专利名称：：一种香烟过滤嘴的制作方法
技术领域：
：本发明涉及金属硫蛋白的用途，尤其涉及金属硫蛋白在制备香烟过滤嘴中的应用。本发明还涉及了一种香烟过滤嘴，尤其是一种可减少香烟烟气气相自由基的香烟过滤嘴。
背景技术：
：香烟中含有大量有害的自由基，包括固相自由基和气相自由基。固相自由基包括多环芳烃自由基、醌/半醌自由基，具有寿命长、性质稳定的特点，能被生物滤嘴截留。而气相自由基包括烷氧自由基、垸过氧自由基等，具有活性高、寿命短的特点。气相自由基可以损伤细胞成份，导致疾病的发生和发展，同时可以刺激巨噬细胞在肺部聚集和活化，产生呼吸爆发和释放活性氧自由基，引起更严重的损伤。
发明内容本发明第一个目的在于提供金属硫蛋白在制备香烟过滤嘴中的应用。本发明的第二个目的在于提供一种可减少香烟气相自由基的的香烟过滤嘴，可以过滤香烟气相中的自由基。本发明的第二个目的是通过以下技术措施来实现的一种可减少香烟烟气气相自由基的香烟过滤嘴，其特征在于过滤嘴中含有金属硫蛋白。所述的香烟过滤嘴中含lmg5mg金属硫蛋白。所述的金属硫蛋白可以直接采用现有的金属硫蛋白方式添加；为达到更好的过滤烟气中气相自由基的效果，本发明优选采用GST—MT蛋白溶液方式添加。所述的GST—MT蛋白溶液通过以下方法制备利用分子生物学技术，通过构建了含有金属硫蛋白(MT)基因的BL21大肠杆菌，得到BL21—PET—GST—MT工程菌菌株，将得到的工程菌菌株进行超声破菌得到包涵体表达产物，再以脱氧胆酸钠(DOC)提纯后进行柱层析得到GST—MT蛋白溶液。本发明提供的香烟过滤嘴中含有金属硫蛋白可以清除香烟烟气中的气相自由，避免香烟中气相自由基损伤细胞成份导致疾病的发生和发展。同时减少刺激巨噬细胞在肺部聚集和活化，避免产生呼吸爆发和释放活性氧自由基引起更严重的损伤。图1是添加了GST-MT蛋白溶液的生物滤嘴香烟烟气气相自由基ESR分析图谱；图2是添加了PBS的生物滤嘴香烟烟气气相自由基ESR分析图谱；图3是添加血红蛋白溶液生物滤嘴香烟烟气气相自由基ESR分析图谱。具体实施方式为了更好地了解本发明的实质，以下通过实施例及试验对
发明内容进行阐述，但本发明的保护范围并不局限于此。所述
技术领域：
的普通技术人员依据本发明公开的内容，均可实现本发明的目的。1、制备纯化金属硫蛋白(1)用蛋白质工程方法构建含有金属硫蛋白基因的大肠杆菌工程菌菌株利用分子生物学技术，构建质粒pGEM—MT和闭环质粒pET—GST，然后采用限制性核酸内切酶BamHI、Nhel双酶切质粒pGEM—MT和闭环质粒pET—GST，经低熔点的琼脂糖凝胶分离并回收MT和质粒载体片段，再用连接酶连接成PET—GST—MT，并转化大肠杆菌BI21，测序验证质粒DNA序列正确性(上海博亚)，从而得到含金属硫蛋白基因的大肠杆菌(即BL21—PET—GST—MT工程菌菌株)。(2)将上述工程菌菌株接种于安苄青霉素(Amp+)的LB培养板(胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCL10g/L，琼脂粉15g/L)培养过夜，然后挑取单克隆接种于LB培养液(胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCL10g/L)中3(TC摇菌活化，以体积比为1:100稀释到Amp+丰富LB培养液，摇菌至OD60(p0.5时，加入1X(W/L)葡萄糖溶液，0.5%(W/L)异丙基-P-硫代半乳糖苷(IPTG)混合均匀，在升温至37'C继续培养8小时。(3)所得菌液4000r/m离心10分钟，去上清，用PH=7.5的磷酸缓冲溶液(PBS)稀释沉淀，冰浴下超声破菌，每次250W超声波处理2分钟，间歇1分钟，共循环6次。超声破菌后10000r/m离心15分钟收集包涵体，用50mMTris-Cl(PH=8)，10mM乙二胺四乙酸(EDTA)，2X脱氧胆酸钠(DOC)缓冲液洗涤包涵体；再用PH=7.5的磷酸缓冲溶液和0.5XN-十二烷基肌氨酸钠(SKL)缓冲液溶解包涵体。溶解液过滤后，上样至5倍柱体积缓冲液平衡的N产亲和层析柱，以IO倍柱体积缓冲液洗脱蛋白，经核酸蛋白检测仪检测，并收集280nm波长下具有吸收峰的蛋白液，将收集到的目的蛋白液合并，装进截留分子量为5000的透析袋，4'C用PH-8的磷酸缓冲溶液充分透析复性，收集复性后的金属硫蛋白溶液。所述的5倍柱体积缓冲液中含PH为8的50mM磷酸缓冲溶液，150mMNaCl，20mM咪唑。所述的10倍柱体积缓冲液中含PH为8的50mM磷酸缓冲溶液，150mMNaCl，200mM咪唑。2、制备香烟生物过滤嘴在香烟生物过滤嘴中加入金属硫蛋白溶液，在35'C烘干，制备得到含金属硫蛋白的香烟生物过滤嘴。3、香烟过滤嘴去除香烟气相自由基的试验本发明通过以下对比试验对含有金属硫蛋白的香烟生物过滤嘴的功能进行说明，其中加入200ul500ulPBS溶液的香烟生物过滤嘴作为空白组，200ul500ul的GST_MT蛋白溶液的香烟生物过滤嘴作为阴性对照组，200ul500ul的血红蛋白溶液的香烟生物过滤嘴作为阳性对照组。上述各组的香烟生物过滤嘴的制备方法采用上述第2点的方法制备。GST-MT蛋白溶液含有GST-MT蛋白，溶解于PBS缓冲液中，浓度为4000ug/ml。血红蛋白溶液含有血红蛋白，溶解于PBS缓冲液中，浓度为7750ug/ml。PBS缓冲液137mMNaCl，2.7mMKCl，10mMNa2HPO4，2mMKH2P04。3.1吸烟机燃吸参数每口吸烟2.5秒，每30秒一个周期，吸烟压力在2秒内逐渐升高及降低。实际吸烟长度为85mm，吸烟1011口，收集烟气。烟气中气相自由基由自由基捕获剂PBN溶液进行收集。3.2ESR实验参数中心磁场3470G，扫场宽度IOOG，扫描时间40S，时间常数0.08S，增益4X10M，调制频率25KHz，调制幅度1G，功率10mW。每个实验组做10支香烟重复实验，每支香烟烟气经过聚萘二酸丁醇酯(PBN)溶液捕获烟气中的气相自由基，采用顺磁共振测定香烟烟气自由基的ESR图谱，谱峰面积(计算机进行自动积分)与自由基含量成正比，从而计算气相自由基数量的变化。3.3结果及结论如表l所示的结果和图l、图2、图3所示的三组实验组ESR的图谱中，可见GST—MT蛋白溶液的实验组与PBS溶液空白组和血红蛋白溶液阳性对照组相比明显地降低了香烟烟气中的气相自由基的含量。表l:气相自由基含量(X10"spin/支)<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>本
技术领域：
普通技术人员按上述实施方式所述的方法制备含15mg的金属硫蛋白的香烟滤嘴，均能达到清除香烟烟气中的气相自由基的效果。权利要求1、金属硫蛋白在制备香烟过滤嘴中的应用。2、一种香烟过滤嘴，其特征在于过滤嘴中含有金属硫蛋白。3、根据权利要求2所述的香烟过滤嘴，其特征在于所述的香烟过滤嘴中含lmg5mg金属硫蛋白。4、根据权利要求2或3所述的香烟过滤嘴，其特征在于所述的金属硫蛋白采用GST—MT蛋白溶液方式添加。5、根据权利要求4所述的香烟过滤嘴，其特征在于通过构建了含有金属硫蛋白基因的BL21大肠杆菌，得到BL21—PET—GST—MT工程菌菌株，将得到的工程菌菌株进行超声破菌得到包涵体表达产物，再以脱氧胆酸钠提纯后进行柱层析得到GST—MT蛋白溶液。全文摘要本发明公开了一种香烟过滤嘴，所述的香烟过滤嘴中含有金属硫蛋白。该香烟过滤嘴可清除香烟烟气中的气相自由，避免香烟烟气中的气相自由基损伤细胞成份导致疾病的发生和发展。同时减少刺激巨噬细胞在肺部聚集和活化，避免产生呼吸爆发和释放活性氧自由基引起更严重的损伤。文档编号A24D3/00GK101263934SQ20081002694公开日2008年9月17日申请日期2008年3月21日优先权日2008年3月21日发明者欣付,刘启才,燕彭,曹晓敏,冰李,谭洁莹,祯陈申请人:广州医学院