专利名称：以受体为基础的拮抗剂和制备方法及用途的制作方法
本申请要求1999年5月19日提交的美国申请号09/313,942的优先权、要求1998年9月25日提交的美国临时申请号60/101,858的优先权。贯穿于本申请中的各种公开文献作为参考。将这些文献所公开的全部技术内容引入本文作为本申请的参考。
背景技术：
尽管发现了不同的生物活性，但是睫状神经营养因子(CNTF)、白血病抑制因子(LIF)、致癌蛋白M(OSM)和白细胞介素-6(IL-6)包括在所定义的细胞因子族中(本文指的是细胞因子的“CNTF族”)。这些细胞因子被分在一组的原因是因其不同的结构相似性[Bazan，《神经元杂志》(J.Neuron)7197-208(1991)；Rose和Bruce，《美国国家科学院学报》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)888641-8645(1991)]并且可能更重要的是因为它们共有“β”信号转导受体成分[Baumann等《生化杂志》(J.Bio.Chem.)26519853-19862(1993)；Davis等《科学》(Science)2601805-1808(1993)；Gearing等《科学》(Science)2551434-1437(1992)；Ip等《细胞》(Cell)691121-1132(1992)；Stahl等《生化杂志》(J.Bio.Chem.)2687628-7631(1993)；Stahl和Yancopoulos《细胞》(Cell)74587-590(1993)]。通过该族细胞因子激活受体是由这些β成分的同二聚化或异二聚化所导致的[Davis等《科学》(Science)2601805-1808(1993)；Murakami等《科学》(Science)2601808-1810(1993)；Stahl和Yancopoulos《细胞》(Cell)74587-590(1993)]。IL-6受体的激活需要gp130的同二聚化[Murakami等《科学》(Science)2601808-1810(1993)；Hibi等《细胞》(Cell)631149-1157(1990)]，所述的gp130是一种开始鉴定为IL-6信号转导物的蛋白质[Hibi等《细胞》(Cell)631149-1157(1990)]。CNTF、LIF和OSM受体的激活是由gp130与第二种与gp130相关的称作LIFRβ的蛋白质之间的异二聚化所导致的[Davis等《科学》(Science)2601805-1808(1993)]，所述的LIFRβ开始因其结合LIF的能力而被鉴定[Gearing等《欧洲分子生物学协会杂志》(EMBO J.)102839-2848(1991)]。
除β成分外，这些细胞因子中的某些还需要确定特异性的“α”成分，它们比β成分更局限于其组织分布且由此可确定特定细胞因子的细胞靶物[Stahl和Yancopoulos《细胞》(Cell)74587-590(1993)]。因此，LIF和OSM是广泛起作用的因子，它们仅需要在响应细胞上存在gp130和LIFRβ，而CNTF需要CNTFRα[Stahl和Yancopoulos《细胞》(Cell)74587-590(1993)]且IL-6需要IL-6Rα[Kishimoto《科学》(Science)258593-597(1992)]。CNTFRα(Davis等《科学》(Science)2591736-1739(1993))和IL-6Rα[Hibi等《细胞》(Cell)631149-1157；Murakami等《科学》(Science)2601808-1810(1990)；Taga等《细胞》(Cell)58573-581(1989)]可以起可溶性蛋白质的作用，这与它们不与胞内信号传输分子发生相互作用而用于帮助其配体与合适的信号转导β亚单位发生相互作用的观点相一致[Stahl和Yancopoulos《细胞》(Cell)74587-590(1993)]。
来自其它细胞因子系统的附加证据也支持了二聚化提供了一种通常的机理的观点，所有细胞因子受体通过该机理启动信号转导。在这方面，生长激素(GH)可能用作最佳的实例。晶体学研究已经显示各GH分子含有两种不同的受体结合位点，它们均由受体中相同结合结构域来识别，使得单一GH分子连接两种受体分子[de Vos等《科学》(Science)255306-312(1992)]。二聚化依次发生，首先在GH上的位点1与一种受体分子结合，随后位点2与第二种受体分子结合[Fuh等《科学》(Science)2561677-1680(1992)]。当红细胞生成素(EPO)受体主要被引入半胱氨酸残基并产生二硫键连接的同二聚体的单一氨基酸改变所激活时，使用红细胞生成素(EP0)受体进行的研究也与受体激活中二聚化的重要性一致[Watowich等《美国国家科学院学报》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)892140-2144(1991)]。
除β亚单位的同或异二聚化作为受体激活的关键步骤外，第二种重要特征在于由CNTF族细胞因子形成最终受体复合物通过一种机理而发生，由此配体以一种有序方式依次结合受体成分[Davis等《科学》(Science)2601805-1818(1993)；Stahl和Yancopoulos《细胞》(Cell)74587-590(1993)]。因此，在最终使LIFRβ恢复成启动信号转导的β成分的异二聚体前，CNTF首先结合CNTFRα，从而形成一种复合物，该复合物结合gp130以形成因仅具有单一β成分而不适宜信号传输的中间体(此处称作αβ1中间体)。尽管尚未直接分离含有与IL-6Rα和gp130单一分子结合的IL-6的类似中间体，但是我们已经根据与其相对较远的相关性(CNTF)类似以及最终活性IL-6受体复合物恢复两种gp130单体这一事实推定它确实存在。总而言之，这些发现对一类细胞因子受体复合物的结构提出了建议(附
图1)，其中各细胞因子最高可以含有3个受体结合位点一个是结合可选择的α特异性决定成分的位点(α位点)；一个是结合第一种β信号转导成分的位点(β1位点)；且一个是结合第二种β信号转导成分的位点(β2位点)[Stahl和Yancopoulos《细胞》(Cell)74587-590(1993)]。以顺序方式使用这3个位点，在复合物形成过程的最后步骤即导致β成分异二聚化的过程中，关键在于启动信号转导[Davis等《科学》(Science)2601805-1818(1993)]。有关受体激活的具体方式和用于CNTF的非功能性β1中间体存在的知识已经导致了这样一种发现、即CNTF在某些情况中是一种IL-6的高亲和性拮抗剂并提供了设计以配体或受体为基础的如下具体所述细胞因子CNTF族的拮抗剂的基础策略。
一旦细胞因子的结合诱导受体复合物形成，则β成分的二聚化激活使各种底物磷酸化的胞内酪氨酸激酶活性[Ip等《细胞》(Cell)69121-1132(1992)]。这种酪氨酸激酶的激活看起来是下游事件的关键，这是因为阻断酪氨酸磷酸化的抑制剂也可防止诸如基因诱导这样的随后发生的事件[Ip等《细胞》(Cell)69121-1132(1992)；Nakajima和Wall，《细胞分子生物学》(Mol.Cell.Biol.)111409-1418(1991)]。近来，我们已经证实新近发现的包括Jak1、Jak2和Tyk2(称作Jak/Tyk激酶)[Firmbach-Kraft等《癌基因》(Oncogene)51329-1336(1990)；Wilks等《细胞分子生物学》(Mol.Cell.Biol.)112057-2065(1991)]并涉及与其它细胞因子信号转导[Argetsinger等《细胞》(Cell)74237-244(1993)；Silvennoinen等《美国国家科学院学报》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)908429-8433(1993)；Velazquez等《细胞》(Cell)70313-322(1992)；Witthuhn等《细胞》(Cell)74227-236(1993)]的非受体酪氨酸激酶族在没有配体存在的情况下预先与β亚单位gp130和LIFRβ的胞质结构域连接并在添加配体时使酪氨酸磷酸化和被激活[Stahl等《科学》(Science)26392-95(1994)]。因此，这些激酶作为细胞外部配体结合结果出现在细胞内部激活胞内信号转导的最接近的步骤中。下面描述检测系统，它用于筛选以该系统为基础的特异性激动剂或拮抗剂活性的小分子收集物。
CNTF族细胞因子在提供拮抗剂和激动剂的潜在治疗应用的各种生理过程中起重要作用。
发明概括本发明的一个目的是用于治疗与细胞因子相关的疾病或紊乱的细胞因子拮抗剂的生产方法。
本发明的另一个目的是所公开的细胞因子拮抗剂在治疗与细胞因子相关的疾病或紊乱中的用途。例如，可以将本文所述的IL-6拮抗剂用于治疗骨质疏松、包括多发性骨髓瘤在内的癌症的初期和二期结果或恶病质。
本发明的另一个目的是开发用于鉴定细胞因子受体的新型激动剂和拮抗剂的筛选系统。
本发明的另一个目的是开发用于鉴定起CNTF族细胞因子激动剂或拮抗剂作用的小分子的筛选系统。
本发明的另一个目的是开发用于鉴定CNTF族细胞因子的新型激动剂和拮抗剂的筛选系统。
本发明的另一个目的是开发用于鉴定CNTF族细胞因子的新型激动剂和拮抗剂的筛选系统。
附图简述附图1一类细胞因子受体模型中受体成分的顺序结合。该模型显示细胞因子最高含有3种受体结合位点且通过结合第一种可选择的α成分、随后结合β1且然后是β2而与其受体成分发生相互作用。许多细胞因子受体的β成分通过膜近侧区(阴影部分)与Jak/Tyk族的胞质蛋白质酪氨酸激酶发生相互作用。仅在β成分的二聚化时启动信号转导，正如β成分和Jak/Tyk激酶的酪氨酸磷酸化(P)的图解表示的。
附图2CNTF在表达IL6Rα、gp130、CNTFRα而不是LIFRβ的PC12细胞系(称作PC12D)中抑制IL-6响应。在有或没有所述CNTF存在的情况下培养不含血清的PC12D细胞+IL-6(50ng/mL)。某些平板还含有所指示的可溶性IL6Rα(1mg/mL)或可溶性CNTFRα(1mg/mL)。用抗-gp130对细胞裂解物进行免疫沉淀并用抗磷酸酪氨酸进行免疫印迹。酪氨酸磷酸化的特征在于IL-6诱导的IL-6受体系统激活，它在共同添加CNTF时被阻断。
附图3碘化CNTF结合在PC12D细胞上的斯卡查德分析。在有或没有用以测定特异性结合情况的过量非放射性竞争剂存在的情况下用不同浓度的碘化CNTF培养PC12D细胞。该附图表示了特异性结合的一定量碘化CNTF的斯卡查德图并给出了符合带有9pM和3.4nM解离常数的两种结合位点的数据。
附图4人gp130-Fc-His6氨基酸序列。1-169位氨基酸来自人gp130(Hibi等《细胞》(Cell)631149-1157(1990))。注意2位氨基酸已经由Leu改变成了Val以便顺应编码DNA序列中的Kozak序列。用斜体字表示gp130-Fc-His6的信号肽(1-22位氨基酸)。用粗体型字表示Ser-Gly的桥连(620、621位氨基酸)。662-853位氨基酸来自人IgG1的Fc结构域(Lewis等《免疫学杂志》(J.Immunol.)1512829-2838(1993))。()表示位于形成连接两个Fc结构域的链间二硫键的Fc之前的IgG铰合部的两个半胱氨酸(632和635位氨基酸)。用粗体/斜体型字表示六组氨酸标记(854-859位氨基酸)。(·)表示终止(STOP)密码子的位置。
附图5人IL-6Rα-Fc的氨基酸序列。关键1-358位氨基酸来自人IL-6Rα(Yamasaki等《科学》(Science)241825-828(1988))。注意2位氨基酸已经由Leu改变成了Val以便顺应编码DNA序列中的Kozak序列。用斜体字表示IL-6Rα-Fc的信号肽(1-19位氨基酸)。用粗体型字表示Ala-Gly的桥连(359、360位氨基酸)。361-592位氨基酸来自人IgG1的Fc结构域(Lewis等《免疫学杂志》(J.Immunol.)1512829-2838(1993))。()表示位于形成连接两个Fc结构域的链间二硫键的Fc之前的IgG铰合部的两个半胱氨酸(371和374位氨基酸)。(·)表示终止(STOP)密码子的位置。
附图6CNTF/IL-6/IL-11受体系统。图解描绘了有序形成的六聚化信号转导受体复合物。细胞因子与Rα成分结合而形成一种专性细胞因子·Rα复合物(Kd约为5nM)。这种低亲和性复合物接下来与第一种信号转导成分(标记的β1)结合而形成一种高亲和性细胞因子·Rα·β1复合物(Kd约为10pM)。就IL-6Rα而言，这种成分是gp130。这种三聚化高亲和性复合物随后与另一种这类复合物结合。这种复合物的形成产生信号转导，此时它分别涉及两种信号转导成分即标记的β1和β2的二聚化(选自(Ward等《生物化学杂志》(J.Bio.Chem.)26923286-23289(1994)；Stahl和Yancopoulos《神经生物学杂志》(J.Neurobiology)251454-1466(1994)；Stahl和Yancopoulos《细胞》(Cell)74587-590(1993)))。
附图7以异二聚化受体为基础的用于IL-6的配体捕获物的设计。异二聚化配体捕获物(trap)由两个链间二硫键连接的蛋白质gp130-Fc和IL-6Rα-Fc组成。证实gp130-Fc·IL-6Rα-Fc复合物(上组)可模拟高亲和性细胞因子·Rα·β1复合物(下组)。配体捕获物通过隔离IL-6且由此不用来与IL-6-响应细胞上的天然受体发生相互作用而起拮抗剂的作用。
附图8异二聚化免疫球蛋白重链/轻链受体融合体。图解描绘了重链/轻链受体融合分子的一个实例。gp130的胞外结构域与Cγ融合，而IL-6Rα的胞外结构域与κ链(κ)的恒定区融合。还描绘了链间二硫键(S-S)。
附图9gp130-Cγ1的氨基酸序列。关键1-619位氨基酸来自人gp130(Hibi等《细胞》(Cell)631149-1157(1990))。用粗体型字表示Ser-Gly的桥连。662-651位氨基酸来自人IgG1的恒定区(Lewis等《免疫学杂志》(J.Immunol.)1512829-2838(1993))。(*)表示终止(STOP)密码子的位置。
附图10gp130Δ3fibro的氨基酸序列。关键1-330位氨基酸来自人gp130(Hibi等《细胞》(Cell)631149-1157(1990))。其它符号如附图9中所述。
附图11J-CH1的氨基酸序列。关键用粗体型字表示Ser-Gly的桥连，用斜体字表示J-肽，给CH1结构域加下划线。
附图12Cγ4的氨基酸序列。关键用粗体型字表示Ser-Gly的桥连，2-239位氨基酸包括Cγ4序列。
附图13κ结构域的氨基酸序列。关键用粗体型字表示Ser-Gly的桥连，2-108位氨基酸包括κ结构域。涉及含有Cγ的CH1结构域的κ结构域二硫键的是C-末端半胱氨酸(108位氨基酸)。
附图14λ-结构域的氨基酸序列。关键用粗体型字表示Ser-Gly的桥连，2-106位氨基酸包括λ结构域(Cheung等《病毒学杂志》(J.Virol.)666714-6720(1992))。涉及含有Cγ的CH1结构域的λ结构域二硫键的是C-末端半胱氨酸(106位氨基酸)。
附图15可溶性IL-6Rα结构域的氨基酸序列。关键1-358位氨基酸包括可溶性IL-6Rα结构域(Yamasaki等《科学》(Science)241825-828(1988))。用粗体型字表示Ala-Gly的桥连。
附图16可溶性IL-6Rα313结构域的氨基酸序列。关键1-313位氨基酸包括截短的IL-6Rα结构域(IL-6Rα313)。用粗体型字表示Thr-Gly的桥连。
附图17gp130-Cγ1·IL-6Rα-κ的纯化。在非还原条件下进行4％-12％梯度凝胶SDS-PAGE。通过用银染色可以观察到蛋白质。泳道1在蛋白质A琼脂糖(Pharmacia)上纯化的约100ng的物质。泳道2标准物分子大小(Amersham)。泳道3此处所示的是在IL-6亲和色谱步骤中进一步纯化后蛋白质A纯化的物质。表示了gp130-Cγ二聚体[(gp130-Cγ1)2]、与一种IL-6Rα-κ[(gp130-Cγ1)2·(IL-6Rα-κ)1]结合的gp130-Cγ1二聚体和与两种IL-6Rα-κ[(gp130-Cγ1)2·(IL-6Rα-κ)2]结合的gp130-Cγ1二聚体的位置以及用千道尔顿表示的标准物分子大小的大小(200、100和46)。
附图18缓慢与配体捕获物IL-6解离。将来自以重链/轻链受体为基础的配体捕获物(gp130-Cγ1·IL-6Rα-κ)的解离比例与用中和单克隆抗体B-E8(BE8 MAb)获得的解离比例进行比较。
附图19IL-6可以诱导配体捕获物的多聚化。(A)图解描绘两种不同的配体捕获物并根据其结合蛋白质A的能力列举。gp130-Fc·IL-6Rα-Fc(GF6F)通过其Fc-结构域结合蛋白质A，而gp130-CH1·IL-6Rα-κ(G16κ)不结合蛋白质A。(B)用蛋白质A-琼脂糖从如所标记的GF6F±IL-6、G16κ±IL-6或GF6G+G16κ±IL-6的混合物中沉淀的蛋白质的抗卡巴蛋白质印迹。
附图20IL-6依赖性XG-1细胞增殖的抑制。为进行增殖试验而通过使细胞缺乏IL-65小时来制备XG-1细胞[Zhang等《血液》(Blood)833654-3663(1994)]。将试验设定在96-孔组织培养皿内的RPMI+10％胎牛血清+青霉素/链霉素+0.050nM 2-巯基乙醇+谷氨酰胺中进行。每孔使用0.1ml的该培养基。在试验的开始阶段以250,000/ml的密度悬浮细胞。在添加IL-6±配体捕获物或抗体72小时后，如上所述进行MTT试验(Panayotatos等《生物化学》(Biochemistry)335813-5818(1994))。列举了使用的不同配体捕获物。
附图21A-21D命名为424的融合多肽的核苷酸序列编码和推定氨基酸序列，它能够结合细胞因子IL-4而形成非功能性复合物。
附图22A-22D命名为603的融合多肽的核苷酸序列编码和推定氨基酸序列，它能够结合细胞因子IL-4而形成非功能性复合物。
附图23A-23D命名为622的融合多肽的核苷酸序列编码和推定氨基酸序列，它能够结合细胞因子IL-4而形成非功能性复合物。
附图24A-24F命名为412的融合多肽的核苷酸序列编码和推定氨基酸序列，它能够结合细胞因子IL-6而形成非功能性复合物。
附图25A-25F命名为616的融合多肽的核苷酸序列编码和推定氨基酸序列，它能够结合细胞因子IL-6而形成非功能性复合物。
附图26A-26E命名为569的融合多肽的核苷酸序列编码和推定氨基酸序列，它能够结合细胞因子IL-1而形成非功能性复合物。
附图27表示在TF1细胞生物测定试验中属于一种IL-2Rγ-scb-IL4Rα-FcΔC1融合多肽的命名为4SC375的IL-4捕获物作为IL-4拮抗剂优于单独的IL4RαFcΔC1几个数量级。
附图28表示在TF1细胞生物测定试验中命名为4SC375的IL-4捕获物显示出与命名为4SC424(附图21A-21D中所述)的IL-4捕获物相同的拮抗剂活性，其中4SC424是一种具有同等含量的IL-2Rγ成分与IL-4Rα成分的IL-2Rγ-IL4Rα-FcΔC1融合多肽。
附图29表示附图24A-24F中所述的IL6捕获物(6SC412IL6R-scb-gpx-FcΔC1)在XG1生物测定试验中是一种优于中和单克隆抗体对人IL-6-BE8的IL-6拮抗剂。
附图30表示捕获物1SC569(附图26A-26E中所述)能够拮抗IL-1的作用并在用IL-1治疗时阻断IL-6从MRC 5细胞中产生。
附图31A-31G列举了IL-4Rα1.IL-13Rα1.Fc单链捕获物构建体的核苷酸和编码的氨基酸序列。
附图32A-32G列举了IL-13Rα1.IL-4Rα1.Fc单链捕获物构建体的核苷酸和编码的氨基酸序列。
附图33由IL-4Rα1.IL-13Rα1.Fc和IL-13Rα1.IL-4Rα1.Fc阻断IL-13。以10nM的浓度添加IL-4Rα1.IL-13Rα1.Fc或IL-13Rα1.IL-4Rα1.Fc捕获物阻断IL-13诱导的生长达～2nM。在～4-5nM的IL-13浓度下，TF1细胞的生长被抑制了50％。
附图34由IL-4Rα1.IL-13Rα1.Fc和IL-13Rα1.IL-4Rα1.Fc阻断IL-4。以10nM的浓度添加IL-4Rα1.IL-13Rα1.Fc或IL-13Rα1.IL-4Rα1.Fc阻断IL-4诱导的生长达～1nM。在～3-4nM的IL-4浓度下，TF1细胞的生长被抑制了50％。
附图35人IL-1捕获物阻断了外源给予的huIL-1的体内作用。在0时给BALB/c小鼠皮下注射huIL-1(0.3μg/kg)。在注射huIL-1前24小时，用载体或150倍摩尔以上的huIL-1捕获物预处理动物。在处死动物前2小时(26小时)，用第2次注射huIL-1(0.3μg/kg，皮下)攻击小鼠。在不同的时间点处采集血样并检测血清中的IL-1水平(表示为平均值±/-SEM；n＝5/组)。
附图36A和附图36B人IL-4捕获物拮抗猴体内的人IL-4的作用。附图36A用所指示的3个部分处理猕猴。每日皮下注射两次人IL-4(25μg/kg)、持续4天；并从给予人IL-4前1天开始静脉内给予人IL-4捕获物(8mg/ml)和载体5天。每日采集血浆并检测MCP-1水平。将结果表示为平均值±/-SEM；n＝4。(ANOVA p＜0.0007；Tukey-Kramer部分2与部分1比较，p 0.05；部分2与部分3比较，p 0.05；部分1与部分3比较，没有显著性差异。)附图36B用所指示的3个部分处理猕猴。每日皮下注射两次人IL-4(25μg/kg)、持续4天；并从给予人IL-4前1天开始静脉内给予人IL-4捕获物(8mg/ml)和载体5天。每日采集全血用于CD16的流式细胞仪分析。将结果表示为平均值±/-SEM；n＝4。(ANOVA p＜0.042；Tukey-Kramer部分2与部分1比较，p＜0.05；部分2与部分3和部分1比较，没有显著性差异。)
附图37小鼠IL-4捕获物部分防止小鼠体内IL-4介导的IgE增加。将用抗小鼠IgD注射(100μl/小鼠，皮下)的BALB/C小鼠随机分成3组，各组接受(第3-5天时)载体、鼠IL-4捕获物(1mg/kg，皮下)或小鼠IL-4的单克隆抗体(1mg/kg，皮下)。在不同的时间点处采集血清并检测IgE水平。将结果表示为平均值±/-SEM(n＝5/组)。(ANOVA p＝0.0002；Tukey-Kramer载体与IL-4捕获物比较，p＜0.01；载体与IL-4抗体比较，p＜0.001；IL-4捕获物与IL-4抗体比较，没有显著性差异)。
发明详述本发明提供了一种编码能够结合细胞因子而形成非功能性复合物的融合多肽的分离的核酸分子，它包括a)一种编码第一种融合多肽成分的核苷酸序列，所述的第一种融合多肽成分包括细胞因子受体特异性决定成分的胞外结构域的细胞因子结合部分的氨基酸序列；b)一种编码第二种融合多肽成分的核苷酸序列，所述的第二种融合多肽成分包括细胞因子受体的信号转导成分胞外结构域的细胞因子结合部分的氨基酸序列；c)一种编码第三种融合多肽成分的核苷酸序列，所述的第三种融合多肽成分包括多聚化成分的氨基酸序列。
所谓“细胞因子结合部分”指的是结合所述细胞因子所必需的胞外结构域的最小部分。本领域技术人员可以接受的观点是细胞因子受体的确定特征是存在的两种含有规范半胱氨酸的纤连蛋白样结构域且存在的WSXWX盒状室(Bazan，J.F.，1990，PNAS 876934-6938)。还可以将编码细胞因子受体结合成分和细胞因子受体信号转导成分的胞外结构域的序列用于生成本发明的融合多肽。类似地，可以使用编码细胞因子受体成分较长部分的较长序列。然而，期望小于胞外结构域的片段起结合细胞因子的作用，且由此本发明期望包括结合细胞因子所必需的胞外结构域最小部分作为细胞因子结合部分的融合多肽。
本发明包括细胞因子受体的“特异性决定成分”和细胞因子受体的“信号转导成分”。无论用于命名细胞因子特定成分或亚单位的命名法如何，本领域技术人员均可以识别用于决定细胞因子的细胞靶物的受体成分或亚单位且由此得知构成“特异性决定成分”的成分。
类似地，无论所用的命名法如何，本领域技术人员均可以得知构成“信号转导成分”的受体成分或亚单位。本文所用的“信号转导成分”是一种不属于特异性决定成分且在没有特异性成分存在的情况下不结合细胞因子或与之结合较弱的天然受体的成分。在该天然受体中，“信号转导成分”可以参与信号传输。
例如，尽管某些细胞因子受体含有命名为α和β的成分，但是IL-4受体含有称作IL-2Rγ的信号转导成分。然而，无论何名称与该成分相关，本领域技术人员均可以得知IL-4受体的何种成分是信号转导成分。因此，为了实施本发明和产生对IL-4的高亲和性捕获物，本领域技术人员生产了一种分离的核酸分子，它包括编码第一种融合多肽成分的核苷酸序列，所述的第一种融合多肽成分包括IL-4受体特异性决定成分(IL-4Rα)的胞外结构域的细胞因子结合部分的氨基酸序列；编码第二种融合多肽成分的核苷酸序列，所述的第二种融合多肽成分包括IL-4受体的信号转导成分(IL-2Rγ)胞外结构域的细胞因子结合部分的氨基酸序列；和编码第三种融合多肽成分的核苷酸序列，所述的第三种融合多肽成分包括多聚化成分(例如一种IgG的Fc结构域)的氨基酸序列，从而生成一种IL-4的高亲和性捕获物。
将可以用于制备本发明细胞因子拮抗剂的受体成分的某些另外的实例列在表1中。表1中列举了用于描述那些起某些细胞因子受体特异性决定成分作用的成分和那些起某些细胞因子受体信号转导成分作用的成分的科学文献中所用的某些可变命名，它们仅作为实例而不以任何方式起限定作用。
表1细胞因子 特异性决定成分 信号转导成分白细胞介素-1(IL-1) I型IL-1R(参考文献8) IL-1R AcP(参考文献8，11)I型IL-1R(参考文献8)IL-1RI(参考文献11)IL-1RII(参考文献11)白细胞介素-2(IL-2) α-亚单位(参考文献2) β-链(参考文献3)α-链(参考文献3) β-亚单位(参考文献2)IL-2Rα(参考文献1) γ-链(参考文献3)IL-2Rβ(参考文献1，10)IL-2Rγ(参考文献1，10)白细胞介素-3(IL-3) IL-3Rα(参考文献1) βc(参考文献1)α-亚单位(参考文献2) β-亚单位(参考文献2)α-受体成分(参考文献5) β-链(参考文献3)β-受体成分(参考文献5)白细胞介素-4(IL-4) IL-4R(参考文献1) γ-链(参考文献3)IL-2Rγ(参考文献1)白细胞介素-5(IL-5) IL-5α(参考文献1)βc(参考文献1)α-亚单位(参考文献2) β-亚单位(参考文献2)α-受体成分(参考文献5) β-链(参考文献3)β-受体成分(参考文献5)
表1(接续)细胞因子 特异性决定成分 信号转导成分粒细胞巨噬细胞集落刺激因 α-受体成分(参考文献5)β-受体成分(参考文献5)子α-亚单位(参考文献2) β-亚单位(参考文献2)GMRα-(参考文献2) β-链(参考文献3)βc(参考文献1)GMRβ(参考文献1，2)白血病抑制因子LIFBP(参考文献1) Gp130(参考文献1，3)α-受体成分(参考文献5) β-受体成分(参考文献5)白细胞介素-11(IL-11) α-链(参考文献4) Gp130(参考文献4)NR1(参考文献4)白细胞介素-15(IL-15) IL-15Rα(参考文献10) IL-2Rβ(参考文献10)IL-2Rγ(参考文献10)干扰素-γ(IFNγ) IFN-γR(参考文献7) AF-1(参考文献7)IFN-γR1(参考文献7)IFN-γR2(参考文献7)TGFβ II型(参考文献6，9) I型(参考文献6，9)
表1中仅引用了大量参考文献中的几篇并将它们列举如下1.Sato和Miyajima《细胞生物学最新观点》(Current Opinionin Cell Biology)6174-179(1994)-参见176页第9-16行；2.Miyajima等《免疫学年鉴回顾》(Annual Review ofImmunology)10295-331(1992)-参见295页第4行至296页第1行；305页最后一段；3.Kondo等《科学》(Science)2621874-1877(1993)-参见1874页第1和2列；4.Hilton等《欧洲分子生物学协会杂志》(EMBO Journal)134765-4775(1994)-参见4766页第1列、第20、24行；5.Stahl和Yancopoulos《细胞》(Cell)74587-590(1993)-参见587页第2列第15至22行；6.Bassing等《生物化学杂志》(Journal of BiologicalChemistry)26914861-14864(1994)-参见14861页第2列第1至9和21至28行；7.Kotenko等《生物科学杂志》(Journal of BiologicalScience)27020915-20921(1995)-参见20915页摘要的第1至5行；8.Greenfeder等《生物化学杂志》(Journal of BiologicalChemistry)27013757-13765(1995)-参见13757页第1列第6行至第2列第3行和第2列第10-12行；第13764页第2列倒数第3行和13765页第1列第1至7行；9.Lebrun和Vale《细胞分子生物学》(Molecular CellBiology)171682-1691(1997)-参见1682页摘要的第2至6行；10.Kennedy和Park《临床免疫学杂志》(Journal of ClinicalImmunology)16134-143(1996)-参见134页摘要的第1至7行；136页第2列第1至5行；11.Wesche等《生物化学杂志》(Journal of BiologicalChemistry)2727727-7731(1997)-参见7731页第20至26行。
Kotenko等近来鉴定了据报导可用作活性IL-10受体复合物和启动IL-10诱导的信号转导事件所必需的辅助链的IL-10R2(IL-10Rβ)链(S.V.Kotenko等《欧洲分子生物学协会杂志》(EMBO Journal)1997第16卷5894-5903)。另外的细胞因子及其受体描述在由Chares A.Janeway，Jr.和Paul Travers著、Current BiologyLtd./Garland Publishing Inc.copyright 1996出版的《免疫生物学、健康与疾病的免疫系统》(Immunobiology，The Immune SystemIn Health and Disease)第2版第A9页附录II中。
在制备编码本发明融合多肽的核酸序列的过程中，用由宿主载体系统表达时产生融合多肽单体种类的单链核苷酸编码所述融合多肽的第一种、第二种和第三种成分。由此表达的单体因多聚化成分(第三种融合多肽成分)之间的相互作用而多聚化。以这种方式生产融合多肽避免了如果第一种和第二种成分作为独立的分子产生且然后多聚化而对由此产生的异二聚化混合物纯化的需求。例如，1995年11月28日授权的美国专利号5,470,952描述了起CNTF或IL-6拮抗剂作用的异二聚化蛋白质的生产方法。从用合适的α和β成分共转染的细胞系纯化异二聚体。然后使用诸如从制备型非变性聚丙烯酰胺凝胶中的被动洗脱法这样的方法或通过使用高效阳离子交换层析法从同二聚体中分离异二聚体。使用本发明的方法可以避免对该纯化步骤的需求。
此外，1996年4月18日公开的PCT国际申请WO 96/11213中命名了二聚化IL-4抑制剂，该申请的申请人已经制备了两种IL-4受体被聚合间隔物所结合的同二聚体并已经制备了IL-4受体被聚合间隔物连接成IL-2受体γ链的异二聚体。所述的聚合间隔物是聚乙二醇(PEG)。分别表达两种受体成分IL-4R和IL-2Rγ并纯化它们。然后通过使用双官能PEG试剂将所述成分彼此连接而生产聚乙二醇化(pegylated)的同二聚体和异二聚体。本发明的有利因素是它可避免对这类耗时而昂贵的纯化和聚乙二醇化(pegylated)步骤的需求。
在本发明的一个实施方案中，编码第一种成分的核苷酸序列是编码第二种成分的核苷酸序列的上游。在本发明的另一个实施方案中，编码第一种成分的核苷酸序列是编码第二种成分的核苷酸序列的下游。可以准备实施本发明另外的实施方案，其中依次重排第一种、第二种和第三种融合多肽成分。例如，如果将编码第一种成分的核苷酸序列命名为1、将编码第二种成分的核苷酸序列命名为2并将编码第三种成分的核苷酸序列命名为3，那么作为从5’-3’读码的本发明分离的核酸中的成分顺序可以是下列6种组合中的任意一种1，2，3；1，3，2；2，1，3；2，3，1；3，1，2或3，2，1。
在本发明的另一个实施方案中，由所述融合多肽结合的细胞因子可以是血细胞生成素族细胞因子，它们选自白细胞介素-2、白细胞介素-3、白细胞介素-4、白细胞介素-5、白细胞介素-6、白细胞介素-7、白细胞介素-9、白细胞介素-11、白细胞介素-13、白细胞介素-15、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、制癌蛋白M、白血病抑制因子和心脏营养蛋白-1(cardiotrophin-1)组成的组。
在本发明另外的实施方案中，由所述融合多肽结合的细胞因子可以是干扰素族细胞因子，它们选自IFN-γ、IFN-α和IFN-β组成的组。
在本发明另外的实施方案中，由所述融合多肽结合的细胞因子可以是免疫球蛋白超家族的细胞因子，它们选自B7.1(CD80)和B7.2(B70)组成的组。
在本发明另外的实施方案中，由所述融合多肽结合的细胞因子可以是TNF族细胞因子，它们选自TNF-α、TNF-β、LT-β、CD40配体、Fas配体、CD27配体、CD30配体和4-1 BBL组成的组。
在本发明另外的实施方案中，由所述融合多肽结合的细胞因子可以是选自白细胞介素-1、白细胞介素-10、白细胞介素-12、白细胞介素-14、白细胞介素-18和MIF组成的组的细胞因子。
因为在TGF-β/BMP族细胞因子中的特异性确定和信号转导通过类似机理发生(参见D.Kingsley，《基因与发育》(Genes &Development)1994，8133-146；J.Wrana，《无机电解质代谢》(Miner Electrolyte Metab)24120-130(1998)；R.Deryneck和X.Feng《生物化学和生物物理学誌》(Biochimica et BiophysicaActa)1333(1997)F105-F150；和J.Massague和F.Weis-Garcia“丝氨酸/苏氨酸激酶受体转化β族生长因子信号的介体”-《癌症调查》(Cancer Surveys)1996第27卷“细胞信号传输”，皇家癌症研究基金会(Imperial Cancer Research Fund))，所以可以将本发明用于生产属于TGF-β/BMP族的细胞因子的高亲和性拮抗剂。
因此，在本发明另外的实施方案中，由融合多肽结合的细胞因子可以是TGF-β/BMP族的细胞因子，它们选自TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、BMP-2、BMP-3a、BMP-3b、BMP-4、BMP-5、BMP-6、BMP-7、BMP-8a、BMP-8b、BMP-9、BMP-10、BMP-11、BMP-15、BMP-16、与子宫内膜出血相关的因子(EBAF)、生长分化因子-1(GDF-1)、GDF-2、GDF-3、GDF-5、GDF-6、GDF-7、GDF-8、GDF-9、GDF-12、GDF-14、米勒抑制物质(mullerian inhibiting substance)(MIS)、活化素-1、活化素-2、活化素-3、活化素-4和活化素-5组成的组。
在本发明的可选择的实施方案中，特异性决定成分、信号转导成分或两者均可以被单链Fv取代。单链Fv(scFv)是一种仅具有通过一段合成肽序列与轻链V区连接的重链V区的截短的Fab。参见，例如转让给Cambridge Antibody Technology Limited的美国专利号5,565,332、5,733,743、5,837,242、5,858,657和5,871,907，将它们引入本文作为参考。因此，本发明期望例如，一种编码能够结合细胞因子而形成非功能性复合物的融合多肽的分离的核酸分子，它包括一种编码第一种融合多肽成分的核苷酸序列，所述的第一种融合多肽成分包括细胞因子受体特异性决定成分的胞外结构域的细胞因子结合部分的氨基酸序列；一种编码第二种融合多肽成分的核苷酸序列，所述的第二种融合多肽成分包括scFv的氨基酸序列，所述的scFv能够在与细胞因子受体的特异性决定成分胞外结构域细胞因子结合部分结合的位点不同的位点上结合细胞因子；和一种编码第三种融合多肽成分的核苷酸序列，所述的第三种融合多肽成分包括多聚化成分的氨基酸序列。另一方面，所述的特异性决定成分可以被scFv取代，所述的scFv在细胞因子上结合到与信号转导成分结合的位点不同的位点。因此，本发明关注一种编码能够结合细胞因子而形成非功能性复合物的融合多肽的分离的核酸分子，它包括一种编码第一种含有scFv氨基酸序列的融合多肽成分的核苷酸序列，所述的scFv在细胞因子上结合与细胞因子受体信号转导成分的胞外结构域细胞因子结合的位点不同的位点；一种编码第二种融合多肽成分的核苷酸序列，所述的第二种融合多肽成分包括细胞因子受体的信号转导成分胞外结构域的细胞因子结合部分的氨基酸序列；和一种编码第三种融合多肽成分的核苷酸序列，所述的第三种融合多肽成分包括多聚化成分的氨基酸序列。
在另一个实施方案中，本发明关注一种编码能够结合细胞因子而形成非功能性复合物的融合多肽的分离的核酸分子，它包括一种编码第一种含有第一种scFv氨基酸序列的融合多肽成分的核苷酸序列，所述的第一种scFv与细胞因子上的位点结合；一种编码第二种含有第二种scFv氨基酸序列的融合多肽成分的核苷酸序列，所述的第二种scFv在细胞因子上结合与第一种scFv结合的位点不同的位点；和一种编码第三种融合多肽成分的核苷酸序列，所述的第三种融合多肽成分包括多聚化成分的氨基酸序列。
在所有上述含有scFv’s的实施方案中，本发明还关注编码第一种成分的核苷酸序列是编码第二种成分的核苷酸序列的上游的实施方案；编码第一种成分的核苷酸序列是编码第二种成分的核苷酸序列的下游的实施方案；和本发明另外的依次重排第一种、第二种和第三种融合多肽的实施方案。例如，如果将编码第一种成分的核苷酸序列命名为1、将编码第二种成分的核苷酸序列命名为2并将编码第三种成分的核苷酸序列命名为3，那么作为从5’-3’读码的本发明分离的核酸中的成分顺序可以是下列6种组合中的任意一种1，2，3；1，3，2；2，1，3；2，3，1；3，1，2或3，2，1。
在本发明优选的实施方案中，所述的多聚化成分包括免疫球蛋白衍生的结构域。更具体地说，免疫球蛋白衍生的结构域可以选自IgG的Fc结构域、IgG的重链和IgG的轻链组成的组。在另一个实施方案中，所述的多聚化成分可以是Fc结构域，可以从其中除去前5个氨基酸(包括半胱氨酸)以便产生称作Fc(ΔC1)的多聚化成分。另一方面，所述的多聚化成分可以是Fc结构域，其中前5个氨基酸内的半胱氨酸已经被另一种诸如(例如)丝氨酸或丙氨酸这样的氨基酸所取代。
本发明还提供了由本发明分离的核酸分子编码的融合多肽。因第三种多聚化成分的功能而优选该融合多肽是多聚化形式。在优选的实施方案中，多聚体是二聚体。合适的多聚化成分是编码免疫球蛋白重链铰合区的序列(Takahashi等，1982，《细胞》(Cell)29671-679)、免疫球蛋白基因序列及其部分。在本发明的一个优选的实施方案中，将免疫球蛋白基因序列、特别是一种编码Fc结构域的基因序列用于编码第三种多聚化成分。
本发明还关注一种包括本文所述本发明核酸分子的载体。
本发明还提供了一种包括本文所述本发明核酸分子的表达载体，其中所述的核酸分子可操作地与一种表达控制序列连接。本发明还提供了一种用于生产融合多肽的宿主-载体系统，它包括已经引入适于表达所述融合多肽的宿主细胞的本发明表达载体。所述的合适的宿主细胞可以是一种诸如大肠杆菌这样的细菌细胞、诸如巴斯德毕赤氏酵母这样的酵母细胞、诸如草地贪夜蛾这样的昆虫细胞或诸如COS、CHO、293、BHK或NSO细胞这样的哺乳动物细胞。
本发明还提供了生产本发明融合多肽的方法，该方法在允许生产所述融合多肽并回收如此生产的融合多肽的条件下通过使本文所述的宿主-载体系统的细胞生长来进行。
本发明提供了以由诸如CNTF族细胞因子这样的细胞因子共有的受体成分为基础的新型拮抗剂。
本文所述的本发明关注任意细胞因子拮抗剂的生产方法，它应用一种α特异性决定成分，在与细胞因子混合时与第一种β信号转导成分结合而形成非功能性中间体，然后与第二种β信号转导成分结合，从而导致β-受体二聚化和随后的信号转导。根据本发明，使受体的可溶性α特异性决定成分(sRα)与细胞因子受体(β1)的第一种β信号转导成分的胞外结构域(β1)结合成异二聚体(sRαβ1)，它们通过结合细胞因子而形成一种非功能性复合物而起拮抗剂的作用。
正如实施例1中所述，CNTF和IL-6共有β1受体成分gp130。CNTF与CNTFRα和gp130形成中间体这一事实可以在缺乏LIFRβ的细胞中得到证实(实施例1)，其中CNTF与CNTFRα的复合物结合gp130并通过IL-6和IL-6Rα防止gp130的同二聚化，由此阻断信号转导。这些研究为开发本文所述的IL-6拮抗剂提供了基础，正如它们表明在配体存在的情况下，如果可以形成由配体、其α受体成分及其β1受体成分组成的非功能性中间体复合物，那么它将有效地阻断配体的作用。其它细胞因子可以使用诸如LIFRβ这样的其它β1受体成分，它们也可用于生产本发明的拮抗剂。
因此，例如在本发明的一个实施方案中，IL-6或CNTF的有效拮抗剂由其受体的α特异性决定成分(分别是sIL-6Rα和sCNTFRα)胞外结构域与gp130的胞外结构域的异二聚体组成。下文分别称作sIL-6Rαβ1或sCNTFRαβ1的所得的异二聚体分别起IL-6或CNTF高亲和性捕获物的作用，由此使细胞因子难以与天然膜结合形式的其受体形成信号转导复合物。
尽管已经证实来自受体胞外部分的可溶性配体结合结构域作为其配体的捕获物起一定的作用且由此起拮抗剂的作用[Bargetzi等《癌症研究》(Cancer Res.)534010-4013(1993)；等《美国国家科学院学报》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)898616-8620(1992)；Mohler等《免疫学杂志》(J.Immunol.)1511548-1561(1993)；Narazaki等《血液》(Blood)821120-1126(1993)]，但是IL-6和CNTF受体的异常方面在于α受体成分构成了配体结合结构域，它们以可溶性形式与其配体一同有效地起受体激动剂的作用[Davis等《科学》(Science)2591736-1739(1993)；Taga等《细胞》(Cell)58573-581(1989)]。按照本发明制备的sRαβ1异二聚体为其配体提供了有效的捕获物，从而结合皮摩尔范围的具有亲和性的这些配体(以对CNTF与PC12D细胞的结合研究为基础)而不会产生功能性中间体。可以将本文所述的技术应用于开发任意细胞因子的细胞因子捕获物，它使用提供特异性的α-成分，以及一种β成分，该β成分在与α-特异性成分结合时，对细胞因子具有的亲和性高于各单独成分。因此，本发明的拮抗剂包括下列物质的拮抗剂白细胞介素1-5[IL-1，Greenfeder等《生化杂志》(J.Bio.Chem.)27013757-13765(1995)；Gou等《生化杂志》(J.Bio.Chem.)27027562-27568(1995)]；IL-2[Taniguchi等欧洲专利号0386289-A和0386394-A(1990)；Takeshita等《科学》(Science)257379-382(1992)]；IL-3[Kitamura等《细胞》(Cell)661165-1174(1991)]；IL-4[Idzerda等《实验药物杂志》(J.Exp.Med.)171861-873(1990)]；IL-5[Taverneir等《细胞》(Cell)661175-1184(1991)]；IL-11[Cherel等直接提交给EMBL/GenBank/DDBJ数据库；登记号Z38102]；白细胞介素15[IL-15；Hemar等《细胞生物学杂志》(J.Cell.Biol.)129555-64(1995)；Taniguchi等欧洲专利号0386289-A和0386394-A(1990)；Takeshita等《科学》(Science)257379-382(1992)]；粒细胞巨噬细胞集落刺激因子[GM-CSF；Hayashida等《美国国家科学院学报》(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)979655-9659(1990)]；LIF；γ干扰素[IFNγ；Aguet等《细胞》(Cell)55273-280(1988)；Soh等《细胞》(Cell)76793-802(1994)]和β转化生长因子[TGFβ；Inagaki等《美国国家科学院学报》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)905359-5363(1993)]。
使用本领域技术人员所公知的方法可以制备α和β受体胞外结构域。已经克隆、测序并表达了CNTFRα受体[Davis等《科学》(Science)25359-63(1993)，将该文献的全部内容引入本文作为参考]。Gearing等在《欧洲分子生物学协会杂志》(EMBO J.)102839-2848(1991)、Hibi等在《细胞》(Cell)631149-1157(1990)中和1993年5月27公开的PCT申请WO 93/10151中描述了LIFRβ和gp130的克隆方法，将这些文献的全部内容引入本文作为参考。
通过在原核或真核表达系统中克隆并表达可以制备用于实施本发明的受体分子。使用许多方法可以表达和纯化重组受体基因。可以将编码所述因子的基因亚克隆入诸如例如不以任何方式起限定作用的pCP110这样的细菌表达载体中。
通过任意技术可以纯化重组因子，使得随后形成稳定的具有生物活性的蛋白质。例如(且不以任何方式起限定作用)，可以从细胞中回收作为可溶性蛋白质或作为包含体的所述因子，用8M盐酸胍和透析可以从细胞中定量提取它们。为了进一步纯化所述因子，可以使用常规的离子交换层析、疏水作用层析、反相层析或凝胶过滤。
可以使用公知的融合区改造sRαβ1异二聚化受体，1993年5月27公开的描述β受体异二聚体的生产方法的标题为“致癌蛋白M和白血病抑制因子的受体”的PCT申请WO 93/10151中描述了这些公知的融合区；或可以通过以化学方式交联胞外结构域来制备sRαβ1异二聚化受体。所用的结构域可以由α和β成分的完整胞外结构域组成或它们可以由维持与其配体形成复合物和sRαβ1复合物中其它成分的能力的突变体或其片段组成，例如，正如下面实施例4中所述，已经使用缺乏三种纤连蛋白样结构域的gp130制备了IL-6拮抗剂。
在本发明的一个实施方案中，使用亮氨酸拉链改造胞外结构域。已经使用1∶1的化学计量法证实了人转录因子c-jun和c-fos的亮氨酸拉链结构域可形成稳定的异二聚体[Busch和Sassone-Corsi《遗传学趋势》(Trends Genetics)636-40(1990)；Gentz等《科学》(Science)2431695-1699(1989)]。尽管还证实了可形成jun-jun同二聚体，但是它们的稳定性低于jun-fos异二聚体约1000倍。尚未检测到Fos-fos同二聚体。
使用遗传工程嵌合基因在上述受体成分的可溶性或胞外结构域的C-末端上对c-jun和c-fos的亮氨酸拉链结构域进行框内融合。这些融合体可以是直接的或它们可以使用诸如人IgG铰合区这样的柔性接头或由诸如甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸或丙氨酸这样的氨基酸组成的各种长度和组合形式的多肽接头。另外，可以用His-His-His-His-His-His(His6)、[SEQ.ID NO.1]标记嵌合蛋白以便通过金属螯合物层析和/或通过可利用的抗体表位进行快速纯化，从而进行蛋白质印迹上的检测、免疫沉淀或生物测定试验中的活性缺失/阻断。
在另一个实施方案中，正如下面实施例3中所述，使用类似的方法、且使用人IgG1的Fc-结构域制备sRαβ1异二聚体[Aruffo等《细胞》(Cell)6735-44(1991)]。与后者相反，当将携带Fc-结构域的嵌合分子表达为二硫键连接的同二聚体时，异二聚体的形成必须通过化学方式实现。因此，在有利于破坏链间二硫键但不影响链内二硫键的条件下可以减少同二聚体。然后按照等摩尔量混合单体与不同的胞外部分并将其氧化成同二聚体和异二聚体的混合物。通过层析技术分离该混合物中的成分。另一方面，通过遗传工程和表达由受体成分的可溶性或胞外部分组成的分子、随后是hIgG的Fc-结构域、随后是上述c-jun或c-fos亮氨酸拉链可以使形成的这类异二聚体产生偏差[Kostelny等《免疫学杂志》(J.Immunol.)1481547-1553(1992)]。由于这些亮氨酸拉链主要形成异二聚体，所以如果需要可以将它们用于形成异二聚体。就使用亮氨酸拉链描述的嵌合蛋白而言，还可以用金属螯合物或表位标记它们。可以将这种标记的结构域用于通过金属-螯合物层析和/或通过抗体快速纯化，从而进行蛋白质印迹上的检测、免疫沉淀或生物测定试验中的活性缺失/阻断。
在另一个实施方案中，可以使用形成二聚体的其它免疫球蛋白衍生的结构域来制备异二聚体。例如，这类结构域包括IgG重链(Cγ1和Cγ4)以及人免疫球蛋白κ和λ轻链的恒定区。Cγ与轻链的异二聚化发生在Cγ的CH1结构域与轻链(CL)恒定区之间并且通过经单一二硫桥共价连接两个结构域得到稳定。因此，正如实施例4中所述，使用这些免疫球蛋白结构域可以制备构建体。另一方面，所述的免疫球蛋白结构域包括可以来源于启动二聚化的T细胞受体成分的结构域。在本发明的另一个实施方案中，通过使用柔性接头环表达为嵌合分子来制备sRαβ1异二聚体。将编码嵌合蛋白的DNA构建体设计成它可表达以串联方式通过柔性环彼此融合的两种可溶性或胞外结构域。这种环可以是完全人工的(例如由丝氨酸或苏氨酸在某一间隔处打断聚甘氨酸重复序列)或“借”自天然出现的蛋白质(例如hIgG的铰合区)。可以对分子进行改造，其中对融合的可溶性或胞外结构域的顺序进行转换(例如sIL6Rα/环/sgp130或sgp130/环/sIL6Rα)和/或其中所述环的长度和组成是可变的，从而对具有所需特征的分子进行选择。
另一方面，按照本发明制备的异二聚体可以纯化自与合适的α和β成分共转染的细胞系。使用本领域技术人员可得到的方法可以从同二聚体中分离异二聚体。例如，通过从制备型、非变性聚丙烯酰胺凝胶中的被动洗脱法可以回收有限量的异二聚体。另一方面，使用高效阳离子结合层析法可以纯化异二聚体。已经使用单S阳离子交换柱获得了极佳的纯化结果。
除通过结合游离的CNTF或IL-6而起拮抗剂作用的sRαβ1异二聚体外，本发明还关注具有新特性的IL-6的改造的突变译本的用途，所述的新特性是能够结合IL-6Rα和单一gp130分子、而不能使第二种gp130完成β成分的同二聚化且由此对任意IL-6响应细胞起有效IL-6拮抗剂的作用。我们用于IL-6和CNTF受体复合物结构的模型表明这些细胞因子具有不同的结合α、β1和β2受体成分的位点[Stahl和Yancopoulos《细胞》(Cell)74587-590(1993)]。包括这些位点中的每一个的关键氨基酸残基的突变产生具有所需拮抗剂特性的新型分子。β1位点的脱离会产生一种仍然结合α受体而非β1成分且由此包括具有纳摩尔亲和力的拮抗剂的分子。包括IL-6的β2位点(IL-6β2-)的关键氨基酸残基的突变产生一种可结合IL-6Rα和第一种gp130单体而不能连接(engage)第二种gp130且由此功能失活的分子。类似地，CNTFβ2位点的突变产生一种可结合CNTFRα和gp130而不能连接LIFRβ的分子(CNTFβ2-)，由此通过形成非功能性β1中间体而拮抗CNTF的作用。以上述CNTF形成具有高亲和性的β1中间体的结合结果为基础，CNTFβ2-和IL-6β2-可构成具有10pM范围亲和力的拮抗剂。
将不同的方法用于生成并鉴定具有所需特性的IL-6或CNTF的突变。可以使用通过编码IL-6或CNTF的DNA的标准方法进行的随机诱变，随后分析收集的产物以便鉴定具有下面所概括的所需新特性的突变细胞因子。已经广泛使用遗传工程进行诱变来阐明重组蛋白质功能结构域的结构组成。在文献中已经描述了进行缺失或取代诱变的几种不同手段。最成功的手段看起来是丙氨酸扫描诱变[Cunningham和Wells(1989)《科学》(Science)2441081-1085]和同系物扫描诱变[Cunningham等(1989)《科学》(Science)2431330-1336]。
可以将使用这类方法进行的IL-6或CNTF核酸序列的定向诱变用于生成CNTFβ2-和IL-6β2-候选物。有系统地进行适于定向诱变的区的选择或这种选择根据研究来决定，由此将对各因子的各组单克隆抗体用于设计细胞因子区，它在结合单一α受体成分或上述αβ1异二聚化可溶性受体后可能暴露。类似地，对单一或与α受体成分或上述αβ1异二聚化可溶性受体结合的复合物形式的细胞因子进行化学修饰或有限蛋白水解、随后分析保护和暴露区可以揭示出潜在的β2结合位点。
鉴定具有所需特性的CNTF或IL-6突变体的检测试验涉及高亲和力阻断对适当响应的细胞系的IL-6或CNTF的作用[Davis等《科学》(Science)2591736-1739(1993)；Murakami等《美国国家科学院学报》(Natl.Acad.Sci.USA)8811349-11353(1991)]。这类检测试验包括由CNTF或IL-6引起的细胞增殖、存活力或DNA合成或细胞系的构建，其中因子的结合诱导诸如CAT或β-半乳糖苷酶这样的报导基因产生[Savino等《美国国家科学院学报》(Natl.Acad.Sci.USA)904067-4071(1993)]。
另一方面，可以使用以受体为基础的检测试验评价不同突变体的特性。一种这类检测试验由下列步骤组成对突变体使用表位标记的[Davis等《科学》(Science)25359-63(1991)]sRαβ1试剂筛选其结合上述sRαβ1受体异二聚体的能力。此外，一种检测试验可以通过评价表位标记的可溶性β2试剂是否可以在有β1异二聚体存在的情况下结合细胞因子来探测β2位点的存在或不存在。例如，CNTF仅在有CNTFRα和gp130存在的情况下结合LIFRβ(β2成分)[Davis等《科学》(Science)2601805-1808(1993)；Stahl等《生化杂志》(J.Biol.Chem.)2687628-7631(1993)]。因此，可溶性LIFRβ试剂仅可以在有可溶性sRαβ1二聚体sCNTFRαβ1存在的情况下结合CNTF。对于IL-6来说，sRαβ1试剂可以是I1-6Rαβ1且用于β2的探针可以是表位标记的sgp130。因此，可以将CNTF的β2-突变体鉴定为结合sRαβ1试剂的那些突变体，从而证明细胞因子的α和β1位点是完整的，不过不能结合β2试剂。
此外，本发明提供了检测或测定潜在2-突变体活性的方法，该方法通过测定β-受体成分或选自Jak1、Jak2和Tyk2或任意其它信号转导成分(诸如CLIPs)组成的组的信号转导成分的磷酸化情况来进行，经测定它们对CNTF族细胞因子的响应是磷酸化。
表达本文所述的信号转导成分的细胞可以如此自然进行或被遗传改造以便如此进行。例如，可以使用本领域中任何公知的方法，通过转导、转染、微注射、电穿孔经转基因动物等将如Velazquez等在《细胞》(Cell)第70卷313-322(1992)中获得的Jak1和编码Tyk-2核酸序列引入细胞。
根据本发明，使细胞与潜在拮抗剂接触并将β-成分或信号转导成分的酪氨酸磷酸化情况与没有潜在拮抗剂存在情况下的相同成分的酪氨酸磷酸化情况进行比较。在本发明的另一个实施方案中，将上述细胞与潜在拮抗剂接触所导致的酪氨酸磷酸化与接触亲代CNTF族的相同细胞的酪氨酸磷酸化进行比较。在这类检测试验中，细胞表达必须胞外受体(α-成分)或可以使细胞在有可溶性受体成分存在的情况下与测试活性剂接触。因此，例如，在为鉴定CNTF激动剂或拮抗剂所设计的检测系统中，细胞可以表达α-成分CNTFRα、β-成分gp130和LIFRβ以及诸如Jak1这样的信号转导成分。使细胞与测试活性剂接触并将β-成分或信号转导成分的酪氨酸磷酸化与在有CNTF存在情况下产生的的磷酸化形式进行比较。另一方面，将接触测试活性剂所导致的酪氨酸磷酸化与没有测试活性剂存在情况下发生的磷酸化进行比较。另一方面，例如，用于IL-6的一种检测系统可以包括使表达β-成分gp130和诸如Jak1、Jak2或Tyk2这样的信号转导蛋白质的细胞接触与可溶性IL-6受体共同施用的测试活性剂。
在本发明的另一个实施方案中，将上述手段用于开发筛选小分子拮抗剂的方法，所述的小分子拮抗剂在配体结合、受体复合物形成和随后的信号转导过程中的不同步骤时起作用。通过评价对如上所述的可溶性受体与配体之间复合物形成的干扰情况来筛选可能干扰配体-受体相互作用的分子。另一方面，对小分子或天然产物的文库筛选IL-6或CNTF诱导报道基因响应的以细胞为基础的检测试验以便鉴定潜在的拮抗剂。在对其它因子(诸如类似于激活受体酪氨酸激酶的GM-CSF或神经营养蛋白-3)产生反应的以细胞为基础的检测试验中重新筛选那些显示出拮抗剂活性的分子以便评价其对CNTF/IL-6/OSM/LIF族因子的特异性。将这类以细胞为基础的筛选方法用于鉴定在信号转导过程中抑制任意大量靶物的拮抗剂。
在一种这样的检测系统中，拮抗剂的特异性靶物是Jak/Tyk族激酶与受体β亚单位之间的相互作用[Firmbach-Kraft《癌基因》(Oncogene)51329-1336(1990)；Wilks等《细胞分子生物学》(Mol.Cell.Biol.)112057-2065(1991)]。如上所述，LIFRβ和gp130预先与Jak/Tyk族胞质蛋白酪氨酸激酶结合，这些激酶随配体诱导的β成分二聚化而被激活(参见Stahl等《科学》(Science)26392-95(1993))。因此，可以进入细胞质并破坏β成分与Jak/Tyk激酶之间相互作用的小分子能够阻断所有随之发生的胞内信号传输。使用评价小分子阻断纯化β成分相关结合结构域与Jak/Tyk激酶之间相互作用的能力的体外实验方案可以筛选这类活性。另一方面，一种方法使用双杂交相互作用系统易于筛选这样的分子，它们可以抑制结合Jak/Tyk激酶的β成分的以酵母为基础进行的检测。[Chien等《美国国家科学院学报》(Proc.Natl.Acad.Sci.)889578-9582(1991)]。在这类系统中，两种蛋白质(在本实施例中是β成分和Jak/Tyk激酶或其相关结构域)之间的相互作用诱导诸如β-半乳糖苷酶这样的合适的标记产生。对选择的小分子测试其破坏所需相互作用而不抑制两种对照蛋白质之间相互作用的能力。这种筛选方法的优点在于需要测试化合物在抑制β成分与Jak/Tyk激酶之间相互作用之前进入细胞。
本文所述的CNTF拮抗剂结合细胞因子CNTF和IL-6或与之竞争。因此，它们可用于治疗由CNTF或IL-6介导的疾病或紊乱。例如，IL-6拮抗剂的治疗应用包括如下情况1)在可以因绝经后妇女或经过卵巢切除术的雌激素水平下降而恶化的骨质疏松症中，看起来IL-6是破骨细胞发生的关键介体，从而导致骨的吸收[Horowitz《科学》(Science)260626-627(1993)；Jilka等《科学》(Science)25788-91(1992)]。重要的是，看起来IL-6仅在雌激素缺失的情况下起主要作用且显然与正常骨的维持的关系最小。与它一致的实验证据表明阻断抗体对IL-6的功能可以减少破骨细胞的数量[Jilka等《科学》(Science)25788-91(1992)]。尽管也使用雌激素替代疗法，但是看起来存在包括子宫内膜和乳腺癌的危害增加在内的副作用。因此，本文所述的IL-6拮抗剂更特别可以将破骨细胞发生降低至正常水平。
2)看起来IL-6通过以自分泌或旁分泌方式起作用来促进肿瘤形成而直接与多发性骨髓瘤相关[van Oers等《血液学年鉴》(Ann.Hematol.)66219-223(1993)]。此外，IL-6水平升高产生不需要的继发性反应诸如骨吸收、血钙过多和恶病质；在有限的研究中，对IL-6或IL-6Rα的功能阻断抗体具有一定成效[Klein等《血液》(Blood)781198-1204(1991)；Suzuki等《欧洲免疫学杂志》(Eur.J.Immunol.)221289-1993(1992)]。因此，本文所述的IL-6拮抗剂有利于继发性反应和抑制肿瘤生长。
3)IL-6可以是导致与AIDS和癌症相关的恶病质的肿瘤坏死因子(TNF)的介体[Strassmann等《临床研究杂志》(J.Clin.Invest.)891681-1684(1992)]，可能通过降低脂肪组织中脂蛋白脂酶活性来达到该目的[Greenberg等《癌症研究》(Cancer Research)524113-4116(1992)]。因此，本文所述的拮抗剂可以用于在这类患者中缓解或减少恶病质。
可以使用本领域技术人员公知的方法来确定用于治疗这些或其它CNTF族相关疾病或紊乱的有效剂量[参见，例如Fingl等《治疗学的药理基础》(The Pharmacological Basis of Therapeutics)，Goodman和Gilman编辑，Macmillan Publishing Co.，New York，pp.1-46(1975)]。本发明应用的药物组合物包括药理上可接受的液体、固体或半固体载体中的与载体或靶分子(targeting)(例如抗体、激素、生长因子等)连接的上述拮抗剂和/或在体内给药前混入脂质体、微囊和控释制剂(包括表达细胞的拮抗剂)。例如，所述的药物组合物可以在诸如无菌水、盐水、磷酸盐缓冲液或右旋糖溶液这样的水溶液中包括一种或多种拮抗剂。另一方面，在可以根据这类治疗需要植入患者体内的固体(例如蜡)或半固体(例如胶质)制剂中可以包括所述的活性剂。给药途径可以是本领域中公知的任意给药方式，包括但不限于静脉内给药、鞘内给药、皮下给药、经注入所涉及的组织给药、动脉内给药、口服给药或通过植入装置给药。
给药可以导致本发明活性剂分布在整个身体中或发布在局限区域。例如，在涉及神经系统远区的某些条件下，可能需要静脉内或鞘内给予活性剂。在某些情况中，可以将含有活性剂的移植物放入损害区域或放在接近损害的区域。合适的移植物包括但不限于以可吸收明胶海绵、蜡或以微粒为基础的移植物。
实施例实施例1CNTF与IL-6竞争结合GP130材料和方法材料从DNAX获得对IL-6有响应的PC12细胞的克隆(PC12D)。如[Kasiakowski等《神经化学杂志》(J.Neurochem.)571003-10012(1991)]所述制备大鼠CNTF。IL-6和sIL-6Rα商购自R&D System。通过所述的方法(Stahl等《生化杂志》(J.Biol.Chem.)2687628-7631(1993))使家兔体内对来源于接近gp130 C-末端区的肽(序列CGTEGQVERFETVGME[SEQ.ID.NO.2])的抗血清升高。抗磷酸酪氨酸单克隆4G10商购自UBI且用于ECL的试剂商购自Amersham。信号转导检测试验使平板(10cm)中的PC12D在不含血清的培养基(RPMI1640+谷氨酰胺)内饥饿1小时，然后在37℃和有或没有规定浓度下的添加的大鼠CNTF存在的情况下用IL-6(50ng/mL)+sIL-6Rα(1mg/mL)对其培养5分钟。接着使样品进行所述的抗-gp130免疫沉淀、SDS-PAGE和抗磷酸酪氨酸免疫印迹(Stahl等《生化杂志》(J.Biol.Chem.)2687628-7631(1993))。结果使用表达IL-6Rα、gp130和CNTFRα而非LIFRβ的PC12细胞系(称作PC12D)测定CNTF阻断IL-6响应的能力。正如作预计的，这些细胞对IL-6有响应而对LIFRβ没有响应(附图2)，这是因为LIFRβ是一种CNTF信号转导所需要的成分[Davis等《科学》(Science)26059-63(1993)]。根据对其它细胞系的结果[Ip等《细胞》(Cell)691121-1132(1992)]，PC12D细胞使gp130(以及各种其它称作CLIPs的蛋白质)酪氨酸磷酸化作为对2nM IL-6的响应(附图2)。添加重组可溶性IL-6Rα(sIL-6Rα)提高了gp130酪氨酸磷酸化的水平，正如在某些其它系统中所报导的[Taga等《细胞》(Cell)58573-581(1989)]。然而，与IL-6同时添加2nM CNTF可严重减少gp130的酪氨酸磷酸化。尽管在有CNTF、IL-6和sIL-6Rα在的情况下保留了轻度的gp130酪氨酸磷酸化响应，但是如果CNTF的浓度有四倍于8nM的增加，那么这种情况被消除。因此，在含有CNTFRα而非LIFRβ的IL-6响应细胞中，CNTF是一种相当有效的IL-6作用的拮抗剂。
实施例2CNTF与CNTFRαβ的结合材料和方法CNTF结合的斯卡查德分析如[Stahl等《生化杂志》(JBC)2687628-7631(1993)]所述制备和纯化125I-CNTF。使用浓度范围在20pM-10nM的125I-CNTF在PC12细胞中进行饱和结合研究。直接在单层细胞上进行结合。从孔中除去培养基并用由磷酸缓冲盐水(PBS；pH7.4)、0.1mM杆菌肽、1mM PMSF、1mg/ml亮异蛋白酶肽和1mg/ml BSA组成的测试缓冲液将细胞洗涤一次。将细胞在室温下的125I-CNTF中培养2小时，随后用测试缓冲液快速洗涤2次。将细胞用含有1％SDS的PBS裂解并用Packardγ计数器在90-95％的效率下计数。通过存在的100倍以上的未标记CNTF来确定非特异性结合的情况。特异性结合的范围在70％-95％。结果根据对PC12D细胞上碘化CNTF结合情况进行斯卡查德分析来估计CNTF与CNTFRαβ1结合的平衡常数(附图3)。该数据与具有解离常数为9pM和3.4nM的2个位点配合一致。低亲和性位点相当于CNTF与具有接近3nM的Kd的CNTFRα的相互作用[Panayptatos等《生化杂志》(J.Biol.Chem.)26819000-19003(1993)]。我们将高亲和性复合物解释为含有CNTF、CNTFRα和gp130的中间体。确实含有CNTFRα、gp130和LIFRβ且由此作为对CNTF的响应产生强有力的酪氨酸磷酸化的尤文氏肉瘤细胞系(EW-1)显示出与具有1nM和10的解离常数极为类似的2个位点配合。因此，如果CNTF结合另外含有LIFRβ的复合物，那么显然CNTF通过同样高的亲和性与仅含有CNTFRα和gp130的复合物结合，由此证明产生本文所述的sRαβ拮抗剂的可能性。
实施例3细胞因子配体捕获物的生产方法病毒原种的生产在27℃下的Gibco SF900II培养基中使获自草地贪夜蛾的SF21昆虫细胞生长至密度为1×106个细胞/ml。将用于GP130-Fc-His6(附图4)或IL6Rα-Fc(附图5)的各病毒原种加入到生物反应器中至低复数为0.01-0.1PFU/细胞以便启动感染。使该感染过程持续5-7天，从而使病毒复制达到最大值而基本上不发生细胞裂解。以无菌方式将细胞混悬液等分入无菌离心瓶并通过离心除去细胞。将不含细胞的上清液收集在无菌瓶中并在4℃下储存至进一步应用为止。
通过如O’Reilly、Miller和Luckow所述的噬菌斑测定试验测定病毒滴度。在接种有2×106个细胞的60mm组织-培养皿中实施该方法。将顺序稀释的病毒原种加入到粘附细胞中并通过振摇培养该混合物以便使病毒吸附各个细胞。加入琼脂覆盖物并在27℃下将平板培养5-7天。用中性红染色存活细胞显示有环状噬菌斑产生，对它们进行计数而得到病毒滴度。用于蛋白质生产的细胞共感染使未感染的SF21细胞在装有40L SF900II培养基的ABEC生物反应器中生长。将温度控制在27℃并通过控制惰性气流中氧的流速将溶解的氧的浓度维持在50％饱和度的水平。当达到2×106个细胞/mL密度时，使用一种带有具有Milipore Prostak 0.65微米膜的切向流过滤装置的低剪切蒸汽灭菌泵将细胞在生物反应器内浓缩至20L体积。浓缩后，将新鲜无菌生长培养基缓慢加入到所述的生物反应器中，同时过滤系统经渗滤持续除去剩余的生长培养基。在已经进行2个体积的交换(40L)后，将另外20L新鲜培养基加入到所述的生物反应器中以便使细胞重新悬浮至40L的原始体积。通过使用血细胞计数器对存活细胞进行计数再测定一次细胞密度。
以细胞密度、病毒滴度和所需的感染复数(MOI)为基础计算各病毒原种的所需用量。5∶1、5∶2、10∶2和10∶4的IL-6Rα-Fc与GP130-Fc-His6的病毒原种之比均导致产生显著量的异二聚体。理想的病毒原种之比高度取决于来自两种同二聚体中每一种的异二聚体纯化的简化。IL6Rα-Fc同二聚体通过固定化金属亲和层析相对易于除去下游。选择病毒感染比例以便将形成的更难以清除下游的GP130-Fc-His6同二聚体减少到最低限度。如果改进了用于清除所得同二聚体的纯化方法时，那么为感染选择的GP130-Fc-His6病毒原种的相对量随连续的批量而增加。
以无菌方式将病毒原种在单一容器内混合、然后转染入生物反应器。这导致SF21细胞的同步感染。使感染过程进行3-4天，从而有充足的时间产生最大量的异二聚体蛋白质。回收和蛋白质A的层析纯化在生物反应器过程的感染阶段结束时，使用10ft2MiliporeProstak滤膜(0.65微米)孔大小在所述的生物反应器中浓缩细胞。在清洁的加工容器内收集通过滤膜的不含细胞的透过物。在过滤操作结束时，用10N NaOH将含有蛋白质产物的透过物流的pH调节至8.0。通过将提取物压过0.8微米的深度滤膜(Sartorious)、随后通过0.2微米滤膜而除去所得的沉淀。加入足量的0.5M EDTA储备液而得到5mM的终浓度。将过滤的蛋白质溶液上含有100-200mL PharmaciaProtein A Sepharose 4 Fast Flow的用PBS平衡的10cm直径柱。蛋白质A对3种重组蛋白质产物中的每一种的Fc-Fc结构域具有极高的亲和性，从而使它们结合，而其它不含细胞的提取物中的蛋白质流过该柱。在上样后，用另含有350mM NaCl的PBS将该柱洗涤至基线。在低pH下用0.5M乙酸或用降低pH梯度的0.1M柠檬酸和0.2M磷酸二钠缓冲液洗脱IgG-Fc标记的蛋白质。将Tris碱或磷酸二钠加入到所洗脱的蛋白质中以便避免与过长时间的与低pH条件的接触。
将收集的蛋白质渗滤入PBS或HEPES缓冲液并用1mM碘乙酰胺衍生(derivitized)以便保护接近各Fc结构域铰合区的游离半胱氨酸上暴露的硫氢基。这可防止二硫化物介导的蛋白质聚集。将具有标称30千道尔顿截断值的6ft2微孔螺旋纹(spiral wound)超滤膜用于进行缓冲液交换。使用渗滤缓冲液作为空白、通过在280nm处的UV吸收度来测定总蛋白质。使用6％的Tris-甘氨酸凝胶(Novex)、通过SDS PAGE凝胶电泳来测定异二聚体和两种同二聚体蛋白质的相对量。将凝胶进行考马斯染色、然后转入脱色溶液过夜。将Shimadzu光密度扫描仪用于测定SDS PAGE凝胶上各蛋白质带的相对密度。将峰面积比用于计算柱收集级分中异二聚体和各同二聚体的级分。固定化金属亲和层析纯化GP130-Fc-His6融合蛋白C-末端上的6个组氨酸残基为从两种同二聚体中分离异二聚化IL-6拮抗剂提供了极佳的分子柄(handle)。GP130-Fc-His6部分的各C-末端组氨酸上的咪唑基具有与包括铜、镍、锌、钴、铁和钙在内的几种二价金属的强结合常数。由于IL6Rα-Fc同二聚体不具有C-末端组氨酸残基，所以显然具有最低的亲和性。IL6Rα-Fc-GP130-Fc-His6异二聚体具有单一固定组的6个组氨酸，使得它对金属具有更强的亲和性，同时GP130-Fc-His6同二聚体具有2组6个组氨酸，它们均使得三种IgG标记的蛋白质与金属亲和柱具有最高的亲和性。在洗脱缓冲液中使用增加量的咪唑选择性洗脱三种蛋白质由此可按如下顺序洗脱蛋白质1.IL6Rα-Fc同二聚体2.IL6Rα-Fc-GP130-Fc-His异二聚体3.GP130-Fc-His同二聚体用硫酸镍溶液饱和含有100mL Pharmacia Chelating SepharoseFast Flow的26mm直径柱，直到在柱洗脱液中观察到明显的绿色为止。然后将该柱用几个柱体积的去离子水洗涤、接着用50mM HEPES、40mM咪唑(pH8.0)平衡。咪唑与固定化镍结合产生绿色至蓝色的改变。将咪唑加入到上样的蛋白质中至终浓度为40mM。将咪唑加入到上样的蛋白质中可减少与IL6Rα-Fc同二聚体的结合、增加剩余两个种类可利用的表面积。上样后，将该柱用几个柱体积的50mMHEPES、80mM咪唑(pH8.0)洗涤至重新建立稳态基线为止。用几个柱体积范围内的50mM HEPES、150mM咪唑(pH8.0)选择性洗脱异二聚体。如上部分中所述收集蛋白质级分并将其渗滤入PBS。
实施例4构建配体捕获物的另一种方法如上所述，通过CNTF且类似地是通过IL-6和IL-11激活受体，其结合事件遵循一固定的顺序(附图6)。细胞因子开始结合其具有低亲和性的同源Rα(Kd＝3-10nM)；这是一种所需的步骤-不表达所述同源Rα的细胞对同源细胞因子没有响应。细胞因子·Rα复合物结合第一种信号转导成分gp130而形成高亲和性复合物(10pM等级的CNTF·CNTFRα·gp130复合物的Kd)。因为产生信号传输的信号转导成分二聚化，这种复合物不会转导信号(Stahl和Yancopoulos《神经生物学杂志》(J.Neurobiology)251454-1446(1994)；Stahl等《科学》(Science)2671349-1353(1995)；Davis等《科学》(Science)2601805-1808(1993)；Stahl等《科学》(Science)26392-95(1994)；Murakami等《科学》(Science)2601808-1810(1993))。至少就Il-6的情况而言，细胞因子·Rα信号转导物异二聚化复合物随后结合另一种类似的复合物而形成六聚化复合物(附图6)(Ward等《生化杂志》(J.Biol.Chem.)26923286-23289(1994))。所得信号转导物的二聚化-就IL-6而言是gp130(Murakami等《科学》(Science)2601808-1810(1993))且就CNTF而言是IL-11、gp130和LIFR(Davis等《科学》(Science)2601805-1808(1993))-引起信号转导。
开始制备的异二聚化分子包括与gp130胞外结构域连接的可溶性Rα成分。证实这些分子可模拟高亲和性细胞因子·Rα·gp130复合物并起其同源细胞因子高亲和性拮抗剂的作用(附图7)。为了制备这些分子，将gp130的胞外结构域分别与IL-6和CNTF、IL-6Rα和CNTFRα的α-受体成分的胞外结构域配对。为了使Rα与gp130胞外结构域连接，使可溶性Rα-成分和gp130与人IgG1的Fc部分融合而分别产生Rα-Fc和gp130-Fc。选择Fc结构域主要但并非唯一的原因是，它自然形成二硫键连接的二聚体。将包括Rα-Fc·gp130-Fc的异二聚化分子表达、纯化并证实起其同源配体高效拮抗剂的作用。此外，发现这些分子对其同源细胞因子具有高度特异性，因为这是确定细胞因子被结合和捕获的α-受体成分的选择(在没有合适的Rα存在的情况下不存在可测定的细胞因子与gp130结合)。
此处我们描述了该项技术的延伸，它使得通过设计可以具有另外的有利特征诸如稳定性、Fc-受体-介导的清除或降低的效应器功能(诸如补体结合)的不同异二聚化可溶性受体配体捕获物的改造成为可能。此外，应证实所述的技术适合于改造哺乳动物或其它合适的蛋白质表达系统中的任意异二聚化蛋白质，包括但不限于应用受体、配体和诸如酶或催化抗体这样的催化成分的异二聚化分子。材料和方法用于IL-6的以异多聚化免疫球蛋白重链/轻链可溶性受体为基础的配体捕获物的遗传工程使用人gp130、人IL-6α-受体(IL-6Rα)、带有或不带有连接区(J)的人IgG1(Cγ1)(Lewis等《免疫学杂志》(Journal ofImmunology)1512829-2838(1993))或IgG4(Cγ4)的重链(Cγ)恒定区以及还带有或不带有不同j-肽(j)的人免疫球蛋白(Ig)的轻链κ和λ恒定区(Cheung等《病毒学杂志》(Journal of Virology)666714-6720(1992))来改造本文所述的IL-6捕获物。这种设计利用了Cγ结构域与κ或λ轻链异二聚化的天然能力。Cγ与轻链的异二聚化发生在Cγ的CH1结构域与轻链(CL)恒定区之间且通过经单二硫桥共价连接2个结构域而得到稳定。我们推定与人IgG1的Fc结构域类似，可以将Cγ与CL的结合用于产生二硫键连接的异二聚化蛋白质，它们由一个链上的gp130胞外结构域与另一个链上的IL-6Rα胞外结构域组成。与这类蛋白质的以Fc为基础的配对物类似，据推测这类蛋白质是IL-6的高亲和性配体捕获物且结果是抑制IL-6与IL-6响应细胞上的天然受体的相互作用，由此起IL-6拮抗剂的作用。此外，与抗体极为类似的是，应用全长Cγ区的构建体可以形成Cγ链的同二聚体，从而产生由两个“轻链”和两个“重链”组成的抗体样分子(附图8)。这种设计的潜在优点在于它可以更为接近地模拟IL-6·IL-6Rα·gp130复合物且可以显示出对配体的亲和性高于可比拟的单异二聚体。将另外的设计与使用仅含CH1结构域的截短译本的Cγ结合起来。这些方法与受体-κ融合蛋白一起形成异二聚化分子且由此类似于抗体的Fab片段。
可以在质粒载体中改造所有的可溶性受体-Ig嵌合基因，所述的质粒载体包括但不限于适合于哺乳动物表达的载体(COS猴肾细胞、中国仓鼠卵巢细胞[CHO]和ras-转化的成纤维细胞[MG-ras])且在用于有效翻译的各嵌合基因开始处包括Kozak序列(CGC CGC CAC CATGGT G)。使用标准遗传工程方法来进行改造。通过DNA测序、哺乳动物表达、随后使用合适抗体进行蛋白质印迹、测定配体结合和解离的生物物理检测试验并通过生长抑制试验(如下所述的XG-1)来检验各构建体。由于用于改造这些嵌合蛋白的结构域位于合适限制位点的侧翼，所以能够使用这些结构域改造其它嵌合蛋白，包括应用诸如IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、GM-CSF、LIF、IL-11、IL-15、IFNγ、TGFβ及其它这样的因子的受体胞外结构域的嵌合体。将用于制备IL-6捕获物的各成分的氨基酸配位体列在下面(注意将带有起始的甲硫氨酸的起始码编为#1；使用20个氨基酸的单字母码列出长序列)(a)应用人gp130的构建体(i)通过使gp130的胞外结构域(1-619位氨基酸)与Ser-Gly桥、随后是包括Cγ1和终止密码子的330个氨基酸框内融合来改造gp130-Cγ1(附图9)。
(ii)除将J-肽(氨基酸序列GQGTLVTVSS)插入Ser-Gly桥与Cγ1序列之间外，按照与gp130-Cγ1相同的方式改造gp130-Cγ1(参见附图9)。
(iii)通过框内融合不带有其三个纤连蛋白样结构域的gp130的胞外结构域来改造gp130Δ3fibro-Cγ1(附图10)。嵌合蛋白的剩余部分与gp130-Cγ1相同。
(iv)除仅使用Cγ1的CH1部分取代Cγ1区外，按照与对gp130-Cγ1所述相同的方式改造gp130-J-CH1(附图11)。这种构建体的C-末端结构域包括含有导致IgG的重链与轻链异二聚化的半胱氨酸残基的铰合部分。含有两个涉及Cγ1同二聚化的铰合部分已经与CH2和CH3结构域一起缺失。
(v)除使用Cγ4取代Cγ1外，按照与对gp130-Cγ1所述相同的方式改造gp130-Cγ4(附图12)。此外，通过在Cγ4结构域的铰合区引入两个碱基的沉默突变来改造RsrII DNA限制位点。RsrsII位点要求进行其它所需的遗传工程操作，诸如构建与gp130-Cγ4相同的CH1。
(vi)除使用人Ig的κ轻链取代Cγ1外，按照与对gp130-Cγ1所述相同的方式改造gp130-κ(附图13)。
(vii)除将J-肽(氨基酸序列TFGQGTKVEIK)插入Ser-Gly桥与κ-区之间外，按照与对gp130-J-k所述相同的方式改造gp130-J-κ(附图13)。
(viii)除使用人Ig的λ轻链的恒定区(Cheung等《病毒学杂志》(Journal of Virology)666714-6720(1992))取代Cγ1外，按照与对gp130-Cγ1所述相同的方式改造gp130-λ(附图14)。
(b)应用人IL-6Rα的构建体(i)通过使包括IL-6Rα胞外结构域(附图15)的IL-6Rα(Yamasaki等《科学》(Science)241825-828(1988))的1-358位氨基酸与Ala-Gly桥、随后是包括Cγ1和终止密码子的330个氨基酸框内融合来改造IL6Rα-Cγ1。
(ii)除使用用于gp130-κ的κ-结构域(附图13)取代Cγ1外，如对IL6Rα-Cγ1所述改造IL6Rα-κ。
(iii)除将对gp130-j-κ所述的j-肽放置在Ala-Gly桥与κ-结构域之间外，如对IL6Rα-κ所述改造IL6Rα-j-κ。
(iv)使用由1-313位氨基酸组成的截短型IL-6Rα改造三种另外的构建体IL6Rα313-Cγ1、IL6Rα313-κ和IL6Rα313-j-κ(附图16)。通过使IL6Rα313与Thr-Gly桥、随后是上述Cγ1、κ和j-κ-结构域框内融合来制备这些构建体中的每一种。改造这些构建体以便补充gp130Δ3fibro-衍生的构建体。配体捕获物的表达和纯化为了生产共价连接的可溶性gp130与可溶性IL-6Rα的异二聚体，将gp130-Ig嵌合蛋白与以互补对形式的合适IL-6Rα-Ig嵌合蛋白共同表达。通过以稳定或短暂的方式将相应的表达载体共转入转染入合适的哺乳动物细胞系来实现共表达。通过几种不同的方法从条件培养基中纯化所得的二硫键连接的异二聚体，所述的方法包括但不限于固定化蛋白质A或蛋白质G上的亲和色谱法、以配体为基础的亲和色谱法、离子交换法和凝胶过滤法。
用于纯化重链/轻链受体融合蛋白的方法类型的一个实例如下通过共转染分别编码gp130-Cγ1和IL-6Rα-κ的两种不同载体而在COS细胞中表达gp130-Cγ1·IL-6Rα-κ。在共转染2天后收集不含血清的条件培养基(400ml)并通过1ml蛋白质A琼脂糖(Phramacia)上的亲和色谱法来纯化含有Cγ1的蛋白质。通过1ml NHS-活化琼脂糖(Phramacia)上的第二次亲和色谱步骤进一步纯化该步骤中产生的用重组人IL-6衍生的物质以便从gp130-Cγ1和IL-6Rα-κ复合物中除去gp130-Cγ1二聚体(该gp130-Cγ1二聚体不结合IL-6)。正如由SDS-PAGE、随后是银染色所证实的，通过该方法产生的蛋白质的纯度超过90％(附图17)。已经成功地使用类似方案对其它重链/轻链受体异二聚体进行了纯化。结果免疫球蛋白重链/轻链受体融合体拮抗剂的生物活性在各种不同的检测试验中对纯化的配体捕获物测试其结合IL-6的能力。例如，与IL-6自抗-IL-6单克隆中和抗体B-E8的解离率一起平行测定与配体捕获物结合的IL-6的解离率[Brochier等《国际免疫药理学杂志》(Int.J.Immunopharmacology)1741-48(1995)及其中的参考文献]。该类型实验的一个实例如附图18中所示。在该实验中用500pM的gp130-Cγ1·IL-6Rα-κ或mAb B-E8将20pM125I-IL-6(1000μCi/mmol；Amersham)预培养20小时。此时加入1000倍以上(20nM)的“冷”IL-6。定期取出反应的等分试样、用蛋白质G-琼脂糖沉淀配体捕获物或B-E8并测定剩余结合的125I-IL-6的cpm数量。在3天后，显然人125I-IL-6从配体捕获物中的解离率极低，大约起始计数的75％仍然与配体捕获物结合。相反，3天后低于5％的计数仍然与抗体结合。这一结果证明配体从这些配体捕获物中的解离率极低。
在不同组实验中测试在有配体存在的情况下配体捕获物多聚化的能力。该实验的一个实例如附图19中所示。通过测试不经自身结合蛋白质A的gp130-CH1·IL-6Rα-κ是否可以在有gp130-Fc·IL-6Rα-Fc存在的情况下以IL-6依赖性方式被蛋白质A-琼脂糖沉淀来测定IL-6诱导的gp130-Fc·IL-6Rα-Fc与gp130-CH1·IL-6Rα-κ的结合(附图9)。通过使用不检测gp130-Fc·IL-6Rα-Fc的抗卡巴特异性HRP接合物的蛋白质印迹来测定由蛋白质A-琼脂糖沉淀的gp130-CH1·IL-6Rα-κ。仅在gp130-Fc·IL-6Rα-Fc和IL-6都存在时，gp130-CH1·IL-6Rα-κ可以被蛋白质A-琼脂糖沉淀。这一结果最终表明IL-6可以诱导配体捕获物多聚化且进一步表明配体捕获物可以模拟六聚化细胞因子·Rα·信号转导物复合物(附图1)。配体诱导的多聚化可以在体内清除细胞因子·配体捕获物方面起显著作用。
可以在测定配体依赖性细胞增殖的检测试验中进一步测试不同配体捕获物的生物活性。有几种IL-6细胞增殖试验且它们应用诸如B9、CESS或XG-1这样的细胞系。使用XG-1细胞系的该类型试验的一个实例如下所述XG-1是一种来源于人多发性骨髓瘤的细胞系(Zhang等《血液》(Blood)833654-3663(1994))。XG-1依赖于外源提供的存活和增殖用人IL-6。XG-1系的IL-6的EC50约为50pmoles/ml。通过在XG-1培养物中用50pg/ml IL-6培养增加量的纯化配体捕获物来测试几种不同IL-6捕获物阻断XG-1细胞的IL-6-依赖性增殖的能力。已经使用与上述那些方法类似的方法表达和纯化了所测试的配体捕获物。发现所有所测试的配体捕获物均可以以剂量依赖性方式抑制IL-6-依赖性增殖(附图20)。所测试的5种不同捕获物中gp130-CH1·IL-6Rα-κ最具活性且主要显示出与抗体B-E8相同的对IL-6的中和活性。低至10倍摩尔过量的gp130-CH1·IL-6Rα-κ或B-E8完全阻断了IL-6的活性(A570-650＝0.3AU的读数相当于没有XG-1细胞增殖)。100倍摩尔过量的所有测试配体捕获物完全阻断了IL-6的活性。这种观测到的抑制是高度选择性的，因为，甚至以相对于IL-6 1000倍摩尔过量使用时，阻断CNTF活性的gp130-Fc·CNTFRα-Fc配体捕获物和gp130-Fc同二聚体均没有表现出任何对IL-6的阻断活性(数据未列出)。该数据证明以异二聚化免疫球蛋白重链/轻链受体为基础的配体捕获物作为其同源配体的高亲和性拮抗剂起作用。
实施例5融合多肽成分的克隆使用组织cDNAs(CLONTECH)、通过标准PCR技术获得人细胞因子受体的胞外结构域；将其克隆入表达载体pMT21(GeneticsInstitute，Inc.)；并使用ABI 373A DNA测序仪和Taq双脱氧终止子循环测序试剂盒(Applied Biosystems，Inc.，Foster City，CA)、通过标准技术测序序列。对于IL-4Rα来说，克隆来自基因库序列的241-868位核苷酸(相当于24-231位氨基酸)。对于IL-2Rγ来说，克隆来自基因库序列D11086的15-776位核苷酸(相当于1-233位氨基酸)。对于IL-6Rα来说，克隆来自基因库序列X52425的52-1044位核苷酸(相当于1-331位氨基酸)。对于gp130来说，克隆来自基因库序列M57230的322-2112位核苷酸(相当于30-619位氨基酸)。对于IL-1RAcP来说，克隆来自基因库序列AB006357的1-1074位核苷酸(相当于1-358位氨基酸)。对于IL-1RI来说，克隆来自基因库序列X16896的55-999位核苷酸(相当于19-333位氨基酸)核苷酸。
实施例6融合多肽(细胞因子捕获物)的生产通过标准克隆和PCR技术由各个克隆的DNAs(上文所述)来构建编码细胞因子捕获物的核苷酸序列。在每种情况中，框内构建所述序列以便使编码第一种融合多肽成分的序列与编码第二种融合多肽成分的序列、随后是作为多聚化成分的Fc结构域(人IgG1的铰合部、CH2和CH3区)融合。在某些情况中，将另外的核苷酸框内插入编码第一种和第二种融合多肽成分的序列之间以便在两种成分之间添加接头(参见附图21A-附图21D-捕获物424；附图24A-附图24F-捕获物412；和附图26A-附图26E-捕获物569)。
对于IL-4捕获物424(附图21A-附图21D)、603(附图22A-附图22D)和622(附图23A-附图23D)来说，IL-2Rγ成分与5’连接、后面是IL4Rα成分且然后是Fc成分。对于IL-6捕获物412(附图24A-附图24F)和616(附图25A-附图25F)来说，IL-6Rα成分与5’连接、后面是gp130成分且然后是Fc结构域。对于IL-1捕获物569(附图26A-附图26E)来说，IL-1RAcP成分是5’，后面连接有IL-1RI成分且然后是Fc结构域。将最终的构建体克隆入哺乳动物表达载体pCDNA3.1(STRATAGENE)。
在569序列(附图26A-附图26E)中，1-1074位核苷酸编码IL1RAcP成分；1075-1098位核苷酸编码接头区；1099-2043位核苷酸编码IL1RI成分且2044-2730位核苷酸编码Fc结构域。
在412序列(附图24A-附图24F)中，1-993位核苷酸编码IL6Rα成分；994-1023位核苷酸编码接头区；1024-2814位核苷酸编码gp130成分且2815-3504位核苷酸编码Fc结构域。
在616序列(附图25A-附图25E)中，1-993位核苷酸编码IL6Rα成分；994-2784位核苷酸编码gp130成分且2785-3474位核苷酸编码Fc结构域。
在424(附图21A-附图21D)和622(附图23A-附图23D)序列中，1-762位核苷酸编码IL2Rγ成分；763-771位核苷酸编码接头区；772-1395位核苷酸编码IL4Rα成分且1396-2082位核苷酸编码Fc结构域。
最后，在603序列(附图22A-附图22D)中，1-762位核苷酸编码IL2Rγ成分；763-1386位核苷酸编码IL4Rα成分且1387-2073位核苷酸编码Fc结构域。
通过本领域技术人员众所周知的标准技术将DNA构建体短暂转染入COS细胞或稳定转染入CHO细胞。通过标准技术、使用蛋白质A亲和层析和大小排阻层析来收集和纯化上清液。(参见，例如Harlow和Lane“抗体-实验室手册”(Antibodies-A Laboratory Manual)，Cold Spring Harbor Laboratory，1988)。
实施例7使用TF-1(ATCC)细胞的IL-4生物测定试验方案所需的试剂和设备MTT染料溶液MTT(3-[4，5-二甲基噻唑-2-基])(Sigma目录号M2128)。
工作浓度将5mg的无水MTT溶于不含Ca+2、Mg+2的200ml PBS中。
无菌过滤并在-20℃下等分储存。增溶溶液将100g SDS、950ml dH2O、50ml二甲基甲酰胺和850μl浓HCl混合成1000ml。
用0.45μm滤膜装置进行无菌过滤。
在室温下储存。TF-1细胞生长培养基RPMI1640、10％FBS、Pen/Strep、2mM L-谷氨酰胺。其它0.4％锥虫蓝染料；稀释用无菌试管；96孔无菌细胞培养平板(Falcon#3072)；血细胞计数器；离心管；ELISA平板读出器；15、25、50和100μl体积的多道移液管；无菌试剂储蓄器、无菌移液管管头；手套。试验方案A.试验平板的制备1.用不同浓度的IL-4和10nM IL-4拮抗剂制备含有50μl生长培养基/孔的96孔无菌组织培养平板。可以通过制备4倍最高检测浓度的IL-4工作稀释液来进行该步骤。在独立的试管中，制备2倍顺序稀释的IL-4。将25μl各稀释液加入到平板的一横行中(即A行得到最高浓度，G行得到最低浓度)。将25μl不含IL-4的生长培养基加入到H行中。通过制备4倍于终浓度的储备液来制备测试用拮抗剂。将25μl加入到一式三份一组的含有IL-4的孔中(纵行1、2、3，A-H)。确定在H行中包括拮抗剂。
2.作为阳性对照，保持一组孔中不含拮抗剂。这些孔中仅含有IL-4和培养基。
3.在制备用于试验的细胞前将平板在37℃下和5％CO2加湿培养箱内培养1-2小时。B.细胞的制备4.通过在不含生长因子的试验培养基中离心将细胞洗涤两次。
5.测定细胞数量和锥虫蓝存活率并在试验培养基中将细胞悬浮至终浓度为8×105/ml。
6.将50μl细胞混悬液(40,000个细胞)分散入平板的所有孔中。总体积目前应为100μl/孔。
7.在37℃下的5％CO2加湿培养箱中将平板培养68小时。C.显色8.在培养68小时后，向各孔中加入15μl的MTT染料溶液。
9.将平板在37℃下的5％CO2加湿培养箱内培养4小时。
10. 4小时后，向各孔中加入100μl的增溶溶液。使平板在密封容器内稳定过夜以便完全增溶甲晶体。
11.在570/650nm处记录吸收度。结果附图27表明在TF1细胞生物测定试验中，属于IL-2Rγ-scb-IL4Rα-FcΔC1融合多肽的命名为4SC375的IL-4捕获物作为IL-4拮抗剂优于单独的IL4RαFcΔC1几个数量级。
附图28表明在TF1细胞生物测定试验中的拮抗剂活性与命名为4SC424的IL-4捕获物相同，所述的4SC424是一种含有等量IL-2Rγ成分与IL-4Rα成分的IL-2Rγ-IL4Rα-FcΔC1融合多肽。
实施例8属于XG-1细胞的IL-6生物测定试验方案所需的试剂和设备MTT染料溶液MTT(3-[4，5-二甲基噻唑-2-基])(Sigma目录号M2128)。
工作浓度将5mg的无水MTT溶于不含Ca+2、Mg+2的200ml PBS中。
无菌过滤并在-20℃下等分储存。增溶溶液将100g SDS、950ml dH2O、50ml二甲基甲酰胺和850μl浓HCl混合成1000ml。
用0.45μm滤膜装置进行无菌过滤。
在室温下储存。试验培养基RPMI1640、10％FBS、Pen/Strep、2mM L-谷氨酰胺、50μM巯基乙醇。其它0.4％锥虫蓝染料；稀释用无菌试管；96孔无菌细胞培养平板(Falcon#3072)；血细胞计数器；离心管；ELISA平板读出器；15、25、50和100μl体积的多道移液管；无菌试剂储蓄器、无菌移液管管头；手套。试验方案A.试验平板的制备1.用不同浓度的IL-6和10nM IL-6拮抗剂制备含有50μl生长培养基/孔的96孔无菌组织培养平板。可以通过制备4倍最高检测浓度的IL-6工作稀释液来进行该步骤。在独立的试管中，制备2倍顺序稀释的IL-6。将25μl各稀释液加入到平板的一横行中(即A行得到最高浓度，G行得到最低浓度)。将25μl不含IL-6的生长培养基加入到H行中。通过制备4倍于终浓度的储备液来制备测试用拮抗剂。将25μl加入到一式三份一组的含有IL-6的孔中(纵行1、2、3，A-H)。确定在H行中包括拮抗剂。典型的IL-6滴定以200ng/ml开始至3.1ng/ml结束。
2.作为阳性对照，保持一组孔中不含拮抗剂。这些孔中仅含有IL-6和培养基但不含拮抗剂。
3.在制备用于试验的细胞前将平板在37℃下和5％CO2加湿培养箱内培养1-2小时。B.细胞的制备4.通过在不含生长因子的试验培养基中离心将细胞洗涤两次(以1000RPM进行5分钟)。
5.测定细胞数量和锥虫蓝存活率并在试验培养基中将细胞悬浮至终浓度为8×105/ml。
6.将50μl细胞混悬液(40000个细胞)分散入平板的所有孔中。总体积目前应为100μl/孔。
7.在37℃下的5％CO2加湿培养箱中将平板培养68小时。C.显色8.在68小时后，向各孔中加入15μl的染料溶液。
9.将平板在37℃下的5％CO2加温培养箱内培养4小时。
10. 4小时后，向各孔中加入100μl的增溶溶液。使平板在密封容器内稳定过夜以便完全增溶甲晶体。
11.在570/650nm处记录吸收度。结果附图29表明在XG1生物测定试验中，附图24A-附图24F中所述的IL6捕获物(6SC412IL6R-scb-gpx-FcΔC1)是一种优于对人IL-6-BE8的中和单克隆抗体的拮抗剂。
实施例9用于IL1捕获物的MRC5生物测定试验MRC5人肺成纤维细胞通过分泌IL-6而对IL-1起反应且由此将它们用于检测IL-1捕获物阻断IL-6的IL-1-依赖性产生的能力。对照属于与Fc结构域融合的IL-1 I型受体胞外结构域的IL-1-RI.Fc测试IL1捕获物1SC569(附图26A-附图26E)。
以1×105个细胞/ml将MRC5细胞悬浮于培养基中并将0.1ml的细胞平板固定(10,000个细胞/孔)入96孔组织培养平板的孔中。在37℃下和加湿5％CO2培养箱中将平板培养24小时。
在96孔组织培养皿中将不同剂量下的IL-1捕获物和重组人IL-1进行预培养并在37℃下培养2小时。然后将0.1ml的该混合物加入到含有MRC5细胞的96孔平板中，使得IL-1捕获物的终浓度为10nM且IL-1的终浓度范围在2.4pM-5nM。对照孔中只含有捕获物或不含任何物质。
接着在37℃下和加湿5％CO2培养箱中将平板培养24小时。收集上清液并使用R&D Systems Quantikine免疫试验试剂盒、按照制造商的说明检测IL-6的水平。结果附图30表明捕获物569(附图26A-26E)能够拮抗IL-1的作用并在用IL-1处理时阻断IL-6从MRC5细胞中产生。在10nM浓度下，捕获物569能够阻断IL-6产生至IL-1浓度为3nM。相反，IL-1-RI.Fc是一种极差的IL-1的拮抗剂。它仅能够阻断IL-1的作用至约10-20pM。因此，捕获物569在阻断IL-1方面优于IL-1-RI.Fc约100倍。
实施例10IL-13/IL-4单链捕获物的构建1.为了生成命名为IL-4Rα.IL-13Rα1.Fc的IL-13/IL-4双捕获物，将人IL-4Rα胞外结构域(相当于附图31A-附图31G的#1-693位核苷酸)和人IL-13Rα1胞外结构域(相当于附图31A-附图31G的#700-1665位核苷酸)通过标准PCR技术扩增并连入含有人Fc序列(相当于附图31A-附图31G的#1671-2355位核苷酸)的表达载体pMT21中，由此生成由N-C末端IL-4Rα、IL-13Rα1以及人IgG1的铰合部、CH2和CH3区组成的融合蛋白。此外，在IL-4Rα与IL-13Rα1之间框内构建带有氨基酸序列SerGly的2个氨基酸接头(相当于附图31A-附图31G的#694-699位核苷酸)并在IL-13Rα1与Fc部分之间框内构建带有氨基酸序列ThrGly的2个氨基酸接头(相当于附图31A-附图31G的#1666-1671位核苷酸)。通过标准技术对所有序列进行序列鉴定。然后使用标准分子生物学技术将IL-4Rα.IL-13Rα1.Fc编码序列亚克隆入表达载体pCDNA3.1(Stratagene)。
2.为了生成命名为IL-13Rα1.IL-4Rα.Fc的IL-13/IL-4双捕获物，将IL-13Rα1胞外结构域(相当于附图32A-附图32G的#1-1029位核苷酸)和人IL-4Rα胞外结构域(相当于附图32A-附图32G的#1060-1692位核苷酸)通过步骤PCR技术扩增并连入含有人Fc序列(相当于附图32A-附图32G的#1699-2382位核苷酸)的表达载体pJEF14中以便生成由N至C的IL-13Rα1、IL-4Rα以及人IgG1的铰合部、CH2和CH3区组成的融合蛋白。此外，在IL-13Rα1与IL-4Rα之间框内构建带有氨基酸序列GlyAlaProSerGlyGlyGlyGlyArgPro的10个氨基酸接头(相当于附图32A-附图32G的#1030-1059位核苷酸)并在IL-4Rα与Fc部分之间框内构建带有氨基酸序列SerGly的2个氨基酸接头(相当于附图32A-附图32G的#1693-1698位核苷酸)。通过标准技术对所有序列进行序列鉴定。然后使用标准分子生物学技术将IL-13Rα1.IL-4Rα1.Fc的编码序列亚克隆入表达载体pCDNA3.1(Stratagene)。实施例11IL-4Rα.IL-13Rα1.Fc和IL-13Rα1.IL-4Rα1.Fc的表达在LB+氨苄西林内使DH10B细胞中大规模(IL)培养的pCAE801(编码IL-4Rα.IL-13Rα1.Fc的DNA载体构建体)和pCAE802(编码IL-13Rα1.IL-4Rα1.Fc的DNA质粒构建体)生长过夜并使用QiagenEndofree Mega试剂盒、按照制造商的方案提取质粒DNA。用UV分光光度计和荧光计测定纯化质粒DNA的浓度。还可以通过用BbsI、XmnI和NcoI限制酶消化等分试样来检验质粒DNA。所有限制酶消化相当于1％琼脂糖凝胶中预定大小的片段。
以4×106个细胞/平板的密度给40个15cm培养平板接种CHO-K1/E1A细胞。平板固定培养基是Gibco Ham’s F-12 w/10％Hyclone胎牛血清(FBS)+青霉素/链霉素并给该培养基补充谷氨酰胺。第二天使用溶于12ml体积的Gibco Oprimem和Gibco Lipofectamine、按照制造商的方案给各平板转染6μg的pCAE801或pCAE802。在向细胞中添加转染混合物4小时后加入12ml/平板的Optimem w/10％FBS。在37℃下和5％CO2培养箱中将平板培养过夜。第二天从各平板中除去培养基并加入25ml表达培养基(Gibco CHO-S-SFM II w/谷氨酰胺+1mM丁酸钠)。在37℃下将该平板培养3天。
培养3天后，将培养基从各平板中除去并用吊桶式转头以400rpm离心至沉淀出细胞。将上清液滗析入1L无菌瓶中并如下所述纯化表达的蛋白质。
实施例12从培养基中纯化IL-4Rα.IL-13Rα1.Fc和IL-13Rα1.IL-4Rα1.Fc1.IL-4Rα.IL-13Rα1.Fc的纯化在CHO细胞中短暂表达人IL-4Rα.IL-13Rα1.Fc并如上所述从平板转染物中收集上清液。分别使用山羊抗-hIgG(γ链特异性；Sigma1-3382)和山羊抗-hIgG(Fc特异性)-FITC接合物(Sigma F9512)捕获和报道抗体、通过夹心式ELISA测定表达的分泌蛋白质。产量在5.8-9.2mg(平均7.5mg)/升条件培养基的范围。将CompleteTM蛋白酶抑制剂片(Roche Diagnostics Corp.)溶入培养基(1片/L)。在4℃下，在上用pH 7.4的Dulbecco’s PBS缓冲液(LifeTechnologies)预平衡的5mL Hi Trap蛋白质A亲和柱(AmershamPharmacia Biotech)前将条件培养基进行无菌过滤(0.22μm孔大小)。流速为～1-2mL/分钟。用PBS充分洗涤该柱以便从该柱中除去非特异性结合的蛋白质。使用20mM柠檬酸钠、150mM NaCl(pH 3.5)洗脱IL-4Rα.IL-13Rα1.Fc。通过用1M Tris-OH滴定而立即中和该洗脱液。收集含有蛋白质的级分并立即将其透析入4℃下、pH 7.4的PBS缓冲液。从蛋白质A纯化步骤中回收6.8mg(73％)。在环境温度下，使用用PBS、5％v/v甘油(pH 7.4)预平衡的superose 6柱(25mL床体积；Amersham Pharmacia Biotech)、通过大小排阻层析进一步纯化IL-4Rα.IL-13Rα1.Fc。流速为0.5mL/分钟。根据考马斯染色的非还原和还原的SDS-PAGE(Novex NuPAGE 4-12％Bis-Tris凝胶)估计蛋白质级分。适当收集级分以便减少聚集的蛋白质的量。总产率为51％(4.4mg)，通过SDS-PAGE评定的纯度为97％。通过非还原和还原的SDS-PAGE(4-12％Bis-Tris)、分析型大小排阻层析(Tosohaas TSKG4000SWXL)、N-末端测序和使用山羊抗-hIgG-HRP接合物(Promega W403B)以及小鼠单克隆抗-hIL-4R(R&DMAB230)、随后是作为二次抗体的抗-mIgG-HRP接合物(PromegaW402B)进行的免疫印迹分析纯化的IL-4Rα.IL-13Rα1.Fc。2.IL-13Rα1.IL-4Rα.Fc的纯化在CHO细胞中短暂表达人IL-13Rα1.IL-4Rα.Fc并如上所述从平板转染物中收集上清液。分别使用山羊抗-hIgG(γ链特异性；Sigma1-3382)和山羊抗-hIgG(Fc特异性)-FITC接合物(Sigma F9512)捕获和报道抗体、通过夹心式ELISA测定表达的分泌蛋白质。产量为8.8/升条件培养基。将CompleteTM蛋白酶抑制剂片(RocheDiagnostics Corp.)溶入培养基(1片/L)。在4℃下，在上用pH 7.4的Dulbecco’s PBS缓冲液(Life Technologies)预平衡的5mL HiTrap蛋白质A亲和柱(Amersham Pharmacia Biotech)前将条件培养基进行无菌过滤(0.22μm孔大小)。流速为～1-2mL/分钟。用PBS充分洗涤该柱以便从该柱中除去非特异性结合的蛋白质。使用20mM柠檬酸钠、150mM NaCl(pH 3.5)洗脱IL-13Rα1.IL-4Rα.Fc。通过用1M Tris-OH滴定而立即中和该洗脱液。收集含有蛋白质的级分并立即将其透析入4℃下、pH 7.4的PBS缓冲液。从蛋白质A纯化步骤中回收3.8mg(43％)。在环境温度下，使用用PBS、5％v/v甘油(pH 7.4)预平衡的superose 6柱(25mL床体积；AmershamPharmacia Biotech)、通过大小排阻层析进一步纯化IL-13Rα1.IL-4Rα.Fc。流速为0.5mL/分钟。根据考马斯染色的非还原和还原的SDS-PAGE(Novex NuPAGE 4-12％Bis-Tris凝胶)估计蛋白质级分。适当收集级分以便减少聚集的蛋白质的量。总产率为17％(1.5mg)，通过SDS-PAGE评定的纯度为95％。通过非还原和还原的SDS-PAGE(4-12％Bis-Tris)、分析型大小排阻层析(TosohaasTSKG4000SWXL)、N-末端测序和使用山羊抗-hIgG-HRP接合物(Promega W403B)以及小鼠单克隆抗-hIL-4R(R&D MAB230)、随后是作为二次抗体的抗-mIgG-HRP接合物(Promega W402B)进行的免疫印迹分析纯化的IL-13Rα1.IL-4Rα.Fc。实施例13通过IL-4Rα.IL-13Rα1.Fc和IL-13Rα1.IL-4Rα.Fc阻断IL-4和IL-13材料和方法TF1生物测定试验 将TF1细胞维持在生长培养基(10ng/ml GM-CSF、RPMI1640、10％FBS、L-谷氨酰胺、青霉素、链霉素)中。为了进行生物测定试验，将细胞用试验培养基(如上所述但不含GM-CSF)洗涤2次且然后以2×105个细胞固定在50μl试验培养基中。以40nM的浓度将纯化的IL-4Rα.IL-13Rα1.Fc和IL-13Rα1.IL-4Rα.Fc稀释入试验培养基。将25μl各捕获物加入到细胞中。在试验培养基中将IL-13或IL-4稀释成40nM且然后制备溶于试验培养基中的2倍稀释液系列。接着将25μl IL-13或IL-4加入到含有细胞和捕获物的孔中。接下来在37℃下和5％CO2中将细胞培养～70小时。通过MTS检测试验、按照制造商的方案(Promega，Inc.)测定TF1细胞增殖程度。结果如上所述在TF1生物测定试验中测定IL-4Rα.IL-13Rα1.Fc和IL-13Rα1.IL-4Rα.Fc捕获物阻断人IL-13和人IL-4活性的能力。IL-13刺激TF1细胞增殖，其半数最大生长浓度是0.2nM。添加10nM浓度的IL-4Rα.IL-13Rα1. Fc或IL-13Rα1.IL-4Rα.Fc捕获物可阻断最高可达2nM的IL-13-诱导的生长(附图33)。在～4-5nM IL-13浓度下，TF1细胞的生长被抑制了50％。TF1细胞对半数最大生长为～0.02nM的刺激其增殖的IL-4更为敏感。添加10nM浓度的IL-4Rα.IL-13Rα1.Fc或IL-13Rα1.IL-4Rα.Fc可阻断最高可达～1nM的IL-13-诱导的生长(附图34)。在～3-4nM IL-4浓度下，TF1细胞的生长被抑制了50％。这些结果证明IL-4Rα.IL-13Rα1.Fc和IL-13Rα1.IL-4Rα.Fc均可以阻断IL-4和IL-13刺激细胞响应的能力。
实施例14体内通过IL-1捕获物阻断注射的IL-1IL-1是一种促炎细胞因子。已经证实系统性给予Il-1可在动物体内引起急性反应，包括短暂高血糖、血胰岛素过少、发热、厌食和白细胞介素-6(IL-6)血清水平升高(Reimers，1998)。由于小鼠对鼠和人IL-1有反应，所以可以使用人IL-1且可以评价人特异性IL-1拮抗剂的体内结合作用。将这种急性小鼠模型用于测定人IL-1捕获物拮抗外源给予的人IL-1的体内作用的能力。这产生了人IL-1捕获物的体内功效的快速迹象且可以将它用作辅助分子筛选的检测试验。实验设计给小鼠皮下注射人IL-1(0.3μg/kg)。在注射人IL-1前24小时用载体或150倍摩尔以上的人IL-1捕获物(0.54mg/kg)预治疗动物。在处死动物前2小时(26小时)，给小鼠第二次注射人IL-1(0.3μg/kg)。在不同的时间点处采集血样并检测血清的IL-6水平。结果外源给予人IL-1导致血清IL-6水平显著升高。在150倍摩尔以上时，人IL-1捕获物完全阻断了IL-6的增加(附图35)。此外，人IL-1捕获物的作用至少又持续了24小时，甚至再次给予IL-1时也可防止IL-6增加(附图35)。这类持续长久的功效提示每日注射IL-6捕获物对慢性应用并不是必需的。实施例15在猕猴中评价IL-4捕获物阻断对人IL-4的生理反应的能力系统性给予人IL-4在猕猴体内引起全身反应(Gundel等，1996)。因此，通过确定这些反应可以证明IL-4捕获物阻断人IL-4的有效性。实验设计本实验由3部分组成人IL-4+载体(部分1)；人IL-4+人IL-4捕获物(部分2)；和人IL-4+载体(部分3)。从给予人IL-4前第1天开始，每日两次皮下注射人IL-4(25μg/kg)、持续4天；且每日静脉内给予人IL-4捕获物(8mg/kg)和载体、持续5天。每日采集全血用于对CD16的流式细胞分析并获得血浆用于检测细胞因子单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)。CD16和MCP-1是IL-4介导的人和猴体内的炎症的标记。结果在有人IL-4存在的情况下，MCP-1增加了2.5倍且被IL-4捕获物明显阻断(附图36A)。类似地，IL-4捕获物减弱外周血液中CD16阳性淋巴细胞百分比的减少(附图36B)。在剩余期限后，给猴重新注射IL-4并重新证实动物对人IL-4的反应性(附图36A和36B)，从而提示IL-4捕获物特异性介导对MCP-1和CD16反应的抑制作用。
实施例16IL-4捕获物对IL-4-诱导的IgE分泌的作用已经证实注射抗小鼠IgD抗体可刺激正常小鼠体内IL-4-介导的IgE增加。已经将该模型广泛用于评价IL-4拮抗剂诸如可溶性IL-4受体和抗-IL-4单克隆抗体(Sato等，1993)。我们决定使用该模型评价IL-4捕获物阻断IL-4-介导的IgE增加的能力。实验设计将注射了抗-小鼠IgD(100μl/小鼠，皮下)的BALB/C小鼠随机分成3组。各组接受(第3-5天时)载体、鼠IL-4捕获物(1mg/kg，皮下)或对小鼠IL-4的单克隆抗体(1mg/kg，皮下)。在不同时间点处采集血清并检测IgE水平。结果用鼠IL-4捕获物或小鼠IL-4抗体治疗均可显著拮抗这种小鼠模型中IL-4-介导的IgG升高(附图37)。这提示鼠IL-4捕获物结合鼠IL-4并拮抗由体内内源性IL-4引起的生理反应。
本发明在范围上并不限于本文所述的特定实施方案。实际上，除所述的那些实施方案外，本领域技术人员显然可以根据上述描述和附图对本发明进行各种修改。这类修改也属于所附权利要求的范围。
权利要求
1.一种编码能够结合细胞因子而形成非功能性复合物的融合多肽的分离的核酸分子，它包括a)一种编码第一种融合多肽成分的核苷酸序列，所述的第一种融合多肽成分包括细胞因子受体特异性决定成分的胞外结构域细胞因子结合部分的氨基酸序列；b)一种编码第二种融合多肽成分的核苷酸序列，所述的第二种融合多肽成分包括细胞因子受体的信号转导成分胞外结构域细胞因子结合部分的氨基酸序列；c)一种编码第三种融合多肽成分的核苷酸序列，所述的第三种融合多肽成分包括多聚化成分的氨基酸序列。
2.权利要求1的核酸分子，其中编码所述第一种成分的核苷酸序列是编码所述第二种成分的核苷酸序列的上游。
3.权利要求1的核酸分子，其中编码所述第一种成分的核苷酸序列是编码所述第二种成分的核苷酸序列的下游。
4.权利要求1的分离的核酸分子，其中所述的细胞因子受体是血细胞生成素族细胞因子的受体，所述的细胞因子选自白细胞介素-2、白细胞介素-3、白细胞介素-4、白细胞介素-5、白细胞介素-6、白细胞介素-7、白细胞介素-9、白细胞介素-11、白细胞介素-13、白细胞介素-15、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、制癌蛋白M和白血病抑制因子以及心脏营养蛋白-1(cardiotrophin-1)组成的组。
5.权利要求1的分离的核酸分子，其中所述的细胞因子受体是干扰素族细胞因子的受体，所述的细胞因子选自IFN-γ、IFN-α和IFN-β组成的组。
6.权利要求1的分离的核酸分子，其中所述的细胞因子受体是免疫球蛋白超家族细胞因子的受体，所述的细胞因子选自B7.1(CD80)和B7.2(B70)组成的组。
7.权利要求1的分离的核酸分子，其中所述的细胞因子受体是TNF族细胞因子的受体，所述的细胞因子选自TNF-α、TNF-β、LT-β、CD40配体、Fas配体、CD27配体、CD30配体和4-1 BBL组成的组。
8.权利要求1的分离的核酸分子，其中所述的细胞因子受体是TGF-β/BMP族的受体，所述的TGF-β/BMP族选自TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、BMP-2、BMP-3a、BMP-3b、BMP-4、BMP-5、BMP-6、BMP-7、BMP-8a、BMP-8b、BMP-9、BMP-10、BMP-11、BMP-15、BMP-16、与子宫内膜出血相关的因子(EBAF)、生长分化因子-1(GDF-1)、GDF-2、GDF-3、GDF-5、GDF-6、GDF-7、GDF-8、GDF-9、GDF-12、GDF-14、米勒抑制物质(mullerian inhibiting substance)(MIS)、活化素-1、活化素-2、活化素-3、活化素-4和活化素-5组成的组。
9.权利要求1的分离的核酸分子，其中所述的细胞因子受体是选自白细胞介素-1、白细胞介素-10、白细胞介素-12、白细胞介素-14、白细胞介素-18和MIF组成的组的细胞因子的受体。
10.权利要求1的分离的核酸分子，其中所述的多聚化成分包括一种免疫球蛋白衍生的结构域。
11.权利要求10的分离的核酸分子，其中所述的免疫球蛋白衍生的结构域选自IgG的Fc结构域、IgG的重链和IgG的轻链组成的组。
12.一种由权利要求1所述分离的核酸分子编码的融合多肽。
13.一种能够结合细胞因子而形成包括权利要求12所述融合多肽的多聚体的非功能性复合物的组合物。
14.权利要求13的组合物，其中所述的多聚体是一种二聚体。
15.一种包括权利要求1所述核酸分子的载体。
16.一种包括权利要求1核酸分子的表达载体，其中所述的核酸分子可操作地与一种表达控制序列连接。
17.一种包括权利要求16所述表达载体的用于生产融合多肽的宿主-载体系统，该表达载体在合适的宿主细胞内。
18.权利要求17的宿主-载体系统，其中所述的合适的宿主细胞是细菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞。
19.权利要求17的宿主-载体系统，其中所述的合适的宿主细胞是大肠杆菌。
20.权利要求17的宿主-载体系统，其中所述的合适的宿主细胞是COS细胞。
21.权利要求17的宿主-载体系统，其中所述的合适的宿主细胞是CHO细胞。
22.权利要求17的宿主-载体系统，其中所述的合适的宿主细胞是293细胞。
23.权利要求17的宿主-载体系统，其中所述的合适的宿主细胞是BHK细胞。
24.权利要求17的宿主-载体系统，其中所述的合适的宿主细胞是NSO细胞。
25.一种包括生长权利要求17宿主-载体系统细胞的生产融合多肽的方法，该方法在允许生产所述融合多肽并回收如此生产的融合多肽的条件下进行。
全文摘要
本发明提供了一种能够结合细胞因子而形成非功能性复合物的融合多肽。本发明还提供了一种编码该融合多肽的核酸序列和该融合多肽的制备方法和用途。
文档编号C12P21/02GK1357049SQ99813723
公开日2002年7月3日 申请日期1999年9月22日 优先权日1998年9月25日
发明者N·斯塔尔, G·D·彦科普洛斯 申请人:里珍纳龙药品有限公司