专利名称：葡激酶微乳制剂及其制备方法
微乳是由水相、油相、表面活性剂和助表面活性剂按适当比例混合后自发形成的各相同性、透明、热力学稳定的分散体系，80年代后作为药物载体受到医药界的重视，在药物制剂研究及临床方面的应用日益广泛。
微乳的实质是乳剂的一种，乳滴小于50nm，乳滴均匀地分散在连续相中。连续相为油相，分散相为水相的微乳称W/O型微乳；而连续相为水相，分散相为油相的微乳称O/W型微乳。根据药物的溶解特性，药物常分散或溶解于分散相中。对于水溶性良好的蛋白质，一般把蛋白质溶解于水相中，形成W/O型微乳。
W/O型微乳的吸收机理有两种方式，一种是拟脂滴吸收方式，因为微乳乳滴很小，只有20-40nm，若选择适当的表面活性剂和助表面活性剂，使其稳定性增加，则微乳与微小脂滴很相似，可以以拟脂滴形式被吸收，即以被动转运方式进入淋巴管，再入血循环；另一种吸收方式是胞饮，因为外相油膜呈脂性，可以与肠上皮细胞接触，再加上微乳内含有的表面活性剂可改变细胞膜张力，引起膜内陷，细胞膜与微乳外相油膜融合，把蛋白质导入胞内。基于这样的吸收机制，微乳的吸收量有可能比其它任何一种制剂都大。
微乳作为蛋白质的口服载体，通过对蛋白质的包裹，可以避开胃酸和胃肠道内各种酶的降解，例如把水溶性良好的胰岛素制成W/O型微乳，胰岛素溶解于内水相中，外油相可有效把蛋白水解酶拒之于外。微乳还具有缓释作用，W/O型微乳犹如水溶性药物的储库，可使药物持续释放，增加药物的生物利用度、延长药物半衰期。
除了用于降低移植后排斥反应的环孢菌素(cyclosporine A，MW＝1202)微乳外，至今还不见水溶性蛋白质的口服微乳面市。cyclosporine A是一种含11个氨基酸的环状多肽化合物，不溶于水，易溶于乙醇，几乎不溶于油，但通过乙醇的介导很好地溶于油中后，加入O/W型表面活性剂及相应的助表面活性剂，口服，进入胃肠道，自发形成O/W型微乳，这就是1994年5月Sandoz公司在德国上市的第二代Sandimmun Neoral软胶囊。cyclosporine A微乳的成功给药剂工作者不少启示。
cyclosporine A与一般蛋白质的本质区别在于溶解性，一般蛋白质呈水溶性，其微乳只能制备W/O型。因为内水相体积有限，如占10％左右，和毫微粒一样，蛋白质包裹率约0.5mg/g微乳；同时微乳制备工艺中需要多种亲脂性物质，如外油相、表面活性剂和助表面活性剂，这些物质的总量相对水相大得多，以致亲水性的蛋白质在这样非极性环境中容易变性析出。W/O型微乳的另一个问题是稳定性，包括储存稳定性和体内亲水环境中的稳定性。虽然存在以上问题，但是微乳仍不啻是口服蛋白质的一种相当有前途的载体。
组织型纤溶酶原激活物(t-PA)、链激酶(SK)、尿激酶(UK)等溶栓药物广泛应用于临床以后，葡激酶(staphylokinase，Sak)以其纤维蛋白特异性强、良好的溶栓能力、分子量小等优点日益受到人们重视。上述几种药物均以静脉滴注方式给药，用于急性心肌梗塞等血管栓塞性疾病的急救，溶栓治疗最佳时间是发病6hr内。但是，静脉注射必须在医院进行，由此，许多病人失去了溶栓治疗的机会。
本发明的目的是提供一种以葡激酶为原料的，适合于较长期使用的非静脉滴注预防性药物制剂，提高人血浆中纤溶或抗凝活性，预防急性心肌梗塞和脑梗塞等血栓性疾病。能服用方便。
本发明采用葡激酶包括从葡萄球菌中提取的天然葡激酶(有公开文献报道)、重组葡激酶(recombinant staphylokinase，r-Sak，专利号为94112105)、通过基因突变产生的葡激酶各种突变体及上述品种的体外修饰物为原料。
本发明集中于以下几个方面a.对油相的选择，如长链、中链脂肪酸，长链、中链脂肪酸酯，长链脂肪醇及上述几种的混合物，包括它们的饱和、不饱和、直链、含支链形式。如大豆油、蓖麻油、亚油酸、油酸、单硬脂酸甘油酯(如Myvaple 600，Eastman Fine Chemical Company)、单油酸甘油酯(如Myverol 18-92，Eastman Fine Chemical Company)、中链(C8-C10)脂肪酸的甘油酯(如Captex 366、Captex200、Capmul MCM，Abitec Corporation)、十六醇等。
b.选择适当的表面活性剂，增加药物的包裹量。选择毒性小、口服安全的非离子型表面活性剂，如脂肪酸甘油酯、PEG类衍生物(如PEG 400单油酸酯、PEG 400单月桂酸酯)、聚氧乙烯脂肪醇醚类(如Brij类)、聚氧乙烯失水山梨醇脂肪酸酯(Tween类)、山梨醇及失水山梨醇脂肪酸酯(Span类)、聚氧乙烯脂肪酸酯类(Myrj类)、Vitamin E衍生物类(如Vitamin E TPGS，Eastamn Fine ChemicalCompany)、聚氧烯烃整体共聚表面活性剂(Pluronic类)；天然表面活性剂，如卵磷脂、豆磷脂、胆甾醇和胆酸类、海藻酸钠等；部分阴离子表面活性剂，如二辛基琥珀酰磺酸钠(Aerosol OT)。
c.选择刺激性小的助表面活性剂，减少或不用助表面活性剂。例如选择聚合度小的聚乙二醇类，如PEG 400。
d.增加微乳的稳定性，包括对水稀释的稳定性及储存稳定性。水相中加入一定量高分子物质(如明胶、PVP)以提高水相粘度、高HLB值的表面活性剂和低HLB值的表面活性剂混合使用(如将单甘酯、卵磷脂、胆固醇等表面活性剂混合使用)、加入一定量O/W型表面活性剂以使微乳进入胃肠道内立即形成W/O/W型复乳等措施有助于提高微乳的对水稀释稳定性。
e.增加微乳的粘度，使微乳固化。选择适当的亲脂性添加剂，使微乳在常温下成流动性很小的凝胶状或固状，进入体内后又融化成液态。硬脂酸钠、十六醇、十八醇、Myverol 18-99、Vitamin E-TPGS等都有此作用。选择适当的固化载体，如CaSO4、海藻酸、硬脂酸酯、HPC等，将液状的微乳吸收，转化成固状，可提高微乳的储存稳定性。
f.微乳中加入适量抑菌剂、抗氧剂。
g.将微乳(液状、凝胶状或固状)装入胶囊(软胶囊或硬胶囊，小肠溶、结肠溶或胃溶)。
本发明采用下列技术方案1.微乳制备油相的选择见上述a。若油相本身在室温下部分或全部呈固状或半固状，需熔融或以适量溶剂如乙醇、PEG 400溶解。油相中加入0.005-0.02％叔丁基对羟基茴香醚(BHA)或二丁甲苯酚(BHT)作抗氧剂。
水相为含Sak的缓冲液(pH 4-9)，可加1-10％高聚合度PEG(聚合度≥20)、0.1-1％明胶或0.1-5％PVP等高分子物质，增加内水相粘度，使微乳稳定。水相中含0.01-0.25％尼泊金类抑菌剂。
乳化剂一般是表面活性剂，包括非离子表面活性剂、阴离子表面活性剂、天然表面活性剂(见上述b)，含量大于油相量的20％，亲水亲油平衡值(HLB)范围比较广。可以使用一种表面活性剂，也可高HLB值的表面活性剂和低HLB值的表面活性剂混合使用，一般地，HLB总＝5-20。若乳化剂水溶性好，则可部分先溶解于含Sak的缓冲液里，再滴入油相、助乳化剂(见上述c)及其它乳化剂的混合液中；若乳化剂水溶性较差，可先以助乳化剂、油相溶解，或与油相熔融混匀后加入水相。
操作顺序一般是在搅拌下，把水相滴入含表面活性剂(和助表面活性剂)的油相中。
所有操作在37℃或室温下完成，得到透明W/O微乳。
增加微乳的稳定性的措施，包括对水稀释的稳定性及储存稳定性见上述d、e。
为了使微乳服用方便、易于运输及增加微乳的储存稳定性，可把微乳固体化，如把微乳装入胶囊(见e)。肠溶型材料包括邻苯二甲酸醋酸纤维素(CAP)、邻苯二甲酸羟丙基甲基纤维素(HPMCP)、邻苯二甲酸聚乙烯醇酯(PVAP)、苯乙烯马来酸共聚物(StyMA)、丙烯酸树脂(如Eudragit L100、Eudragit S100)等，软胶囊可采用压制法制得。
2.生物活性法检测微乳体外稳定性及大鼠口服Sak W/O微乳生物利用度2.1微乳体外稳定性微乳1g，加入PBS 100ml，37℃搅拌2-4hr后，10000rpm×20min离心，酪蛋白板溶圈法测水层纤溶活性。
2.2大鼠口服Sak W/O微乳生物利用度SD大鼠24只，分成对照组和给药组，每组12只，其中给药组服含1.5mg Sak的微乳，对照组服等体积空白微乳，给药前及给药后每隔2hr尾部取血0.4ml，肝素抗凝，3000rpm×5min离心，取血浆。
不影响Sak活性的Sak单抗纯化后包被于96孔板，加入待测血浆及含有Sak活性标准系列，37℃温育1hr，倾去，洗涤后加入发色底物S2390与人纤溶酶原混合液，37℃温育，测A405，作活性-时间曲线，计算AUCpo。
大鼠12只，戊巴比妥钠麻醉，静脉注射与上述口服剂量相同的Sak，不同时间取血，酪蛋白板溶圈法测血浆中纤溶活性变化，计算AUCiv。
计算大鼠口服口服Sak微乳的生物利用度。
微乳载药量定义为每g微乳含有的Sak毫克数。
微乳按1∶100用PBS稀释，37℃搅拌2hr，酪蛋白板溶圈法显示，水相Sak量占总Sak量2-10％，表明微乳比较稳定。
大鼠口服Sak微乳后血浆纤溶活性明显上升，证实了部分Sak进入血液循环。
人或大鼠静脉注射Sak，快速消除相t1/2＝3.0min，而口服Sak微乳t1/2为2-3hr(见附表4)，说明口服Sak制剂具缓释作用。
本发明的Sak微乳除了可用于口服吸收(小肠吸收、结肠吸收)之外，还可用于透皮吸收。
表1例举了Sak 5种W/O型微乳的制备方案(以A、B、C、D和E表示)。其中水相为含有Sak、抑菌剂、0.5％明胶的PBS(pH7.4)溶液，油酸中含抗氧剂。
实施例1把油酸、Tween 80、Span 80混合，三者互溶，加入助表面活性剂正丁醇、PEG 400，室温搅拌下滴入水相，混匀即可。
实施例250℃融化Vitamin E TPGS，加入油酸、Span 80，三者互溶，使温度降至37℃，37℃下逐滴加入37℃保温的水相，混匀即可。
实施例360℃融化Pluronic F68，加入油酸、Span 80，三者互溶，使温度降至37℃，37℃下逐滴加入37℃保温的水相，混匀即可。
实施例4卵磷脂以乙醇溶解，加入PEG 400、油酸，混合均匀，室温搅拌下滴入水相，混匀即可。
实施例510％AOT以乙醇溶解，加入PEG 400、油酸，混合均匀，室温搅拌下滴入水相，混匀即可。
实施例6大豆油4g、Pluronic F68 2g、Span 85 1.2g、Sak溶液0.9ml。60℃融化Pluronic F68，加入大豆油、Span 85，三者互溶，使温度降至37℃，37℃下逐滴加入37℃保温的水相，混匀即可。
实施例7亚油酸3.5g、Vitamin E TPGS1.8g、Span 830.8g、Sak溶液1.1ml。50℃融化Vitamin E TPGS，加入亚油酸、Span83，三者互溶，使温度降至37℃，37℃下逐滴滴加37℃保温的水相，混匀即可。
1g该微乳可以3g海藻酸或单硬脂酸酯吸收，成固体制剂。
实施例8Captex 366 10g、Tween 20 5g、Myvaple 600 1.5g、PEG400 3ml、Sak溶液2.7ml。Myvaple 600与Captex 366、PEG400混合，加热熔融，加入Tween 20，混匀，使温度降至37℃，37℃下逐滴加入37℃保温的水相，混匀即可。
例2、3、6、7、8在37℃呈流动性良好的液体状，当温度降至20℃左右，粘度逐渐增高，流动性差；温度进一步降低，可呈固状，易于贮存，此时若再将温度升至37℃，制剂又呈流动性良好的液体。
表2例举了表1中Sak 5种W/O型微乳的载药量(mg/g微乳)。
表3例举了表1中Sak 5种W/O型微乳在PBS中37℃搅拌2hr后，水层的纤溶活性占微乳中Sak总活性的百分数。
表4例举了表1中Sak 5种W/O型微乳大鼠口服的生物利用度(活性代谢方式)。
附
图1为大鼠口服微乳后血浆纤溶活性的变化。
由例1-5可见，表面活性剂的选择直接影响微乳的载药量、稳定性及口服给药的生物利用度。
表1是微乳成分表表1
表2是W/O微乳载药量表2单位mg/gA BC D E0.18 0.75 0.63 0.38 0.82表3是微乳在PBS中37℃搅拌2hr后，水层的纤溶活性占微乳中Sak总活性的百分数表3A B CD E8.9％ 4.1％ 2.0％7.0％ 2.5％表4为大鼠口服r-Sak W/O微乳生物利用度(活性代谢方式)表4A B C D EAUCpo1035 1542 1491 9901959(HU.min.ml-1)AUCiv26502(HU.min.ml-1)生物利用度 3.9％ 5.7％ 5.7％ 3.6％ 7.2％t1/2po(hr) 2.54 2.54 2.45 2.43 2.94t1/2iv(min)3.0
权利要求
1.一种葡激酶的微乳制剂，其特征在于采用葡激酶作为原料，采用水相、油相、表面活性剂和助表面活性剂混合物作为药物载体，制备微乳制剂。
2.按权利要求1所述的葡激酶微乳制剂，其特征在于所述的葡激酶包括天然葡激酶、重组葡激酶、通过基因突变产生的各种突变体及上述品种的体外修饰物。
3.按权利要求1所述的葡激酶微乳制剂，其特征在于所述的油相包含长链、中链脂肪酸，长链、中链脂肪酸酯，长链脂肪醇及上述几种的混合物，包括它们的饱和、不饱和、直链、含支链形式。
4.按权利要求3所述的葡激酶微乳制剂，其特征在于所述的油相包含如大豆油、蓖麻油、亚油酸、油酸、单硬脂酸甘油酯、单油酸甘油酯、中链(C8-C10)脂肪酸的甘油酯、十六醇等。
5.按权利要求1所述的葡激酶微乳制剂，其特征在于所述的表面活性剂为非离子型表面活性剂、天然表面活性剂、部分阴离子表面活性剂。
6.按权利要求5所述的葡激酶微乳制剂，其特征在于所述的非离子型表面活性剂是脂肪酸甘油酯、PEG类衍生物、聚氧乙烯脂肪醇醚类、聚氧乙烯失水山梨醇脂肪酸酯、山梨醇及失水山梨醇脂肪酸酯、聚氧乙烯脂肪酸酯类、Vitamin E衍生物类、聚氧烯烃整体共聚表面活性剂。
7.按权利要求5所述的葡激酶微乳制剂，其特征在于所述的天然表面活性剂是卵磷脂、豆磷脂、胆甾醇和胆酸类、海藻酸钠等。
8.按权利要求5所述的葡激酶微乳制剂，其特征在于所述的部分阴离子表面活性剂是二辛基琥珀酰磺酸钠。
9.按权利要求1所述的葡激酶微乳制剂，其特征在于所述的助表面活性剂是采用聚乙二醇类。
10.按权利要求1所述的葡激酶微乳制剂，其特征在于采取水中加入高分子物质、高HLB值的表面活性剂和低HLB值的表面活性剂混合使用、加入O/W型表面活性剂等措施提高水相粘度和微乳对水稀释的稳定性。
11.按权利要求1所述的葡激酶微乳制剂，其特征在于采用亲脂性添加剂和固化载体。
12.按权利要求10所述的葡激酶微乳制剂，其特征在于所述的亲脂性添加剂为硬脂酸钠、十六醇、十八醇、Myverol 18-99、VitaminE-TPGS等。
13.按权利要求10所述的葡激酶微乳制剂，其特征在于所述的固化载体为CaSO4、海藻酸、硬脂酸酯、HPC等。
14.一种葡激酶微乳剂的制备方法，其特征在于采用下述步骤(1)选择油相，若油相是固体的半固体状，熔融或加溶剂溶解，再往油相内加入抗氧剂。(2)制备水相，水相中含葡激酶。(3)选择表面活性剂作乳化剂。(4)在37℃或室温下，搅拌中把水相滴入含表面活性剂的油相中。(5)增加微乳粘度或固化微乳，提高微乳稳定性。(6)微乳装入胶囊。
全文摘要
本发明采用不同的油相、表面活性剂、助表面活性剂及多种添加剂,制备葡激酶(Sak)W/O型微乳制剂,实验证明:微乳体外稀释试验稳定;动物及人口服吸收效果良好,与注射Sak水溶液比较,口服微乳使血浆纤溶活性升高的时间明显延长。本发明微乳能提高血浆纤溶活性,在通过消化道时保护Sak活性,有缓释作用,具有预防血栓性疾病的功效。
文档编号A61K38/43GK1264598SQ00111418
公开日2000年8月30日 申请日期2000年1月5日 优先权日2000年1月5日
发明者宋后燕, 黄阳滨 申请人:上海医科大学