编码番茄β－半乳糖苷酶多肽的基因的制作方法

专利名称：：编码番茄β－半乳糖苷酶多肽的基因的制作方法
技术领域：
：本发明涉及编码多肽的新植物基因家族，所述多肽的特征在于其水解β-D-半乳糖苷的末端非还原性3-D-半乳糖基残基的能力。更具体地说，提供得自称为pZBG2-1-4(在美国临时申请第60/088,805中称为pTomβgal4)的cDNA克隆的多核苷酸序列，它编码称为β-半乳糖苷酶Ⅱ的特有植物多肽。还提供编码六种其它同源多肽的cDNA克隆、使用这些cDNA克隆生产本发明β-D-半乳糖苷多肽的方法以及通过使用本发明的多核苷酸或多肽改进果实品质的方法。
背景技术：
：涉及呼吸高峰果实采集后品质的最显著和最重要的处理是在成熟期间发生的结构、颜色、味道和芳香味的改变。因为结构方面的有害变化对品质和采集后保存期限具有重要影响，所以已经着重研究了与在番茄果实成熟期间发生的硬度损失有关的机制。尽管果实软化可能与膨压、解剖学特性和细胞壁完整性的变化有关，但一般认为导致细胞壁完整性丧失的细胞壁分解是关键因素。在组成成分和大小方面最明显的变化发生在细胞壁的果胶部分(参见在Seymour和Gross,1996中的参考文献)。已知在果实成熟期间发生在细胞壁果胶部分的变化包括可溶性、解聚作用、脱酯化作用增加以及含有侧链的中性糖的显著净损失(Huber,1983；Fischer和Bennett,1991；Seymour和Gross,1996)。最充分特征鉴定的果胶修饰酶是多聚半乳糖醛酸酶(内切-α1→4-D-聚半乳糖醛酸水解酶；E.C.3.2.1.15；PG)和果胶甲酯酶(E.C.3.1.1.11；PME)。尽管PG和PME在番茄果实成熟期间相对充裕并具有丰富活性，但在转基因植物中PG(Smith等1988,1990)或PME(Tieman等1992；Hall等1993)基因表达和酶活性被显著下调的果实仍然发生软化，尽管稍微延迟。而且，PG在非成熟突变体rin番茄果实中的过量表达没有造成软化，即使果胶明显发生明显解聚和溶解(Ginvannoni等，1989)。在其它已知的于果实发育期发生的果胶变化之中，最充分特征鉴定的一个变化是在许多成熟果实的细胞壁中发生的半乳糖基残基的显著净损失(Gross和Sams,1984；Seymour和Gross,1996)。尽管半乳糖基残基的一些损失可能是由PG的作用间接造成，但β-半乳糖苷酶(外切-β(1→4)-D-吡喃半乳糖苷；E.C.3.2.1.23)是在高等植物中鉴定出的唯一一个能够直接切割β(1→4)半乳聚糖键的酶，并可能在半乳聚糖侧链损失中起作用(DeVeau等，1993；Carey等，1995；Carrington和Pressey,1996)。尚未在高等植物中鉴定出内切作用的半乳聚糖酶。在成熟期的番茄中，β-半乳糖苷酶活性产物游离半乳糖(Gross,1984)急剧增加，并且叫做β-半乳糖苷酶Ⅱ的特定酶的活性相应增加(Carey等，1995)，这些现象支持β-半乳糖苷酶在成熟期对由细胞壁释放半乳糖基残基起作用的观点。据认为，β-半乳糖苷酶活性对细胞壁代谢重要(Carey等，1995)。通常使用人工底物，诸如对硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷(PNP)、4-甲基伞形基-β-D-吡喃半乳糖苷和5-溴-4-氯-3-吲哚酚-β-D-吡喃半乳糖苷(X-GAL)，检测β-半乳糖苷酶。然而，显然β-半乳糖苷酶Ⅱ也具有对天然底物即β(1→4)半乳聚糖的活性(Carey等，1995；Carrington和Pressey,1996；Pressey,1983)。在许多其它果实中已纯化和特征鉴定了β-半乳糖苷酶蛋白，所述果实包括猕猴桃(Ross等，1993)、咖啡(Golden等，1993)、柿子(Kang等，1994)和苹果(Ross等，1994)。Carey等(1995)能够从成熟番茄果实中纯化出三种以前鉴定的β-半乳糖苷酶(Pressey,1983)，但只有一种(β-半乳糖苷酶Ⅱ)对β(1→4)半乳聚糖有活性。虽然他们能够鉴定出推定的β-半乳糖苷酶cDNA克隆，但所述cDNA的推断的氨基酸序列没有一个匹配所述β-半乳糖苷酶Ⅱ蛋白的氨基末端序列。尽管已经纯化了存在于成熟期番茄(LycopersiconesculentumMill.)果实中并能够降解番茄果实半乳聚糖的β-半乳糖苷酶Ⅱ蛋白，但仍难以获得相应基因的克隆。利用几种方法已经实现了对植物基因表达的改进。分子生物学家可以由一系列降低或增加基因表达或改变特定基因的空间和时间表达的已知方法中选择。例如，已经利用特异性反义RNA或部分(截短的)有义RNA的表达降低植物中不同靶基因在植物中的表达(如Bird和Ray,1991,BiotechnologyandGenetic-EngineeringReviews9:207-227所论述)。这些技术包括将用来表达反义或有义RNA的合成基因加入到植物的基因组中。它们已成功用于向下调节与番茄果实的发育和成熟有关的一系列个体基因的表达(Gray等，1992,PlantMolecularBiology,i9:69-87)。还开发了增加靶基因表达的方法。例如可以将用来表达含有所述靶基因的完全编码区的RNA的另外的基因加入到所述植物的基因组中，以“过量表达”所述基因产物。已知各种其它改变基因表达的方法；例如使用可变调节序列。以上提及的每个参考文献的全部公开内容都通过引用完整结合到本文中。因此存在一种需要即克隆β-半乳糖苷酶Ⅱ和相关多肽的基因，并使用已知的改变植物基因表达的方法从而提供改变果实品质的方法，尤其是通过改变细胞壁，从而直接影响所述果实成熟的方法。发明概述本发明是基于对得自编码β-半乳糖苷酶的基因家族的cDNA克隆的新DNA序列的发现。在图1A、B中显示了基于对本发明DNA序列的共有氨基酸序列同一性的系统树。在图2中显示了5个cDNA克隆和2个逆转录酶PCR(RT-PCR)克隆，本文称为TBG1、TBG2、TBG3、TBG4、TBG5、TBG6和TBG7，它们分别具有称为SEQIDNO1-7的核苷酸序列，经鉴定它们与其它已知β-半乳糖苷酶具有高度共有序列同一性。对应的氨基酸序列本文分别称为SEQIDNO8-16，并示于图2和3。SEQIDNO1-7的核苷酸序列收录于GenBank，获得以下相应的收录号SEQIDNO:1TGB1AF0238471997年9月10日收录SEQIDNO:2TGB2AF1544201999年5月19日收录SEQIDNO:3TGB3AF1544211999年5月20日收录SEQIDNO:4TGB4AF0203901997年8月21日收录SEQIDNO:5TGB5AF1544231999年5月20日收录SEQIDNO:6TGB6AF1544241999年5月20日收录SEQIDNO:7TGB7AF1544221999年5月20日收录在以下的整个论述中，应当理解无论在本发明说明书中何处论及TBG4,TBG1-3和5-7也包括在该叙述中，除非另有说明。还提供一种方法，该方法通过克隆编码本发明蛋白(诸如β-半乳糖苷酶Ⅱ)的cDNA(例如pZBG2-1-4)，或通过由基因组DNA获得所述DNA序列，或通过用所述cDNA序列作为引导序列从头开始合成DNA序列，从而提供本发明的DNA序列。还提供改变细胞壁代谢的方法，该方法包括改变至少一种半乳糖苷酶的活性并因此改变所述果实的品质。本发明还提供DNA构建物，它包括在植物中有效的转录起始区控制下的部分或全部示范性β-半乳糖苷酶DNA序列，以使该构建物可以在植物细胞中产生RNA。还发现了与编码β-半乳糖苷酶的基因的表达相关的增强子/启动子。本发明还涉及重组载体(它包括本发明的分离的核酸分子)、包含所述重组载体的宿主细胞，以及产生这样的载体和宿主细胞的方法和使用它们通过重组技术产生β-半乳糖苷酶多肽或肽的方法。本发明还提供包含本发明的DNA构建物的植物细胞；由其产生具有改变的β-半乳糖苷酶基因表达的植物；和由这样的植物产生的种子。本发明的β-半乳糖苷酶Ⅱ蛋白已显示了其在导致组织完整性丧失和果实软化的细胞壁分解中的酶活性。所述β-半乳糖苷酶Ⅱ蛋白可能还涉及细胞壁代谢，细胞壁代谢可能与细胞延长和/或扩张有关，并因此与植物生长和发育有关。β-半乳糖苷酶可以通过水解细胞壁中的半乳糖使成熟开始和/或发展，因为半乳糖可能涉及单独或与非结合N-聚糖一起刺激乙烯产生。本发明的β-半乳糖苷酶可能涉及在果实成熟期间通过降解叶绿体膜半乳糖脂将叶绿体(绿色-叶绿素)转变为色质体(红色-番茄红素)。预期由示于图2的核苷酸序列代表的基因家族编码一组相似的酶，它们具有相同类型的水解活性，但具有不同的组织和/或底物特异性或细胞区室类型。本发明的β-半乳糖苷酶Ⅱ蛋白以及其它由示于图2的核苷酸序列编码的蛋白可用来制备果胶或其它得自细胞壁的具有降低的半乳糖基含量的聚合物，用于需要较低或较高交联或粘度特性的生物膜和溶液(例如澄清的果汁)。本发明还提供β-半乳糖苷酶用作酶混合物组成成分，用于分离原生质体。附图简述图1A和1B显示了在番茄β-半乳糖苷酶克隆TGB1-7和其它已知植物β-半乳糖苷酶多肽之间的基于共有氨基酸序列同一性的系统树。图2显示本发明的7个β-半乳糖苷酶基因(TGB1、TGB2、TGB3、TGB4、TGB5、TGB6和TGB7)的cDNA序列[分别为SEQIDNO:1-7]。图3显示番茄果实cDNA克隆TGB1、TGB2、TGB3、TGB4、TGB5、TGB6和TGB7的推断氨基酸序列[分别为SEQIDNO:8-16]和各种植物β-半乳糖苷酶cDNA克隆的推断氨基酸序列的多重序列对比。图4显示对在各种植物组织(花、叶、根和茎)中表达的TBG进行RNA印迹分析的放射自显影图。图5显示对在处于不同发育阶段的果实组织中表达的TBG进行RNA印迹分析的放射自显影图。图6显示对在果实组织(青熟(maturegreen)或转换期(turningstage)果实的果皮、外果皮(outerpericarp)、内果皮(innerpericarp)和子房室(locular))中表达的TBG进行RNA印迹分析的放射自显影图。图7显示对在正常和突变果实组织中表达的TBG进行RNA印迹分析的放射自显影图。图8显示对在乙烯处理的青熟果实组织中表达的TBG进行RNA印迹分析的放射自显影图。图9显示对酵母表达的TBG4的蛋白质印迹分析。图10显示对在大肠杆菌(E.coli)中表达的pZBG2-1-4的β-半乳糖苷酶活性的检测。图11A-E(1-4)显示包含抑制TBG4mRNA的反义构建物的番茄植物果实和亲代系果实的结构检测的对比结果。图12A-B显示对在包含TBG4反义构建物的转基因果实中表达的TBG4的RNA印迹分析。图13显示用于转化植物和以反义方向表达TBG4(pZBG2-1-4)的双元构建物(Binaryconstruct)。发明详述下文的详细描述涉及本发明的优选实施方案，并意欲说明每个本发明其它DNA序列。本发明提供含有编码β-半乳糖苷酶多肽(尤其是具有示于图2的氨基酸序列的β-半乳糖苷酶Ⅱ多肽)的多核苷酸的分离的核酸分子。本发明的示范性β-半乳糖苷酶ⅡcDNA克隆的DNA序列由编码β-半乳糖苷酶Ⅱ的cDNA克隆pZBG2-1-4测定，收录于GenBank，获得的收录号为AF020390。不是所有的β-半乳糖苷酶都对提取的细胞壁物质由包含β(1→4)-D-半乳聚糖的细胞壁聚合物中经释放半乳糖具有体外活性。已经表明，由示范性β-半乳糖苷酶Ⅱ克隆pZBG2-1-4表达的多肽具有β-半乳糖苷酶活性和外切半乳聚糖酶(exogalactinase)活性。如图2所示，本发明的示范性β-半乳糖苷酶Ⅱ蛋白和由以下cDNA克隆推断的氨基酸序列具有序列同源性，所述cDNA克隆为β-半乳糖苷酶cDNA克隆TBG2-7和芦笋(收录号P45582)、苹果(收录号P48981)和康乃馨(收录号Q00662)果实的cDNA克隆，本发明的示范性β-半乳糖苷酶Ⅱ蛋白还和分离自成熟‘AilsaCraig’果实的番茄β-半乳糖苷酶cDNA克隆(命名为pTomβgall，获得的收录号为P48980)的先前公开序列的β-半乳糖苷酶cDNA克隆序列具有序列同源性(Carey等，1995)。本发明人在此公开的TBG1克隆(收录号AF023847)的ORF与先前由Carey等描述的cDNA几乎相同。如图2所示，在所有公开的植物β-半乳糖苷酶的7个克隆(TBG1-7)和其它植物β-半乳糖苷酶中都具有高共有推断序列同一性。对所述数据库的BLAST检索也表明，在植物β-半乳糖苷酶与哺乳动物和真菌β-半乳糖苷酶的域之间存在明显的共有序列同一性，但用细菌β-半乳糖苷酶检测几乎没有共有序列同一性。如在图1中所示，TBG1和TBG3具有高共有氨基酸同一性。TBG4也非常类似于TBG1和3。TBG2和7的氨基酸序列是独特的，因为氨基酸插入的几个区似乎遍及其序列(图3)。核酸分子除非另有说明，否则通过测序本文的DNA分子确定的所有核苷酸序列都使用基于PCR的双脱氧核苷酸终止法和ABI自动DNA测序仪(诸如AppliedBiosytems,Inc.,FosterCity,CA的373型测序仪)测定，而所有的由本文测定的DNA分子编码的多肽的氨基酸序列都通过翻译如上测定的DNA序列推算。因此，如本领域对通过此自动方法测定任何DNA序列的了解，本文测定的任何核苷酸序列可能包含一些错误。通过自动装置测定的核苷酸序列与所测序的DNA分子的实际核苷酸序列通常具有至少约90％同一性，更通常至少约95％至至少约99.9％同一性。通过其它方法可以更精确的测定实际序列，包括在本领域广为人知的手工DNA测序法。本领域还知道，与实际序列相比，在所测定的核苷酸序列中单个的插入或缺失将在翻译所述核苷酸序列时产生移码，使得推算的由所测定的核苷酸序列编码的氨基酸序列与由所测序的DNA分子实际编码的氨基酸序列从此插入或缺失点开始完全不同。所述核酸分子或多核苷酸的“核苷酸序列”对于DNA分子或多核苷酸而言意指脱氧核糖核苷酸序列，而对于RNA分子或多核苷酸而言意指相对应的核糖核苷酸序列(A、G、C和U)，其中在特定脱氧核糖核苷酸序列中的每个胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸(T)都置替换为尿嘧啶核糖核苷酸(U)。可以使用本文提供的信息，诸如示于图2的示范性核苷酸序列[SEQIDNO:4]，使用标准克隆和筛选方法，诸如那些使用mRNA作为原料克隆cDNA的方法，获得编码β-半乳糖苷酶Ⅱ多肽的本发明核酸分子。在图2[SEQIDNO:4]中描述的作为本发明实例的核酸分子发现于得自‘Rutgers’番茄植物的花端着色(breaker)、转换和粉红色果实的果皮的cDNA文库。pZBG2-1-4的cDNA插入片段的全序列可由GenBank(AF020390)获得并示于图2[SEQIDNO:4]。该cDNA插入片段为2532个核苷酸(nt)长，并包含单一的长可读框(ORF)，估计它在位于核苷酸64的框内的第一个ATG开始，并在核苷酸2238的TAA终止。此ORF编码724个氨基酸长的79kD的蛋白。推断的pZBG2-1-4的氨基酸序列和在资料库中所有公开的植物β-半乳糖苷酶序列(图1A、B)具有明显的氨基酸同一性。当将每个β-半乳糖苷酶基因的完整ORF与pZBG2-1-4对比时，共有序列同一性就番茄pTomβgal1(P48980)而言约为64％，就苹果(P48981)而言约为67.6％，就芦笋(P45582)而言约为63％，而就康乃馨(Q00662)而言约为55％。一般技术人员应当意识到，由于上文论述的可能出现的测序错误，包含约724个氨基酸并由所收录的cDNA编码的实际的完全β-半乳糖苷酶Ⅱ多肽可能略短或略长。更一般地说，实际的可读框可能在±20个氨基酸的范围内的任何位置，更可能是在±10个氨基酸的范围内，由这二者中的任一个预测它为示于图2[SEQIDNO:4]的N端的第一个蛋氨酸密码子。在任何情况下，如下文的进一步论述，本发明进一步提供在完全多肽的N端缺失各种残基的多肽，包括在本文所述的β-半乳糖苷酶Ⅱ多肽的N端缺少一个或几个氨基酸的多肽。前导序列和成熟序列对pZBG2-1-4的推断氨基酸序列的分析表明，基于疏水性前导序列、前导序列切割位点和三个可能的N-糖基化位点分泌的可能性很高。使用PSORT(版本6.4,Nakai和Kanehisa,1992，通过引用结合到本文中)和SignalP(版本1.1,Nielsen等，1997，通过引用结合到本文中)程序推算，所述ORF包含应在分别于位置23和24的丙氨酸和丝氨酸残基之间被切割的疏水性前导序列，而所述成熟多肽具有胞外定位。所述成熟多肽在编号282、459和713的天冬酰胺处包含三个可能的N-糖基化位点，然而在位置713的天冬酰胺由于在位置714的脯氨酸而不大可能被糖基化。估测未糖基化成熟多肽的分子量为75kD,pⅠ为8.9。因此，本发明的完全β-半乳糖苷酶Ⅱ蛋白的氨基酸序列包括前导序列和成熟蛋白，如图3[SEQIDNO:4]所示。更具体地说，本发明提供编码成熟形式的β-半乳糖苷酶Ⅱ蛋白的核酸分子。因此，按照信号假说，分泌性蛋白具有由所述完全多肽切下的信号或分泌前导序列，以产生分泌性“成熟”形式的蛋白。在某些情况下，对分泌性蛋白的切割不完全一致，这产生了两种或两种以上的成熟蛋白。此外，很早就知道分泌性蛋白的切割特异性最终通过完全蛋白的一级结构测定，即它是在多肽的氨基酸序列中固有的。所以，本发明提供编码成熟β-半乳糖苷酶Ⅱ多肽的核苷酸序列，所述多肽具有由示于图2[SEQIDNO:4]并收录于GenBank(收录号AF20390)的cDNA编码的氨基酸序列。所述“具有由示于图2[SEQIDNO:4]的cDNA克隆编码的氨基酸序列的成熟β-半乳糖苷酶Ⅱ多肽”是指通过在植物细胞中表达由示于图2[SEQIDNO:4]并收录于GenBank(收录号AF20390)的克隆的cDNA序列编码的完全可读框生产的成熟形式的β-半乳糖苷酶Ⅱ蛋白。本发明的示范性β-半乳糖苷酶ⅡcDNA(TBG4)已经在大肠杆菌菌株XLIblueMR(1acZ)(Stratagene,LaJolla,CA)中表达，如下文所述(参见实施例)。对表示本发明其它β-半乳糖苷酶基因的cDNA克隆的推断氨基酸序列的分析也揭示了可读框，并在某些情况下显示分泌所编码蛋白的可能性很高。推测所有的全长cDNA克隆都具有信号序列(图2)。使用两个预测程序SignalP和PSORT，由两个程序预测都显示TBG4是分泌性的。用SignalP预测显示TBG1、2和3具有可切割的信号序列，但PSORT预测TBG1、2和3具有不可切割的信号序列。利用PSORT显示TBG7靶向叶绿体。基于利用所述程序PSORT(版本6.4)和SingalP(版本1.1)预测的疏水性前导序列的存在，对所述7个克隆中的每一个的具体观察如下TBG1起始密码子位于306[SEQIDNO:1],ORF=835个氨基酸[SEQIDNO:8]，信号序列位于1-24；TBG2起始密码子未确定[SEQIDNO:2],ORF=888个氨基酸[SEQIDNO:9]，信号序列位于1-25；TBG3起始密码子位于32[SEQIDNO:3],ORF=838个氨基酸[SEQIDNO:10]，信号序列位于1-22；TBG5起始密码子未确定[SEQIDNO:5],ORF=251个氨基酸[SEQIDNO:12]，信号序列未确定；TBG6起始密码子未确定[SEQIDNO:6],ORF=248个氨基酸[SEQIDNO:13]，信号序列未确定；TBG7起始密码子位于104[SEQIDNO:7],ORF=870个氨基酸[SEQIDNO:14]，信号序列位于1-35。还使用程序DNAsis对所述7个克隆的推断的氨基酸序列进行分析，在表Ⅰ中概述了预测的分子量、细胞寻靶、pⅠ和潜在的N联糖基化位点。表1．番茄β-半乳糖苷酶(TBG)cDNA序列数据。克隆5个全长和2个部分长度的cDNA并测序。所述DNA和推定的氨基酸序列数据如下克隆mRNA(kb)kDpⅠN联靶TBG13.290.86.22ER/OUTTBG23.097.06.26PMTBG32.890.58.21ER/OUTTBG42.677.98.93OUTTBG5～3TBG6～3TBG73.093.38.06CHLORN联=可能的N联糖基化位点；ER=内质网；OUT=分泌的；PM=限于质膜；CHLOR=叶绿体正如所示，本发明的核酸分子可以是RNA形式，诸如mRNA,或是DNA形式，包括例如通过克隆获得的或合成产生的cDNA和基因组DNA。所述DNA可以是双链或单链。单链DNA或RNA可以是编码链，也叫做有义链，或者可以是非编码链，也叫做反义链。所述“分离的”核酸分子是指已经脱离其天然环境的核酸分子DNA或RNA。例如对于本发明来说，包含于载体中的重组DNA分子被认为是分离的。更多分离的DNA分子的实例包括保持在异源宿主细胞中的重组DNA分子或在溶液中的(部分或大致)纯化的DNA分子。分离的RNA分子包括本发明的DNA分子的体内或体外RNA转录本。按照本发明的分离的核酸分子进一步包括所述合成产生的分子。本发明的分离的核酸分子包括包含可读框(ORF)的DNA分子，所述ORF的起始密码子位于示于图2的核苷酸序列[SEQIDNO:4]的位置64。还包括包含成熟β-半乳糖苷酶Ⅱ蛋白的编码序列的DNA分子，所述编码序列示于图2[SEQIDNO:4]的位置135-2532。另外，本发明的分离的核酸分子包括包含一种序列的DNA分子，所述序列大体上不同于以上描述的那些序列，但由于遗传密码的简并性仍可编码所述β-半乳糖苷酶Ⅱ蛋白。当然，所述遗传密码和种特异性适宜密码子在本领域是众所周知的。因此，产生上述的简并变异体，例如最佳化密码子表达于特定宿主(例如将植物mRNA的密码子改变为诸如大肠杆菌的细菌宿主优选的那些密码子)，对于本领域的技术人员而言应是常规操作。最好是，该核酸分子将编码由上述收录cDNA克隆编码的成熟多肽。本发明进一步提供具有示于图2的核苷酸序列[SEQIDNO:4]的分离的核酸分子或具有上述序列的互补序列的核酸分子。这样的分离分子，尤其是DNA分子，通过和染色体原位杂交用作基因作图的探针，以及例如通过RNA印迹分析用于检测所述β-半乳糖苷酶Ⅱ基因在植物组织中的表达。本发明进一步涉及编码本文所述的部分核苷酸序列的核酸分子以及涉及本文所述的分离的核酸分子的片段。具体而言，本发明提供具有代表图2[SEQIDNO:4]的部分的核苷酸序列的多核苷酸，所述核苷酸序列包括图2[SEQIDNO:4]的位置1-2538。另外，本发明提供具有涉及图2[SEQIDNO:4]的多个部分(extensiveportions)的核苷酸序列的另外的核酸分子，所述核苷酸序列已经由以下的相关cDNA克隆确定如图3所示的TBG1-3和TBG5-7,SEQNO1-3和5-7。另一方面，本发明提供包含一种多核苷酸的分离的核酸分子，所述多核苷酸在严格杂交条件下与上述的本发明核酸分子(例如示于图2[SEQIDNO:4]的cDNA克隆)中的一部分多核苷酸杂交。所述“严格杂交条件”是指在溶液中(包含50％甲酰胺、5×SSC(150mMNaCl,15mM柠檬酸三钠)、50mM磷酸钠(pH7.6)、5×Denhardt氏溶液、10％硫酸葡聚糖和20μg/ml剪切变性的鲑精DNA)于42℃过夜温育，接着在约65℃以0.1×SSC漂洗滤膜。正如所述，编码β-半乳糖苷酶Ⅱ多肽的本发明核酸分子包括但不限于，单独编码所述成熟多肽的氨基酸序列的核酸分子；所述成熟多肽的编码序列和另外的序列(诸如编码约1-23氨基酸的前导序列的序列)，如前蛋白或蛋白原或前蛋白原序列；所述成熟多肽的编码序列有或没有上述另外的编码序列。还发现了与编码β-半乳糖苷酶的基因表达相关的增强子/启动子。本发明人已特征鉴定了TBG2mRNA的表达形式，并已克隆了λ基因组cDNA。TBG2在果实成熟开始之前表达并在整个成熟期中保持在同一水平上。已经发现TBG2在所有的果实组织中表达，并已经发现其是果实特异性的。试验已经显示TBG2不受乙烯的影响。在开花期后正常时序时间TBG2表达于成熟突变体rin、nor和Nr。所发现的启动子对在有义或反义方向表达任何基因均有用，尤其是在番茄果实中，在所有的番茄果实组织中表达都在成熟过程之前开始并持续整个成熟过程。所述启动子还可以用于在成熟突变体rin、nor和Nr中表达任何基因，而不需要用外来的乙烯气体处理所述果实。变异体和突变体多核苷酸本发明进一步涉及本发明核酸分子的变异体，它编码所述β-半乳糖苷酶Ⅱ蛋白的部分、类似物或衍生物。变异体可以天然产生，诸如天然等位基因变异体。所述“等位基因变异体”是指在生物体的染色体上占据特定基因座的基因的几种可选形式之一。GenesⅡ,Lewin,B.编辑，JohnWiley&Sons，纽约(1985)。可以使用本领域已知的诱变技术产生非天然产生的变异体。这样的变异体包括通过核苷酸置换、缺失或添加产生的变异体。所述置换、缺失或添加可以包括一个或几个核苷酸。所述变异体可以在编码区、非编码区或这二者中改变。在所述编码区的改变可以产生保守或非保守的氨基酸置换、缺失或添加。在这其中特别优选的是沉默置换、添加和缺失，它们不改变所述β-半乳糖苷酶Ⅱ蛋白或其部分的特性和活性。在这点上还特别优选保守置换。最高度优选的是编码具有示于图2的氨基酸序列的成熟蛋白核酸分子(如pZBG2-l-4)或由所收录的cDNA克隆编码的成熟β-半乳糖苷酶Ⅱ氨基酸序列的核酸分子。进一步的实施方案包括含有一种多核苷酸的分离的核酸分子，所述多核苷酸和选自以下的多核苷酸具有至少90％、更优选至少95％、96％、97％、98％或99％核苷酸序列同一性(a)编码具有示于图2[SEQIDNO:4]的完全氨基酸序列的β-半乳糖苷酶Ⅱ多肽的核苷酸序列；(b)编码具有示于图2[SEQIDNO:4]的成熟β-半乳糖苷酶Ⅱ多肽的核苷酸序列；(c)与以上(a)或(b)中的任一核苷酸序列互补的核苷酸序列。载体和宿主细胞本发明还涉及包括本发明的分离的DNA分子的载体、用所述重组载体进行基因工程操作的宿主细胞以及通过重组技术产生β-半乳糖苷酶Ⅱ多肽或其片段。所述载体可以是例如噬菌体、质粒、病毒或反转录病毒载体。反转录病毒载体可以是复制型或复制缺陷型。在后一种情况下，病毒繁殖通常只在互补型宿主细胞中发生。所述多核苷酸可以连接至包含选择标记的载体，用于在宿主中繁殖。一般来说，在沉淀(诸如磷酸钙沉淀)中或在具有带电脂质的复合物中引入质粒载体。如果所述载体是病毒，则可以使用合适的包装细胞系将其体外包装，然后转导入宿主细胞中。所述DNA插入片段应当操作性连接至合适的启动子，诸如噬菌体λPL启动子、大肠杆菌lac、trp、phoA和tac启动子、SV40早期和晚期启动子和反转录病毒LTR启动子，在此仅举几个例子。其它适合的启动子是熟练技术人员已知的。所述表达构建物将进一步包含转录起始位点、终止位点以及在转录区中的用于翻译的核糖体结合位点。由所述构建物表达的转录本的编码部分最好包括位于要翻译的多肽的开始部分的翻译起始密码子和在该多肽末端的合适位置的终止密码子(UAA、UGA或UAG)。正如所述，所述表达载体最好包括至少一个选择标记。这样的标记包括用于真核生物细胞培养的二氢叶酸还原酶、G418或新霉素抗性基因和用于在大肠杆菌和其它细菌中培养的四环素、卡那霉素或氨苄青霉素抗性基因。合适宿主的代表性实例包括但不限于，细菌细胞，诸如大肠杆菌、StrepZBG2-1-4yces和鼠伤寒沙门氏杆菌(Salmonellatyphimurium)细胞；真菌细胞，诸如酵母细胞；昆虫细胞，诸如果蝇属S2细胞和草地夜蛾Sf9细胞；动物细胞，诸如CHO、COS、293和Bowes黑素瘤细胞；和植物细胞。适于上述宿主细胞的培养基和培养条件是本领域已知的。优选用于细菌的载体包括由QIAGEN,Inc.，同上，获得的pQE70、pQE60和pQE-9；可由Stratagene获得的pBS载体、Phagescript载体、Bluescript载体、pNH8A、pNH16a、pNH18A、pNH46A；以及可由Pharmacia获得的ptrc99a、pKK233-3、pKK233-3、pDR540、pRIT5。优选的真核生物载体是可由Stratagene获得的pWLNEO、pSV2CAT、pOG44、pXT1和pSG；以及可由Pharmacia获得的pSVK3、pBVP、pMSG和pSVL。其它合适的载体对技术熟练人员而言将是显而易见的。可以通过磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖介导的转染、阳离子脂质介导的转染、电穿孔、转导、感染或其它方法实现将所述构建物引入到所述宿主细胞中。在许多标准实验室手册中都描述了这些方法，诸如Davis等，BasicMethodsInMolecularBiology(1986)。实施例使用标准培养方法在温室中培育番茄载培品种Rutgers(LycopersiconesculentumMill.,cv.‘Rutgers')植株。所述成熟突变体成熟抑制剂(rin)、非成熟(nor)和永不成熟(Nr)(Tigchelaar等，1978)都出自所述‘Rutgers’。在开花时对花做标记，而果实就按照开花后的天数(dpa)或基于如前所述的其成熟期的表面颜色采集(Mitcham等，1989)，该文献的全部公开内容在此通过引用完整结合到本文中。关于基因表达研究，由温室培育的植物采集各种叶、花和茎组织，并由基础组织培养基中培育的幼苗采集根，该幼苗在种子萌芽后培育4周。RNA提取于温室采集果实后立即对其进行以下加工在冰上冷却、切除各种组织并使它们在液氮中冻结。使用臼和杵磨碎组织样品，并储存在-80℃。使用在Verwoerd等(1989)中描述的方法提取RNA。使用寡聚物(dT)柱(Pharmacia,Piscataway,NJ)由总的RNA中纯化聚腺苷酸化RNA。通过使用双光束分光光度计检测A260定量RNA。RT-PCR基于我们在苹果(收录号P48980)、芦笋(P445582)和康乃馨(Q00662)的β-半乳糖苷酶cDNA克隆之间发现的最高共有推断氨基酸序列同一性，设计简并引物。用于第一个反应的两个引物是BG5＇E1(WSNGGNWSNATHCAYTAYCC)和BG3＇E(CCRTAYTCRTCNADNGGNGG)。使用BG5＇Ⅰ1(ATHCARACNTAYGTNTTYTGG)和BG3＇E对第一个反应的产物进行第二个反应。所述引物序列的简并密码是N=a+t+c+g；H=a+t+c；B=t+c+g；D=a+t+g；V=a+c+g；R=a+g；Y=c+t；M=a+c；K=t+g；S=c+g；和W=a+t。所述5＇和3＇引物分别对应于所述苹果克隆的氨基酸72-78和321-315。使用AmpliTaqDNA聚合酶(PerkinElmer,Norwalk,CT)和标准PCR条件，使用由以下所述的第一个cDNA文库(Ausubel等，1987)制得的cDNA作为模板，进行扩增。在琼脂糖凝胶中分离PCR产物，纯化预期大小(约750bp)的片段，将其克隆入pCRscript(Stratagene,LaJolla,CA)中并测序。cDNA文库构建两个cDNA文库。第一个包含分离自‘Rutgers'植物的花端着色、转换和粉红色的果实果皮的聚腺苷酸化(poly(A))RNA。根据生产商的ZAP-cDNAGigapackⅡGold克隆试剂盒(Stratagene)的说明书精确地进行cDNA合成和文库构建，该说明书的全部公开内容通过引用完整结合到本文中。使用多脱氧胸苷酸(poly(dT))引物引发cDNA第一链的合成，并使用EcoRⅠ和XhoⅠ限制位点将插入片段直接克隆到Uni-ZapXR载体中。第二个文库包含分离自‘Rutgers’植物的生绿色(immaturegreen)、青熟、花端着色、转换、粉红色、红色-成熟和过熟果实的所有果实组织(种子除外)的聚腺苷酸化RNA。根据生产商对用于cDNA合成和·克隆的SuperScriptλ系统(GibcoBRL,Gaithersburg,MD)的说明书精确地进行cDNA合成和文库构建。使用寡脱氧胸苷酸引物引发cDNA第一链的合成，并使用SalⅠ和NotⅠ限制位点将cDNA插入片段直接克隆到·ZipLox克隆载体中。扩增两个文库并使用生产商提供的宿主菌株按照其说明书保持。使用一种所述克隆(RT-PCR2-1)以低严格性(在无甲酰胺的情况下于45℃杂交，并用0.2×SSC于42℃最后漂洗)由番茄果实cDNA文库中筛选106噬菌斑。鉴定30个阳性cDNA克隆并部分测序。对所述RT-PCR和cDNA克隆的完全测序和特征鉴定揭示了7种可能的独特的β-半乳糖苷酶基因。DNA和RNA凝胶印迹分析使用每个全长克隆的3＇UTR和RT-PCR克隆作为探针对限制酶消化的基因组DNA进行DNA分析。基本上如在Smith和Fedoroff(1995)中的描述进行DNA凝胶印迹分析，除了用于每次消化的是3μg基因组DNA。对应于所述克隆的基因似乎作为单一拷贝存在(未提供数据)。上述探针使用重组近交系的RFLP用于所述7个基因中的6个的作图，基因座名称和图位示于表Ⅱ(JamesGioviannone,TexasA&MUniversity，个人通信)。表Ⅱ．TBG基因座图位。使用重组近交系的RFLP通过DNA分析对基因作图基因染色体图位TBG112★IL12-2、IL12-3的重叠TBG29IL9-3TBG33IL3-5TBG412★IL12-2、IL12-3的重叠TBG511IL11-3TBG62IL2-4、IL2-5的重叠TBG7无RFLP★TBG1和4是松散连锁在甲醛/Mops琼脂糖凝胶中分离总的RNA(20μg/泳道)，转移到Hybond-N+尼龙膜(Amersham,ArlingtonHeights,IL)，通过于80℃温育2小时固定，在杂交培养箱(RobbinsScientific,Sunnyvale,CA)中使用Church和Gilben(1984)描述的缓冲液过夜杂交，最终的漂洗严格条件为含0.2％SDS的0.1×SSC、65℃，并基本按照Ausubel等(1987)所述放射自显影。使用RNA梯标准品(GibcoBRL)测定所述RNA的长度。使用用32p-dATP作为标记的随机引物试剂盒(BoehringerMannheim,Indianapolis,IN)合成探针。使用每个全长克隆的3＇UTR和RT-PCR克隆作为探针合成的模板进行RNA分析。至于加样量对照，剥离RNA印迹并使用大豆26SrDNA片段(Turano等，1997)在降低杂交和漂洗严格条件下再探测RNA印迹。对于所有的杂交，将32p-(dATP)标记的探针稀释至1-2×106dpm/mL。以上参考文献的全部公开内容都通过引用完整结合到本文中。序列分析使用基于PCR的双脱氧核苷酸终止法和ABI自动测序仪(AppliedBiosystems,Fostercity,CA)在Iowa州立大学测序中心(Ames,IA)进行测序。通过引物步移(primerwalking)对cDNA插入片段的两条链进行测序。使用BLAST搜索(Altschul等，1990)对核苷酸序列和推断的氨基酸序列与所述数据库进行对比。使用DNAStrider1.2(Marck,1988)和MacDNAsis(Hitachi,SanBruno,CA)软件分析序列数据并进行对比。以上参考文献的全部公开内容都通过引用完整结合到本文中。RNA印迹分析组织特异性表达进行RNA印迹分析，以揭示所述β-半乳糖苷酶基因的RNA具有(如果有的话)果实特异性表达模式。除了TBG2以外，在非果实组织中检测到所有克隆的转录本(图4)。在所有的测试组织中都检测到TBG1、4、5和6的转录本。在根和茎组织中检测到低水平的TBG3转录本，而在花和茎组织中检测到TBG7转录本。在果实中的时间表达模式使用提取自除种子之外的所有果实组织的RNA检测所述7个基因在果实组织中的时间表达模式。在果实发育的几个阶段检测所有7个基因的转录本(图5)。TBG1和3具有相似的表达模式，并在花端着色至过熟阶段的整个过程中都检测到它们的转录本。TBG2具有独特的表达模式，由30dpp至过熟阶段检测到其恒定水平的转录本。TBG4表达模式类似于TBG1和3，但不同之处在于转录本水平在转换阶段明显较高。TBG5在发育的成熟阶段具有和TBG4相似的表达模式，但在果实发育的所有较早期的过程中也检测到TBG5转录本。TBG6的表达模式令人关注，只是在所测试的所有成熟前阶段检测到其高水平的转录本。TBG7也具有独特的表达模式，在所测试的所有阶段中检测到的其转录本水平都非常低，而在10dpp和过熟阶段检测到中等水平的转录本。在果实中的空间表达模式还进行RNA印迹分析，以测定在各种果实组织中的转录物累积。因为所述TBG基因的时间表达模式不同，所以使用青熟阶段和转换阶段果实进行RNA提取(图6)。在所测试的所有青熟果实组织中都检测到TBG2和TBG6转录本。TBG7转录本存在于所测试的所有果实组织中，子房室除外。在由所有转换阶段果实组织中提取出的RNA样品中都检测到TBG1和TBG4转录本。值得注意的是，TBG4转录本在果皮中更加丰富。TBG3和TBG5的表达模式是独特的，分别除了外果囊皮和子房室之外，在所有的组织中都检测到它们的转录本。对比正常和突变果实的表达为了更好地了解所述TBG产物的潜在作用和转录调节机制，使用来自成熟突变体rin、nor和N′的果实组织进行RNA分析。该分析是重要的，因为它可能获得初步确定任一所述TBG可能具有任何潜在的成熟和/或软化作用的线索。突变果实的RNA分析的结果提示，在突变果实组织中TBG1、2、3、5和7的转录调节未受影响，它们的转录本以正常的时序(dpp)模式存在(图7)。然而在所述突变果实中TBG4和6转录本的丰度是不同的。在N′果实组织中未检测到TBG4转录本，而在rin和nor中检测到比野生型果实组织低得多的TBG4转录本水平。通常在果实发育的早期过程中检测到高水平的TBG6转录本，但在青熟阶段(40-42dpp)之后检测不到TBG6转录本。在所有三种突变体的果实中TBG6转录本甚至持续至50dpp。用乙烯调节转录使用突变体和野生型果实进行的RNA分析表明，乙烯可能上调节TBG4表达，而可能下调节TBG6表达。为了评价此假说，采集青熟果实，使其经受连续气流的混合在空气中的10ppm乙烯。在1、2、12和24小时使用对照和乙烯处理的果实进行RNA提取。该试验的结果证实了突变果实RNA分析的发现。正如所料，TBG1、2、3、5和7转录本的存在和丰度在经受外来乙烯处理的青熟组织中基本不受影响(图8)。然而，在乙烯存在的情况下，在青熟组织中的TBG4转录本丰度增加。根据给出的数据，用外来乙烯处理是否降低TBG6转录本的丰度并不清楚，因为其转录本水平通常在果实发育的这个阶段降低。酶活性为了确定所述TBG编码产物的作用，我们使用异源表达系统开始表达cDNA编码的酶的试验。试验了几种大肠杆菌表达系统，但由于毒性(参见下文实施例)产物的得率非常低。因此我们使用分泌成熟氨基末端FLAG融合蛋白至培养基中的酵母表达系统。首先测试所述TBG4cDNA，结果导致每50ml培养物产生约1mgTBG4活性蛋白。首先使用TBG4是因为该cDNA编码所述酶β-半乳糖苷酶Ⅱ，该酶纯化自番茄果实并已相当详细地特征鉴定(Carey等1995,Smith等1998)。所以我们能够对比异源系统表达的蛋白和纯化自番茄的天然酶的活性。使用抗FLAG亲和树脂成功地亲和纯化了所述TBG4蛋白(图9)。证实所述亲和纯化的TBG4酶利用其水解合成底物对硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷的能力(Smith等，1998)具有β(1→4)-D-半乳糖苷酶活性。该酶可切割各种细胞壁底物中的半乳糖基残基并因此具有外切半乳聚糖酶活性(表Ⅲ)。目前对其余成功表达活性酶的全长cDNA克隆进行了试验。初步的结果已显示TBG1编码的酶还具有β-D-半乳糖苷酶活性和外切半乳聚糖酶活性(表Ⅲ)。表Ⅲ．在酵母中表达的TBG4和TBG1的细胞壁降解活性。由纯化自番茄果实的螯合剂可溶性果胶(CSP)和碱溶性果胶(ASP)以及半纤维素(HCF)细胞壁部分中去除半乳糖基残基。释放的半乳糖μg酶底物煮熟的新鲜的aTBG4CSP05ASP014.5HCF04bTBG1ASP01.22mg底物；于37℃4小时a.005单位酶/rxb.0005单位酶/rx编码β-半乳糖苷酶的pZBG2-1-4将TBG4ORF按阅读框架克隆入阻遏/诱导型细菌表达载体pFLAG-CTC。宿主菌株XL1-BlueMR是突变株，既不含内源β-半乳糖苷酶活性，也不含α互补。在30-37℃，用(IPTG)诱导基因转录使大肠杆菌生长立即停止。然而，在20℃诱导确实能使某些大肠杆菌有限生长。当在20C培养包含pZBG2-1-44ORF的克隆并用IPTG诱导时，所述细胞在包含所述β-半乳糖苷酶底物X-GAL的培养基中生长36小时后缓慢变蓝(图10)。如果不用IPTG诱导，则即使是在包含X-GAL的培养基中延时培养之后也未观察到蓝色。至于另外的阴性对照，在用或不用IPTG诱导的情况下，即使是在培养7天后，由用所述FLAG载体单独转化的XL1-BlueMR组成的克隆也从未显示任何β-半乳糖苷酶活性(图10)。至于最大β-半乳糖苷酶活性的阳性对照(得自大肠杆菌β-半乳糖苷酶)，将克隆载体pGEM转化到宿主菌株DH5α中，结果也示于图10。图10显示对在大肠杆菌中表达的pZBG2-1-4的β-半乳糖苷酶活性的检测。收获细胞并每隔12小时制备提取物，检测A615。将培养物在外加显色底物X-GAL(空心符号)或X-GAL和转录诱导剂IPTG(实心符号)的所述培养基中进行培养。用作大肠杆菌β-半乳糖苷酶活性阳性对照的载体是pGEM(■)，而用作阴性对照和用于表达的载体是或不含(○,●)或含pZBG2-1-4ORF(△,▲)的pFLAG-CTC。对植物组织结构的作用为进一步证实TBG4编码的β-半乳糖苷酶Ⅱ的功能，进行以下的试验。包含抑制TBG4mRNA的反义构建物的番茄植物果实与亲代系果实相比，坚硬度最多大40％(比较图11A-11E(1-4)中的亲代系#1和反义系#2的平均值)。在所述转化体中具有最坚硬果实的株系也具有最低的总TBG4mRNA水平(图12A、B)。这种相关性表明TBG4mRNA的减少与果实坚硬度的增加有关。较坚硬的果实可以导致(1)较少运输损伤(a)较少缘于损伤的损失和(b)能够在产生较好味道的较后阶段采集上市；(2)对于市场和顾客而言都具有较长的保存期限；(3)对于新鲜切片销售而言果实品质更好；在较坚硬时粉红色/红色阶段的果实更好切割。方法为测定TBG4编码的β-半乳糖苷酶Ⅱ的功能，使用组成型表达的35SCaMV启动子制备反义构建物，以表达TBG4反义RNA(图13)。使用农杆菌介导的转化将构建物移入番茄中。为了评价TBG4抑制对加工的番茄(cv‘UC82b')果泥品质的作用，已经转化了4个番茄栽培品种和3个新的精选栽培品种。所述新的精选栽培品种中的一个品种是软果实鲜樱桃色番茄(softfruitlargecherrytomato)(cv‘AilsaCraig')，第二个是软果实老繁殖系(cv‘Rutgers')，而第三个是最新研制的稍微坚硬的载培品系‘NewRutgers'。在这些其中TBG4mRNA受到抑制的品系当中，我们期望发现硬度和果泥粘性增加。结构尽管此项目接近完成，但还未完成全部的生物化学和分子分析。对所述‘NewRutgers’载培品系分析的初步结果列于图11A-E(1-4)和12A、B。在此实施例中使用叫做‘NewRutgers’的新精选栽培品系。培养购买种子植株并使其自交，产生的种子用作亲代对照(系1)。培养7个包含TBG4反义构建物的独立转化植物(系2-8)并使其自交。通过DNA印迹分析证实转化(T-DNA插入片段)(未列出数据)。培养每种转化系的各5株植物连同10株亲代系植物。在花端着色阶段(第一次发生颜色变化)对果实进行标记并在花端着色+7天采集。使用每种系的15-20个果实收集数据。对每个果实都进行两次每种类型的结构检测，使用StableMicroSystem的TA-XT2i结构分析仪对果实进行4种类型的结构检测。所述4种检测是1、2英寸平板压至3mm(图11A)，2、4mm球形硬度试验压头(indenter)压至3mm(图11B),3、4mm圆柱形硬度试验压头压至3mm(图11C)和4、4mm圆柱形硬度试验压头穿刺至10mm(图11D)。这些数据的概述于图11E(1-4)。在图11A-E(1-4)中，系1是亲代系，而系2-8每个都代表独立的包含1个T-DNA拷贝的所述TBG4反义构建物的转化体。对所述数据的统计学分析(Duncans和Scheffé)揭示，转化系3、7和8的果实和亲代系没有明显不同，但转化系2、4、5和6明显比亲代系果实更坚硬。最值得注意的是转化系2的果实的平均硬度比所述亲代系的果实坚硬40％(图11A-D)。RNA印迹分析目前我们正在研究其中TBG4mRNA水平被抑制的果实中的生物化学成分的任何变化。这些试验用来显示在果实硬度增加和TBG4mRNA抑制、TBG4编码的酶活性抑制、细胞壁可能的改变(例如半乳糖基残基含量增加)以及在果实成熟过程中游离半乳糖水平降低之间的关系。这些试验虽然不完整，但进行了一些初步的RNA印迹试验，数据示于图12A、B。在图12A、B中没有显示亲代或不成对的对照果实RNA，因为这些植物最后培养，并且RNA提取现在正在进行。作为对比的正常果实TBG4mRNA水平参见以上图5。图5的数据显示TBG4mRNA水平在青熟阶段较低，在转换阶段达到峰值，并在红色阶段减少。除系2和3之外所有的品系都表达反义TBG4mRNA(图12A、B)。所述反义转录本表现为两条带，在长度上比内源mRNA小。这两条带可能原因是1、由NOS终止子提供预期的转录终止信号和2、在所述反义TBG4cDNA中的隐藏转录终止信号。最值得注意的结果是在系2中于转换阶段未检测到TBG4mRNA。系2也具有最坚硬的红色果实(参见图11A-D)。没有可检测的TBG4mRNA可能是由内源和反义mRNA二者共抑制造成。当与较早的印迹(例如图4)相比时，所有的所述品系似乎都具有大体降低的TBG4mRNA水平，但在同一RNA分析中没有亲代和不成对对照RNA的情况下，所以不可能赋予此说明以具体数值。本说明书公开了β-半乳糖苷酶Ⅱ多肽参与果实成熟过程中的细胞壁果胶的降解。在本发明中，说明了番茄中β-半乳糖苷酶在果实成熟和软化过程中的作用，并描述了对编码表达于成熟番茄果实组织中的β(1→4)半乳聚糖降解酶的β-半乳糖苷酶cDNA克隆的克隆。本发明研究指出，pZBG2-1-4是得自所述TBG4基因转录本的cDNA，它编码β-半乳糖苷酶Ⅱ是由于以下原因首先，预期的成熟pZBG2-1-4翻译产物的高度保守的氨基末端部分的推断的氨基酸序列和由Carey等(1995)纯化并命名为TOMAA的β-半乳糖苷酶Ⅱ的氨基末端序列几乎完全匹配(30个氨基酸中的28个匹配)。重要的是，在所述β-半乳糖苷酶Ⅱ序列(TOMAA)中不匹配本发明的pZBG2-1-4推断氨基酸序列的两个氨基酸(KY)据信是不正确的，因为在数据库中的所有植物β-半乳糖苷酶序列和4个另外的从番茄鉴定的β-半乳糖苷酶相关cDNA同pZBG2-1-4推断氨基酸序列在这两个相同的氨基酸(ST)位置上全部匹配或具有保守置换(图3)。其次，在检测到β-半乳糖苷酶Ⅱ活性的同时也用pZBG2-1-4在正常成熟果实中检测到转录本(图5；Carey等，1995)。而且，在45和50dpa的所述突变体nor、rin和Nr的果实中几乎未检测到或未检测到转录本(图7)。这个观测结果也与Carey等(1995)提供的数据一致β-半乳糖苷酶Ⅱ活性保持在和青熟果实相等的水平上，并在45-65dpa的nor或rin植物的果实中没有升高。令人关注的是Carrington和Pressey(1996)已经报道在成熟的转换阶段之后只在‘Rutgers’果实中检测到β-半乳糖苷酶Ⅱ活性。在本发明中的RNA数据表明，最大的β-半乳糖苷酶Ⅱ活性仅在转换阶段后出现，假定mRNA水平表示可提取的酶活性(图5)。第三，由所述pZBG2-1-4序列预测的成熟蛋白表观分子量为77.9kD,pⅠ为8.9，这与以下对β-半乳糖苷酶Ⅱ的测定结果相似Pressey(1983)通过凝胶过滤柱层析测定的分子量为62Kd和通过等电聚焦测定的pⅠ为7.8，另一方面Carey等(1995)通过SDS-PAGE测定的分子量为75kD，通过等电聚测定的pⅠ为9.8。第四，使用异种酵母表达系统由pZBG2-1-4ORF产生的酶具有β-半乳糖苷酶活性和外切半乳聚糖酶活性。所引用的参考文献AltschulSF,GishW,MillerW,MeyersEW,LipmanDJ(1990)Basiclocalalignmentsearchtool.JMolBiol215:403-410AusubelF,BrentR,KingstonR,MooreD,SeidmanJ,SmithJ,StruhlK,eds,(1987)CurrentProtocolsinMolecularBiology.JohnWileyandSons,NewYorkCareyAT,HoltK,PicardS,WildeR,TuckerGA,BirdCR,SchuchW,SeymourGB(1995)Tomatoexo-(1→4)-β-D-galactanase.Isolation,changesduringripeninginnormalandmutanttomatofruit,andcharacterizationofarelatedclone.PlantPhysiol108:1099-1107CarringtonCM,PresseyR(1996)β-galactosidaseⅡactivityinrelationtochangesincellwallgalactosylcompositionduringtomatoripening.JAmerSocHortSci121:132-136ChurchGM,GilbertW(1984)Genomicsequencing.ProcNatlAcadSciUSA81:1991-1995DeVeauEJ,GrossKC,HuberDJ,WatadaAE(1993)Degradationandsolubilizationofpectinbyβ-galactosidasespurifiedfromavocadomesocarp.PhysiolPlant87:279-285FischerRL,BennettAB(1991)Roleofcellwallhydrolasesinfruitripening.AnnuRevPlantPhysiolPlantMolBio42:675-703GiovannoniJJ,DellaPennaD,BennettAB,FischerRL(1989)Expressionofachimericpolygalacturonasegeneintransgenicrin(ripeninginhibitor)tomatofruitresultsinpolyuronidedegradationbutnotfruitsoftening.PlantCell1:53-63GoldenKD,JohnMA,KeanEA(1993)β-GalactosidasefromCoffeaarabicaanditsroleinfruitripening.Phytochemistry34:355-360GrossKC(1984)Fractionationandpartialcharacterizationofcellwallsfromnormalandnon-ripeningmutanttomatofruit.PhysiolPlant62:25-32GrossKC,SamsCE(1984)Changesincellwallneutralsugarcompositionduringfruitripening:Aspeciessurvey.Phytochemistry23:2457-2461GrossKC,WallnerSJ(1979)Degradationofcellwallpolysaccharidesduringtomatofruitripening.PlantPhysiol63:117-121HallLN,TuckerGA,SmithCJS,WatsonCF,SeymourGB,BundickY,BoniweilJM,FletcherJD,RayJA,SchuchW,BirdCR,GriersonD,(1993)Antisenseinhibitionofpectinesterasegeneexpressionintransgenictomatoes.PlantJ3:121-129HuberDJ(1983)Theroleofcellwallhydrolasesinfruitsoftening.HortRev5:169-219KangIK,SuhSG,GrossKC,ByunJK(1994)N-terminalaminoacidsequenceofpersimmonfruitβ-galactosidase.PlantPhysiol105:975-979KimJ,GrossKC,SolomosT(1991)Galactosemetabolismandethyleneproductionduringdevelopmentandripeningoftomatofruit.PostharvBiolTechnol1:67-80MarckC(1988)DNAStrider:a“C”programforthefastanalysisofDNAandproteinsequencesontheAppleMacintoshfamilyofcomputers.NucleicAcidsRes16:1829-1836MitchamEJ,GrossKC,NgTJ(1989)Tomatofruitcellwallsynthesisduringdevelopmentandsenescence.Invivoradiolabelingofcellwallfractionsusing[14C]sucrose.PlantPhysiol89:477-481NakaiK,KanehisaM(1992)Aknowledgebaseforpredictingproteinlocalizationsitesineukaryoticceils.Genomics14:897-911NielsenH,EngelbrechtJ,BrunakS,vonHeijneG(1997)Identificationofprokaryoticandeukaryoticsignalpeptidesandpredictionoftheircleavagesites.ProteinEngineering10:1-6PresseyR(1983)β-Galactosidasesinripeningtomatoes,PlantPhysiol71:132-135RossGS,RedgwellRJ,MacRaeEA(1993)Kiwifruitβ-galactosidase:isolationandactivityagainstspecificfruitcell-wallpolysaccharides.Planta189:499-506RossGS,WegrzynT,MaeRaeEA,RedgwellRJ,(1994)Appleβ-galactosidase.ActivityagainstcellwallpolysaccharidesandcharacterizationofarelatedcDNAclone.PlantPhysiol106:521-528SeymourGB,GrossKC(1996)Cellwalldisassemblyandfruitsoftening.PostharvestNewsInfo7:45N-52NSmithCJS,WatsonCFS,RayJ,BirdCR,MorrisPC,SchuchW,GriersonD(1988)AntisenseRNAinhibitionofpolygalacturonasegeneexpessionintransgenictomatoes.Nature334:724-726SmithDL,FedoroffNV(1995)LRPl,ageneexpressedinlateralandadventitiousrootprimordiaofArabidopsis.PlantCèll7:735-745SmithDL,StarrettDAandGrossKC(1998)Agenecodingfortomatofruitβ-galatosidaseⅡisexpressedduringfruitripening.PlantPhysiol.117:417-423TiemanDM,HarrimanRW,RamamohanG,HandaAK(1992)Anantisensepectinmethylesterasegenealterspectinchemistryandsolublesolidsintomatofruit.PlantCell4:667-679TigehelaarEC,MeGlassonWB,BuescherRW(1978)Geneticregulationoftomatofruitripening.HortScience13:508-513TuranoFJ,ThakkarSS,FangT,WeisemannJM(1997)CharacterizationandexpressionofNAD(H)dependentglutamatedehydrogenasegenesinArabidopsisthaliana.PlantPhysiol113:1329-1341VerwoerdTC,DekkerBMM,HoekemaA(1989)Asmall-scaleprocedurefortherapidisolationofplantRNAs.NucAcidsRes17:2362WegrzynTF,MacRaeEA(1992)Pectinesterase,polygalacturonase,andβ-galactosidaseduringsofteningofethylene-treatedkiwifruit.HortScience27:900-90权利要求1．包括具有与选自以下的序列具有至少95％同一性的核苷酸序列的多核苷酸的分离的核酸分子(a)编码具有选自以下的完全氨基酸序列的β-半乳糖苷酶Ⅱ多肽的核苷酸序列SEQIDNO:8、SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、SEQIDNO:11、SEQIDNO:12、SEQIDNO:13、SEQIDNO:14、SEQIDNO:15和SEQIDNO:16，并命名为TBG1、TBG2、TBG3、TBG4、TBG5、TBG6和TBG7，分别示于图2或由选自以下的cDNA克隆编码包含于GenBank收录号为AF023847、AF154420、AF154421、AF020390、AF154423、AF154424和AF154422中的cDNA克隆；(b)编码具有在选自以下的序列中约位置24-724的氨基酸序列的成熟β-半乳糖苷酶Ⅱ多肽的核苷酸序列SEQIDNO:8、SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、SEQIDNO:11、SEQIDNO:12、SEQIDNO:13、SEQIDNO:14、SEQIDNO:15和SEQIDNO:16，并命名为TBG1、TBG2、TBG3、TBG4、TBG5、TBG6和TBG7，分别示于图2或由选自以下的cDNA克隆编码包含于GenBank收录号为AF023847、AF154420、AF154421、AF020390、AF154423、AF154424和AF154422中的cDNA克隆；和(c)与在以上(a)或(b)中的任一核苷酸序列互补的核苷酸序列。2．权利要求1的核酸分子，其中所述多核苷酸具有选自以下的完全核苷酸序列SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6和SEQIDNO:7，如图2所示。3．权利要求1的核酸分子，其中所述多核苷酸具有在图2(SEQIDNO:4)中的核苷酸序列，该核苷酸序列编码具有在图2中称为TBG4的氨基酸序列的β-半乳糖苷酶Ⅱ多肽。4．权利要求1的核酸分子，其中所述多核苷酸具有在图2(SEQIDNO:4)中的核苷酸序列，该核苷酸序列编码具有在图2中称为TBG4的氨基酸序列中的约24至约724的氨基酸序列的成熟多肽。5．权利要求1的核酸分子，其中所述多核苷酸具有包含于GenBank收录号为AF023847中的cDNA克隆的完全核苷酸序列。6．权利要求1的核酸分子，其中所述多核苷酸具有包含于GenBank收录号为AF154220中的cDNA克隆的完全核苷酸序列。7．权利要求1的核酸分子，其中所述多核苷酸具有包含于GenBank收录号为AF154421中的cDNA克隆的完全核苷酸序列。8．权利要求1的核酸分子，其中所述多核苷酸具有包含于GenBank收录号为AF020390中的cDNA克隆的完全核苷酸序列。9．权利要求1的核酸分子，其中所述多核苷酸具有包含于GenBank收录号为AF154423中的cDNA克隆的完全核苷酸序列。10．权利要求1的核酸分子，其中所述多核苷酸具有包含于GenBank收录号为AF154424中的cDNA克隆的完全核苷酸序列。11．权利要求1的核酸分子，其中所述多核苷酸具有包含于GenBank收录号为AF154422中的cDNA克隆的完全核苷酸序列。12．包含在严格杂交条件下与具有和在权利要求1的(a)、(b)或(c)中的核苷酸序列同等的核苷酸序列的多核苷酸杂交的多核苷酸的分离的核酸分子，其中所述杂交的多核苷酸在严格杂交条件下不和具有仅由A残基或仅由T残基组成的核苷酸序列的多核苷酸杂交。13．包含一种多核苷酸的分离的核酸分子，所述多核苷酸编码具有权利要求1的(a)、(b)或(c)中的氨基酸序列的β-半乳糖苷酶Ⅱ多肽的带有表位部分的氨基酸序列。14．制备重组载体的方法，该方法包括将权利要求1的分离的核酸分子插入到载体中。15．通过权利要求14的方法产生的重组载体。16．制备重组宿主细胞的方法，该方法包括将权利要求15的重组载体引入到宿主细胞中。17．通过权利要求16的方法产生的重组宿主细胞。18．生产β-半乳糖苷酶Ⅱ多肽的重组方法，该方法包括在便于表达所述多肽的条件下培养权利要求17的重组宿主细胞和回收所述多肽。19．包含与选自以下的序列具有至少95％同一性的氨基酸序列的分离的β-半乳糖苷酶Ⅱ多肽a)在选自以下的序列中的约位置24-724的氨基酸序列SEQIDNO:8、SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、SEQIDNO:11、SEQIDNO:12、SEQIDNO:13、SEQIDNO:14、SEQIDNO:15和SEQIDNO:16，并命名为TBG1、TBG2、TBG3、TBG4、TBG5、TBG6和TBG7，分别示于图2；和b)由选自以下的cDNA克隆编码的氨基酸序列包含于GenBank收录号为AF023847、AF154420、AF154421、AF020390、AF154423、AF154424和AF154422中的cDNA克隆。20．包含所述β-半乳糖苷酶Ⅱ蛋白的带有表位部分的分离的多肽。21．特异性结合权利要求20的β-半乳糖苷酶Ⅱ多肽的分离的抗体。22．包含和选自以下的序列具有至少95％核苷酸序列同一性的核苷酸序列的多核苷酸的分离的核酸分子(a)编码具有选自以下的完全氨基酸序列的β-半乳糖苷酶Ⅱ多肽的核苷酸序列SEQIDNO:8、SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、SEQIDNO:11、SEQIDNO:12、SEQIDNO:13、SEQIDNO:14、SEQIDNO:15和SEQIDNO:16，并命名为TBG1、TBG2、TBG3、TBG4、TBG5、TBG6和TBG7，分别示于图3或由选自以下的cDNA克隆编码包含于GenBank收录号为AF023847、AF154420、AF154421、AF020390、AF154423、AF154424和AF154422中的cDNA克隆；(b)编码具有在选自以下的序列中的约位置24-724的氨基酸序列的成熟β-半乳糖苷酶Ⅱ多肽的核苷酸序列SEQIDNO:8、SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、SEQIDNO:11、SEQIDNO:12、SEQIDNO:13、SEQIDNO:14、SEQIDNO:15和SEQIDNO:16，并命名为TBG1、TBG2、TBG3、TBG4、TBG5、TBG6和TBG7，分别示于图3或由选自以下的cDNA克隆编码包含于GenBank收录号为AF023847、AF154420、AF154421、AF020390、AF154423、AF154424和AF154422中的cDNA克隆；和(c)与在以上(a)或(b)中的任一核苷酸序列互补的核苷酸序列。23．权利要求22的核酸分子，其中所述多核苷酸具有在图2中的选自SEQIDNO:1-3和5-7的完全核苷酸序列。24．权利要求22的核酸分子，其中所述多核苷酸具有在图2中的选自SEQIDNO:1-3和5-7的核苷酸序列，所述SEQIDNO:1-3和5-7分别编码具有称为TBG1-3和5-7的完全氨基酸序列的β-半乳糖苷酶多肽。25．权利要求22的核酸分子，其中所述多核苷酸具有在图2中的选自SEQIDNO:1-3和5-7的核苷酸序列，所述SEQIDNO:1-3和5-7分别编码具有称为TBG1-3和5-7的完全氨基酸序列的成熟多肽。26．权利要求22的核酸分子，其中所述多核苷酸具有包含于选自以下的GenBank收录号序列中的cDNA克隆的完全核苷酸序列，其中所述GenBank收录号选自AF023847、AF154420、AF154421、AF020390、AF154423、AF154424和AF154422的ATCC保藏号(whereinsaidpo1ynucleotidehasthecompletenucleotidesequenceofthecDNAclonecontainedinanGenBankAccessionNo.selectedfromthegroupconsistingofATCCDepositNo.selectedfromthegrorpconsistingofAF023847、AF154420、AF154421、AF020390、AF154423、AF154424andAF154422)。27．改变植物中的细胞壁代谢的方法，该方法包括用适合改变β-半乳糖苷酶活性的DNA构建物转化所述植物、培育所述植物或其后代并选择具有改变的细胞壁特征的植物，所述构建物包含在植物中有效的、可操作地连接至编码至少一个β-半乳糖苷酶的DNA序列的转录起始区。28．权利要求27要求保护的方法，其中所述DNA序列选自在权利要求1或权利要求22中要求保护的核酸分子的序列。29．用权利要求1或权利要求22要求保护的核酸分子转化的植物细胞。30．用权利要求29要求保护的植物细胞产生的植物。31．用权利要求30要求保护的植物产生的植物种子。32．用于改进植物中β-半乳糖苷酶基因表达的方法，该方法包括用权利要求1或权利要求22要求保护的核酸分子转化所述植物、培育所转化的植物并选择相比于未转化植物具有改进的β-半乳糖苷酶基因表达的植物。全文摘要提供新β－半乳糖苷酶基因家族和得自编码这些基因产物的cDNA的克隆的DNA序列,以由cDNA克隆pZBG2－1－4编码的β－半乳糖苷酶Ⅱ蛋白作为实例。还提供改变细胞壁代谢的方法,该方法包括改变至少一个β－半乳糖苷酶的活性并因此改变所述果实的品质。本发明还提供DNA构建物,该构建物包括在植物中有效的转录起始区控制下的部分或全部β－半乳糖苷酶DNA序列,以使其可以在植物细胞中产生RNA和可选地产生β－半乳糖苷酶多肽。本发明还涉及包括本发明的分离的核酸分子的重组载体、包含所述重组载体的宿主细胞以及制备这样的载体和宿主细胞的方法和使用它们通过重组技术生产β－半乳糖苷酶多肽或肽的方法。本发明还提供包含本发明的DNA构建物的植物细胞;由其产生的具有修饰的β－半乳糖苷酶基因表达的植物;和由这样的植物产生的种子。文档编号C12N9/38GK1311816SQ99809249公开日2001年9月5日申请日期1999年6月8日优先权日1998年6月9日发明者K·C·格罗斯,D·L·史密斯申请人:美国政府农业部