专利名称：人源抗狂犬病毒中和性基因工程抗体的制作方法
技术领域：
本发明涉及预防和治疗用人源基因工程单克隆抗体的制备及应用，尤其是特异性针对狂犬病毒糖蛋白的中和性基因工程单克隆抗体。
自1975年B淋巴细胞杂交瘤细胞融合技术问世以来，单克隆抗体作为一类用于基础研究，实验室诊断，临床治疗和预防的新型产物，其运用价值和开发前景已获得普遍的肯定。分子生物学和分子免疫学的研究发展导致了基因工程抗体的产生和发展。通过抗体分子基因水平的重组可获得多种多样的特异性鼠源及人源抗体，使对单克隆抗体的研究有了突破性进展并越来越显示出其重要意义及实际运用前景。80年代末90年代初兴起的噬菌体抗体基因库技术兴起和整个基因工程抗体技术研究领域的发展，使当今世界人源或基因工程抗体的开发研究取得很大进展并已由基础研究阶段步入实质性应用研究和开发阶段。目前美国FDA批准上市或待批的生物制品中，各种形式的单克隆抗体和基因工程抗体占到一定比例，目前以批准上市的67种生物制品中，治疗和预防用单克隆抗体和基因工程抗体共有9种。正在待批中等抗体有54种。其中已批准上市并且产生巨大经济和社会效益的四种人源化基因工程抗体中，其中有一种即为抗病毒基因工程抗体，其商品名为“SynagisTM″，为人源化抗呼吸道合病毒(RSV)基因工程抗体，而来源于噬菌体抗体库筛选的人源抗RSV病毒基因工程抗体已被批准进入II期临床，另一种抗病毒抗体抗乙型肝炎表面抗原抗体也在审批之中。
至今为止，大多数病毒性疾病无特异性治疗药物。狂犬病的暴露后治疗一直是世界性难题，对于严重暴露者(III)而言，世界卫生组织建议同时用疫苗和狂犬病毒免疫球蛋白(Rabies Immune Globulin，RIG)进行主动和被动免疫治疗，目前可以选用的抗血清有马抗狂犬病毒免疫球蛋白(ERIG)和人血来源的抗狂犬病毒免疫球蛋白(HRIG)。但由于ERIG在注入人体后有较强的副反应，所以美国免疫学会建议在HRIG和ERIG中优先选用HRIG进行治疗，但由于HRIG来源少，价格高，而且血制品中不仅非特异性杂蛋白多，特异性抗体含量很低，而且最大的问题是血源制品潜在的未能检出的病原污染问题，从长远利益考虑应当摒弃。因此以人源基因工程产品替代血制品已成为国内外研究的一大方向，并正在逐步走向成功。用纯鼠源单克隆抗体预防和治疗病毒性疾病在国际上尚无任何批准的先例，鼠源抗体人用最大的不利之处为异源蛋白，在人体内易引起遗传免疫排斥而使抗体失效并引起免疫性疾病。因此，特异性抗病毒人源中和性抗体是病毒性疾病预防和治疗的最有前景的生物制品之一。人源抗病毒基因工程抗体的研究除已成功的抗RSV抗体外，通过噬菌体表面呈现系统，基因工程抗体库技术和分子生物学手段的联合运用，这一领域的研究已取得重大进展目前已研制成功的人源抗病毒全抗体有抗以下病毒的抗体呼吸道合胞病毒，爱滋病毒(HIV)，乙肝病毒，单纯疱疹病毒(HSV)，汉坦病毒等以及尚未发表的本所已研制成功的抗甲型肝炎病毒，狂犬病毒抗体等。人源抗狂犬病毒基因工程抗体制剂的研制成功，将为国内外首创，有可能获一类新药证书。
本发明的目的是通过基因工程手段和噬菌体表面表达技术结合运用，直接从人抗体基因库中筛选出中和性抗狂犬病毒的基因工程单克隆抗体，获得其抗体基因，为将来可能的临床抗病毒预防和治疗提供可行性的特异性抗体药物。
本发明陈述的人源抗狂犬病毒中和性基因工程抗体包括1、人源抗狂犬病毒中和性基因工程抗体RVG10，包括Fab抗体和IgG全抗体基因、基因产物及其应用。其主要特征在于此重组抗体是由存在于抗体轻链和重链基因可变区中的高变区(CDRs)特异性基因序列决定的并在原核和真核细胞中获得有效表达的特异性结合狂犬病毒的功能性中和抗体。
2、人源抗狂犬病毒中和性基因工程抗体RVG10，其主要特征在于抗体蛋白功能由存在于抗体基因轻链和重链可变区的决定族互补区域CDR1、CDR2和CDR3中特异性核苷酸序列决定的，其相应的氨基酸序列构成了抗体的特异性抗原结合区域，如图9，是人源抗狂犬病毒中和性基因工程抗体可变区核苷酸和氨基酸序列。
3、人源抗狂犬病毒中和性基因工程抗体RVG10，其主要基因特征在于特异性的轻链和重链可变区基因来源于对人源抗狂犬病毒抗体基因库的特异性富积筛选表达，其轻链(VL)和重链各自相应的三个CDR区序列为本抗体特有的全新序列。重链(VH)三个CDR区的氨基酸序列包括CDR1为GGSITSHHYWS；CDR2为YHSGTTNYNPSLKSRV；CDR3为VRVTTGAFNL。轻链(VL)三个CDR区的氨基酸序列包括CDR1为RASQSVSSNLA；CDR2为ASTRAA；CDR3为QQYNTWPPYT。
4、人源抗狂犬病毒中和性基因工程抗体RVG10Fab抗体，其特征在于为一种在原核细胞中获得稳定有效表达的基因重组的人源抗狂犬病毒糖蛋白中和性基因工程单克隆抗体Fab抗体，由重链Fd和Kappa链组成。
5、人源抗狂犬病毒中和性基因工程抗体RVG10IgG全抗体，其特征在于由全长IgG1重链基因和全长lambda链轻链组成，其轻重链先导序列和重链Fc基因来源于载体pAc-L-Fc，已在专利申请号为00105698.0的专利申请中陈述。在轻链基因先导序列和VL基因之间含有SacI酶切点；在重链基因先导序列和VH基因之间含有XhoI酶切点；在重链Fd基因和Fc基因之间含有SpeI酶切点。
6、人源抗狂犬病毒中和性基因工程抗体RVG10，其主要功能特征在于特异性识别狂犬病毒糖蛋白蛋白，具有抗狂犬病毒感染的中和活性功能。
7、人源抗甲肝病毒中和性基因工程Fab抗体的用途，其特征在于利用上述获得的中和性抗体可变区，Fab或全抗体基因，可以在原核细胞、酵母细胞、真核细胞及任何重组病毒系统中表达和生产此抗体基因或以此为基础的改建后的含有此抗体基因任何其他基因，获得具有中和狂犬病毒感染的抗体产物，其基因表达产物可望在临床上用于预防和治疗由狂犬病毒引起的狂犬病。
8、人源抗狂犬病毒中和性基因工程抗体基因的用途，其特征在于根据发表的抗狂犬病毒中和抗体RVG10的可变区中的CDR区特异性核苷酸或氨基酸序列，可在体外人工合成与此相同的抗体轻重链6个CDR区的核苷酸序列或编码相同氨基酸的核苷酸序列，从而获得相同的抗体基因或用于相关基因的改造，而获得抗狂犬病毒糖蛋白的中和抗体或相关蛋白或多肽产物。
传统的利用杂交瘤细胞技术获得人源单克隆抗体相当困难，而且建立的细胞系通常不稳定，基因易丢失。本发明陈述的人源抗狂犬病毒中和性基因工程抗体，是在获得抗体基因的基础上获得基因产物的表达，此抗体基因可随着质粒DNA在细菌内的复制而稳定复制，并可根据不同需要任意改建抗体基因，从而获得一种可行性的临床治疗用抗体制剂。
以下的优先实施例对本发明作详细说明，担不意味着限制本发明的内容在这些实施例中，为说明本发明，采用噬菌体表达载体为pComb3(Barbas C.III et al，Proc.Natl.Acas.Sci USA 1991，8910164-10168)。所用主要菌株为商品化产品XLI-Blu(美国Strategene公司)。所用噬菌体为VCSM13。狂犬病毒为我国分离的AG株。
实施例1-6为人源抗狂犬病毒中和性基因工程Fab抗体和全抗体RVG10的筛选制备方法；实施例7为人源抗狂犬病毒中和性基因工程抗体RVG10的基因特征；实例8-12为人源抗狂犬病毒中和性基因工程抗体RVG10的蛋白及功能特征。
实例1，人源IgG Fab段基因的PCR扩增用淋巴细胞分离液从经狂犬病毒PM株Vero细胞疫苗免疫过的供体外周抗凝血中分离淋巴细胞，用Tril-Zon(美国Gibco，BRL)提取总细胞RNA，用Olig-dT引物将提取的RNA通过逆转录酶(美国Gibco，BRL)逆转录成cDNA，用一组特异性IgGFabGamma链、Kampa链及Lamda链引物(表1)，对人源轻链和重链Fab基因进行PCR扩增。PCR条件为94℃1分钟，54℃1分钟、72℃2分钟，35个循环(PE 480)，上述PCR产物分别经琼脂糖凝胶回收，经过DNA纯化柱Spin-X(美国Gibco，BRL)纯化后，获得650-700bp左右的Kamba、Lamda和Fd链PCR产物。
实例2，噬菌体抗体基因库的建立将不同引物合成的Kamba和Lamda链PCR产物混合，将不同引物合成的Fd链混合，分别用SacI/XbaI和XhoI/SpeI克隆入噬菌体载体pComb3，将克隆入轻，重链基因的pComb3载体DNA连接产物经乙醇沉淀后，用10ul蒸溜水悬起，电转导入事先制备好的200ul电转菌XLI-Blu，(电转条件为Bio-Red电转仪，0.2cm电转杯，2.5K伏)，电转后加10mlSOC培养液，37℃1小时，加入10ml带有氨苄青霉素和四环素的SB培养液(3)，37℃1小时，加入80-100ml前述SB，37℃2小时后加入辅助噬菌体M13GCM 1 X10 12，1小时后加入卡那霉素(70ug/ml)，37℃摇床培养过夜。用4％PEG8000和3％NaCl沉淀噬菌体上清，经9000rpm，20分钟，4℃离心后，用2ml 0.02M PBS PH 7.4重悬沉淀，建立噬菌体抗体库，分装保存于-20℃冰柜中。
实例3，用于抗体库富集筛选的狂犬病毒抗原的制备1)狂犬病毒颗粒的纯化所用病毒为BHK-21细胞转瓶培养的病毒上清(流研所贾珂丽老师惠赠)。将上清在4000rpm离心10分钟，弃去细胞碎片。先用15％、20％、25％、30％的蔗糖溶液做垫层离心，以确定合适的蔗糖浓度。选用SW40的转头。每管加入10ml病毒培养上清，然后将1ml蔗糖溶液加入溶液底部，4℃，25000rpm离心2小时。然后将超离纯化的样品进行电泳鉴定，确定合适浓度的蔗糖溶液。用合适的浓度，采用SW28转头，4℃，25000rpm离心2小时纯化抗原。将纯化的的抗原进行SDS-PAGE分析和Western Blot鉴定。2)感染细胞裂解液的制备用狂犬病毒aG株感染的细胞，用2％NP40细胞裂解液裂解细胞，制成狂犬病毒抗原。
实例4，噬菌体抗体库的特异性富集筛选用0.1M NaHCO3(pH8.6)的溶液包被纯化的狂犬病毒抗原(0.5-1μg/ml)，每孔55μl，4℃过夜；次日用1×PBST洗去未吸附的抗原，用4％的脱脂奶37℃封闭1小时，弃封闭液；每孔加入50μl噬菌体抗体库，37℃孵育2小时，弃去孔中未结合的噬菌体，用1×TBST(50mM Tris-HCl，150mMNaCl，0.5％Tween 20，pH7.5)洗液冲洗各孔，冲洗时，用带有吸头的移液器反复吹打，共洗10-20遍，以充分洗去未吸附的噬菌体；最后用ddH2O洗两遍，吸净孔中的液体；每孔加入50μl Gly-HCl(pH2.2)的洗脱液，室温孵育10分钟。加入适量的2M Tris，以中和洗脱下来的噬菌体；将洗脱的噬菌体立即加入2ml新鲜制备的XLI-Blu菌液中(OD600＝1)，室温孵育15-20分钟；然后转入250ml三角瓶中，加入SB10ml(氨苄青霉素20μg/ml，四环素10μg/ml)，立即取10μl涂氨苄青霉素平皿，以滴定噬菌体；三角瓶与37℃振荡培养1小时，加入100mlSB(氨苄青霉素100μg/ml)，37℃1小时后，加入辅助噬菌体VCSM13 1ml，37℃振荡培养2小时，加入卡那霉素(终浓度70μg/ml)，37℃培养过夜。如此反复筛选4-5次。
实例5，人IgGFab抗体可溶性表达产物的制备将带有阳性抗体轻重链基因插入的阳性克隆扩增后按常规方法提取质粒DNA，用SpeI和NheI切除载体中的gIII，变FdgIII融合蛋白为独立表达的蛋白，连接后转化XL1-Blu菌，从过夜生长的氨苄碟子中挑取单个菌落，接种SB或TB细菌培养液，当细菌长至OD600＝0.2-0.3，加入1mM IPTG，在30℃诱导表达10-12小时。收获细菌，离心后加入原培养液1/10体积的PBS(0.02 M pH7.4)重悬，反复冻融三次，4℃10000rpm离心10分钟，上清即为表达的Fab抗体。备用于进一步的检测和鉴定。阴性对照为载体pComb3转化菌按同样方法制备的细菌裂解液。
实例6，人源抗狂犬病毒中和性基因工程全抗体基因的克隆重组将通过噬菌体表面呈现系统获得的抗狂犬病毒中和抗体Fab基因克隆入本实验室发明的杆状病毒IgG表达载体中。其中，轻链基因以SacI和EcoRV克隆入pAc-L-Fc中，置于p10启动子控制之下，获得中间载体pAc-HA-L，重链Fd基因以XhoI和SpeI克隆入pAc-HA-L中，置于多角体启动子控制之下；获得带有抗甲肝抗体轻，重链全抗体基因的表达载体pAc-HA-HL。此载体质粒DNA经柱层析纯化后用于转染昆虫细胞，获得重组杆状病毒。用重组杆状病毒感染昆虫细胞后，获得全人源IgG抗体的表达。
实例7人IgGFab抗体RVG10的可变区基因的核酸序列分析用Qiagen MiniprepKit(美国Qiagen)制备质粒DNA进行核酸序列分析。测序为自动测序。至少3个克隆被用于确定同一相同的序列。所获序列均用DNA Strider(美国微软公司)序列分析软件进行分析处理，并比较Internet网络上基因库中的IgG序列。证实人源抗甲肝病毒中和性基因工程Fab抗体HAFab16基因由人IgGγ链Fd和λ链组成，其基因特征由VH和VL结构域中的6个CDR区的特异性核甘酸序列和氨基酸构成，序列资料如图9，是人源抗狂犬病毒中和性基因工程抗体可变区核苷酸和氨基酸序列。
实例8从狂犬病毒免疫供体血液中分离淋巴细胞，用PCR技术扩增了人源IgG Fab抗体基因，建立了噬菌体抗体基因库，用噬菌体表面呈现技术筛选并从富集筛选后获得的Fab阳性克隆中，最后选出三株阳性克隆，其中两株为Fab抗体RVG10和RVB2，RVG10来源于纯化抗原的筛选，RVB2则来源于单抗捕捉狂犬病毒抗原的筛选。将表达的菌体细胞裂解上清同时检测其对抗人Fab抗体的结合活性及对狂犬病毒纯化抗原的抗原结合活性。ELISA结果表明获得3株单抗不仅被抗人IgGFab抗体所识别，同样也识别结合上述纯化狂犬病毒颗粒抗原。如
图1，是人源抗狂犬病毒基因工程Fab抗体与抗人Fab抗体和纯化狂犬病毒抗原ELISA结合。将单抗RVG10与已有的一株鼠源抗狂犬病毒糖蛋白中和单抗进行了竞争，结果表明，鼠单抗可以封闭糖蛋白上G10单抗的抗原结合位点，如图2所示。表明这株抗体针对对狂犬病毒糖蛋白。
实例9，将RVG10株抗体Fab基克隆入全抗体表达载体pAc-K-Fc，构建成pAC-H(κ)-G10昆虫细胞表达质粒。将RVG10杆状病毒表达质粒转染SF9细胞，5天后收获转染上清，细胞用FITC标记的抗人Fab抗体和抗人IgG抗体分别检测，结果表明转染后的细胞中有Fab和IgG的表达，而空白细胞中没有，G10表达质粒转染成功，全抗体在细胞中得到有效表达。如图3所示，是RVG10全抗体基因在昆虫细胞SF9细胞中的表达。标记抗体为抗人IgG荧光抗体。
实例10，抗体纯化将收获的上清先用0.45μm的滤膜过滤除去残余的杂质，用1ml纯化柱(Hitrap1ml Protein G)进行纯化，并洗脱除去纯化抗体中的盐成分，然后测定纯化蛋白的含量。取3-5μg的纯化抗体进行SDS-PAGE电泳分析。如图4为纯化RVG10全抗体分子的蛋白电泳图。将定量的抗体进行亲和力测定，结果表明0.4μg/ml的抗体即可结合aG株纯化抗原，故所获全抗体的亲和力为2.67×10-9M。同时与鼠抗狂犬病毒糖蛋白单抗竞争结合，这种特异性结合可被鼠单抗所竞争抑制。如图5，是RVG10全抗体与鼠抗狂犬病毒糖蛋白单抗对纯化狂犬病毒抗原的竞争抑制ELISA分析。
实例11，体外中和实验利用G10单抗中和aG株病毒，从而使病毒不再感染细胞或感染后的症状减轻。固定抗体量(100μg/ml)，将病毒进行系列对数稀释，体外中和病毒30～60分钟后，感染新传代的Vero细胞(24孔板，Costar)，将细胞在33℃、5％CO2孵箱中培养，一周后收获感染后的细胞上清，换成维持液，并继续培养观察。病毒感染细胞三周后，观察细胞的形态，同时收获感染的病毒上清，细胞用荧光法检测狂犬病毒感染状况。如图6所示，是狂犬病毒感染的Vero细胞病变。与未能中和病毒感染的对照抗体100 IgG相比(图上方)，被RGV10中和抗体中和的病毒感染的细胞出现圆缩，折光率变差，颗粒增多，细胞脱落，并且细胞间出现明显拉网(图下方)。
实例12，为进一步鉴定狂犬病毒的中和状况，我们将两次收获的上清注射11～13g无菌小白鼠(检定所提供)，30μl/只，最后用荧光法检测感染细胞，同时检测上清和细胞中的病毒。如图表7所示，用感染7天后的细胞上清注射鼠脑，被G10中和后的病毒(10-1)上清注射的小鼠100％存活，而无关单抗中和的对照却无一存活。而在21天后的上清中(7天时细胞换成维持液)，被G10中和的(10-1)的病毒上清注射的小鼠存活率为1/3，这一结果表明，病毒并没有完全被中和，而是有少量病毒存在，经过一段时间后，病毒又有扩增。
为进一步确定中和aG株病毒所需要的抗体量，我们又通过固定病毒，稀释抗体的方法将上述实验重复了一次，病毒感染细胞两天后，换成维持液，33℃、为进一步确定中和aG株病毒所需要的抗体量，我们又通过固定病毒，稀释抗体的方法将上述实验重复了一次，病毒感染细胞两天后，换成维持液，33℃、5％CO2孵箱培养7天后，收获培养上清，鼠脑接种检测上清中的病毒，同时用荧光法检测细胞中的病毒，结果如图表8，RVG10抗体在6ug/ml浓度下仍然可以中和狂犬病毒感染，证实RVG10是一株亲和力较高的中和抗体。
权利要求
1.人源抗狂犬病毒中和性基因工程抗体RVG10，包括Fab抗体和IgG全抗体基因、基因产物及其应用。其主要特征在于此重组抗体是由存在于抗体轻链和重链基因可变区中的高变区(CDRs)特异性基因序列决定的并在原核和真核细胞中获得有效表达的特异性结合狂犬病毒的功能性中和抗体。
2.人源抗狂犬病毒中和性基因工程抗体RVG10，其主要特征在于抗体蛋白功能由存在于抗体基因轻链和重链可变区的决定族互补区域(Complementarity-Determining Regions，CDRs)CDR1、CDR2和CDR3中特异性核苷酸序列决定的，其相应的氨基酸序列构成了抗体的特异性抗原结合区域，如摘要附图。
3.人源抗狂犬病毒中和性基因工程抗体RVG10，其主要基因特征在于特异性的轻链和重链可变区基因来源于对人源抗狂犬病毒抗体基因库的特异性富积筛选表达，其轻链(VL)和重链各自相应的三个CDR区序列为本抗体特有的全新序列。重链(VH)三个CDR区的氨基酸序列包括CDR1为GGSITSHHYWS；CDR2为YHSGTTNYNPSLKSRV；CDR3为VRVTTGAFNL。轻链(VL)三个CDR区的氨基酸序列包括CDR1为RASQSVSSNLA；CDR2为ASTRAA；CDR3为QQYNTWPPYT。
4.人源抗狂犬病毒中和性基因工程抗体RVG10Fab抗体，其特征在于为一种在原核细胞中获得稳定有效表达的基因重组的人源抗狂犬病毒糖蛋白中和性基因工程单克隆抗体Fab抗体，由重链Fd和Kappa链组成。
5.人源抗狂犬病毒中和性基因工程抗体RVG10IgG全抗体，其特征在于由全长IgG1重链基因和全长lambda链轻链组成，其轻重链先导序列和重链Fc基因来源于载体pAc-L-Fc，已在专利申请号为00105698.0的专利申请中陈述。在轻链基因先导序列和VL基因之间含有SacI酶切点；在重链基因先导序列和VH基因之间含有XhoI酶切点；在重链Fd基因和Fc基因之间含有SpeI酶切点。
6.人源抗狂犬病毒中和性基因工程抗体RVG10，其主要功能特征在于特异性识别狂犬病毒糖蛋白蛋白，具有抗狂犬病毒感染的中和活性功能。
7.根据上述6条权利要求，人源抗甲肝病毒中和性基因工程Fab抗体的用途，其特征在于利用上述获得的中和性抗体可变区，Fab或全抗体基因，可以在原核细胞、酵母细胞、真核细胞及任何重组病毒系统中表达和生产此抗体基因或以此为基础的改建后的含有此抗体基因任何其他基因，获得具有中和狂犬病毒感染的抗体产物，其基因表达产物可望在临床上用于预防和治疗由狂犬病毒引起的狂犬病。
8.根据权利要求2和3，人源抗狂犬病毒中和性基因工程抗体基因的用途，其特征在于根据发表的抗狂犬病毒中和抗体RVG10的可变区中的CDR区特异性核苷酸或氨基酸序列，可在体外人工合成与此相同的抗体轻重链6个CDR区的核苷酸序列或编码相同氨基酸的核苷酸序列，从而获得相同的抗体基因或用于相关基因的改造，而获得抗狂犬病毒糖蛋白的中和抗体或相关蛋白或多肽产物。
9.根据权利要求2，3和5，人源抗狂犬病毒中和性基因工程抗体基因的用途，其特征在于根据权利要求2，3中所述的CDR区氨基酸序列为本抗体专有的抗体序列，任何新的工程抗体可变区基因或相关产物基因不应含有与上述任何两种CDR区序列完全相同或仅1-2个氨基酸差易的序列。任何新的工程抗体全抗体基因不应含有权利要求5中所述的特征。
全文摘要
人源抗狂犬病毒中和性基因工程抗体,命名RVG10,包括Fab段和IgG全抗体基因、基因产物及其应用。其主要特征在于此重组抗体是由存在于抗体轻链和重链基因可变区中的高变区(CDRs)特异性基因序列决定的并在原核和真核细胞中获得有效表达的特异性结合狂犬病毒的功能性中和抗体。其今后的可能用途在于利用此中和抗体CDR区或部分或全基因,可在原核、孝母、昆虫和真核细胞及任何表达系统中生产此抗体,可在临床上预防或治疗狂犬病。
文档编号A61K39/395GK1355253SQ00132570
公开日2002年6月26日 申请日期2000年11月29日 优先权日2000年11月29日
发明者梁米芳, 候云德, 张世珍 申请人:中国预防医学科学院病毒学研究所