自ptubulin的Hinf1片段形式的微管蛋白基因克隆到上面制备的pFSE-MFS14上。将所得到MFS14-微管蛋白-nos作为FSE片段克隆到pVB6上，产生RMS30(图41)。
以BamHI片段形式将MFS14+lac操纵子启动子从RMS32上切除，并克隆到pFSE上。在插入所述微管蛋白基因之后，将MFS14-lac-op-微管蛋白-nos FseI片段克隆到pVB6上，产生RMS32(图42)。RMS30和RMS32(稻)将含有MFS14启动子(+/-lac op)-微管蛋白-nos的FseI片段克隆到pMOG1006-Fse上，产生植物转化载体。优化海藻糖-磷酸磷酸酶(TPP)和海藻糖-6-磷酸水解酶(TreC)，以便用于在玉米上产生不育性用于在玉米中表达的TPP和TreC编码区的优化形式(在每一个密码子的丰余位点具有对G或C的偏嗜)是由Operon技术公司合成的。核苷酸序列是由其氨基酸序列推导的，使用在活体中以高于1.0％的比例存在、并且以能代表天然发生比例的频率出现的密码子(按照Genbenk密码子使用数据库，Release108)。还包括靠近翻译起始位点的有用的限制酶位点，包括BamHI和NcoI，以及位于3’末端的PstI位点，以便于克隆。测定优化的TPP和TreC玉米密码子使用的结构使用Stratagene的Quick Change系统用以下核苷酸除去位于载体pFSE-MFS14上的MFS14启动子的5’末端的BamHI位点DAM-7A 5’-CGATGCTTTCGGAACCGGTACCGAATTCG-3’DAM-7S 5’-CGAATTCGGTACCGGTTCCGAAAGCATCG-3’然后以BamHI和PstI片段形式将合成的TPP和PreC基因切除，并克隆到修饰过的pFSE-MFS14载体的MFS14启动子和nos终止子之间。将adh1内含子插入所述启动子和编码序列之间，以便提高表达水平。然后将完成的框转入以pUC为基础的克隆载体上，该载体含有IGPD细菌选择标记和除草剂抗性基因框，以便选择转基因植物。例11生产转基因植物业已通过农杆菌属介导的转化将pSRN.AGS导入烟草、油菜和番茄(这些植物被称为Alc-GUS植物)，将pMOG1006-Fse-SRNAGS和pMOG1006-C5-GUS导入稻。
业已通过农杆菌属介导的转化将含有上述任一种表达框组合的植物转化载体导入烟草和/或稻。通过PCR分析外殖体，将含有完整插入片段的外殖体无性繁殖，并转移到温室中生长到开花。另外，业已将RMS30和32导入烟草。
业已通过微粒轰击方法将pUIRN.AGS导入小麦和玉米，通过与携带一种选择标记的质粒同时进行轰击回收转基因植物。通过微粒轰击将用于测定各种部分的其他载体转入玉米。例12分析转基因植物对由AlcA启动子启动的GUS表达的研究在组织培养物中为了确定在用含有诸如芽孢杆菌RNA酶的细胞毒性基因连接的启动子的结构转化之后植物是否能够恢复，特别是所述启动子在转化过程的愈伤组织阶段具有某些表达的情况下，研究了在烟草愈伤组织中的表达，以便确定GST27启动子的表达是否是组成型的，或者是否可以通过使用乙醇诱导。
将在标准组织培养条件下生长的4周龄Alc-GUS(35S-AlcR-nos/AlcA-GUS-nos)烟草植物，用于测定AlcA启动子在愈伤组织中使用和不使用乙醇的条件下的表达。产生叶片，并放置到添加了3％(w/v)蔗糖和0.8％(w/v)细菌用琼脂、1微克/毫升6-BAP和100ng/ml NAA激素的MS培养基上。将其中的某些叶片放置到含有0.1％(v/v)乙醇的同一种培养基上。3周之后，当愈伤组织已经形成时，将愈伤组织的样品用于荧光GUS测定，其结果如图43所示。GUS含量表明，AlcA启动子在愈伤组织中是渗漏的，并且其含量随着向植物组织培养基中添加乙醇而提高。因此，可以用启动恢复基因的AlcA启动子恢复转基因，该启动子与用于启动细胞毒性基因的启动子处于相同的结构上。在温室中业已证实，在通过喷雾、蒸汽或灌根使用化学诱导物乙醇时，AlcA/R基因开关能在烟草叶片中对报导基因或性状基因进行高水平诱导(Caddick等，Salter等)。将转基因AlcA-GUS烟草、油菜和番茄植物用于在花组织中检测基因诱导。烟草1)用一个塑料袋密封AlcA-GUS烟草花茎，并将一个装有50ml 5％乙醇的小罐放在袋里面。3天之后，收集来自不同花芽阶段的花药，分析GUS表达。结果如图44所示。图中示出了来自野生型、未诱导过的AlcA-GUS和诱导过的AlcA-GUS植物的4种独立的花芽的GUS值。花芽长度用毫米表示，每一个棒表示5个花药。以上曲线表明，与未接受乙醇蒸汽处理的AlcA-GUS植物相比，来自诱导过的植物的花药含有较高水平的GUS。
2)切割野生型和Alc-GUS烟草植物的花茎，并放入装有300毫升水、1％、2％或5％乙醇的烧杯中，并在温室中放置2天，然后从花芽上收集花药用于荧光GUS分析。图45是表示来自该实验的GUS数据的棒图，表示源于野生型、水处理的Alc-GUS花茎和1％、2％或5％乙醇处理的Alc-GUS花茎。该实验还证实，在所述花药中通过乙醇诱导的报导基因的表达水平高于在用水处理的花中的表达水平。来自诱导过的AlcA-GUS花药的GUS表达水平高于MSF14-GUS植物的表达水平。
3)在温室中用250毫升水或5％乙醇对成熟AlcA-GUS烟草植物进行灌根。同样用乙醇处理野生型和35S-GUS植物。2天之后，解剖来自各种大小花芽的雌蕊，并染色进行GUS活性分析。图46表示来自水和5％乙醇处理的Alc-GUS植物的9-10毫米花芽的雌蕊。照片清楚地表明，乙醇处理在雌蕊中导致了GUS诱导。图47和48表示，来自同样用水处理和乙醇处理的Alc-GUS植物的17-22毫米和33-35毫米花芽的雌蕊的柱头/花柱区。与类似于野生型的水处理过的植物相比，在整个该部位出现GUS染色。
4)另外，试验了Alc-CAT植物(35S-AlcR-nos/AlcA-CAT-nos)，并证实了在用乙醇诱导之后在花组织中报导基因水平的提高。
油菜1)在第0天和第1天用250毫升水、1％或2％乙醇对油菜(OSR)AlcA-GUS植物进行灌根。在第一次诱导之后2天从上述植物采集花的样品。用于荧光GUS分析的样品是来自成熟花的花药(成熟表示它们是完全开裂的)，来自成熟花的柱头/花柱，来自未成熟花的花药(具有未开裂花瓣的花芽)，来自未成熟花的柱头/花柱以及包括子房在内的花雌蕊的其余部分。
图49图解表示GUS数据，并且从左至右表示来自水诱导的Alc-GUS，1％乙醇诱导的Alc-GUS和2％乙醇诱导Alc-GUS油菜植物的结果。每一部分中的头两个棒分别表示未诱导过的花药和未诱导过的柱头/花柱GUS含量。每一个棒表示3次重复，每一次重复含有来自3种不同花的花药或来自8种不同花的柱头/花柱或来自6种不同花的子房。
以上数据清楚地表明，与水处理的油菜相比，在乙醇诱导的植物上在花组织中GUS含量提高。在2％乙醇处理过的植物上所检查过的所有组织中，均表现出GUS高于未诱导过的含量和水处理的对照植物的含量。
2)在用乙醇诱导之后，对油菜Alc-GUS花进行GUS染色。图50是在诱导之前Alc-GUS花的照片，而图51是在用250毫升5％乙醇灌根之后2天用来自同一株植物的花的照片。图中表明，所述处理导致了报导基因在柱头/花柱部位以及花丝中的诱导。
图52表示去掉了萼片和花的未成熟花芽。与左侧的水处理的对照相比，右侧的乙醇处理的植物表现出在柱头/花柱部位表达GUS。图53-55是其进一步例子。图56表示来自野生型和水诱导油菜Alc-GUS植物的雌蕊切片。图57表示来自用2％乙醇灌根的植物的在取得花的样品之前2天的雌蕊切片。图中表明了GUS在整个雌蕊部位的诱导。图58表示来自水处理植物和5％乙醇处理植物的雌蕊。再次证实了使用化合物乙醇在雌性组织中导致了GUS诱导。
图59表示来自一种实验的花，其中切割花茎，并放入5％乙醇的烧杯中，在其中放置2天，然后对整个花进行染色检测GUS活性。在所述花的花丝、萼片、花瓣和柱头/和花柱部位蓝色染色是明显的。番茄以上述诱导烟草花的方法，用乙醇蒸汽诱导Alc-GUS番茄花。在诱导之后2天，对花药和花粉进行染色，以便检测GUS表达。从图60a和60b中可以看出，在两种组织中观察到蓝色染色。稻前面测试Alc开关的诱导能力实验包括水培试验，包括对叶片进行2天的乙醇蒸汽处理，然后测定GUS活性。一旦放入温室中，在脂膜形成/开花期之前和期间用1-5％乙醇灌根，以便研究GUS在花组织中表达的诱导。GUS测定在2-300微升提取缓冲液(100mM磷酸钠缓冲液pH7，10mM EDTA，0.1％Triton X-100，1％十二烷基肌氨酸钠，10mM b-巯基乙醇)中研磨花材料。在离心机中离心样品15分钟，并将5微升上清液用于Bradford蛋白测定，用BSA做标准物。用提取缓冲液以1∶5的比例稀释20微升样品，并加入400微升测定缓冲液(与提取缓冲液相同，所不同的是含有lmM 4-MUG和20％甲醇)。取100微升(T0样品)并加入900微升终止缓冲液(0.2M碳酸钠)中，其余部分在37℃下温育2小时，然后再取100微升(T2样品)，加入900微升终止缓冲液中。
在分光光度计上测定样品的荧光，GUS以每小时每毫克蛋白的nM4M U表示。小麦用pUIRN.AGS对小盾片组织进行轰击，并用乙醇蒸汽处理该组织。2-3天之后染色分析GUS表达，当出现多个蓝色斑点时，表明AlcA启动子被诱导，导致了GUS表达。
将所获得的转基因Alc-GUS植物生长到成熟并收获种子，以与上文所述水稻相同方式测定其后代植物中诱导型GUS表达。GUS组织化学为了进行GUS染色，使用Blume和Grierson(1997)的方法。不育性研究1)雄性不育植物a)根据花粉的缺乏或死花粉的存在，鉴定由框A转化产生的孢子体雄性不育植物。通过以野生型烟草作为花粉供体进行回交生产种子。
b)通过对花粉进行活体染色，鉴定由框B转化产生的配子体不育植物，50％的花粉是不育的，50％的花粉可育。
2)雌性不育植物根据其不能由野生型花粉授粉杂交的特征，鉴定由框F转化产生的孢子体雌性不育植物。在两种情况下通过框E和G转化产生的恢复植物是自花授粉的，种植后代，并按常规方法通过对T2种子进行卡那霉素选择，筛选纯合品系。育性的诱导恢复预计孢子体不育植物和野生型植物杂交的后代会出现1∶1的不育性分离，同时出现转基因，并在生长早期阶段通过PCR分析进行选择。进行诱导实验，以便研究育性的恢复，因为所述不育植物可以通过灌根或喷雾或使用蒸汽用乙醇处理以便诱导芽孢杆菌RNA酶抑制剂在相关菌株中表达。预计在合适的时期诱导能进行自花授粉并产生种子，然后，可以方便地进行统计。用常规方法从所得到的后代中筛选纯合植物，并用于通过与纯合的恢复植物杂交测定组成型恢复。
不过，让C5-芽孢杆菌RNA酶.AlcA-芽孢杆菌RNA酶抑制剂植物与野生型植物回交或自交可以导致一种群体的恢复，其中50％是完全可育的，50％产生花粉仅有50％是可育的。不过，这些植物可以用乙醇喷雾、灌根或蒸汽处理进行诱导，以便在发育中的花粉中表达芽孢杆菌RNA酶抑制剂，从而进行自花授粉。在这种情况下，纯合植物是100％不育的，而半纯合的植物是50％不育的。通过染色所获得的结果的差别，可以归结为诱导和自花授粉的效力。异花授粉对育性的组成型恢复雄性不育植物与雄性恢复植物的杂交是通过将恢复植物的花粉转移到雄性不育植物的雌蕊上实现的(在除去所有花药之后进行，即使这些花药仅含有死花粉)。然后对授粉的雌蕊进行套袋，以防被野生型或其他环境中的其他花粉污染。收获所产生的种子。种植后代，观察并测定花粉的产生。用这种方法恢复育性可导致正常花粉产生。
雌性不育植物的杂交是通过将该植物上的花粉转移到雌性可育性恢复植物的雌蕊上而实现的，同样是在所述植物上除去花药之后进行。按上述方法将花套袋。收获所产生的种子。种植其后代并对花进行套袋。观察这些植物自花授粉的能力。以这种方法恢复的育性使得自花授粉可以发生。用相同方法分析由框E和F，即用雌性不育、并携带雄性恢复基因转化产生的植物，和用框A和G，即雄性不育并携带雌性恢复基因转化产生的植物。
在不超出本发明范围的前提下，对本发明的其他改进在本领域技术人员看来是显而易见的。
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WO94/13822稳定转化小麦的方法，Ciba Geigy。
权利要求
1.一种制备杂交种子的方法，包括相间种植雄性可育并且纯合隐性雌性不育的父本植物和纯合隐性雄性不育并且雌性可育的母本植物，进行异花授粉，并获得由此产生的种子。
2.如权利要求1的方法，其中，在每一种亲本植物的基因组DNA上整合了一种基因结构，该结构包括对外源化学诱导物的存在或缺乏有反应的启动子序列，该序列任选有效连接于一个或几个翻译增强子或内含子序列上，后者有效连接于一个能完全恢复每一种亲本植物的育性的基因上，所述基因是通过在所述植物上使用一种外源化学诱导物而表达的，从而每一种亲本能自花授粉。
3.如权利要求1-3中任一项的方法，其中，所述母本植物具有纯合的隐性基因，该基因能明显破坏有活力的花粉的生物合成，或减弱花粉的生活力。
4.如权利要求1-3中任一项的方法，其中，所述父本植物的隐性基因是纯合的，该基因能破坏胚珠、花柱、柱头产生或功能或花粉萌发，粘接，水合，花粉管生长或导向。
5.如权利要求2-4中任一项的方法，其中，所述对外源化学诱导物的存在或缺乏有反应的启动子序列是AlcA启动子序列或GST-27启动子序列。
6.如上述权利要求中任一项的方法，其中，所述亲本植物是小麦、大麦、稻、玉米、番茄、向日葵、甜菜、canola、棉花、大豆和其他蔬菜。
7.如上述权利要求中任一项的方法，其中，所产生的F1杂交种子所产生的植物是完全可育的。
8.如上述权利要求中任一项的方法，其中，所产生的F2杂交种子所产生的植物会发生不育性分离，大约25％是雌性的不育的。
9.如上述权利要求中任一项的方法，其中，所述亲本的不育性是由天然或遗传操作的突变导致的。
10.将上述上述权利要求中任一项所述方法用于生产杂交种子的用途。
11.通过权利要求1-9的方法生产的可育植物。
12.如权利要求11的植物的后代，所述植物和所述后代的种子。
13.一种表达框，包括(a)第一基因启动子序列，它是雄花特异性启动子；(b)编码一种能够破坏雄性育性的产物的破坏基因，该基因有效连接于所述第一基因启动子序列上；(c)第二基因启动子序列，它是可任选有效连接于一个或几个翻译增强子或内含子序列上的雌花特异性启动子序列；(d)编码一种能够恢复雌性育性的产物的恢复基因，它有效连接于所述第二基因启动子序列上；(e)对一种外源化学诱导物的存在或缺乏有反应的第三基因启动子序列，它可任选有效连接于一个或几个翻译增强子或内含子序列上；和(f)编码一种能够恢复雄性育性的产物的恢复基因，它有效连接于所述第三基因启动子序列上；因此，所述外源化学诱导物的存在能够控制雄性可育性。
14.如权利要求13的表达框，其中，所述破坏基因编码一种能够破坏花粉产生的产物。
15.如权利要求13的表达框，其中，所述破坏基因编码一种能在植物的毡绒层细胞中表达的产物。
16.如权利要求13-15中任一项的表达框，其中，所述第三基因启动子序列是AlcA启动子序列或GST-27启动子序列。
17.一种表达框，包括(a)第一基因启动子序列，它是雌花特异性启动子序列；(b)编码一种能够破坏雌性育性的产物的破坏基因；(c)第二基因启动子序列，它是可任选有效连接于一个或几个翻译增强子或内含子序列上的雄性组织特异性启动子序列；(d)编码一种能够恢复雄性育性的产物的恢复基因，它有效连接于所述第二基因启动子序列上；(e)对一种外源化学诱导物的存在或缺乏有反应的第三基因启动子序列，它可任选有效连接于一个或几个翻译增强子或内含子序列上；和(f)编码一种能够恢复雌性育性的产物的恢复基因，它有效连接于所述第三基因启动子序列上；因此，所述外源化学诱导物的存在能够控制雌性可育性。
18.如权利要求17的表达框，其中，所述恢复基因编码一种能够恢复花粉生产的产物。
19.如权利要求17的表达框，其中，所述恢复基因编码一种能在毡绒层细胞中恢复花粉产生的产物。
20.如权利要求17-19中任一项的表达框，其中，所述第三基因启动子序列是AlcA启动子序列或GST-27启动子序列。
21.一种生产杂交种子的方法，包括将权利要求13-16中任一项所述的表达框整合到第一种植物中，以便产生半纯合的母本植物，并将权利要求17-20中任一项所述的表达框整合到第二种植物中，以便产生半纯合的父本植物；将一种外源化学诱导物施加在所述转化体上，从而使得该植物自花授粉；由所得到的种子长成植物；选择雄性和雌性纯合植物；让所选择的雄性和雌性植物杂交；和获得所产生的杂交种子。
22.如权利要求21的方法，其中，所述雄性植物包括能恢复雄性育性的纯合显性基因。
23.如权利要求21或22的方法，其中，所述雌性植物包括能恢复雌性育性的纯合显性基因。
24.如权利要求21-23中任一项的方法，其中，所述产生的F1杂交种子能产生植物，该植物的花药产生大约50％的可育花粉，而权利要求13-16中任一项所述的表达框的第一基因启动子序列是配子体启动子序列。
25.权利要求21-23中任一项的方法，其中，所述产生的F1杂交种子能产生全部是完全可育的植物，而权利要求13-16中任一项所述的表达框的第一启动子序列是孢子体启动子序列。
26.权利要求21-25中任一项的方法，其中，所述F2杂交种子所产生的植物会发生不育性分离，其中大量的植物是雌性不育的。
27.权利要求21的方法，其中，所述雄性和雌性纯合植物可以繁殖并通过在该植物上使用外源化学诱导物从而使得该植物能自花授粉而得以保持。
28.权利要求21-27中任一项的方法，其中，所述植物是小麦、稻、玉米、番茄、向日葵、甜菜、canola、棉花、大豆或其他蔬菜。
29.用权利要求13-20中任一项所述表达框中的一种或几种转化的植物组织或其部分和由所述转化的植物组织产生的材料。
30.包括权利要求29的组织或材料的可育的全植株。
31.上述权利要求的植物的后代，所述后代包括整合，优选稳定整合到其基因组上的权利要求13-20中任一项所述表达框中的一种或几种，或其部分，以及所述植物和所述后代的种子。
32.一种植物，其基因组包括权利要求13-16中任一项的表达框。
33.一种植物，其基因组包括权利要求17-20中任一项的表达框。
34.通过让权利要求32的植物与权利要求33的植物杂交并获得由此产生的杂交种子所生产的杂交种子。
35.将权利要求21-28中任一项所述方法用于生产杂交种子的用途。
36.一种转化植物的方法，包括将权利要求13-16或权利要求17-20中任一项所述的表达框整合到所述植物的基因组上，其中，所述有效连接于第三种基因启动子序列上的恢复基因在目标组织中是诱导型形式表达的，但也可以在一种或几种其他组织中以组成型形式表达，以便所述破坏基因只能在目标组织中起作用。
37.如权利要求36的方法，其中，所述恢复基因在愈伤组织中是以组成型形式表达的。
38.如权利要求36或37的方法，其中，所述恢复基因在雄花或雌花结构中是以诱导型形式表达的。
39.如权利要求36-38中任一项的方法，其中，所述第三基因启动子序列是GST-27启动子序列。
40.如权利要求36-38中任一项的方法，其中，所述第三基因启动子序列是AlcA启动子序列。
41.一种大体上如上文所述并参照图2、6和7中任一个的生产杂交种子的方法。
42.一种大体上如上文所述并参照图1和3-5中任一个的表达框。
全文摘要
披露了制备杂交种子的方法,上述方法包括将雄性可育并且纯合隐性雌性不育的父本植株和纯合隐性雄性不育和雌性可育的母本植株相间种植在一起,进行异花授粉,并获得由此所产生的种子。每一种亲本植株的基因组材料上还可以整合一种基因结构,该结构包括对一种外源化学诱导物的存在或缺乏有反应的启动子序列,并可任选有效连接于一个或几个增强子或内含子序列上,有效连接于能完全恢复每一种亲本植株的育性的基因上,所述基因是通过在所述植株上使用一种外源化学诱导物,以便使得每一种亲本异花授粉而得到表达。
文档编号C12N9/24GK1298450SQ99805258
公开日2001年6月6日 申请日期1999年1月22日 优先权日1998年2月20日
发明者M·E·奈特, I·杰普森, A·达利, M·W·贝利斯 申请人:曾尼卡有限公司