专利名称：用于移植术的药剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于从供体向需要器官的接受者移植组织或器官的药剂。
组织(器官)移植是保健系统中发展迅速的一个领域，每年的移植术数量都在增加。组织(器官)的供应十分有限，并且移植术前组织(器官)仅能在普通环境中存放几小时。其限制性因素是时间问题，即从供体摘除组织(器官)到它在组织(器官)接受者中起作用这一段有效时间。这一时间因素非常重要，并且需要夜间手术(因为白天的几个小时是不够的)、救护车和空运，同时还要为在不同医院的多达5-6个接受者准备多个手术。接受者的肝移植手术可长达12小时。
在下述说明和权利要求书中，术语“组织”可包括所有可被移植的组织、器官和细胞。在说明书中这些术语可互换使用。
移植术中存在三个难处理的步骤，均与潜在的氧化应激反应(stress)问题有关，即组织(器官)的特性、存活问题I.对供体的深入细致照料时间。这意味着要暴露于氧环境(高比例和压力的)和面临许多正常受体功能的衰竭。
II.从摘除到在接受者中起作用的时间。这是非常关键的。器官需冷却至+4℃，并且用储藏和运输的溶液如UW-溶液洗涤。摘除后的器官存放于置于冰上的所述溶液中。UV溶液是一种含有添加剂的盐水，所述添加剂的目的在于维持盐平衡和避免组织损害。
III.对于接受者来说也存在几个关键步骤，首先是再灌注即灌注到血流中这可造成大量的氧化猝发。其次是移植术存在的免疫反应和长期效应问题(某些细胞组的部分细胞死亡)。
移植术步骤的最优化是非常重要的，有些接受者的生命就依赖于整个步骤的有效性和在该方法中器官未受到破坏。
当氧化剂和自由基与例如SOD酶、过氧化氢酶、DNA-修复等保护机制失衡时，就会发生氧化应激反应。氧化应激反应是多数疾病的主要或次要部分，这些疾病包括心/脑梗塞、创伤、脓毒病、关节炎、免疫系统疾病、癌症、炎症、感染和CNS-疾病。在所有这些疾病中，氧化应激反应导致细胞损伤，其结果取决于器官是否能在急性期存活，这种情形适用于梗塞，但也与慢性病有关，例如关节炎就伴随着长期的关节氧化应激反应。
本发明涉及药剂在从供体向需要器官的接受者移植器官中的用途。本发明药剂适用于移植术的不同步骤中。该药物可a)经口、腹膜内、静脉内给予将要摘除器官的供体；b)加到储藏和运输器官的溶液中(如UW溶液)；c)经口、腹膜内、静脉内给予器官接受者，即将要植入器官的病人。
氧化应激反应可通过几种不同的机理如氧化蛋白质、脂质和DNA影响组织，因此组织的退化(Degradetion)就有几种机理。在组织的蛋白质和脂质氧化期间，其结构遭到自由基的严重损害，其结果是功能的损失，从而导致细胞死亡并最终导致组织的死亡。
本发明令人惊奇地发现使用下面式I的取代吲哚喹喔啉即可保护移植器官，使之在实施移植术的整个必需步骤中避免了由于氧化应激反应所导致的退化现象。
本发明与移植术联用的药物是下面式I化合物及其与酸或卤素优选碘、一氯化碘或一溴化碘形成的生理可接受的加合物 其中R1在位置1-4和/或1-7为氢。或一个或几个、优选1-4个相同或不同的取代基，选自卤素优选溴、不高于4个碳的低级烷基/烷氧基、三氟甲基基团、三氯甲基基团；R1在位置7-10之一可以是羟基；X为-(CH2)n-R2，其中R2是含氮的碱基如NH2、NHR4或NR5R6，其中R4、R5和R6独立地为低级烷基或环烷基并且n为1-4的整数，R3为氢、不高于4个碳的低级烷基/环烷基、R1优选为氢和低级烷基、特别优选甲基。更优选R1在位置2和3为甲基，而在其他位置为氢。
下面式II化合物被证明特别有效 此类化合物及其制备参见专利EP0238459和US4990510的描述，在此引入作为参考。
本发明药剂这三种应用[I、II和III]用于防止移植术过程中对组织的损伤。因此，通过对欲移植的组织进行原位处理可激活其保护机制，从而使器官得以存活。本发明药剂可以下调或阻断组织的退化机理，这意味着可延长组织的储藏和运输时间。这种延期也意味着可在更广泛的国家和区域间进行移植组织的交换。这样，由于组织的DNA/蛋白质/酶等受到保护而不会被降解，因而移植的组织就不会发生退化。
通常，测定其代谢能力或组织功能即可测得组织损伤。这样，对于组织如肝而言，其降低血液中乳酸盐和生成胆汁的能力就可作为标识(指示剂)。由于DNA控制着细胞和组织的整个功能，所以DNA的氧化对于整个组织存活也是一个风险因素。因此说DNA的氧化也是一种前诱变物。
在DNA的氧化中，细胞暴露于活性氧下。在这种氧化应激反应期间，羟基和过氧化物自由基可使dG氧化，结果可形成8-OH-dG，这是一种前诱变物，其导致发生了链断裂、碱基取代、dG开环和/或影响DNA-甲基化(dG是脱氧鸟苷，DNA的一种碱基)。
由于式I化合物大幅度地降低了氧化应激反应，它在移植术中可用作提高细胞和器官存活的重要的潜在药剂。式I化合物在体内无毒并且可以两种方法保护组织。首先是阻滞可产生氧化剂的氧化性酶(氧化酶)。其次是通过基因调控而激活非特异性(general)细胞防御。这样，式I化合物就不单纯作为抗氧剂，而且能激活细胞的防御机制从而上调抵御氧化应激反应。
附图简述
图1表示肝灌流系统中DNA(8-OH-dG)的氧化性损伤。
图2表示大鼠肝分析8-OH-dG体内试验。
图3表示肝灌流系统中局部缺血的诱因和乳酸盐的降低。
图4和5表示灌流系统中大鼠肝的乳酸盐和胆汁流。
图6和7表示灌流系统中大鼠肝的总胆汁流。
图8表示灌流系统中大鼠肝的乳酸盐水平。
为了研究本发明用于移植术中的药剂，采用心/肺机对灌流液中的大鼠肝进行了试验。为了测定器官损伤，分析了肝中的8-OH-dG量。将二甲亚砜(DMSO，已知可影响细胞膜的化合物)作为8-OH-dG的诱导物加到灌流系统中。试验中使用了不同试验组一个不加任何物质到灌流液中的肝对照组指定为对照C；另一组为把100μlDMSO加到灌流液中，该组使8-OH-dG显著提高；和加入100μlDMSO前分别加有2、5和10mg本发明化合物(B220)的三个组。结果如图1所示。从图中可以看出B220的抗DNA氧化作用存在剂量/响应关系。另外，B220还可将8-OH-dG降低到对照值以下(下调节)。
在另一试验中，对大鼠进行了体内试验并分析了肝的8-OH-dG。在该试验中有三个试验组。一个对照组，一组经口给予2，7-二硝基-芴(2，7-dNF)，它是已知的柴油机排气中的致癌物质和8-OH-dG的诱导物，另一组联合给予2，7-dNF和本发明化合物(B220)。在给予2，7-dNF的-48、-24和+6小时给予B220。所有剂量均以玉米油为载体经口给予，而对照组仅给予载体。测量肝中DNA的氧化(鸟嘌呤的氧化，8-OH-DG)，8-OH-dG为几种不同类型疾病如癌症、糖尿病和感染的预诱变物。
结果如图2所示。B220不仅能抗2，7-dNF-诱导的8-OH-dG形成。而且还可将8-OH-dG降低到对照值以下(下调)。
又进行了第3个试验，其中将大鼠肝取出并置于心/肺机上灌注。灌流液是含有移植的肝的血液。当系统达到平衡时，截断灌流液10-20分钟后再接通，即所谓的再灌注(局部缺血)。再灌注(局部缺血/梗塞)的已知毒性作用(氧化应激反应造成的组织损伤)是从灌注液中清除乳酸的能力降低。在该试验中，本发明用于移植术的药剂(B220)与三种不同的已知可保护组织的化合物进行了比较，它们是乙酰水杨酸(ASA，已知的炎症性损伤和发热的保护剂)、Clomethiasol(一种治疗梗脑塞所致脑损伤的潜在新药物)和维生素E(一种已知的抗氧剂和自由基清除剂)。对照组(C)仅诱发局部缺血。其他4组在局部缺血以前在灌注液中加入指示物质(5mg)。B220是唯一能显著降低乳酸盐的物质。但是，已知可对发热、炎症和疼痛下调的ASA并不显示任何保护作用，Clomethiasol(一种保护梗脑塞后脑组织的药物)和已知的抗氧剂和组织保护剂维生素E也如此。
结果如图3所示。B220是试验中唯一可提供统计学显著意义的保护作用的物质。
取大鼠肝在心/肺机上进行了系列试验(图4和5)。
将乳酸盐加到对照肝灌注液中，测定胆汁流和乳酸盐水平随时间的变化。胆汁流是肝功能的临床参数，胆汁流越高表明肝功能越好。对照组的结果见图4和5的上图。正常肝可下调乳酸盐快速达到体内水平(3-5mM)。虚线代表对照组中的正常胆汁流。
在下一试验中，先关闭心/肺机10分钟，再启动以诱发氧化应激反应(再灌注)。测定状表组织损伤的乳酸盐的量随时间的变化，同时也测量代表毒性作用的胆汁流随时间的变化。结果见图4，中间的图表示再灌注后高水平乳酸盐(实线)和降低的胆汁流(虚线)。它们均是组织损伤的标识。
在下一试验中进行了同样的再灌注试验，其中系统中含有2mgB220。以乳酸盐含量和胆汁流为标识的结果见图4下图。如图4所示，乳酸盐含量和胆汁流快速调节到正常值，这表明B220可消除再灌注所致的组织损伤。乳酸盐的排除和胆汁流均好于对照组。
在下一试验中(图5)，将一种非常有毒的化合物Triphorbolester(TPA)加到灌注液中。TPA是炎症的诱导物和非常有效的肿瘤启动子。以乳酸盐含量和胆汁流为标识的结果见图5中图，表明仅有非常有限的降低乳酸盐和生产胆汁的能力。
除了灌注液中加有2mgB220外，其他条件相同又进行了同样的试验。结果如图5的下图所示。结果表明，当系统中含有B220时，TPA的毒性效果被抑制并且乳酸盐和胆汁流的值得到恢复(甚至好于如图5上图的对照组)。这些数据与B220在体内长期试验中可中止TPA(在动物试验中是最有效的肿瘤启动子)的强效肿瘤启动子作用和“切断”肿瘤过程相关。这种作用的模式在于阻断了增生/炎症。
在另一试验中，对隔离灌注液中的大鼠肝进行了试验，其中给予供体B220。在手术摘除肝的24小时前，给予供体单剂量B220，肝在放入灌注液前在+30℃下保温2小时(组3)。(鼠肝在高温(+30℃)下“短期”存放(2小时)是为了刺激移植术)。第2组不给予B220，第1组为直接放入灌注液中的对照组。给予供体一定剂量的B220(术前24小时腹膜内给药)，灌注期间，测量总胆汁流可测定其降低的毒性效果。“运输”和灌注过程可产生大量导致组织损伤的氧化应激反应。
在图6中，以总胆汁流作为移植术所致组织损伤的标识。对照组直接“移植”到灌注系统中，而第2组肝在“移植术”前30℃存放2小时。第3组为30℃处理2小时，但是给予供体B220。如图所示，B220将胆汁流完全恢复到对照样品的水平。
重复同样的试验，但是采用运输人肝时的温度(+4℃)。在放入灌注系统前将肝存放24小时，而人肝移植术时的最大存放时间为12小时。如图7所示，经B220预处理的供体的胆汁流得到了恢复。图8表明对乳酸盐水平也有同样的保护作用。该试验除了时间和温度与图6不同外，其他均相同。
试验表明式I药剂可在适用于人肝移植术的环境下对肝提供保护。这表明该药剂可对人肝移植术中采用的储存温度(+4℃)和运输时间起作用，经腹膜、口或静脉给给药，该药剂均可达到保护效果。如果在紧急情况下时间不够用，可缩短预处理时间。从供体到接受者的移植术时间很可能延长至24小时，而目前最多为12小时。
从上述实施例可知，在移植术中用B220对供体进行预处理，可有效地下调氧化应激反应。这种下调不仅可消除移植术所致的氧化应激反应，而且能将氧化应激反应下调到低于对照值水平。这种效果加上非常低的毒性(基本上无毒)意味着B220可干扰氧化应激反应的正常调节(保护)。另外，B220的亲脂性使之可被细胞膜快速吸收。
对于移植术而言，组织的存活时间延长，即运输和保存的时间可以延长(使更多的器官可以移植)，同时也增加了器官存活和正常运行的机会。
权利要求
1.通式I取代的吲哚喹喔啉及其与酸或卤素优选碘、一氯化碘或一溴化碘形成的生理可接受加合物在制备用于移植术中保护组织、器官和细胞的药剂中的用途， 其中R1在位置1-4和/或1-7为氢。或一个或几个、优选1-4个相同或不同的取代基，选自卤素优选溴、不高于4个碳的低级烷基/烷氧基、三氟甲基、三氯甲基；R1在位置7-10之一可以是羟基；X为-(CH2)n-R2，其中R2是含氮的碱性残基如NH2、NHR4或NR5R6，其中R4、R5和R6独立地为低级烷基或环烷基并且n为1-4的整数，R3为氢、不高于4个碳的低级烷基/环烷基。
2.如权利要求1的用途，其中化合物的R1在位置2和3为甲基，而在其他位置为氢。
3.如权利要求1或2的用途，其中化合物的R1在位置7-10之一为羟基，优选在位置9。
4.如前述任一权利要求的用途，其中化合物的X为CH2N(CH3)2和R3为氢。
5.如前述任一权利要求的用途，其特征在于将化合物加到贮藏或运输移植器官的溶液中。
6.如权利要求1-4之一的用途，其特征在于将化合物加到与移植术连接的灌注系统中。
7.如权利要求1-4之一的用途，其特征在于将化合物注入或给予其组织将被移植的供体。
8.如权利要求1-4之一的用途，其特征在于将所述化合物给予移植组织的接受者。
全文摘要
式I化合物及其与酸或卤素优选碘、一氯化碘或一溴化碘形成的生理上可接受的加合物在制备用于移植术中保护组织、器官和细胞的药物的用途,其中R
文档编号A61P39/00GK1341023SQ00804108
公开日2002年3月20日 申请日期2000年2月18日 优先权日1999年2月25日
发明者L·默勒, J·博格曼 申请人:莱尔夫·J·I·伦德布拉得