专利名称：一种生物活性蛋白质的非均一制品及其制备方法
技术领域：
本发明涉及蛋白质修饰领域，具体地涉及集落细胞刺激因子(G-CSF)的氨基酸残基与水溶性多聚物共价修饰的领域。
集落细胞刺激因子(G-CSF)是一种促进血细胞生长的细胞因子，它能促进粒细胞系的生长造血，诱导其分化，增殖和成熟。对于中性粒细胞减少的恢复具有明显的促进作用。作为一种升白药，G-CSF已在国内外临床上广泛使用。但是，由于它在体内的高清除率，病人必须每天注射一次来维持有效血浓度。通过PEG修饰蛋白质，则能解决基因工程药物的这一弊病(Mumtaz S，Bachhawat BK，Indian J Biochem BiopHys 1991 Oct-Dec；28(5-6)346-51)。有关这方面的研究也陆续在各国专利中发表(EP 0,335,423；EP 0,401,384；USP 4,904,584；USP5,773,581；USP 5,824,784)。然而，由于该项技术的高成本性及反应位点的不确定性，给PEG修饰蛋白质的产业化带来不小的困难。而且，PEG化的蛋白质生物活性有所降低；在体内起效较慢；且因在体内清除率低，故多次使用易对肾脏产生毒性。
为了克服PEG修饰蛋白质产业化的上述缺点，本发明者通过潜心研究，完成了本发明。
本发明的一个目的是提供一种生物活性蛋白质的非均一制品。
本发明的另一个目的是提供上述生物活性蛋白质非均一制品的制备方法。
本发明的还有一个目的是提供含上述生物活性蛋白质非均一制品的药物组合物。
本发明所提供的生物活性蛋白质非均一制品包含聚乙二醇(PEG)化学修饰的G-CSF和G-CSF或其类似物。
本发明的制品中，聚乙二醇的分子量为4,000-50,000道尔顿，较佳为20,000道尔顿。
本发明的制品包含15％-85％PEG-GCSF和85％-15％G-CSF或其类似物；较佳为包含35％-80％PEG-GCSF和65％-20％G-CSF或其类似物；更佳为包含70％PEG-GCSF和30％G-CSF或其类似物。
本发明所提供的生物活性蛋白质非均一制品的制备方法包括以下步骤(1)在碱性环境下，使G-CSF与聚乙二醇分子发生偶合反应；和(2)去除残余的聚乙二醇。
本发明的制备方法中，所述碱性环境是指pH 8.0；所述反应温度为4-25℃；所述反应时间为5-40小时。残余聚乙二醇的去除可采用本领域技术人员熟知的方法。
本发明方法制备的生物活性蛋白质非均一制品可与药学上可接受的添加剂形成药物组合物。所述药物组合物包含有效量的聚乙二醇化学修饰的G-CSF和G-CSF或其类似物及药学上可接受的添加剂。
所述药物组合物是物理状态稳定的制剂。它可以是注射剂或口服制剂。所述制剂中的添加剂包括稀释剂、缓冲剂、增溶剂、润滑剂、乳化剂、助悬剂、螯合剂、抗氧化剂、防腐剂、等渗调节剂、填充剂和/或保护剂。
所述稀释剂可以是水、乙醇、丙二醇、甘油等。所述缓冲剂为诸如醋酸盐，磷酸盐，碳酸盐等。所述乳化剂为聚山梨醇酯等。所述助悬剂为诸如明胶、甘氨酸等。所述螯合剂为诸如EDTA-2Na。所述抗氧化剂为诸如亚硫酸钠、焦亚硫酸钠、抗坏血酸、维生素E等。所述防腐剂为苯甲醇等。所述等渗调节剂为诸如氯化钠、葡萄糖。所述填充剂为甘露醇、甘氨酸、乳糖等。所述保护剂为乳糖、蔗糖等。
以上所述的本发明制备方法可以将活化的聚乙二醇偶合到蛋白质的氨基酸残基上，使蛋白质大分子化。由于选择了具有从4000Da至50000Da的分子量的聚乙二醇，并通过控制反应条件，如选择合适的缓冲液和pH值，得到具有一定配比的PEG-GCSF和G-CSF混合制剂，所得产物中PEG-GCSF和G-CSF的最佳比为7∶3。该制剂起效快，作用维持时间长，水溶液稳定。它兼有PEG-GCSF和G-CSF的优点，并有效地避免了它们两者单独使用的不足。其起效时间比纯PEG-GCSF短，生物半衰期比纯G-CSF长。
同时，本发明的生产工艺简单，仅用一步化学反应即完成PEG与GCSF的结合，并省去了后续分离单一纯品的烦琐步骤，大大降低了生产成本，更有利于大规模产业化生产。
图1是PEG-GCSF和G-CSF混合制品经过分子筛层析柱的流出情况。
图2是PEG-GCSF和G-CSF混合制品的SDS-PAGE图谱。
图3是PEG-GCSF和G-CSF混合制品的分子排阻HPLC图谱。
图4是PEG-GCSF和G-CSF混合制品的等电聚焦电泳图谱。
以下用实施例和实验例对本发明作进一步说明，它们旨在阐述本发明的最佳实施方案。本领域技术人员根据本发明的启示，结合本领域的常识所做的各种变更，均落在本申请权利要求的范围内。
实例一1.重组人G-CSF的制备人G-CSF的氨基酸序列如下Met Thr Pro Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu LysCys Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu Gln Glu Lys LeuCys Ala Thr Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu Glu Leu Val Leu Leu Gly His Ser LeuGly Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser Cys Pro Ser Gln Ala Leu Gln Leu Ala GlyCys Leu Ser Gln Leu His Ser Gly Leu Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala LeuGlu Gly Ile Ser Pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu Asp Val AlaAsp Phe Ala Thr Thr Ile Trp Gln Gln Met Glu Glu Leu Gly Met Ala Pro Ala LeuGln Pro Thr Gln Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala Phe Gln Arg Arg Ala GlyGly Val Leu Val Ala Ser His Leu Gln Ser Phe Leu Glu Val Ser Tyr Arg Val LeuArg His Leu Ala Gln Pro本发明者将含有该序列的质粒，转化大肠杆菌进行表达，对获得的菌体蛋白进行复性，及经离子交换、分子筛柱纯化(参见方向东等，中国生物制品学杂志，1997，10(1)1-4；及美国专利USP 4,810,643)，获得G-CSF半成品，作为聚乙二醇化的原料。
2.样品制备(1)聚乙二醇化学修饰的G-CSF和G-CSF混合制品的制备将如上1中制备的1.5mg/ml G-CSF溶液，用100mM(pH 8.0)的磷酸钠缓冲液透析过夜，加入溶解于此缓冲液的平均分子量为20000的2-甲氧基甲亚胺基甲基聚乙二醇(摩尔比为聚乙二醇∶G-CSF＝5∶1)，于4℃缓慢搅拌10小时。
将用上述方法获得的蛋白质进行分子筛层析，以除去未反应的聚乙二醇。柱为Pharmacia Sephcryl S-200 HR，300ml。以20mM醋酸钠(pH 4.0)缓冲液平衡。上样蛋白以6ml/分钟流速洗脱200分钟，在280nm处监测蛋白的流出情况，合并目的蛋白峰，结果见图1。
(2)对照品PEG-GCSF(纯品)的制备将2mg/ml的G-CSF溶液，用100mM(pH 8.0)的磷酸钠缓冲液透析过夜，加入溶解于此缓冲液的平均分子量为20000的2，-甲氧基甲亚胺基mPEG(摩尔比为聚乙二醇∶G-CSF＝5∶1)，于4℃缓慢搅拌12小时。
所得产物用20mM乙酸钠(pH 4.0)透析过夜。然后上样于Pharmacia CMSepharoseFF柱(1ml树脂结合1mg蛋白质)，以缓冲液A(20mM醋酸钠，pH 4.0)平衡柱。将蛋白质上样，再以缓冲液B(1M的氯化钠)，其浓度梯度为0-30％进行浓度梯度洗脱。流速为3ml/分钟，洗脱液在280nm处监测，收集蛋白含量大于0.5mg/ml的部分。合并不同峰的流份进行分析产物生物活性测定将从离子交换层析柱获得的蛋白质进行分子筛层析。柱为PharmaciaSephcryl S-200 HR，300ml。以20mM醋酸钠(pH 4.0)缓冲液平衡。上样蛋白以6ml/分钟流速洗脱200分钟，在280nm处监测蛋白的流出情况，合并目的蛋白峰。即为纯度达99％的纯PEG-GCSF。
3.产物分子量分析(1)SDS-PAGE电泳利用10％的变性SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，并用考马斯亮蓝染色。结果见附图2。图中，第一栏显示标准蛋白质分子量；第二栏显示PEG-GCSF和G-CSF混合制品的分子量；第三栏为PEG-GCSF纯品的分子量；第四栏为G-CSF纯品的分子量。由图2可见，在PEG-GCSF和G-CSF的混合制品中，PEG-GCSF的分子量为38,800，G-CSF的分子量为18,800。
(2)分子排阻HPLC采用TSK gel SW3000凝胶柱，以10mM磷酸钠缓冲液(pH7.4)为流动相，进行分子排阻HPLC，流速为1.0ml/分钟，洗脱液在280nm处监测。结果见图3。从图3所示非均一制品的分子排阻HPLC图谱经计算机对峰面积进行积分处理，数据如下
以上结果表明，PEG-GCSF和G-CSF混合制品中PEG-GCSF∶G-CSF＝7∶3。
4.产物等电点测定分别取自制PEG-GCSF和G-CSF混合制剂、PEG-GCSF纯品和美国Amgen公司G-CSF标准品作为对照液及等电点标准液各2μl分别加入IEF胶的加样L中，进行聚焦。100V 15分钟，200V 15分钟，450V 60分钟，停止聚焦(此时电流趋于零)。然后，进行固定和脱色，结果见图4。图4中第一栏显示的是GCSF样品；第二栏显示的是PEG-GCSF纯品；第三栏显示的是PEG-GCSF和G-CSF的混合制品。从图4可见，样品PEG-GCSF纯品与G-CSF标准品以及自制PEG-GCSF和G-CSF混合制品都具有相同的等电点。
5.产物稳定性研究将PEG-GCSF和G-CSF的注射液置于37℃放置48天，分别于第0天、第6天、第12天、第24天、第36天和第48天取样，测定体外生物活性。结果见表1。表1不同时间的PEG-GCSF和G-CSF混合制品的稳定性
从表1的结果可以看出，PEG-GCSF和G-CSF在放置48天后生物活性基本上没有降低，证明其性质非常稳定。
6.体外生物活性测定利用对G-CSF依赖的细胞株NFS-60，在含有10％经热灭活的胎牛血清和G-CSF的IMDM培养基中，于37℃、5％CO2培养72小时。然后，用无G-CSF的培养基清洗细胞2次，以每孔10,000个细胞/50μl加入96孔板，并分别加入以IMDM-FBS配制的浓度为20、40、80、160、320pg/ml的美国Amgen公司G-CSF标准品和自制PEG-GCSF样品。于37℃、5％CO2培养48小时后，按Cell Titer 96 Aqueous细胞生长的非同位素检测试剂盒中的说明，加入新鲜配制的按20∶1混合的MTS/PMS溶液，20μl/孔，继续培养4小时，用BioTek酶标仪读取490nm的值。酶标仪上自带的软件可显示出标准曲线及计算出待测样品的生物活性。结果见表2。
表2体外生物活性测定
如表2所示，采用本发明方法制备得到的PEG-GCSF和G-CSF的混合制品具有明显的体外诱导嗜中性粒细胞快速增殖的作用，其活性高于纯PEG-GCSF约50％。与欧洲专利EP 0335423中的PEG-GCSF相比，更是高约10倍。
7.体内生物活性测定选择ICR小鼠(18-22克)，以10μg蛋白质/kg体重计量静脉注射自制PEG-GCSF和G-CSF注射液，并以美国Amgen公司G-CSF标准品作为阳性对照。注射后，间隔一定时间，取外周血，对嗜中性粒细胞进行计数。结果见表3。
表3体内生物活性测定
如表3结果所示，采用本发明的方法制得的PEG-GCSF和G-CSF混合制品在体内仍然具有生物学活性，并且生物半衰期较对照的GCSF延长了近3倍。与欧洲专利EP0401384中的PEG-GCSF相比，本发明的产物生物半衰期延长约5小时。
8.血药浓度与时间的关系选择ICR小鼠(18-22克)，以10μg蛋白质/kg体重计量皮下注射自制PEG-GCSF和G-CSF混合制品注射液(PEG-GCSF占70％)，并以PEG-GCSF纯品作为对照。注射后，间隔一定时间，取外周血待用。
将用IMDM-FBS配成的浓度为20、40、80、160、320pg/ml的美国Amgen公司G-CSF标准品和以上制备的血样加入96孔培养板中，每个浓度3孔，每孔100μl，然后放入培养箱(5％CO2，100％湿度，37℃)预温30分钟，其间将已传代培养后的NFS-60细胞株用Hank’s液洗3次，每次1500rpm；5分钟，离心后去除上清液，加10％IMDM-FBS制成5×105/ml细胞浓度，加入以上96孔培养板中，每孔50μl，放入培养箱(5％CO2，100％湿度，37℃±1℃)培养21小时。21小时后，每孔加3H-胸苷(5μci/ml)50μl，继续培养6小时，结束后，收集细胞。65℃干燥，然后在液烁计数仪上计数1分钟。结果见表4。
表4 PEG-GCSF和G-CSF混合制品的血药浓度与时间的关系
从表4可以看出，PEG-GCSF和G-CSF混合制品的起效比对照组快30分钟以上。此外，本发明的混合制剂与欧洲专利EP0335423中的PEG-GCSF相比，起效约快30分钟。
9.急性毒性试验取昆明种小鼠20只，体重18.1±0.8克，雌雄各半，禁食12小时后受试。以3600μg蛋白质/kg体重计量静脉注射自制PEG-GCSF和G-CSF混合制剂注射液，观察其给药后的反应及7天内的死亡情况，结果见表4。
表5混合制品的急性毒性测定
实例二将1.5mg/ml G-CSF溶液，用100mM(pH 8.0)的磷酸钠缓冲液透析过夜，加入溶解于此缓冲液的平均分子量为20000的2’-甲氧基甲亚胺基mPEG(摩尔比为聚乙二醇∶G-CSF＝1∶1)， 25℃缓慢搅拌5小时。
将用上述方法获得的蛋白质进行分子筛层析，以除去未反应的聚乙二醇。柱为Pharmacia SepHcryl S-200 HR，300ml。以20mm醋酸钠(pH 4.0)缓冲液平衡。上样蛋白以6ml/分钟流速洗脱200分钟，在280nm处监测蛋白的流出情况，合并目的蛋白峰。产物经过HPLC含量测定PEG-GCSF∶G-CSF＝15∶85。体外生物活性测定结果见表4。
实例三将1mg/ml G-CSF溶液，用100mM(PH 8.0)的磷酸钠缓冲液透析过夜，加入溶解于此缓冲液的平均分子量为20000的2’-甲氧基甲亚胺基mPEG(摩尔比为聚乙二醇∶G-CSF＝6∶1)，4℃缓慢搅拌40小时。
将用上述方法获得的蛋白质进行分子筛层析，以除去未反应的聚乙二醇。柱为Pharmacia SepHcryl S-200 HR，300ml。以20mm醋酸钠(pH 4.0)缓冲液平衡。上样蛋白以6ml/分钟流速洗脱200分钟，在280nm处监测蛋白的流出情况，合并目的蛋白峰。产物经过HPLC含量测定PEG-GCSF∶G-CSF＝85∶15。体外生物活性测定结果见表6。
表6不同配比的PEG-GCSF和G-CSF混合制品的体外生物活性比较
实例四取药用级醋酸钠配制成10mM(pH4.0)的醋酸钠缓冲液650ml。称取药用级辅料甘露醇50克溶解于上述醋酸钠缓冲液中。准确取PEG-GCSF和G-CSF混合制品300mg，与上述溶液混匀，定容至1000ml。将此溶液用0.22μm滤膜过滤，并无菌分装，每瓶1ml，压塞、扎盖，即得到300μg/瓶的注射用针剂。
权利要求
1.一种生物活性蛋白质的非均一制品，包含聚乙二醇化学修饰的G-CSF和G-CSF或其类似物。
2.如权利要求1所述制品，其中所述聚乙二醇的分子量为4000-50000道尔顿。
3.如权利要求2所述制品，其中所述聚乙二醇的分子量为20000道尔顿。
4.如权利要求1所述制品，其中包含15％-85％聚乙二醇化学修饰的G-CSF和85％-15％G-CSF或其类似物。
5.如权利要求4所述制品，其中包含70％聚乙二醇化学修饰的G-CSF和30％G-CSF或其类似物。
6.权利要求1所述制品的制备方法，其特征在于包括以下步骤(1)在碱性环境下，使G-CSF与聚乙二醇分子发生偶合反应；和(2)去除残余的聚乙二醇。
7.如权利要求6所述方法，其中所述聚乙二醇的分子量为4000-50000道尔顿。
8.如权利要求7所述方法，其中所述聚乙二醇的分子量为20000道尔顿。
9.如权利要求6所述方法，其中所述碱性环境是指pH 8.0。
10.如权利要求6所述方法，其中反应温度为4-25℃。
11.如权利要求6所述方法，其中反应时间为5-40小时。
12.权利要求1所述制品的药物组合物，包含有效量的聚乙二醇化学修饰的G-CSF和G-CSF或其类似物与药学上可接受的添加剂。
13.如权利要求12所述的药物组合物，其中所述添加剂包括稀释剂、缓冲剂、增溶剂、润滑剂、乳化剂、助悬剂、螯合剂、抗氧化剂、防腐剂、等渗调节剂、填充剂和/或保护剂。
全文摘要
本发明提供一种生物活性蛋白质非均一制品,包含聚乙二醇化学修饰的G－CSF(15%－85%)和G－CSF或其类似物(85%－15%)。其中聚乙二醇的分子量为4,000－50,000道尔顿。该制品起效快,作用维持时间长,水溶液稳定,可与药学上可接受的添加剂组成药物组合物。本发明还提供该生物活性蛋白质非均一制品的制备方法,系在碱性环境下,使G－CSF与聚乙二醇分子发生偶合反应。该生产工艺简单,仅采用一步化学反应,并省去单一纯品的分离步骤,降低了成本,有利于大规模产业化生产。
文档编号A61P35/02GK1355252SQ00127510
公开日2002年6月26日 申请日期2000年11月23日 优先权日2000年11月23日
发明者赵剑, 金蓓文, 陈虎 申请人:赵剑