专利名称：一种合成肽流感疫苗及其制备方法
技术领域：
本发明涉及用生物工程技术制备的疫苗及其制备方法，特别是涉及一种流感疫苗及其制备方法。
流感是一种常见、多发的病毒性传染疾病，对人类特别是对老人、儿童及身体较弱的人有很大的威胁。已有的流感疫苗及其设计和制备技术如下1、流感病毒灭活疫苗，该疫苗目前在成人中广泛使用，是利用流感病毒灭活后的病原体制成的。但是该疫苗株需要随流感毒株抗原性变异而及时更换，否则免疫效果就无保证，甚至无效。由于流感病毒的变异性很强，所以这种疫苗很难确保其预防效果。
2、流感病毒减毒活疫苗，该疫苗于1960年开始大量用于人体，也是利用流感病毒减活后的病原体制成的。由于与第一种情况相同的原因，疫苗株需要随流感毒株抗原性变异而及时更换，目前，国内外正在进行新的疫苗株的筛选实验。
3、流感病毒亚单位疫苗，该疫苗是目前国外儿童正在使用的流感疫苗。是利用基因重组的病毒表面抗原诱导免疫防护，病毒表面抗原也需要随流感毒株抗原性变异而及时更换，否则免疫效果就无保证，甚至无效。
上述3种正在使用的流感疫苗总的特点是不能对付流感病毒毒株的抗原性变异。然而，流感病毒的变异性很强，抗原性变异是不断发生的。
另一方面，流感病毒胞膜蛋白HA上的几个主要中和表位(例如HA92-105，KAYSNCYPYDVPDY；HA127-133，WTGVAQD；HA183-195，HHPITDSDQTRLY；HA317-341，ATGLRNIPSIQSRGLFGAIAGFIEG)能诱导很强的免疫防护(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1992，898995-8999；Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1982，79569-573；Vaccine 1995，13927-932；Eur.J.Immunol.1997，273105-3114)。最新的研究结果证明流感病毒胞膜蛋白M2也能诱导广泛的、长时期的、针对甲型流感病毒感染的免疫防护(Nature Medicine 1999，51157-1163)。
本发明的目的是提供一种能对付流感病毒变异的合成肽流感病毒疫苗。
本发明的另一个目的是提供一种生产上述合成肽流感病毒疫苗的方法。
为实现上述目的，本发明采取以下设计方案一种合成肽流感病毒疫苗，它包括至少一个耦联到载体蛋白或载体多肽上形成耦联物的包含有流感病毒胞膜蛋白HA或M2上的中和表位或变异表位的人工合成的多肽。
上述含有中和表位和变异表位的多肽分别为ATGLRNIPSIQSRGLFGAIAGFIEGWTGVAQD
HHPIFDSDQTRLY为了增强本发明疫苗抵抗病原体变异的能力，上述疫苗中还包括耦联到载体蛋白或载体多肽上形成耦联物的下述多肽KAYSNCYPYDVPDY为了更进一步增强本发明的疫苗抵抗病原体变异的能力，上述疫苗中还可以加入耦联到载体蛋白或载体多肽上形成耦联物的下述多肽SLLTEVETPIRNEWPIRNEWGCRCNDSSDK N E W G C R C N D S S D G N E W G C R C N D S S DK E T P I R N E W G G E T P I R N E W GK S L L T E V E T P I R N E W G C R C N D S S DK S L L T E V E T P I R G S L L T E V E T P I R为了适于注射，疫苗中还应该包括可接受的药用佐剂。
本发明制备合成肽流感疫苗的方法，具有以下步骤(1)、人工合成至少一条含有流感病毒胞膜蛋白HA或M2上抗原区中和表位或变异表位的多肽；(2)、将上述多肽分别耦联到载体蛋白或载体多肽上形成耦联物；(3)、将上述耦联物配以可接受的佐剂制备成流感疫苗。
其中，所述人工合成含有流感病毒胞膜蛋白HA和M2上抗原区中和表位或变异表位的多肽为ATGLRNIPSIQSRGLFGAIAGFIEGWTGVAQDHHPITDSDQTRLY而且上述3种抗原区多肽的疫苗中还可以包括KAYSNCYPYDVPDY以及SLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSDPIRNEWGCRCNDSSD本发明巧妙地利用了流感病毒胞膜蛋白HA及M2上的中和表位能够诱导人体产生较强，而且时间较长的免疫防护的特性。针对流感病毒变异较多的特点，本发明的流感疫苗是一种能刺激人体对流感病毒产生多种中和抗体的多联疫苗，也就是说，当流感病毒的一个或几个表位发生变异，注射了疫苗的人体中还存在着足以对付该变异流感病毒的对应于其它未变异表位的抗体。本发明的疫苗具有以下优点1、该疫苗是一种能刺激产生多种中和抗体的高效多联疫苗，能有效对付病毒的变异，进而克服已有流感疫苗预防效果不足甚至无效的缺点。2、该疫苗的有效成分是耦联到载体蛋白或载体多肽上形成耦联物的包含有流感病毒胞膜蛋白HA或M2上的中和表位或变异表位的多肽，这些多肽没有流感病毒的遗传物质及活性，不会产生因流感病毒的遗传物质诱发的副作用，也没有灭活疫苗或减毒疫苗在人体中有复性可能之虞。3、能诱导很强的针对特定中和表位的免疫应答，是相应的亚单位疫苗诱导的特定中和抗体水平的10-20倍，针对特定中和表位的抗体量为10-240微克/毫升血清。4、根据流感病毒的变异，可以很快生产出其相应类型的疫苗，不需进行长时间的试验，降低生产成本。该技术将对世界预防医学研究产生重大影响，将使流感病毒疫苗的制备技术产生革命性变化，并且将带来巨大的经济效益和社会效益。
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1、制备以流感病毒胞膜蛋白HA为基础的合成肽流感疫苗，包括以下步骤(1)、人工合成含有HA蛋白上主要中和表位的1条多肽C A T G L R N I P S I Q S R G L F G A I A G F I E G(2)、利用MBS(m-maleimidobenzoyl-N-hydroxy succinimide ester)将多肽与载体蛋白BSA耦联；(3)、将耦联物配以铝佐剂制备成疫苗。
实施例2、制备以流感病毒胞膜蛋白HA为基础的多联-合成肽流感疫苗，包括以下步骤(1)、人工合成含有HA蛋白上主要中和表位的3条多肽C A T G L R N I P S I Q S R G L F G A I A G F I E GC G W T G V A Q DC G H H P I T D S D Q T R L Y(2)、利用MBS(m-maleimidobenzoyl-N-hydroxy succinimide ester)将多肽分别与载体蛋白BSA耦联；(3)、将3种耦联物混合后配以铝佐剂制备成流感病毒疫苗，其中，3种耦联物的份数比可以根据不同年份统计学处理得出的各位点的变异机率进行调整。
实施例3、制备以流感病毒胞膜蛋白HA为基础的多联-合成肽流感疫苗，包括以下步骤(1)、人工合成含有HA蛋白上主要中和表位的5条多肽C G W T G V A Q D G W T G V A Q DC G H H P I T D S D Q T R L Y G H H P I T D S D Q T R L YC K A Y S N C Y P Y D V P D Y G K A Y S N C Y P Y D V P D YC A T G L R N I P S I Q S R G L F G A I A G F I E G
C G L F G A I A G F I E G G L F G A I A G F I E G(2)、利用戊二醛将多肽分别与载体蛋白牛血清白蛋白耦联；(3)、将5种耦联物混合后配以铝佐剂制备成多肽疫苗，其中，3种耦联物的份数比可以根据不同年份统计学处理得出的各位点的变异机率进行调整。
实施例4、制备以流感病毒M2蛋白为基础的多联-合成肽流感疫苗，包括以下步骤(1)、人工合成含有M2蛋白上主要中和表位的4条多肽K N E W G C R C N D S S D G N E W G C R C N D S S DK E T P I R N E W G G E T P I R N E W GK S L L T E V E T P I R N E W G C R C N D S S DK S L L T E V E T P I R G S L L T E V E T P I R(2)、利用戊二醛将多肽分别与载体蛋白牛血清白蛋白耦联；(3)、将4种耦联物混合后配以铝佐剂制备成流感疫苗，其中，4种耦联物的份数比可以根据不同年份统计学处理得出的各位点的变异机率进行调整。
实施例5、制备以流感病毒胞膜蛋白HA和M2蛋白为基础的多联-合成肽流感疫苗，包括以下步骤(1)、人工合成含有HA和M2蛋白上主要中和表位的5条多肽C G W T G V A Q D G W T G V A Q DC G H H P I T D S D Q T R L Y G H H P I T D S D Q T R L YC K A Y S N C Y P Y D V P D Y G K A Y S N C Y P Y D V P D YC A T G L R N I P S I Q S R G L F G A I A G F I E GK S L L T E V E T P I R N E W G C R C N D S S D(2)、利用MBS(m-maleimidobenzoyl-N-hydroxy succinimide ester)将上述多肽分别与载体蛋白BSA耦联；(3)、将5种耦联物混合后配以铝佐剂制备成流感疫苗，其中，5种耦联物的份数比可以根据不同年份统计学处理得出的各位点的变异机率进行调整。
权利要求
1.一种合成肽流感病毒疫苗，它包括至少一个耦联到载体蛋白或载体多肽上形成耦联物的包含有流感病毒胞膜蛋白HA或M2上的中和表位或变异表位的人工合成的多肽。
2.根据权利要求1所述的合成肽流感病毒疫苗，其特征在于所述中和表位和变异表位的多肽分别为ATGLRNIPSIQSRGLFGAIAGFIEGWTGVAQDHHPITDSDQTRLY
3.根据权利要求2所述的合成肽流感病毒疫苗，其特征在于所述中和表位和变异表位的多肽还包括KAYSNCYPYDVPDY
4.根据权利要求2或3所述的合成肽流感病毒疫苗，其特征在于所述中和表位和变异表位的多肽还包括K N E W G C R C N D S S D G N E W G C R C N D S S DK E T P I R N E W G G E T P I R N E W GK S L L T E V E T P I R N E W G C R C N D S S DK S L L T E V E T P I R G S L L T E V E T P I R
5.根据权利要求1或2或3或4所述的合成肽流感病毒疫苗，其特征在于疫苗中还包括可接受的药用佐剂。
6.根据权利要求4所述的合成肽流感病毒疫苗，其特征在于疫苗中还包括可接受的药用佐剂。
7.一种制备合成肽流感病毒疫苗的方法，基本上包括以下步骤(1)、人工合成至少一条含有流感病毒胞膜蛋白HA或M2上抗原区中和表位或变异表位的多肽；(2)、将上述多肽分别耦联到载体蛋白或载体多肽上形成耦联物；(3)、将上述耦联物配以可接受的佐剂制备成流感疫苗。
8.根据权利要求7所述的一种制备合成肽流感病毒疫苗的方法，其特征在于所述人工合成含有流感病毒胞膜蛋白HA或M2上抗原区中和表位或变异表位的多肽选自ATGLRNIPSIQSRGLFGAIAGFIEGWTGVAQDHHPITDSDQTRLYKAYSNCYPYDVPDYSLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSDPIRNEWGCRCNDSSD
全文摘要
本发明公开了一种合成肽流感病毒疫苗,它包括至少一个耦联到载体蛋白或载体多肽上形成耦联物的包含有流感病毒胞膜蛋白HA或M2上的中和表位或变异表位的多肽。制备流感疫苗的方法,包括以下步骤:(1)人工合成含有流感病毒胞膜蛋白HA和M2上抗原区中和表位或变异表位的多肽;(2)将上述多肽分别耦联到载体蛋白或载体多肽上形成耦联物;(3)将上述耦联物配以可接受的佐剂制备成流感疫苗。本发明能有效对付病毒的变异,具有广泛的经济及社会效益。
文档编号A61P31/16GK1338308SQ0012129
公开日2002年3月6日 申请日期2000年8月10日 优先权日2000年8月10日
发明者陈应华, 陆韵, 丁健 申请人:清华大学