专利名称：：一种采用微生物发酵咖啡制备烟用香料的方法
技术领域：
：本发明涉及到烟用香料的制取方法，属于烟草
技术领域：
，具体地说是以咖啡为原料利用微生物发酵技术生产特色烟用香料的方法。
背景技术：
：加香加料是巻烟工艺中的关键环节，是完善产品风格的决定性因素和提高巻烟香气质量的有效手段之一。目前烟用香料按香料生产方法的不同主要分为2种，即采用各种分离手段直接从烟草或其它植物中提取的天然香料和采用化学反应合成的香料。目前这两种生产方法均存在着其各自的局限性。对于某种植物香料，其香气组分及特征是恒定的，我们很难按照对香味的需要使植物产生具有另一种风味的香料，而且植物提取香料的开发由于可用植物资源的有限而存在局限性。对于化工合成香料，除香气单一外，由于受合成方法及条件的限制，很多优良香气成分尚不能人工合成，或成本太高。咖啡在成为商品之前一般要经过发酵处理，未经过发酵的咖啡香味和风味低劣。咖啡豆的发酵一般采取堆积法实施，咖啡豆的发酵过程是一个相当复杂的生物化学过程，通过果肉中的多种酵母，细菌和霉菌参与微生物活动，同时果肉本身的还原酶，转化酶，麦芽糖酶，淀粉酶，蛋白酶共同参与了发酵过程。经过发酵处理的咖啡果实的子叶部分分离，色素细胞破裂，咖啡碱和鞣质的含量下降；果胶含量增加，蛋白质酶解成可溶性的含氮物质。产生了乙醇，乙酸，乳酸，风味前体，小肽，自由氨基酸以及降解的还原糖。在经过储存运输以及清除杂质，接下来烘烤工艺，烘烤能够进一步将咖啡豆干燥，将异味物质除去，形成最终的风味和色泽。在烘烤的过程中最主要的是通过Maillard反应产生了咖啡特有的香味，同时烘烤还改变了咖啡豆中的多糖，蛋白质，多酚以及Maillard产物间的相互作用从而产生了不溶性物质。除去部分咖啡脂得到咖啡饼，再将咖啡饼磨碎得到咖啡粉。咖啡粉具有的浓烈的香味是一种优良的香气成分。此外在未陈化和人工陈化的烤烟叶面存在大量微生物群落，利用烟草中的细菌在增殖过程中可产生庞大的高活性酶系，如多糖水解酶类、蛋白酶类、纤维素酶类、酯化酶类、氧化还原酶类及裂合酶类等，在酶促作用、化学作用及微生物体内复杂代谢的协同作用下，以咖啡为原料发生分解、降解、氧化、还原、聚合、偶联、转化等作用，形成复杂的低分子化合物，其中包括各种香味化合物，如醇类、醛类、酮类、酸类、酯类、酚类、呋喃类、吡嗪类、吡啶类和萜烯类等，这些香气物质无疑也是烟草的香气组分。但现有技术中，利用咖啡粉为原料采用微生物发酵技术生产特色烟用香料的方法未见报道。
发明内容针对现有技术中的上述不足，本发明要解决的技术问题是提供一种以咖啡为原料利用微生物发酵技术生产特色烟用香料的方法。本发明的方法工艺过程简单，成本低廉，可直接用于巻烟的加香加料。本发明的技术方案是一种采用微生物发酵咖啡制备烟用香料的方法，所述的方法依以下的步骤进行(1)烟叶复合培养基的制备-将自然陈化一年至两年的白肋烟和水按1:5的比例混合后加热至10(TC，并保持l-2小时，过滤得到白肋烟水提液；将白肋烟水提液和微生物固体培养基按3:7的比例混合，制成烟叶复合培养基；(2)产香微生物的筛选取自然陈化一年至两年的白肋烟叶5-10g，加入到无菌蒸馏水中，震荡30-60min，从中取100-1000p1液体，滴加到已配制好的烟叶复合培养基上，均匀涂开，用有氧或厌氧条件，用平板划线分离或稀释涂平板法纯化后，得到的白肋烟叶表面优势菌即为筛选的产香微生物；(3)用筛选的白肋烟叶表面优势菌对咖啡进行液体发酵或固体发酵，得到发酵咖啡烟用香料。以上步骤中所述的微生物固体培养基是牛肉膏蛋白胨、PDA培养基或基本培养基。所筛选的白肋烟叶表面优势菌为芽孢杆菌、芽孢梭菌、假单孢菌、曲霉菌、青霉菌、酵母菌，菌种可为菌曲或菌液形式。用筛选的白肋烟叶表面优势菌对咖啡进行液体发酵，按以下步骤进行①菌种活化取白肋烟叶表面优势菌，接种于准备好的斜面培养基上，放置于3037'C的恒温培养箱中培养2448h使菌种活化，再将活化的菌种接种于添加糖源的LB液体培养基中，于3037。C恒温培养2448h，得到活化的种子液；②原料的预处理选取干燥的己粉碎的咖啡粉作为原料，以水咖啡粉二l:(50-100)的比例混合，在上述混合液中加入占上述混合液1-5%的糖源和0.1-2%的无机盐，在115。C下灭菌1520min，即为灭菌好的咖啡液体培养基；③液体发酵将活化好的种子液接种于灭菌好的咖啡液体培养基中，接种体积比为种子液咖啡液体培养基=1:(50100)，混合均匀后，置于3037。C的恒温培养箱中发酵2448h;④发酵液的浓縮与精制将发酵好的咖啡发酵液，菌种灭活后板框滤膜过滤，再减压浓縮或冷冻干燥浓縮成膏状，按照l:(14)的质量比将膏状物与萃取溶剂相混合，使膏状物充分的溶解，再过滤后，将滤液减压浓縮至除去80-95%的溶剂，所得液体膏状物质即发酵咖啡烟用香料。因此，本申请文件中有时也将此香料简称为咖啡浸膏。用筛选的产香微生物对咖啡进行固体发酵按以下步骤进行①菌种活化取纯化的白肋烟叶表面优势菌，接种到斜面培养基上，放置于2037。C的恒温培养箱中培养2448h使菌种活化，再将活化的菌种接种于添加糖源的液体培养基中，于2037'C恒温培养2448h，将培养液离心弃除上清液，沉淀菌体用生理盐水稀释震荡均匀，即为得到的活化种子液；②原料的预处理选取干燥的已粉碎的咖啡粉作为原料，在115°C下灭菌1520min，得到无菌的咖啡粗粉；(D固体发酵将活化种子液按照l:110的质量比接种到无菌的咖啡粗粉中，搅拌，使粗粉固体与种子液充分混合均匀，放置于2835'C的培养箱中发酵27天；④提取和精制将上述发酵好的咖啡粗粉，按发酵固体与提取液质量比1:(15)的比例加入适量的提取液，加热至90-IO(TC并回流提取23次，每次提取13h，将提取液收集并过滤后，将滤液减压浓縮成浸膏；按照1:(14)的质量比将膏状物与萃取溶剂相混合，使膏状物充分的溶解，进一步过滤后，减压浓縮除去多余溶剂，所得液体膏状物质即为发酵咖啡烟用香料。因此，本文申请文件中有时也将此香料简称为咖啡浸膏。步骤①中菌种活化所述的斜面培养基为牛肉膏蛋白胨、PDA培养基和基本培养基，培养基可为固体或液体形式。步骤④中发酵液的浓縮与精制和步骤④提取和精制中所述的提取液、萃取溶剂为水或乙醇，或两者的复合溶液。所述的咖啡发酵过程中添加的糖源为蔗糖、葡萄糖、果糖中的一种或多种的混合物。步骤②中原料的预处理所述的无机盐是KH2P04、(NH4)2S04、MgS04，或NaCl。本发明的方法工艺过程简单，成本低廉，所得发酵咖啡烟用香料能直接用于巻烟的加香加料。发酵咖啡烟用香料具有独特的酸香的香韵特征，添加在巻烟中有降低剌激，丰富和饱满烟气，掩盖杂气，使烟气柔和以及改善口感的作用。附图1是本发明的发酵咖啡烟用香料中挥发性和半挥发性香气成分总离子流图。本附图1中的数据是用气相色谱-质谱和液相色谱-质谱对发酵咖啡烟用香料检测得到的。具体实施例方式下面结合实施例对本发明的有关技术问题作进一步详细描述。实施实例1:用液态发酵的方式制备发酵咖啡烟用香料。①菌种活化取芽孢梭菌，接种到牛肉膏蛋白胨培养基斜面上，放置于恒温培养箱中，在厌氧条件下3(TC培养36h，再接种到深层基本液体培养基中，于3(TC培养24h，得到活化的种子液。②原料的预处理选取100g干燥的已粉碎的咖啡粉(咖啡粉为市售的产品，以下同)作为原料，添加100g的蔗糖和10g(NH4)2S04、2gMgS0"5gKH2P03，加入4000ml纯净水，配制成液体发酵液，在115。C下灭菌20min。③液体发酵将活化好的种子液40ml接种于灭菌好的咖啡液体培养基中，充分混合均匀后，置于37'C的恒温培养箱中密封发酵48h。④发酵液的浓縮与精制将发酵好的咖啡发酵液，菌种灭活后板框滤膜过滤后，减压浓縮或冷冻干燥浓縮成膏状，按照l:4的质量比将膏状物与95%乙醇相混合，使膏状物充分的溶解，进一步过滤后，减压浓縮除去多余溶剂便可得到发酵咖啡烟用香料。实施例2:用固态发酵的方式制备发酵咖啡烟用香料。①菌种活化:取酵母菌，接种到固体PDA培养基鞋面上放置于28°C的恒温培养箱中培养48h，再接种于再接种于的PDA液体培养基中，于28"C恒温培养48h，得到活化的种子液。②原料的预处理选取1000g干燥的己粉碎的咖啡粉作为原料，在115。C下灭菌20min，得到无菌咖啡粗粉。③固体发酵将处理好的种子液100ml接种到上述的无菌咖啡粗粉中，搅拌，使粗粉固体与种子液充分混合均匀，将接种好的咖啡粉放置于28°C的培养箱中发酵7天。④提取和精制将发酵好的咖啡粗粉，按发酵固体与水质量比1:3的比例加入适量的纯净水，加热回流萃取3次，每次萃取3h，将萃取液收集进一步过滤后，减压浓縮成浸膏；按照1:3的质量比将膏状物与95%乙醇相混合，使膏状物充分的溶解，进一步过滤后，减压浓縮除去80-95%的溶剂，便可得到发酵咖啡烟用香料。本发明的方法从烟叶表面筛选微生物，这是因为发明人经研究后认识到，在未陈化和人工陈化的烤烟叶面存在大量微生物群落。但是微生物的种类和数量有别，这与烤烟品种/产地/时间等级及醇化条件不同有关。烤烟叶面微生物主要包括细菌/霉菌和放线菌，另有少量酵母菌。其中细菌占绝对优势，达到90%99%，放线菌、霉菌和酵母菌比例甚小。烟草中的细菌主要是芽孢杆菌，芽孢梭菌，假单孢菌及葡萄球菌放线菌主要是链霉菌；霉菌主要是曲霉菌和青霉菌。其中芽孢杆菌和芽孢梭菌占烟叶表面微生物种类的90%左右。发明人认为，由于微生物在增殖过程中可产生庞大的高活性酶系，如多糖水解酶类、蛋白酶类、纤维素酶类、酯化酶类、氧化还原酶类及裂合酶类等，在酶促作用、化学作用及微生物体内复杂代谢的协同作用下，便可使底物发生分解、降解、氧化、还原、聚合、偶联、转化等作用，形成复杂的低分子化合物，其中包括各种香味化合物，如醇类、醛类、酮类、酸类、酯类、酚类、呋喃类、吡嗪类、吡啶类和萜烯类等，这些香气物质无疑也是烟草的香气组分。发明人还认为，用添加烟叶水提液的培养基来进行微生物的筛选可更好的模拟微生物在自然陈化过程中生长的条件以及所需要的营养成分，更好的准确的筛选出烟叶表面所需要的产香微生物，减小筛选的盲目性，增加筛选的成功率。发明人对本发明的方法生产的产品迸行了检测通过气相色谱-质谱和液相色谱-质谱对发酵烟用咖啡香料的成分进行检测，其结果请见表1。表l、发酵烟用咖啡香料的成分<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>2717.902818.632918.863019.053119.423219.513319.833320.053420.553521.813623.423725.753826.473927.814031.024131.834233.094335.392，4-二叔丁基苯酚Phenol,2,4-di-tert-butyl18.16二十四烷Tetracosane硬脂酸甲酯Octadecanoicacidmethylester软脂酸甲酯Hexadecanoicacidmethylester十二酸n-Dodecanoicacid8，11-十八碳二烯酸甲酯8，11-Octadecadienoicacidmsthylsster9，12-十八碳二烯酸乙酯9，12-OctadecadienoicacidEthylester邻苯二甲酸二异丁酯Phthalicacidbis-isobutylester二十六踪Hexacosane豆蔻酸Myristicacid二十八烷Octacosane7-十六'j:希酸7-Hexadecanoicacid十六烷内酉旨Cyclohexadecanolde三十烷n画Triacontane三十四烷n-Tetratriacontane硬脂酸Strearicacid6-十八烯酸6-Octadecenoicacid9.12-十八二烯酸9，12-OctadecadienoicacidC14H220C24H50G19H38O2C19H3602C12H24O2C19H34O2C20H36O2C16H22O4C26H54C14H28O2C28H58C16H30O2C16H30O2C30H62C34H7018H36O218H34O218H32O2Ccc0.23%0.21%0.23%0.41%0.95%0.34%0.31%0.57%0.48%3.73%1.50%2.06%2.06%1.25%0.79%1.51%3.46%38%1本发明利用微生物发酵的方法对咖啡进行处理来制备咖啡烟用香料。发明人认为，咖啡在微生物的作用下，挥发性和半挥发性物质成分已经发生了很大的变化，主要表现在低碳链的有机酸，醇类，酯类以及垸烃类物质。而且发酵后的咖啡还保存了咖啡原有的香气成分，苯甲醛、苯乙醛、糠醛、苯乙烯、呋喃、高级脂肪酸及其酯类是形成特征性咖啡风味的关键致香成分的主要物质。苯甲醛具有令人愉快的杏仁香、坚果香和水果香；苯乙醛有似风信子、紫丁香样的香气，有玫瑰坚果底蕴，香气强烈，留香非常持久。发酵咖啡香料中的乙酸、丙酸、丁酸能够缓和辛辣的烟气，掩盖杂气；戊酸、4-甲基戊酸、异戊酸、己酸、庚酸、辛酸、癸酸、，等一系列低碳链的有机酸对巻烟的烟气有利，他们可以降低烟气中的碱性，从而可以减少刺激性使吃味醇和；十二酸、月桂酸、豆蔻酸、十六酸、9.12-十八二烯酸、7-十六烯酸等高级脂肪酸能改善烟气粗劣而使其具有淡甜柔和的吸味，而棕榈酸乙酯、棕榈酸甲酯、硬脂酸甲酯、软脂酸甲酯、8，11-十八碳二烯酸甲酯、9，12-十八碳二烯酸乙酯等高级脂肪酸的酯类则可提高和改善巻烟香味；5-甲基呋喃醛、3-糠醛、2-糠醇在巻烟中提调烟香，修饰咖啡、焦糖、坚果和辛香风味；苯甲醇、苯乙醇能够改善烟草的品质和巻烟的烟香吸味，增加巻烟香味的圆熟和津醇的吸味。经过巻烟加香评吸试验表明，经过微生物发酵处理的咖啡具有良好的加香效果，增加了烟气的细腻程度和柔和感，对于巻烟的刺激感也有明显的降低效果。表2、咖啡发酵浓縮浸膏的巻烟加香评吸结果巻烟叶组加香量评吸结果未发酵咖啡浸膏发酵咖啡浸膏混合型叶组0.2%口腔感稍好于空白样，主要体现在润感和残留方面，香气质粗糙，前半支体现出的是焦甜香，后半支有杂气出现，口腔后回甜感，干燥感较大。烟气的细腻与平滑感改善较明显，烟气有润感和轻微的甜感，入喉的刺激性也明显减轻，烟香更清晰，烤甜香，在整个舌面无明显残留，稍有涩感。16<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>以上评吸结果表明本发明的方法一方面筛选到的菌种可以利用外加糖源，通过自身一系列的代谢途径，形成低级脂肪酸以及低级脂肪酸的甲酯和乙酯等化合物，低级脂肪酸具有掩盖烟叶固有杂气和减轻剌激性的作用并对香气质有一定的改善，低级脂肪酸的甲酯和乙酯等化合物具有水果香或酒香、脂肪香、蜡香，其中不少是烟气香精的重要成分，对于丰富烟气起到了重要的作用。另一方面筛选到的菌种利用其细胞内产生的各种酶系将咖啡本身对烟气有一定负作用的长链脂肪酸及其酯类物质降解成低碳链的脂肪酸、酯类、杂环类化合物、醇类，羰基化合物等与香气密切相关的物质。将蛋白质降解为氨基酸，协调因蛋白质过多而产生的刺激性气味。由此证明本发明的方法是十分成功的。权利要求1、一种采用微生物发酵咖啡制备烟用香料的方法，其特征在于所述的方法依以下的步骤进行(1)烟叶复合培养基的制备将自然陈化一年至两年的白肋烟和水按15的比例混合后加热至100℃，并保持1-2小时，过滤得到白肋烟水提液；将白肋烟水提液和微生物固体培养基按37的比例混合，制成烟叶复合培养基；(2)产香微生物的筛选取自然陈化一年至两年的白肋烟叶5-10g，加入到无菌蒸馏水中，震荡30-60min，从中取100-1000μl液体，滴加到已配制好的烟叶复合培养基上，均匀涂开，用有氧或厌氧条件，用平板划线分离或稀释涂平板法纯化后，得到的白肋烟叶表面优势菌即为筛选的产香微生物；(3)用筛选的白肋烟叶表面优势菌对咖啡进行液体发酵或固体发酵，得到发酵咖啡烟用香料。2、根据权利要求1所述的一种采用微生物发酵咖啡制备烟用香料的方法，其特征在于所述的微生物固体培养基是牛肉膏蛋白胨、PDA培养基或基本培养基。3、根据权利要求1所述的一种采用微生物发酵咖啡制备烟用香料的方法，其特征在于所筛选的白肋烟叶表面优势菌为芽孢杆菌、芽孢梭菌、假单孢菌、曲霉菌、青霉菌、酵母菌，菌种可为菌曲或菌液形式。4、根据权利要求1所述的一种采用微生物发酵咖啡制备烟用香料的方法，其特征在于用筛选的白肋烟叶表面优势菌对咖啡进行液体发酵，按以下步骤进行①菌种活化取白肋烟叶表面优势菌，接种于准备好的斜面培养基上，放置于3037i:的恒温培养箱中培养2448h使菌种活化，再将活化的菌种接种于添加糖源的LB液体培养基中，于3037'C恒温培养2448h，得到活化的种子液；②原料的预处理选取干燥的已粉碎的咖啡粉作为原料，以水咖啡粉二l:(50-100)的比例混合，在上述混合液中加入占上述混合液1-5%的糖源和0.1-2%的无机盐，在115。C下灭菌1520min，即为灭菌好的咖啡液体培养基；③液体发酵将活化好的种子液接种于灭菌好的咖啡液体培养基中，接种体积比为种子液咖啡液体培养基=1:(50100)，混合均匀后，置于3037。C的恒温培养箱中发酵2448h;④发酵液的浓縮与精制将发酵好的咖啡发酵液，菌种灭活后板框滤膜过滤，再减压浓縮或冷冻干燥浓縮成膏状，按照l:(14)的质量比将膏状物与萃取溶剂相混合，使膏状物充分的溶解，再过滤后，将滤液减压浓縮至除去80-95%的溶剂，所得液体膏状物质即发酵咖啡烟用香料。5、根据权利要求1所述的一种采用微生物发酵咖啡制备烟用香料的方法，其特征在于用筛选的产香微生物对咖啡进行固体发酵按以下步骤进行①菌种活化取纯化的白肋烟叶表面优势菌，接种到斜面培养基上，放置于2037。C的恒温培养箱中培养2448h使菌种活化，再将活化的菌种接种于添加糖源的液体培养基中，于2037i:恒温培养2448h，将培养液离心弃除上清液，沉淀菌体用生理盐水稀释震荡均匀，即为得到的活化种子液；②原料的预处理选取干燥的已粉碎的咖啡粉作为原料，在115°C下灭菌1520min，得到无菌的咖啡粗粉；③固体发酵将活化种子液按照1:110的质量比接种到无菌的咖啡粗粉中，搅拌，使粗粉固体与种子液充分混合均匀，放置于2835'C的培养箱中发酵27天；④提取和精制将上述发酵好的咖啡粗粉，按发酵固体与提取液质量比1:(15)的比例加入适量的提取液，加热至90-IO(TC并回流提取23次，每次提取13h，将提取液收集并过滤后，将滤液减压浓縮成浸膏；按照1:(14)的质量比将膏状物与萃取溶剂相混合，使膏状物充分的溶解，进一步过滤后，减压浓縮除去80-95%溶济，所得液体膏状物质即为发酵咖啡烟用香料。6、根据权利要求4或5所述的一种采用微生物发酵咖啡制备烟用香料的方法，其特征在于①菌种活化中所述的斜面培养基为牛肉膏蛋白胨、PDA培养基或基本培养基，培养基可为固体或液体形式。7、根据权利要求4或5所述的一种采用微生物发酵咖啡制备烟用香料的方法，其特征在于④发酵液的浓縮与精制和④提取和精制中所述的提取液、萃取溶剂为水或乙醇，或两者的复合溶液。8、根据权利要求4或5所述的一种采用微生物发酵咖啡制备烟用香料的方法，其特征在于所述的咖啡发酵过程中添加的糖源为蔗糖、葡萄糖、果糖中的一种或多种的混合物。9、根据权利要求4所述的一种采用微生物发酵咖啡制备烟用香料的方法，其特征在于②原料的预处理中所述的无机盐是KH2P04、(NH4)2S04、MgS04，或NaCl。全文摘要本发明公开了一种采用微生物发酵咖啡制备烟用香料的方法，涉及到烟用香料的制取方法，属于烟草
技术领域：
。方法依以下的步骤进行(1)烟叶复合培养基的制备；(2)产香微生物的筛选；(3)用筛选的白肋烟叶表面优势菌对咖啡进行液体发酵或固体发酵，得到发酵咖啡烟用香料。本发明的方法工艺过程简单，成本低廉，所得发酵咖啡烟用香料能直接用于卷烟的加香加料。发酵咖啡烟用香料具有独特的酸香的香韵特征，添加在卷烟中有降低刺激，丰富和饱满烟气，掩盖杂气，使烟气柔和以及改善口感的作用。文档编号A24B15/00GK101497844SQ20081004683公开日2009年8月5日申请日期2008年1月30日优先权日2008年1月30日发明者品吕,湘周,巍朱,颖朱,丹李,珊王,霖肜,陈守文,龙黄申请人:湖北中烟工业有限责任公司